इन विट्रो में और Vivo में मानव कोशिकाओं में Mitophagy का पता लगाने, सी. एलिगेंस, और चूहों

Medicine

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Summary

Mitophagy, क्षतिग्रस्त mitochondria समाशोधन की प्रक्रिया, mitochondrial homeostasis और स्वास्थ्य के रखरखाव के लिए आवश्यक है । यह आलेख मानव कोशिकाओं, Caenorhabditis एलिगेंस, और चूहों में नवीनतम mitophagy डिटेक्शन तरीकों में से कुछ प्रस्तुत करता है ।

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Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

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Abstract

Mitochondria कोशिकाओं के बिजलीघरों और एटीपी के रूप में सेलुलर ऊर्जा का उत्पादन कर रहे हैं । Mitochondrial शिथिलता जैविक उम्र बढ़ने के लिए योगदान देता है और चयापचय रोगों सहित विकारों की एक विस्तृत विविधता, समय से पहले उम्र बढ़ने सिंड्रोम, और अल्जाइमर रोग (AD) और पार्किंसंस रोग (पीडी) जैसे neurodegenerative रोगों. mitochondrial स्वास्थ्य का अनुरक्षण mitochondrial उत्पत्ति और mitophagy के माध्यम से बेकार mitochondria के कुशल निकासी पर निर्भर करता है । विशेष रूप से पशु मॉडलों में autophagy/mitophagy का पता लगाने के लिए प्रयोगात्मक तरीके, विकसित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । mitophagy के आणविक तंत्र की समझ की दिशा में हाल ही में प्रगति उपंयास mitophagy का पता लगाने तकनीकों के विकास को सक्षम किया गया है । यहां, हम मानव कोशिकाओं, Caenorhabditis एलिगेंस (जैसे, Rosella और डीसीटी-1/रेनिन-1 उपभेदों), और चूहों (मीट्रिक टन-Keima) में mitophagy की निगरानी करने के लिए कई बहुमुखी तकनीक का परिचय । क्रॉस प्रजातियों के मूल्यांकन सहित इन mitophagy का पता लगाने तकनीक का एक संयोजन, mitophagy माप की सटीकता में सुधार होगा और स्वास्थ्य और रोग में mitophagy की भूमिका की एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व.

Introduction

mitochondrial के रखरखाव के लिए Mitophagy जरूरी है । Mitochondria एकाधिक सेल संकेतन मार्ग काटना और यूनिवर्सल उप सेलुलर organelles सेलुलर ऊर्जा उत्पादन के लिए जिंमेदार हैं, सेल चयापचय, और कैल्शियम homeostasis1,2,3, 4. Mitochondria लगातार अंतर्जात और exogenous स्रोतों, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) और mitochondrial विषालु, क्रमशः, जो "वृद्ध" और बेकारी Mitochondria की पीढ़ी के लिए नेतृत्व से चुनौतियों का अनुभव । क्षतिग्रस्त mitochondria के संचय एटीपी उत्पादन की दक्षता कम हो जाती है, जबकि हानिकारक ROS की मात्रा में वृद्धि, और चयापचय रोगों, विज्ञापन के रूप में उम्र से संबंधित रोगों से जोड़ा गया है, और पीडी1,5,6 . mitochondria प्रेरित सेलुलर रोग को रोकने के लिए, कोशिकाओं को विशेष रूप से क्षतिग्रस्त mitochondria पहचान और कुशलतापूर्वक एक सेलुलर प्रक्रिया के माध्यम से उंहें हटाने की जरूरत mitochondrial autophagy (mitophagy) । यह स्वास्थ्य और रोग में mitophagy का प्रदर्शन महत्व सटीक और कुशल तरीकों दोनों विट्रो में और vivo मेंmitophagy का पता लगाने के लिए की जरूरत है दिखाता है ।

Mitophagy कई प्रोटीन और प्रोटीन कॉंप्लेक्स5,7,8शामिल है एक बहु कदम प्रक्रिया है । संक्षेप में, एक क्षतिग्रस्त mitochondrion पहले पहचाना और एक डबल-झिल्ली phagophore, जो प्लाज्मा झिल्ली, endoplasmic जालिका, Golgi परिसर, नाभिक, या mitochondrion ही9,10से उत्पन्न कर सकते हैं द्वारा घिरा हुआ है । गोलाकार phagophore लंबी और अंततः mitochondria के अंदर जवानों, mitochondrial autophagosome (mitophagosome) का गठन । mitophagosome तो क्षरण के लिए lysosome के साथ फ़्यूज़, एक autolysosome है जिसमें क्षतिग्रस्त mitochondrion नीचा और पुनर्नवीनीकरण है गठन7,8। mitophagy में शामिल प्रमुख autophagic प्रोटीन भी शामिल हैं: Autophagy संबंधित 7 (ATG7) और Beclin1 (दीक्षा), Microtubule-एसोसिएटेड प्रोटीन 1a/1b-लाइट चेन 3 (LC3-II) (रेनिन-1 में C. elegans) और p62 (phagophore के अवयव), और लाइसोसोमल-एसोसिएटेड झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन २ (LAMP2),. इसके अलावा, mitophagy के लिए अद्वितीय कई आवश्यक प्रोटीन्स हैं, जिनमें PTEN-प्रेरित ख्यात कळेनासे 1 (पिंक-1), Parkin1, न्यूक्लियर डॉट प्रोटीन ५२ केडीए (NDP52), optineurin, BCL2 इंटरैक्ट प्रोटीन 3 जैसे (इंकार/BNIP3L) (डीसीटी-1 in C. एलिगेंस), अंय लोगों के अलावा5,6,11

autophagy के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक आम विधि LC3-ii/LC3-I या LC3-ii/actin के अनुपात से है । हालांकि, इस विधि विशिष्ट है, इस अनुपात में वृद्धि के रूप में या तो एक वृद्धि की दीक्षा या mitophagosome के एक बिगड़ा फ्यूजन को प्रतिबिंबित कर सकते है lysosome12। एक अन्य विधि एक autophagy मार्कर के बीच colocalization का मूल्यांकन करने के लिए है (जैसे, LC3) और एक mitochondrial प्रोटीन (जैसे, बाहरी Translocase झिल्ली की mitochondrial 20 (TOMM20, जो proteasomes द्वारा नीचा किया जा सकता है)). हालांकि, यह केवल कुल mitophagy स्तर में परिवर्तन का संकेत कर सकते है और जो रुकावट होती है चरण (s) भेद नहीं कर सकता । यह लाइसोसोमल अवरोधकों का उपयोग करके स्पष्ट किया जा सकता है (उदा., E64d + Pepstatin एक, mitophagosomes के संचय के कारण समानांतर में EP) । आधार रेखा पर mitophagosomes की संख्या और mitophagosomes की संख्या के बीच अंतर EP के साथ उपचार के बाद mitophagy संकेत कर सकते हैं । इन सीमाओं ने उपन्यास mitophagy डिटेक्शन तकनीक के विकास का संकेत दिया है. मानव रोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में mitophagy की बढ़ती प्रासंगिकता को ध्यान में रखते हुए, हम शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है जो कई मजबूत mitophagy का पता लगाने तकनीक वर्तमान. हम दोनों में इन विट्रो और vivo तकनीकों में कवर और mitophagy के परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए कई तकनीकों के संयोजन की सिफारिश ।

