Author Produced

Total aislamiento y cultivo In Vitro de Intramolluscan etapas de la humano platija de la sangre Schistosoma Mansoni

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Este artículo describe un protocolo para el aislamiento axénico a gran escala y la colección de miracidia nadan de la humana platija de la sangre mansoni de Schistosoma y su posterior procesado para la introducción en cultivo en vitro .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Humanas sangre trematodos, Schistosoma spp., tienen un ciclo de vida complejo que comprende las fases del desarrollo asexuales y sexuales dentro de un caracol intermedio y mamífero huésped definitivo, respectivamente. La capacidad para aislar y sostener las etapas del ciclo de vida diferente bajo condiciones de cultivo en vitro ha facilitado enormemente las investigaciones de los mecanismos celulares, bioquímicos y moleculares de regulación de host, el desarrollo y crecimiento del parásito interacciones. Transmisión de la esquistosomiasis requiere reproducción asexual y el desarrollo de múltiples etapas larvales en el host de caracol; desde el miracidium contagiosa, a través de esporocisto primaria y secundaria, a la etapa final de cercarial que es contagioso a los seres humanos. En este trabajo presentamos un protocolo paso a paso para la eclosión total y aislamiento del mansoni del schistosoma miracidia de huevos obtenidos de hígados de ratones infectados y su posterior introducción en cultivo en vitro . Se prevé que el protocolo detallado anime a nuevos investigadores y ampliar este importante campo de investigación de esquistosoma.

Introduction

El ser humano sangre platijas Schistosoma spp., son los agentes causativos de la esquistosomiasis, una enfermedad tropical desatendida que afecta a un estimado de 230 millones de personas en todo el mundo1. La especie más difundida, Schistosoma mansoni, se distribuye geográficamente en América del sur, el archipiélago Caribe, Oriente Medio y África subsahariana2. El ciclo de vida de S. mansoniy otros esquistosomas, es complejo, que implica un mamífero hospedador definitivo y los caracoles de agua dulce del género Biomphalaria que sirven como hospederos intermediarios obligados.

S. mansoni macho y hembra adulto del gusano pares viven en las venas mesentéricas posteriores de la reproducción del huésped mamífero, lo que resulta en la liberación de huevos embrionados (ova) que se metieran en las pequeñas vénulas de la mucosa intestinal. Huevos se rompe a través de las paredes del recipiente, migran a través de tejido mucoso y finalmente entrar en la luz intestinal donde son anuladas con las heces. Cuando óvulos entran las larvas nadan libremente y de agua dulce (miracidia) Portilla, deben, en poco tiempo, encontrar un caracol Biomphalaria adecuado para infectar a fin de continuar su ciclo de vida. Este proceso de infección consiste en miracidial accesorio a la superficie de cuerpo exterior de caracol seguida por la penetración activo y la entrada de la larva en el host. Pronto después de la entrada, el miracidium comienza a arrojar sus placas epidérmicas ciliadas externas como forma un sincitio se convertirá en la nueva superficie exterior (tegumento) de la siguiente etapa larval, el sporocyst primario o madre. A través de reproducción asexual, cada sporocyst primario produce y libera una segunda generación de esporoquistes, denominados secundarios o esporoquistes de hija, que a su vez, generaran y liberan grandes cantidades de la fase final de la intramolluscan, la cercaria3 . A escapar de la sede de caracol, cercariae nado libre es capaces de conectar a y penetrar directamente en la piel de un humano o de otro huésped mamífero adecuado. Al entrar en su nuevo host, cercariae transforma a la etapa de parásito esquistosómula y invade el sistema vascular. A su vez, migran a los pulmones y luego a la vena hepática donde maduran a gusanos adultos, forman pares masculinos y femeninos y viajar a las venas mesentéricas para completar su ciclo de vida.