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Protocol

पशु (पुरुष और मादा चूहे) पैदा हुए थे और NIH पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार एक मांयता प्राप्त पशु सुविधा में नस्ल, । इच्छामृत्यु के तरीके सभी राष्ट्रीय और संस्थागत नियमों के अनुरूप होने चाहिए ।

1. मानव कोशिकाओं में Mitophagy का पता लगाना

  1. एमटी-Keima प्लाज्मिड का उपयोग करके mitophagy का पता लगाना
    नोट: Keima प्रोटीन, एक mitochondria लक्ष्य संकेत करने के लिए जुड़े हुए, मीट्रिक टन-Keima के रूप में सरलीकृत, vivo mitophagy डिटेक्शन में के लिए उपयोगी साबित कर दिया है. mt-Keima एक ratiometric पीएच-संवेदी फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो बुनियादी या तटस्थ परिस्थितियों में हरी प्रतिदीप्ति (उत्तेजना ४५८ एनएम) और अम्लीय स्थितियों में लाल प्रतिदीप्ति (उत्तेजना ५६१ एनएम) दर्शाती है । स्वस्थ mitochondria बुनियादी या तटस्थ स्थितियों में पनपे (पीएच 7-8) और हरी प्रतिदीप्ति द्वारा संकेत कर रहे है जब मीट्रिक टन के साथ transfected-Keima । जब mitochondria mitophagy और अम्लीय lysosomes के साथ फ्यूज से गुजरना, पीएच ४.५ और मीट्रिक टन-Keima प्रदर्शन लाल प्रतिदीप्ति6,13,14युक्त mitochondria के लिए चला जाता है । महत्वपूर्ण बात, मीट्रिक टन-Keima लाइसोसोमल के लिए प्रतिरोधी है, अब समय पर mitophagy के मूल्यांकन को सक्षम करने से । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल 6-well प्लेट्स के लिए डिज़ाइन किया गया है ।
    1. 1 दिन: या तो प्राथमिक मानव कोशिकाओं का प्रयोग करें (उदा, fibroblasts) या अमर मानव कोशिकाओं (जैसे, हेला कोशिकाओं या U2OS कोशिकाओं). बीज लगभग 0.3-1 × 106 कोशिकाओं/(सेल वृद्धि दर पर निर्भर करता है कोशिकाओं को अगले दिन पर ७०% प्रवाह तक पहुंचने के लिए अनुमति देने के लिए) एक 6 में अच्छी तरह से थाली । पूरा सेल संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखने (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मध्यम 10% FBS के साथ पूरक, और पेनिसिलिन-streptomycin के 1% मिश्रित समाधान), और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति मशीन में मशीन (20% हे2, 5% सह2 ). 1 मिलीलीटर पूरा सेल संस्कृति एक 6-खैर प्लेट में मध्यम/
      नोट: जीन एक्सप्रेस/पछाड़ना या दवा उपचार इस स्तर पर किया जा सकता है6.
    2. 2 दिन: मिक्स मीट्रिक टन-Keima प्लाज्मिड डीएनए6 और डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट (एक अच्छी तरह से एक 6 के लिए मिश्रण अच्छी तरह से थाली) ।
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सीरम मुक्त माध्यम के १५० µ एल के साथ एक डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट के 15 µ एल पतला ।
      2. पतला मीट्रिक टन के 2-5 µ जी-Keima प्लाज्मिड डीएनए के साथ १५० µ एल के सीरम मुक्त माध्यम.
      3. पतला मीट्रिक टन जोड़ें-Keima प्लाज्मिड को पतला डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट, भंवर के लिए 10 एस, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
        नोट: डीएनए अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन प्लेट आकार के आधार पर आवश्यक हो सकता है (विवरण के लिए निर्माताओं के प्रोटोकॉल देखें) ।
      4. डीएनए/अभिकर्मक एजेंट मिश्रण dropwise कोशिकाओं को जोड़ने के लिए, तो 5-10 एस के लिए धीरे से प्लेटें शेक जब तक समाधान पूरी तरह से मिला है ।
    3. Day 3: डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट की जगह बदलकर मीडिया को बदलें-ताजा पूरा सेल कल्चर मीडियम (1 मिलीलीटर/
    4. 4 दिन: छवि फोकल माइक्रोस्कोपी6का उपयोग कर कोशिकाओं । दो इमेजिंग चैनल का प्रयोग करें: ग्रीन चैनल (उत्तेजना ४५८ एनएम, उत्सर्जन 570-695 एनएम) के लिए सामांय mitochondria और लाल चैनल (उत्तेजना ५६१ एनएम, उत्सर्जन 570-695 एनएम) कल्पना mitochondria जो mitophagy के दौर से गुजर रहे हैं । बेतरतीब ढंग से छवि 40x आवर्धन के तहत 20 क्षेत्रों में हर अच्छी तरह से 100-200 कोशिकाओं की कुल कवर करने के लिए ।
    5. डेटा विश्लेषण निष्पादित करें । "mitophagy सूचकांक" (mitochondria दौर से गुजर mitophagy के प्रतिशत) की गणना, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए दोनों लाल और हरे चैनलों में प्रतिदीप्ति की मात्रा यों तो: लाल प्रतिदीप्ति के अनुपात ले लाल + ग्रीन प्रतिदीप्ति, और से गुणा १००6
      नोट: अभिकर्मक के लिए विकल्प मीट्रिक टन-Keima छुरा व्यक्त हेला सेल लाइनों14का उपयोग शामिल है । चूंकि हेला कोशिकाओं Parkin व्यक्त नहीं करते हैं, Parkin इस सेल लाइन में Parkin-निर्भर mitophagy का अध्ययन करने के लिए छुरा व्यक्त किया जाना चाहिए ।
  2. Cytochrome C oxidase उपइकाई II (COXII) और LAMP2 के बीच colocalization का उपयोग करके mitophagy का पता लगाना
    नोट: COXII एक mitochondrial जीनोम-भीतरी झिल्ली प्रोटीन इनकोडिंग है । ' mitophagy सूचकांक ' COXII की कुल राशि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त LAMP2 के साथ COXII colocalized के अनुपात के बराबर है ।
    1. बीज हेला कोशिकाओं (या ब्याज की अंय कोशिकाओं 1.1.1 चरण में उल्लेख किया) में एक 4 अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड (1-5 × 104 कोशिकाओं में 1 मिलीलीटर पूरा सेल संस्कृति मध्यम/एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस (20% हे2में, 5% सह2) रातोंरात ।
    2. 10 मिमी carbonyl साइनाइड-4 के ३.० µ एल जोड़ें-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) और सेल संस्कृति मशीन में मशीन (कदम 1.2.1) 3 एच के लिए ।
      नोट: mitophagy को प्रभावित करने वाली अन्य दवाओं का उपयोग किया जा सकता है ।
    3. एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर संस्कृति मध्यम निकालें, कोशिकाओं को दो बार धोने के साथ 1 मिलीलीटर/ठंडा (0-4 ° c) 1x पंजाबियों के साथ । समाधान दो अगले धोने से पहले 10-30 एस के लिए बैठते हैं । फिर प्रत्येक वेल को 1x पंजाब में ०.५ मिलीलीटर ३.७% paraformaldehyde (पीएफए) जोड़ें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए बर्फ पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      सावधानी: पीएफए विष है । पीएफए का उपयोग करते समय एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।
    4. एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर पीएफए समाधान त्यागें, ठंड 1x पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो (1 मिलीलीटर/चलो समाधान 10 एस के लिए अगले धोने से पहले बैठो), और 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं permeabilize/०.२५% डिटर्जेंट (1x पंजाब में) के लिए बर्फ पर 10 मिनट के लिए ।
    5. permeabilizing बफर छोड़ें, धीरे से ठंड 1x पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने और त्यागें (समाधान के लिए 10 एस के बीच बैठने के लिए बैठते हैं) । 4 ° c पर रात भर 1x पंजाब में 5% FBS की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक । कक्षों को ढककर नमी घटाने से रोकें ।
    6. 5% एंटीबॉडी के साथ 1x पंजाब में COXII एंटीबॉडी (माउस, 1:250 कमजोर पड़ने) और LAMP2 FBS (खरगोश, 1:20-1:50 कमजोर पड़ने) के साथ एक मिश्रित एंटीबॉडी समाधान के ०.५ मिलीलीटर/अच्छी तरह से तैयार करें, और 0.5-1 एच के लिए बर्फ पर स्टोर ।
    7. ठंडे कमरे से 4-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड बाहर ले और एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ अवरुद्ध समाधान त्यागें । धीरे कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर के साथ दो बार धोने/ठंडा 1x पंजाबियों की अच्छी तरह से और त्यागें (समाधान के लिए बैठो 10 बहाकर के बीच एस), तो जोड़ने के ०.५ मिलीलीटर मिश्रित एंटीबॉडी समाधान । कम गति पर एक शेखर पर 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    8. एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर पहली एंटीबॉडी समाधान छोड़ें और धीरे कोशिकाओं को धोने के साथ तीन बार 1 मिलीलीटर/ चलो समाधान 10 एस के लिए अगले धोने से पहले बैठता है । फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, बकरी विरोधी खरगोश के साथ लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) की तरंग दैर्ध्य ५६८ एनएम के साथ LAMP2 के लिए, और बकरी विरोधी माउस (COXII के लिए GFP) के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ४८८ एनएम के साथ एक मिलीलीटर/1:250 कमजोर पड़ने के साथ 5% 1x पंजाब में FBS । एल्यूमीनियम पंनी के साथ 4-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड कवर और कम गति पर एक शेखर पर 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    9. एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ दूसरा एंटीबॉडी समाधान छोड़ें । धीरे कोशिकाओं को धो 1 मिलीलीटर के साथ छह बार/ चलो समाधान अगले धोने से पहले 1 मिनट के लिए बैठते हैं ।
    10. माउंट DAPI के साथ antifade बढ़ते माध्यम के ५० µ एल के साथ कोशिकाओं, और कवर फिसल जाता है जोड़ें ।
    11. छवि 66x आवर्धन और विसर्जन तेल के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं (टाइल स्कैन/मोज़ाइक के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा imaged कोशिकाओं की संख्या को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) । चैनल एक्सपोजर टाइम, डिजिटल गेन, डिजिटल ऑफ़सेट, आदि सभी इमेजिंग प्रक्रियाओं (विवरण के लिए सॉफ़्टवेयर निर्देश देखें)15के रूप में एक ही सेटिंग का उपयोग करें ।
    12. colocalization विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग मात्रात्मक रूप से १०० कक्षों के ंयूनतम 20 यादृच्छिक छवियों का विश्लेषण करने के लिए15। संपूर्ण व्यक्तिगत कक्षों का चयन करने के लिए "बंद Bezier" फ़ंक्शन का उपयोग करें. पियरसन के colocalization गुणांक की तुलना GFP आरएफपी के लिए, या तो भारित या unभारित, विश्लेषित कोशिकाओं में mitophagy स्तर निर्धारित करने के लिए. विश्लेषण के दौरान colocalization विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के क्षैतिज और अनुलंब क्रॉसहेयर के लिए मान बनाए रखें । इन क्रॉसहेयर को सटीकता से सेट करने के लिए, कक्षों के दो अतिरिक्त सेट और लेबल एक COXII और दूसरे LAMP2 को तैयार करें । फिर, प्रत्येक चैनल15 के लिए पिक्सेल वितरण के ऊपर सीधे क्रॉसहेयर सेट करें (विवरण के लिए सॉफ़्टवेयर निर्देश देखें) ।
  3. mitophagy स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च प्रवाह इमेजिंग माप
    नोट: बड़े यौगिक पुस्तकालयों से mitophagy उत्प्रेरण या mitophagy बाधा यौगिकों की उच्च प्रवाह स्क्रीन प्रदर्शन तकनीकी रूप से मांग कर रहा है. एक इमेजिंग तकनीक autophagosomes के साथ mitochondria के colocalization पर आधारित एक अधिक सरलीकृत है, mitophagy स्क्रीनिंग के लिए अभी तक अति संवेदनशील विकल्प16.
    1. 1 दिन: बीज कोशिकाओं (उदा, मानव प्राथमिक fibroblasts पर ५,००० कोशिकाओं/100 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया/खैर एक ९६ प्लेट में (1.1.1 कदम देखें) ।
    2. 2 दिन: FCCP या निर्दिष्ट मशीन समय के लिए ब्याज की अंय यौगिकों के साथ दूसरे दिन से कोशिकाओं का इलाज (कदम 1.2.2 देखें) ।
    3. चरणों का पालन करें 1.2.2-1.2.9 COXII के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस, 1x पंजाब में 5% FBS के साथ 1:250 कमजोर पड़ने) और LC3B (खरगोश, 1:100-1:200 कमजोर पड़ने के साथ 5% FBS 1x पंजाब में) का उपयोग कर । वैकल्पिक रूप से, COXII और LAMP2 के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    4. छवि एक फ्लोरोसेंट रीडर16का उपयोग कर कोशिकाओं । बेतरतीब ढंग से रखा क्षेत्रों में छवियों को इकट्ठा करने और एक न्यूनतम ५०० कोशिकाओं के साथ/
    5. कक्ष विश्लेषक अनुकूलित प्रोटोकॉल16का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें ।