Exitoso intramolluscan o el desarrollo de la "fase Caracol" de esquistosomas larvales es esencial para la continuación del ciclo de transmisión humana de host a host. De importancia crítica es la entrada siguiente períoda del miracidium nadan libremente en el host de caracol y su transformación temprana a la etapa del sporocyst primario. Dependiendo de la compatibilidad fisiológica e inmunológica entre huésped y parásito, es durante esta fase de desarrollo larval inicial éxito o el fracaso para establecer infecciones es determinado4,5,6 . Desarrollo posterior de esporocisto primaria capaz de producir asexualmente esporoquistes secundarios, que luego generan cercariae infeccioso en humanos, además requieren un entorno de host fisiológica permisiva que ofrece para todos los del crecimiento del parásito y necesidades de reproducción.

Hasta la fecha, poco se sabe sobre el subyacente fisiológico, bioquímico y moleculares procesos controlar las interacciones de schistosome caracol, especialmente las moléculas y vías implicados en regulación de la reproducción y desarrollo larval, o modulación de respuestas inmunitarias del huésped. Acceso a un gran número de estos estadios larvarios en condiciones en vitro cultura que permiten manipulación experimental facilitaría enormemente el descubrimiento de vías de desarrollo y los mecanismos subyacentes del crecimiento celular, diferenciación y la reproducción. Crítico parásito vías o mecanismos, identificados a través de la experimentación en vitro , podrían utilizarse para interrumpir el crecimiento/reproducción larvaria en el host de caracol, o caracol huésped inmune mecanismos implicados en el reconocimiento y eliminación de miracidial o sporocyst etapas.

En este artículo y el vídeo de presentación, ofrecemos una descripción detallada de un método para aislar gran cantidad de nado libre S. mansoni miracidia para la introducción en cultivo en vitro que luego puede ser sometida a seguimiento experimental manipulación (ver figura 1 para una descripción esquemática del flujo de trabajo de protocolo). Aunque se han descrito procedimientos similares previamente7,8,9, sentimos que un protocolo detallado sería útil a los investigadores que deseen emplear este modelo para abordar preguntas todavía sin respuesta relacionadas con intramolluscan desarrollo larvario, proliferación celular e interacciones inmunes schistosome caracol. Además, este enfoque se podría adaptar fácilmente para el aislamiento de huevos de otros trematodos médicamente importantes tales como vejiga-vivienda S. hematobium, hígado trematodos o tremátodos del pulmón.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales y cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité de uso de la Universidad de Wisconsin-Madison bajo protocolo y atención institucional del Animal no. V005717. El siguiente protocolo consiste en trabajar en un centro de bioseguridad nivel 2 (BSL2) para patógenos humanos, aunque ninguna de las etapas de esquistosoma, representadas en este protocolo son infecciosas para los seres humanos o de otros mamíferos. Seguir las políticas institucionales para el manejo de grupo de riesgo 2 (RG2) patógenos humanos.

Nota: Utilizamos mujer ratones Swiss-Webster (6 - semanas de edad) debido a su mayor susceptibilidad a la infección10, produciendo así mayores cargas de huevo. Tucker et al. , describen los protocolos de infección del ratón y caracol utilizados en este modelo de sistema11. La Tabla de materiales enumera todos los equipos específicos, materiales, reactivos y fuentes animales para llevar a cabo este protocolo experimental.