2. C. एलिगेंस में Mitophagy का पता लगाना

नोट: निमेटोड C. एलिगेंस जीव स्तर पर mitophagy परख करने के लिए एक मंच प्रदान करता है । दो उपभेदों mitophagy पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: (1) mitochondria-लक्षित Rosella (mtRosella) या (2) mitophagy रिसेप्टर डीसीटी-1 GFP के साथ autophagosomal मार्कर रेनिन के साथ जुड़े Discosoma के साथ जुड़े. लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy Rosella का उपयोग कर निगरानी
    नोट: Rosella एक आणविक संवेदी है कि एक पीएच-असंवेदनशील DsRed एक पीएच-संवेदी GFP संस्करण के लिए आपस में जुड़े हुए को जोड़ती है । Rosellaा सेंसर अम्लीय lysosome (पीएच ~ ४.५) और अन्य सेलुलर डिब्बों के बीच पीएच मतभेदों का लाभ लेता है. इस Saccharomyces cerevisiae और कई स्तनधारी सेल लाइनों, जैसे हेला, HEK293, और HCT11618,19में mitophagy को सफलतापूर्वक मॉनीटर करने के लिए इस विसेंसर का इस्तेमाल किया गया है । हम इस बहुमुखी दोहरी-फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और उत्पंन ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस सूत्रकृमि व्यक्त mitochondria-लक्षित Rosella (mtRosella) शरीर में दीवार मांसपेशी कोशिकाओं । Mitophagy प्रेरण mtRosella प्रतिदीप्ति के एक कम GFP/DsRed अनुपात द्वारा संकेत दिया है ।
    1. 1 दिन: mitochondria-लक्षित Rosella (mtRosella) शरीर में दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में एक निमेटोड विकास मीडिया (NGM) प्लेट ई. कोलाई (OP50) एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर के साथ बीज पर व्यक्त कीड़े के L4 लार्वा उठाओ5। प्लेस 10-20 कीड़े/प्लेट पर कम से तीन ३.५ सेमी प्लेट । 20 डिग्री सेल्सियस के मानक तापमान पर सूत्रकृमि की मशीन5.
      नोट: कीड़ा एनाटॉमी के लिए संदर्भ देखें, L4 लार्वा20की पहचान सहित, और रास्ता एक लेने के लिए जो एक स्थान से एक और21से कीड़े हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है बनाने के लिए ।
    2. 5 दिवस: 15-20 L4 ट्रांसजेनिक लार्वा का चयन करके और उंहें ताजा OP50 वरीयता प्राप्त NGM प्लेट पर स्थानांतरित करके सूत्रकृमि सिंक्रनाइज़ करें । प्रायोगिक शर्त के अनुसार कम से पांच प्लेट का प्रयोग करें ।
    3. 7 दिवस: mitophagy के लिए वाहन प्लेटें तैयार-ब्याज या सकारात्मक नियंत्रण की दवाओं को प्रभावित ।
      1. मार ई. कोलाई (OP50) बैक्टीरिया NGM प्लेटों के साथ 15 मिनट के लिए उजागर द्वारा वरीयता प्राप्त २२२ µW/सेमी2 (यूवी प्रकाश की तीव्रता) सुनिश्चित करें कि mitophagy-उत्प्रेरण यौगिकों बैक्टीरिया द्वारा metabolized नहीं कर रहे हैं । प्लेट्स २,००० J/2के साथ उजागर किया जाना चाहिए ।
        नोट: जोखिम के सेकंड की जरूरत = 2000/((µW/cm2में तीव्रता) * १००) ।
      2. सीड NGM प्लेट्स के शीर्ष पर ब्याज के यौगिक (एस) जोड़ें । यौगिक वाहन के समकक्ष राशि (विलायक एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में वाहन प्लेटों के लिए यौगिक, जैसे dimethyl sulfoxide (DMSO)) को भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जोड़ें । mitophagy प्रेरण, एक mitochondrial विषाक्तता, paraquat (8 मिमी अंतिम एकाग्रता) के सकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था । उपचार समूह के लिए आगर प्लेट के शीर्ष पर ddH2O के १९० µ l के साथ 8 M paraquat शेयर के 10 µ l से युक्त समाधान जोड़ें । वाहन समूह के लिए, आगर प्लेट के शीर्ष पर ddH2O के १९० µ l के साथ DMSO के 10 µ l से युक्त समाधान जोड़ें ।
        नोट: paraquat-कार्य समाधान 4 ° c पर 1 महीने के लिए रखा जा सकता है ।
      3. धीरे से प्लेटें घूमता है जब तक दवा या वाहन पूरी सतह कोट । प्लेटों को ढक्कनों के साथ सूखने के लिए अनुमति दें ताकि कीड़े को स्थानांतरित करने से पहले कमरे के तापमान पर कम 1 घंटे के लिए बंद हो ।
        नोट: यह जम जाने से पहले लिक्विड NGM में दवाओं को जोड़कर ड्रग प्लेट्स भी तैयार किया जा सकता है.
    4. 7 दिवस: स्थानांतरण 10-20 के 2 दिन पुराने वयस्क ट्रांसजेनिक जानवरों या तो paraquat, यौगिक (एस) ब्याज, या वाहन (DMSO) युक्त प्लेटों के लिए कदम 2.1.2 में तैयार की । 2 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसजेनिक जानवरों की मशीन ।
    5. 9 दिन: 2% agarose पैड तैयार ( अनुपूरक सामग्रीदेखें) । उसके बाद पैड प्रति M9 में 20 मिमी levamisole की एक छोटी बूंद (10 µ एल) जोड़ें । इमेजिंग के लिए ट्रांसजेनिक जानवरों को मैटीरियल, उन्हें M9-levamisole ड्रॉप में रखकर । धीरे से शीर्ष पर एक coverslip जगह है ।
    6. एक epifluorescence माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक कैमरा का उपयोग कर एकल ट्रांसजेनिक जानवरों पर कब्जा. पूरे ट्रांसजेनिक सूत्रकृमि के फ्लोरोसेंट छवियां प्राप्त शरीर में mtRosella एक्सप्रेस-दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में 10x आवर्धन5। एकत्र छवियों को बचाओ ।
    7. ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहीत छवियों की प्रक्रिया । आंत्र ऊतक में autofluorescence से बचने के लिए कृमि के सिर में स्थित शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं का विश्लेषण करें । प्रत्येक जानवर के प्रमुख क्षेत्र के केवल प्रत्येक फ्लोरोसेंट छवि के लिए औसत पिक्सेल तीव्रता मूल्य और कुल क्षेत्र को मापने । रुचि के विशिष्ट क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए:
      1. छवियों को बदलने के लिए ' छवि ' और ' रंग ' ड्रॉप डाउन मेनू के तहत ' विभाजित चैनल ' का चयन करें ।
      2. ब्याज की फ्लोरोसेंट क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए ' मुक्तहस्त चयन ' उपकरण का उपयोग ।
      3. ' विश्लेषण ' ड्रॉप डाउन मेनू के तहत ' माप ' आदेश का चयन करें और पिक्सेल तीव्रता विश्लेषण करते हैं ।
      4. पिक्सेल तीव्रता विश्लेषण कुल क्षेत्र द्वारा तीव्रता विभाजित द्वारा सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. सामांयीकरण करने पर, GFP DsRed अनुपात22के लिए परिकलित करें ।
    8. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए या तो छात्र t-परीक्षण (दो समूहों के बीच तुलना) या ANOVA (एकाधिक समूहों के बीच तुलना) के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए p < ०.०५ के रूप में महत्वपूर्ण5,17 .
  2. डीसीटी-1 और रेनिन-1 के बीच सह-स्थानीयकरण का उपयोग करके mitophagy का आकलन करना
    नोट: डीसीटी-1 एक बाहरी mitochondrial झिल्ली प्रोटीन है कि तनाव की स्थिति के जवाब में एक mitophagy रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है, इसके ख्यात orthologues BNIP3 और इंकार के समान/स्तनधारियों में BNIP3L5। इस प्रकार, mitophagy दीक्षा डीसीटी के बीच सह स्थानीयकरण द्वारा मूल्यांकन किया गया है-1 mitophagy रिसेप्टर और autophagosomal झिल्ली प्रोटीन रेनिन-1 (homolog स्तनधारी के LC3).
    1. 1 दिन: उठाओ ट्रांसजेनिक पशुओं के L4 लार्वा दोनों डीसीटी-1:: GFP और DsRed:: रेनिन-1 शरीर में दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में एक OP50 वरीयता प्राप्त NGM प्लेट पर5 । प्लेस 5-10 कीड़े/3.5 cm की थाली, और का उपयोग कम से कम तीन प्लेटें । 20 डिग्री सेल्सियस पर सूत्रकृमि की मशीन ।
      नोट: transgenes अलग plasmids पर स्थित हैं और वे जीनोम में एकीकृत नहीं कर रहे हैं । दोनों rol-6 (su1006) और पीmyo-2 GFP रूपांतरण मार्कर ले सूत्रकृमि उठाओ । दोनों रूपांतरण मार्करों के साथ केवल ट्रांसजेनिक कीड़े एक्सप्रेस दोनों डीसीटी-1:: GFP और DsRed:: रेनिन-1 शरीर में दीवार मांसपेशी कोशिकाओं ।
    2. 2.1.2-2.1.5 से चरणों का पालन करें ।
    3. छवि एकल शरीर दीवार मांसपेशी एक फोकल माइक्रोस्कोप5,23से जुड़े कैमरे का उपयोग कर कोशिकाओं । पूरे शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं की सीमाओं का पता लगाने और 63x आवर्धन के तहत जेड-ढेर छवियों ले । उच्च आवर्धन भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    4. खुला और प्रक्रिया छवियों फोकल सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहीत किया । mitophagy की दीक्षा mitophagy रिसेप्टर के सह स्थानीयकरण द्वारा संकेत दिया है (डीसीटी-1:: GFP) autophagosomal मार्कर के लिए (DsRed:: रेनिन-1). शरीर के प्रत्येक स्टैक में सह-स्थानीयकरण घटनाओं को मैन्युअल रूप से मापने-दीवार मांसपेशी सेल5. यह सभी माइक्रोस्कोप और कैमरा सेटिंग्स (लेंस और ताल, फिल्टर, जोखिम समय, संकल्प, लेजर तीव्रता, लाभ, आदि) प्रयोगों भर में लगातार रखने के लिए आवश्यक है. सभी सेटिंग्स पर ध्यान दिया जाना चाहिए ।
    5. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए या तो छात्र t-परीक्षण (दो समूहों के बीच तुलना) या ANOVA (एकाधिक समूहों के बीच तुलना) के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए p < ०.०५ के रूप में महत्वपूर्ण5,17 . दो तरह की तुलना के लिए छात्र का t-परीक्षण (p < ०.०५ महत्वपूर्ण माना जाता है) का उपयोग करें । एकाधिक तुलना के लिए, पोस्ट हॉक Bonferroni परीक्षण द्वारा सही किया गया एकल फ़ैक्टर (ANOVA) प्रसरण विश्लेषण का उपयोग करें । हम प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए कम से 50-70 पशुओं या 30-50 शरीर दीवार मांसपेशी कोशिकाओं का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं । प्रयोग को कम से तीन बार दोहराएं ।