1. proceso de hígados infectados

  1. Eutanasia a ratones, post-infección 6-7 semanas, por asfixia de CO2 (tasa de 10-30% del volumen de la cámara por minuto). Ratones de monitor para el cese de la respiración y del latido del corazón.
    Nota: Por lo general, a 20 ratones pueden procesarse en un momento dado.
  2. Después de la transferencia sacrificaron ratones a un gabinete de bioseguridad, poner ratones en sus espaldas y rocíe las superficies ventrales con etanol al 70%. Remojar durante 1 minuto.
  3. Apriete y tire hacia arriba la piel del abdomen inferior y en toda la base de la piel que mantiene pellizcada más cercana al abdomen con tijeras quirúrgicas estériles. Tire la piel corte anterior (es decir, hacia la cabeza) para revelar el hígado. Tenga en cuenta que el hígado agrandado y manchado debido a una respuesta granulomatosa inducida por huevo (figura 2A).
  4. Retirar el hígado y colocarlo en un vaso que contiene 200 mL de estéril solución de NaCl del 1,2% que contiene pluma/strep.
  5. Repita los pasos 1.3 y 1.4 con los ratones restantes.
    Nota: Veinte ratones generalmente se procesan en una sola cosecha.
  6. Coloque los hígados en una placa Petri estéril y retirar tejidos de hígado sin grasa/conectivos con pinzas estériles.
  7. Transferencia ajustado/limpiar hígado a una botella de centrífuga estériles de 250 mL que contiene ~ 200 mL de solución estéril de NaCl de 1.2% con pluma/strep.
  8. Enérgicamente sacudir la botella que contiene el hígado y, con una pipeta desechable estéril, retire la superficie excesiva espuma/flotación ruina. Poco a poco retirar la solución salina restante en un recipiente o fregadero que contiene 1% cloro (desinfectante).
  9. Añadir ~ 200 mL de solución salina fresca a los hígados y repita el paso 1.8 tres veces más.

2. hígado extracción y miracidial aislamiento

  1. Coloque los hígados en una taza pequeña batidora de acero inoxidable estéril y añadir 2 mL de solución de NaCl al 1.2% (figura 2B).
  2. Cubra la taza con papel de aluminio y una placa de Petri para evitar derrames y mezclar durante 1 minuto alternando baja y alta velocidad (20 s baja velocidad/10 s velocidad; repetición) (figura 2).
  3. Distribuir la suspensión de hígado mezclada en botellas de centrífuga estériles de 250 mL (para 20 hígados usan 4 botellas).
  4. Añadir solución salina estéril con antibióticos a ~ 200 mL botella de volumen total. Pesa/balanza botellas antes de centrifugar.
  5. Centrifugar el hígado mezclado a 290 x g durante 15 min a 4 oC. suavemente retirar el sobrenadante en un recipiente con lejía antes de desecharlos.
  6. Repita los pasos del 2.4-2.5 una vez. Asegúrese de resuspender completamente el hígado sedimento antes de centrifugar.
  7. Después de descartar la última solución salina lavar (paso 2.6), agregue 200 mL de agua estéril estanque con pluma/estreptococos al tejido hepático alimentos Peletizado, agitar para Resuspender el sedimento y transferir la suspensión a un matraz aforado estéril de 1 L que ha sido completamente cubierto con aluminio papel de aluminio, excepto en la parte superior 3 cm del cuello (Figura 2D).
    Nota: Use dos botellas (= 10 hígados) cada frasco de 1 L. Agua de estanque simula el entorno natural de agua dulce necesario para estimular miracidial eclosión de los huevos.
  8. Usar agua estéril, llenar el frasco a unos 3 cm por encima de la lámina que cubre el cuello. Entonces, sin demora (como miracidia pronto comienzan a eclosionar), quitar la espuma residual y tejido hepático flotando a la superficie mediante pipeteo rápidamente hasta ~ 12 mL de agua del estanque que contenía desechos y descartarlo en un separado deseche el tubo. Vuelva a colocar con agua estéril fresca.
  9. Repetir limpieza paso 2.8, tres veces, comprobando la presencia de miracidia en el tubo de descarte. Dejar de repetición de la limpieza paso si miracidia aparece en la solución de lavado.
  10. Después del último lavado, agregue lentamente ~ 12 mL de agua tibia charca estéril (previamente calentado a 30 oC) para crear un gradiente de temperatura con agua caliente limpia y estéril en la parte superior.
    Nota: Esto se logra mejor descargando lentamente a lo largo de la parte del cuello del frasco para evitar la mezcla.
  11. Coloque una cubierta de caja de Petri pequeña sobre la apertura del frasco y brillar una luz brillante en la parte superior del matraz por encima de la cubierta de aluminio para iluminar la superficie superior del agua.
    Nota: Normalmente, dentro de 5-10 minutos, nadando miracidia, atraído por la luz, se concentrará en gran número dentro de los primeros 2-3 cm de agua de los estanques (Figura 3A).