3. चूहों में Mitophagy का पता लगाना

नोट: चूहों में mitophagy का पता लगाने के लिए पिछले तरीकों बोझिल, असंवेदनशील थे, और यों तो मुश्किल है । एक ट्रांसजेनिक माउस फ्लोरोसेंट रिपोर्टर Keima (एमटी-Keima) के mitochondrial-लक्षित रूप व्यक्त मॉडल अब शारीरिक और mitophagy की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला में pathophysiological के स्तर का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

  1. Euthanize एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर चूहों14
  2. अंग में पिन का उपयोग कर कार्य मंच के लिए माउस (ventral पक्ष ऊपर) सुरक्षित. कम पेट में एक चीरा microsurgery कैंची और संदंश का उपयोग कर जिगर को बेनकाब करने के लिए24। जिगर का एक टुकड़ा काट (उदा, 1 × 1 × 1 सेमी पर सही पालि का एक टुकड़ा) microsurgery कैंची और संदंश का उपयोग कर ।
    नोट: चूहों में mitophagy का पता लगाने जटिल है और माउस शरीर रचना विज्ञान और अत्यधिक निपुण माउस हैंडलिंग और माउस सर्जरी पर ज्ञान की आवश्यकता है. यह प्रोटोकॉल इस विधि पर मूल, कुंजी चरण प्रदान करता है, और अधिक विस्तृत विधि24उपलब्ध है ।
  3. बर्फ पर एक धातु की थाली पर जिगर का नमूना प्लेस तेजी से ऊतक शांत करने के लिए । के रूप में जल्दी संभव के रूप में ठंड धातु की थाली और प्रक्रिया पर ऊतक रखें । बेहतर, विच्छेदन के 1 ज के भीतर का उपयोग करें ।
  4. घुमावदार संदंश का उपयोग कर जिगर के नमूने लिफ्ट और बर्फ ठंडा 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर के साथ कुल्ला ।
  5. एक रंग की चंमच अंत का उपयोग कर बर्फ पर एक पेट्री डिश (Ø १०० mm) के लिए जिगर स्थानांतरण ।
  6. 0.5-1 मिमी मोटी एकल बढ़त ब्लेड का उपयोग वर्गों में हाथ से जिगर का नमूना काट ।
  7. ध्यान से ऊतक वर्गों microsurgery संदंश का उपयोग कर एक गिलास नीचे पकवान को हस्तांतरण ।
  8. ध्यान से जिगर खंड सेट संदंश के साथ नीचे समतल करने के लिए ।
  9. ठंड 1x पंजाबियों की 3-5 बूंदों के साथ कटा हुआ जिगर को कवर ।
    नोट: DAPI धुंधला कुछ ऊतकों (जैसे, मस्तिष्क)24में ब्याज के क्षेत्र की पहचान करने के लिए सिफारिश की है । lysosome के साथ लाल मीट्रिक टन-Keima संकेत के सह-स्थानीयकरण को मान्य करने के लिए, लाइसोसोमल रंजक, जैसे dextran झरना नीला और lysosensor,24का उपयोग किया जा सकता है ।
  10. दो अनुक्रमिक उत्तेजित24के माध्यम से फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत ऊतक वर्गों छवि । दो इमेजिंग चैनल सेट: "ग्रीन" मीट्रिक टन-Keima चैनल (उत्तेजना ४५८ एनएम, उत्सर्जन 570-695 एनएम रेंज) और "लाल" मीट्रिक टन-Keima (उत्तेजना ५६१ एनएम, उत्सर्जन 570-695 एनएम रेंज) । प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच इमेजिंग सेटिंग्स बनाए रखें । अधिक कुशल इमेजिंग के लिए, एक बार में दो जानवरों का विश्लेषण ।

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Representative Results

मानव कोशिकाओं में Mitophagy का पता लगाने:

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए मानव हेला कोशिकाओं को एमटी-Keima प्लाज्मिड के साथ transfected गया । स्वस्थ कोशिकाओं mitophagy (आरएफपी, ५६१ एनएम) की कुछ घटनाओं के साथ एक अच्छी तरह से आयोजित mitochondrial नेटवर्क (GFP, ४८८ एनएम) का प्रदर्शन किया । हालांकि, एक mitochondrial unयुग्मक FCCP (3 एच के लिए 30 µ एम) के साथ इलाज कोशिकाओं mitophagy घटना (चित्र 1a) में एक गहरा वृद्धि का प्रदर्शन किया. Mitophagy भी LAMP2 और COXII (आंकड़ा 1b) के बीच सह स्थानीयकरण का उपयोग कर मापा गया था.

C. एलिगेंस में Mitophagy का पता लगाना

हम शरीर की दीवार की मांसपेशी कोशिकाओं की जांच की ट्रांसजेनिक सूत्रकृमि व्यक्त DsRed के साथ जुड़े रेनिन-1 और या तो mtRosella या डीसीटी-1 GFP के तहत सामांय और mitophagy-उत्प्रेरण स्थितियों जैसे oxidative के साथ जुड़े हुए तनाव । ट्रांसजेनिक पशु paraquat (2 दिनों के लिए 8 मिमी) के संपर्क में थे । Mitophagy प्रेरण mtRosella प्रतिदीप्ति की घटी हुई GFP/DsRed अनुपात (चित्र 2a) द्वारा दर्शाई गई है । साथ ही, डीसीटी-1 के बीच सह-स्थानीयकरण ईवेंट्स की उंनत संख्या:: GFP और DsRed:: रेनिन-1 संकेतों mitophagy तनाव (चित्र 2 बी) के उत्तर में oxidative उत्तेजना का प्रतीक है ।

mt-Keima चूहों का उपयोग करके Mitophagy का पता लगाना:

vivo mitophagy में इमेजिंग विश्लेषण सामांय और pathophysiological स्थितियों में mitophagy में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, विभिन्न अंग ऊतकों में mitophagy घटना, जैसे जिगर और सेरिबैलम (चित्रा 3), फोकल mitophagy के साथ visualized किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. मानव कोशिकाओं में mitophagy का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न तरीकों. () मानव हेला कोशिकाओं तीन दिनों के लिए mt-Keima प्लाज्मिड के साथ transfected थे, इमेजिंग द्वारा दोनों ४८८ एनएम और ५६१ एनएम पर पीछा किया । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, ceflls FCCP (30 µ एम) 3 एच इमेजिंग करने से पहले के साथ इलाज किया गया । () LAMP2 (आरएफपी) और COXII (GFP) के साथ दाग मानव प्राथमिक fibroblasts की छवियां । (C) एंटी-TOM20 (लाल) और एंटी-LC3 (हरा) एंटीबॉडी के साथ सना हुआ मानव fibroblasts की छवियां । दाईं ओर पट्टियां mitochondria के readout को दिखाते हैं-autophagosomes के साथ स्थानीयकृत । सह स्थानीयकरण ऊर्जावान तनाव से वृद्धि हुई है (ग्लूकोज मुक्त गैलेक्टोज मीडिया) और लाइसोसोमल अवरोधकों के अलावा E64d और Pepstatin ए (EP) के लिए 24 एच. (A) के लिए प्रतिनिधि स्केल बार्स, (B), और (C) पिछले पर लेबल किए गए है प्रत्येक पैनल का आंकड़ा, स्वतंत्र रूप से । मात्रात्मक डेटा मतलब ± S.E.M. में दिखाया गया है * * *p < ०.००१; t-परीक्षण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. C. एलिगेंसमें mitophagy का पता लगाने में vivo . () ट्रांसजेनिक सूत्रकृमि व्यक्त mtRosella शरीर में दीवार मांसपेशी कोशिकाओं 8 मिमी paraquat के साथ इलाज किया गया । Mitophagy उत्तेजना ph-संवेदी GFP के बीच घटी हुई अनुपात से ph-असंवेदनशील DsRed (n = ५०; * * *p < ०.००१ का प्रतीक है; t-परीक्षण) । ऐरोहेड बाहर आंत्र autofluorescence बिंदु । स्केल पट्टियां निरूपित 20 µm. अधिग्रहण विवरण: एक्सपोजर टाइम, २०० ms; इसके विपरीत, मध्यम । छवियां एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । मात्रात्मक डेटा मतलब ± S.E.M. मूल्यों में दिखाया जाता है । () ट्रांसजेनिक सूत्रकृमि सह व्यक्त mitophagy रिसेप्टर डीसीटी-1 GFP के साथ एक साथ जुड़े autophagosomal प्रोटीन रेनिन-1 शरीर में DsRed के साथ जुड़े-दीवार मांसपेशी कोशिकाओं 8 मिमी paraquat को उजागर किया गया. Mitophagy प्रेरण सह GFP और DsRed संकेतों के स्थानीयकरण का प्रतीक है (छवियों के प्रत्येक समूह के लिए डीसीटी-1 के शीर्ष पर हरे रंग में दिखाया गया है, नीचे लाल रंग में, और नीचे एक विलय छवि; n = 30; * * *p < ०.००१; t-परीक्षण) । बिक्री सलाखों के 20 µm. अधिग्रहण विवरण: संकल्प, १,०२४ X १,०२४ निरूपित; मास्टर लाभ, Track1:५६२ और Track2:७३०; उत्सर्जन फिल्टर, Track1 Channel1:६३९ एनएम और Track2 Channel2:५१९ एनएम; लेजर तीव्रता, Track1 (५४३ एनएम): १२.९% और Track2 (४८८ एनएम): ३९.४% । छवियां एक 40X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । मात्रात्मक डेटा मतलब ± S.E.M. में दिखाए जाते है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3. vivo में mitophagy का पता लगाने में एमटी-Keima ट्रांसजेनिक चूहों । प्रतिनिधि छवियों के मीट्रिक टन-Keima संकेतों में जिगर (ऊपरी) और सेरिबैलम क्षेत्र (सहित Purkinje कोशिकाओं, निचले पैनल) के एक मीट्रिक टन-Keima माउस (४५८ एनएम, हरा; ५६१ एनएम, लाल). स्केल बार नोट 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