3. Miracidial cosecha y cultivo

  1. Cuando miracidia han acumulado en la superficie después de 10 min, utilizando una pipeta de transferencia estéril, retire ~ 8 mL de agua del estanque y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 mL estéril. Coloque el tubo que contienen miracidia en hielo.
  2. Añadir back 8 mL de agua estéril tibia por el interior del matraz volumétrico y esperar otros 10 minutos.
  3. Utilizando tubos de nuevo cada vez, repita los pasos 3.1 y 3.2 tres veces más. Después de la colecciónth 4, mantenga el tubo final en hielo durante 10 minutos permitir que el miracidia resolver. Este conjunto de tubos consta de la primera cosecha.
  4. Tubos de centrífuga que contienen miracidia 290 x g durante 1 min a 4 oC en una centrífuga refrigerada previamente enfriada.
  5. Retire inmediatamente la mayor parte del sobrenadante (~ 7 mL) teniendo cuidado de no perturbar el sedimento del parásito (figura 3B).
  6. Piscina todas la miracidia de esta primera cosecha en un tubo, luego lavar todos los tubos originales con agua estéril ~ 1 mL y añada al tubo "agrupado".
  7. Permite parásitos a reposar en hielo ~ 5 min y otra vez centrifugar los parásitos a 290 x g durante 1 min a 4 oC.
  8. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y añadir que 6-8 mL estéril Chernin equilibrada solución de sal (CBSS +; véase tabla de materiales) que contienen pluma/strep.
  9. Suspender suavemente las miracidia y alícuota en una placa de cultivo de 24 pozos (1 mL por pozo), seguido por enjuague el tubo en 6-8 mL CBSS + y añadir 1 mL de enjuague a cada pocillo. Incubar los parásitos a 26 oC normoxic condiciones. Concentraciones de miracidia aislado varían, pero generalmente promediarán ~ 7000/mL.
  10. Si los parásitos se concentran aún en la fuente de luz, repita los pasos 3.1 a 3.9 a continuar cosechando tarde eclosión miracidia pero aumentar el intervalo de tiempo entre colecciones de 15-20 minutos.
    Nota: Este nuevo conjunto de tubos representa la segunda cosecha. Sin embargo, porque miracidial números por lo general son bajos, las larvas de todos los tubos generalmente son agrupadas en una sola cultura, bien que contiene 2 mL CBSS +.
  11. En cultivo y poscosecha de 24 h, resuspender suavemente esporoquistes en sus pozos por pipeteo.
  12. Espere unos minutos para permitir que los parásitos resolver en el fondo de los pozos. Una vez que han colocado, retire con cuidado el sobrenadante (~1.5 mL), que contendrá la mayoría de las placas epidérmicas ciliadas derramada por miracidia durante transformación larvaria. Esta "transformación" sobrenadante puede desechar o incorporada a estudios de seguimiento de productos de secreción de larvas.
  13. Añadir 1,5 mL de CBSS fresco + a cada bien y suavemente la pipeta para resuspender esporoquistes. Repita el paso 3.12 si se desea más lavar o cambiar a un medio diferente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La gran mayoría de miracidia normalmente habrán sido recogida en las dos primeras "cosechas". Incubación de miracidia aislado en CEMB + desencadena el proceso de transformación de miracidio-sporocyst (Figura 4A- C). En la primera hora siguiente traslado a cultura pozos que contienen CBSS +, la mayoría de miracidia deje nadar (Figura 4A). A las 6 h en cultura, miracidia estamos activamente vertimiento sus placas epidérmicos ciliados (Figura 4B). Coincidente con este proceso de desprendimiento, las larvas forman su cubierta tegumental sincitial externo como transforman a esporocisto primaria. La mayoría de los parásitos rindiendo transformación larvaria, convirtiéndose en sporocystes totalmente formado, por cultivo después de 24-48 h en CEMB + (figura 4). Después de 4 días de la cultura en CEMB + solo, supervivencia del sporocyst puede esperarse disminución de ~ 80%. Sin embargo, macroquistes cultivan durante 1 día en CEMB + y transfieren a medio de Bge (cBge) completo para 3 días normalmente dar como resultado mejores tasas de supervivencia y larvas con una apariencia más robusta (figura 4). Viabilidad del sporocyst generalmente permanece estable entre 4 y 7 días en cBge con el continuo aumento en el crecimiento larvario durante este tiempo en la cultura en comparación con el CBSS + solo.

Figure 1
Figura 1 . Resumen de flujo de trabajo de protocolo. Resumen esquemático de los pasos más importantes en el aislamiento y cultivo de miracidia derivados de ratones infectados con la platija humana de la sangre, S. mansoni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Procesamiento de los hígados infectados. (A) ratón hígado pesadamente infectado con huevos de S. mansoni . Tenga en cuenta el tamaño agrandado, color anormal y la presencia de granulomas en el hígado infectado (derecha) comparado con un hígado normal no infectado (izquierdo). (B) lavado del ratón hígados después de transferencia a taza de la licuadora estéril de acero inoxidable. Hígados se mezclaron entonces durante un minuto utilizando lámina estéril y plato de Petri para cubrir la Copa, evitando así derrames (C). Después de mezclar, el homogeneizado de hígado, que contienen huevos, fue lavado varias veces con solución salina y resuspendió en agua estéril, antes de ser transferido a un matraz aforado de 1 L cubierto con papel de aluminio (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Recolección de S. mansoni miracidia. Activamente la natación miracidia concentrado por atracción a la luz en la parte superior del matraz volumétrico (A). A intervalos de 10 minutos, parásitos son cosechados con una pipeta y colocar a 4 ° C para inmovilizar las larvas. Miracidia son entonces lavados en CEMB + por centrifugación y recogidos en un solo tubo (B) justo antes de la distribución a los pocillos de una placa de cultivo. CEMB +; Chernin había equilibrada solución de sal (Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Transformación Miracidial esporocisto primaria y su mantenimiento en vitro . S. mansoni del schistosoma miracidia y macroquistes colocan en cultivo en vitro para diferentes tiempos post-cosecha. Miracidia recién cosechado dentro de 1 h de la cultura en CEMB + (A). Después de 6 h de la cultura, miracidia han comenzado a arrojar sus placas epidérmicos ciliados (flechas) como transforman a esporocisto primaria (B). Después de 24 h en CEMB + la mayoría de la miracidia transformaron completamente a esporocisto primaria (C). Esporoquistes se transformó en CEMB + de 24 h, luego transfirieron y mantenidos en medio de cBge por 3 días (D). Macroquistes generalmente aparecen más robustos y tienen mayores tasas de supervivencia en cultivo después de 4 días en presencia de cBge, en comparación con el CBSS + solo. CEMB +, Chernin equilibrada solución de sal; cBge medio, completa B. glabrata embrionario célula medio (véase Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Miracidia de S. mansoni, aislados y manipulados como se describe en este documento, puede infectar solamente el anfitrión intermedio del caracol y por lo tanto no representan un riesgo biológico humano durante esta fase de desarrollo larvario. Sin embargo, para evitar la exposición accidental, infección de los caracoles, debe tenerse cuidado para realizar aislamientos miracidial en una ubicación diferente de áreas donde especies de caracoles Biomphalaria susceptibles pueden ser presente o mantenido. Un cuarto separado, registrado como espacio BSL2, es altamente recomendable. Además, todo lavado soluciones utilizadas en la elaboración de hígados y aislamiento de larvas deben ser tratadas con desinfectante (por ejemplo, 1% de lejía) antes de la eliminación.