mitophagy का सटीक माप तकनीकी रूप से मांग कर रहा है । यहां, हम कई मजबूत तकनीक है जो mitophagy और सबसे आम प्रयोगशाला प्रयोगात्मक मॉडल में mitophagy स्तर के ठहराव के दोनों गुणात्मक पता लगाने के लिए अनुमति प्रस्तुत किया है ।

replicable डेटा प्राप्त करने के लिए, कम से तीन जैविक दोहराव के साथ एक प्रायोगिक डिजाइन आवश्यक है । प्रयोग और विश्लेषण में शामिल सभी शोधकर्ताओं प्रयोगात्मक समूह की पहचान के लिए अंधा किया जाना चाहिए । इसके अलावा, इमेजिंग क्षेत्रों छवि अधिग्रहण के दौरान बेतरतीब ढंग से चुना जाना चाहिए । सेल कल्चर और C. एलिगेंस अध्ययनों के लिए, कम से तीन जैविक दोहरावों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए । मीट्रिक टन-Keima माउस अध्ययन के लिए, यह सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए चूहों की एक पर्याप्त संख्या का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. स्तनधारी कक्षों के लिए, प्रत्येक प्रयोग के लिए 30-100 कक्षों का विश्लेषण करें, और कम से 3 विभिंन प्रयोग चलाएं । इन चरणों में गुणवत्ता नियंत्रण replicable परिणाम सक्षम करता है । खमीर में mitophagy का पता लगाने के हाल ही में25कहीं संक्षेप किया गया है ।

इन विट्रो mitophagy डिटेक्शन तकनीकों में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । अभिकर्मक दक्षता, जो रिएजेंट और डीएनए की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, मीट्रिक टन-Keima प्रोटीन के अभिकर्मक के दौरान महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, विभिंन स्थितियों में अभिकर्मक दक्षता का अनुकूलन (उदा, विभिंन कक्ष रेखाओं का उपयोग करना) आवश्यक है । LAMP2/COXII विधि के लिए, एंटीबॉडी विशिष्टता और इष्टतम प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने गुना छवियों की गुणवत्ता को प्रभावित और प्रयोगों शुरुआत से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए । एक ही उच्च सामग्री इमेजिंग विधि है, जहां एंटीबॉडी गुणवत्ता और कमजोर पड़ने महत्वपूर्ण है पर लागू होता है । स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्रणाली और अनुकूलित विश्लेषण प्रोटोकॉल इमेजिंग और कम से १,५०० कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है/हालत है, जो परिणाम अत्यंत मजबूत करने के लिए अन्य की तुलना में vivo इमेजिंग आधारित विधियों में बनाता है. साथ ही, विश्लेषण प्रोटोकॉल और mitochondrial पैरामीटर जैसे लंबाई और कुल क्षेत्र कक्ष के आधार पर, जो mitophagy अनुसंधान में अत्यधिक उपयोगी है पर डेटा प्रदान करता है ।

कुछ मामलों में, यह TOMM20 के रूप में mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन के साथ LAMP2 के colocalization परख करने के लिए अनुशंसित नहीं है । mitophagy के बहुत प्रारंभिक दौर में शामिल है mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन की Parkin-मध्यस्थता ubiquitination, TOMM20 और Mitofusin 1 (MFN1) सहित. Parkin conjugates K48-लिंक्ड ubiquitin चेन, जो 26S proteasome द्वारा प्रोटीन के क्षरण को बढ़ावा देने सहित इन प्रोटीन पर एकाधिक अलग ubiquitin चेन लिंकेज । इसलिए, इन ubiquitinated mitochondrial बाहरी झिल्ली प्रोटीन अभी भी नीचा किया जा सकता है mitophagy6अवरुद्ध है, भले ही । यह डेटा तिरछा कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप समग्र डेटा व्याख्या में झूठी सकारात्मकता आई है. इसके अलावा, mitochondrial डीएनए (mtDNA nucleoids) के उंमूलन mitophagy का एक दूसरा संकेतक है, और यह मात्रा द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक विरोधी डीएनए एंटीबॉडी6का उपयोग कर सकते हैं ।

C. एलिगेंस में vivo mitophagy में निगरानी के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम नीचे सूचीबद्ध हैं:

1. नई प्लेटों के लिए ट्रांसजेनिक पशुओं का अंतरण हर 24 – 48 एच को संतति की वृद्धि से बचने की सिफारिश की जाती है, जो मिश्रित जनसंख्या या भुखमरी की ओर ले जाती है, जो स्वयं mitophagy को ट्रिगर कर सकती है । इसलिए भूखे-प्यासे सूत्रकृमि का प्रयोग करना चाहिए ।

2. Levamisole एक हल्का संवेदनाहारी है जिसका प्रयोग सूत्रकृमि मैटीरियल करने के लिए किया जाता है । निश्चेतक से बचें जो सोडियम azide जैसे mitochondrial गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं । सोडियम azide ब्लॉक mitochondrial श्वसन श्रृंखला और perturbs ऊर्जा उत्पादन के घटकों, mitochondrial और oxidative तनाव के लिए अग्रणी । इस प्रकार, सोडियम azide mitophagy ट्रिगर करने की संभावना है ।

3. नमूनों को सूक्ष्म परीक्षा के दौरान बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । इसलिए, पानी के बजाय M9 बफर का उपयोग अनुकूल परासरणी परिस्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है ।