Cabe señalar que infectados de la extirpación quirúrgica de los hígados de ratones y su posterior tratamiento antes del mezclado/homogeneización se llevan a cabo en un gabinete de la seguridad biológica (BSC) en condiciones asépticas. Sin embargo, por razones prácticas (facilidad de manipulación de las muestras a granel) todos los otros procedimientos se realizan en un banco desinfectado utilizando contenedores estériles (p. ej., vasos de licuadora, frascos, botellas y tubos, pipetas de transferencia, etc.) y soluciones estériles que contengan antibióticos (solución salina, agua de estanque, CBSS). Antibióticos se añaden a las soluciones como una precaución adicional contra contaminación microbiana introducida. Además, durante el aislamiento miracidial y cosecha pasos (secciones 2 y 3 del Protocolo), una cubierta de la pequeña caja de Petri se coloca sobre el frasco para minimizar la contaminación externa durante la extracción inicial de residuos de espuma, hígado y posterior traslado de miracidia concentrado del frasco a tubos de centrífuga.

Por lo general, cosechamos miracidia de hígado de ratón infectado 20 en un solo lote, de la cual estimamos larvas rendimientos de cerca de 5000 larvas por hígado. Sin embargo, los rendimientos pueden variar considerablemente dependiendo de la intensidad de la infección de ratones individuales, resultando en variación de lote a lote en las recuperaciones miracidial. Aislamiento puede realizarse con menos hígado inicial, aunque el método que hemos descrito es aplicable generalmente para hígados 10-20. Cuando se procesan los 20 hígados, después de la final resuspensión de los pellets de hígado en agua estéril (protocolo sección 2, paso 2.7), las suspensiones deben distribuirse igualmente en dos matraces de 1000 mL (2 botellas/frasco). Si se usan 10 hígados o menos, la original homogenados de hígado (protocolo sección 2, paso 2.3) pueden ser distribuido a 2 botellas y lavaron suspensiones transferidas a un matraz aforado solo para su posterior procesamiento. Uno o 2 hígados también se pueden procesar, pero cantidades (volúmenes) de la extracción, lavado y tramando soluciones deben reducirse proporcionalmente, con final lavado de sedimento en el agua del estanque se transfieren a un matraz aforado de 10 mL cubierto de papel de aluminio para concentrar miracidia.

Con el fin de maximizar miracidial rendimientos con un mínimo de contaminación de desechos del hígado, también es importante realizar los lavados de agua de estanque (protocolo sección 2, medidas 2.7-2.9) como rápidamente y eficientemente como sea posible. Una vez que los huevos están expuestos a agua de estanque, miracidial eclosión ocurre pronto después de eso, aunque antes de aspecto larval en la fuente de luz en el cuello del frasco puede variar de 5-20 min después de la eclosión comienza. Para limitar la pérdida de parásitos durante la limpieza de agua de estanque pasos es crucial comprobar visualmente cada agua lavan miracidia que llegan temprano en la capa de agua superior del cuello del matraz. Además, una vez miracidia se transfieren a tubos de 15 mL y se colocan en hielo, Cesar la actividad de natación y asentarse en el fondo del tubo. Sin embargo, después de la centrifugación para que sedimenten las larvas (sección 3, pasos 3.4-3.5) miracidia otra vez comenzará a nadar si agua caliente. Por lo tanto, es importante quitar el agua rápidamente, pero sin perturbar el pellet o pipeteo por parásitos de la natación.