4. C. एलिगेंसमें उम्र के साथ आंत्र autofluorescence बढ़ता है । इस प्रकार, शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं आंत के करीब सूक्ष्म परीक्षा के दौरान बचा जाना चाहिए ।

5. अगर paraquat mitophagy प्रेरित करने के लिए विफल रहता है: a. कीड़े पर paraquat जोखिम समय बढ़ाएँ, बी. paraquat एकाग्रता बढ़ाएं, या c. समय के साथ अपनी दक्षता में गिरावट के बाद से paraquat का एक ताजा काम समाधान तैयार करें ।

6. यदि वृद्धि हुई matricidal सेने paraquat को उजागर कीड़े में मनाया जाता है, या तो: a. paraquat उपचार की अवधि कम, b. paraquat एकाग्रता को कम, सी. fluorodeoxyuridine (FUdR) के साथ अनुपूरक प्लेट्स (अंतिम 100-400 माइक्रोन की एकाग्रता), डीएनए संश्लेषण की एक अवरोध करनेवाला है कि अंडे सेने, या घ. पुराने कीड़े में प्रयोग (जैसे, 4 दिन पुराने कीड़े) आचरण रोकता है ।

इस कार्यविधि का वर्णन करता है में इमेजिंग mitophagy के लिए चरणों का उपयोग करते हुए जिगर मीट्रिक टन-Keima ट्रांसजेनिक चूहों, के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । मस्तिष्क और जिगर के अलावा अंय ऊतकों मीट्रिक टन-Keima प्रणाली14का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है । दोहरे उत्तेजना अनुपात यकृत ऊतक में इमेजिंग दो अनुक्रमिक उत्तेजित के माध्यम से प्राप्त की है । सभी छवियों को नए सिरे से उत्पाद के अंगों से प्राप्त किया जाना चाहिए । ऊतकों की जांच ठंडा रखा जाना चाहिए और जितनी जल्दी हो सके संसाधित । लिवर स्लाइस किसी भी उम्र में प्राप्त किया जा सकता है । जब इमेजिंग mitophagy, एक अंग के लिए सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान लेजर शक्तियों और जोखिम समय का अनुकूलन । लेजर शक्ति ंयूनतम उत्पादन है कि मीट्रिक टन-Keima संकेत14के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है पर सेट किया जाना चाहिए । हालांकि, mt-Keima ट्रांसजेनिक चूहों के लिए कुछ सीमाएं हैं । Keima की अस्थिरता के साथ ही निर्धारण के तहत लाइसोसोमल झिल्ली भर में एक पीएच ढाल के नुकसान के कारण, इस माउस मॉडल क्रायो-अनुभाग और immunohistochemistry के लिए उपयुक्त नहीं है । एक और सीमा है कि मीट्रिक टन-Keima, या इस प्रोटीन के मैट्रिक्स समुच्चय, अज्ञात mitochondrial या सेलुलर कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं, भले ही यह mitochondrial ऑक्सीजन की खपत दर14परिवर्तन नहीं करता है । इसके अलावा, समय और लागत मीट्रिक टन Keima चूहों के साथ जुड़े यह aforementioned सेल संस्कृति और सी. एलिगेंस तरीकों से उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए कम वांछनीय प्रदान करते हैं । यहां बताए गए तरीकों के अलावा, मात्रात्मक रूप से एमटी-Keima चूहों में mitophagy अध्ययन करने के अन्य तरीके पश्चिमी ब्लाटर या FACS शामिल हैं । नोट करने के लिए, मीट्रिक टन-Keima ट्रांसजेनिक चूहों के अलावा, वहाँ एक और mitophagy माउस मॉडल है, "मिळो-QC", एक पीएच के साथ एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल-संवेदनशील फ्लोरोसेंट mitochondrial सिग्नल26. जटिलता और mitophagy की गतिशीलता के कारण, हम निष्कर्षों को मजबूत करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और वेस्टर्न सोख्ता के रूप में अन्य आम mitophagy का पता लगाने के तरीकों, के साथ aforementioned प्रतिदीप्ति तरीकों के संयोजन की सिफारिश ।

इस तरह के उन उल्लेख के रूप में नए mitophagy का पता लगाने की तकनीक का विकास व्यापक अनुप्रयोगों, mitophagy के यंत्रवत अध्ययन से उच्च प्रवाह दवा स्क्रीन करने के लिए होगा । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि mitophagy आसानी से दोनों अंतर्जात और exogenous उतार चढ़ाव (जैसे, कोशिका घनत्व, भुखमरी, हाइपोक्सिया, आदिके रूप में सेल संस्कृति की स्थिति से प्रभावित है.) 1 , 5 , 8. इसलिए, यह सर्वोपरि है कि सभी प्रयोगों के लिए एक ही प्रायोगिक शर्तें रखी जाती हैं. यह दोनों विट्रो में और vivo अध्ययनों में mitophagy स्थिति की सही व्याख्या को सत्यापित करने के लिए अलग mitophagy खोज विधियों का एक संयोजन का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । mitophagy के तंत्र की आगे की समझ, यहां उल्लेख किया तकनीकों के माध्यम से प्राप्त की, mitophagy का पता लगाने के नए, और अधिक सटीक तरीकों के विकास के लिए अनुमति देगा ।

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Disclosures

बोह्र लेबोरेटरी में ChromaDex और ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन के साथ CRADA व्यवस्था की गई है ।

Acknowledgments

हम एमटी-Keima प्लाज्मिड और एमटी-Keima एकीकृत हेला कोशिकाओं को बांटने के लिए डॉ॰ अतसुशी Miyawaki और डॉ॰ रिचर्ड जे Youle का धन्यवाद करते हैं । हम राघवेंद्र ए Shamanna और डॉ दबोरा एल Croteau पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धंयवाद । इस शोध को NIH (VAB), वृद्धावस्था पर राष्ट्रीय संस्थान के अंदर रिसर्च प्रोग्राम के साथ-साथ एक 2014-2015 और 2016-2017 निया अंतरराज्यीय प्रयोगशाला अनुदान (EFF, VAB) द्वारा समर्थित किया गया. EFF HELSE SOR द्वारा समर्थित था-OST RHF (परियोजना नहीं: २०१७०५६) और नॉर्वे के अनुसंधान परिषद (परियोजना नहीं: २६२१७५) ।

लेखक योगदान:

EFF पांडुलिपि डिजाइन और मसौदा तैयार किया; केपी, एनएस, EMF, आरडीएस, JSK, सैक, YH, और ईडी ने कागज के विभिन्न वर्गों को लिखा; NT, जेपी, हेमवती, और VAB पांडुलिपि संशोधित और विशेषज्ञता प्रदान की है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar
#CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

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References

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (5), 308-321 (2016).
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  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61, (5), 654-666 (2016).
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