Como se mencionó anteriormente, rendimientos de miracidia aislado pueden variar dependiendo de la consistencia de los protocolos de infección inicial y el número de pares del gusano adulto presentes en los ratones (intensidad de infección). Miracidia son fuertemente fototropismo y la mayoría (80-90%) se concentra en la fuente de luz durante el primer período de cosecha. El 10-20% restante de miracidia seguirá portilla y más lentamente se acumulan durante el período de cosecha. Más (> 95%) miracidia introducido en cultura y mantenido a 26 oC en CEMB + medio habrán transformado a esporocisto primaria dentro de las 24-48 h de cultivo. En este momento, viabilidad larvaria suele ser > 90%. Después de 4 días en CEMB + viabilidad solo cae considerablemente (70-80%). Sin embargo, cambiar el medio de cultivo de CEMB + para completar Bge media 24 h siguientes cultivo CBSS inicial resulta en mayores tasas de supervivencia y un crecimiento más robusto. Habitualmente mantenemos a corto plazo culturas sporocyst normoxic condiciones. Sin embargo, macroquistes son muy sensibles a los niveles de oxígeno y especialmente a especies reactivas de oxígeno que pueden infligir daño oxidativo nocivo7. C.J. Bayne4 y otros han reportado que la salud y viabilidad de los macroquistes en vitro general se mejoran significativamente cuando las culturas se mantienen bajo condiciones hipóxicas. Niveles de oxígeno bajos pueden obtenerse por gasear (con nitrógeno) individuales pueda cerrar frascos, o por enriquecimiento de nitrógeno de la fase de gas de la incubadora4.

Como citados arriba, métodos para aislar y cultivar de schistosome axénicos miracidia y esporoquistes se han descrito anteriormente. Se reconoció desde el principio que miracidial fototropismo se podría utilizar para atraer y concentrar larvas nadando y eso miracidia aislado podría ser rápidamente inmovilizado en hiperosmóticos soluciones salinas (entre 120-160 mOs/Kg)8. Se observó además que el mantenimiento en soluciones salinas resultó en la transformación de miracidia a esporocisto primaria, la primera etapa larval intramolluscan9,12. Medios complejos también se han formulado para apoyar el crecimiento a largo plazo en vitro y el desarrollo de la S. mansoni sporocyst etapas9,13,14,15, así como las células derivados desde el host de caracol Biomphalaria glabrata16. Estas formulaciones incorporaron diversos medios de comunicación comerciales y pueden haber sido complementadas con aminoácidos, sales, lípidos, agentes reductores y azúcares. Formulaciones de medios completo también incluyen bovino fetal inactivado con calor o suero de caballo a diferentes concentraciones. Nos hemos encontrado que adecuada inactivación de calor (HI) fue crucial para la supervivencia del sporocyst y desarrollo a largo plazo en vitro. Encontrado incubación del suero (botellas descongelados, 100 mL) en un baño de agua con 60 oC durante 60 min, con suave mezcla cada 10 minutos para la calefacción uniforme era más eficaces. Además, generalmente probamos varios lotes de suero de un proveedor prospectivo para la compatibilidad de cultivo larval. Por último, el establecimiento de la línea celular de moluscos auténtico primer (y actualmente solamente), la línea de celular (Bge) embrionaria B. glabrata por Hansen16 fue un gran avance que facilita significativamente avances en larvas schistosome esfuerzos de cultivo. Aislados de S. mansoni del schistosoma miracidia, cuando coloca en co-cultivo con células Bge desarrolladas de primaria a secundaria e hija esporoquistes17y finalmente a la etapa final de cercarial18,19. Así, se ha logrado continuo en vitro el cultivo de la fase de caracol todo el ciclo de vida de S. mansoni . El medio de celular Bge utilizado en nuestro sistema de cultura apoya sporocyst crecimiento, desarrollo y mantenimiento de la línea de celular Bge.

En Resumen, hemos descrito y visualmente ilustrado un protocolo detallado para masa axénico aislamiento y cultivo de la fase de nado libre miracidial de S. mansoni. Estos miracidia, cuando se someten a condiciones de cultivo apropiadas, son capaces de desarrollar a las generaciones sucesivas sporocyst primario y secundario y eventualmente cercariae. Con el desarrollo y perfeccionamiento continuo de las herramientas actualmente disponibles para manipular genes y gene expresión en vitro a través de transgénicas, los RNA de interferencia y genoma de edición (por ejemplo, CRISPR/Cas9) enfoques, se prevé que eficiente métodos para el aislamiento y cultivo de miracidia de diversas especies de trematodos20 seguirá necesario para procurar materiales para seguir el avance de la investigación en este campo. Este método complementa muy bien un protocolo previamente descrito para el aislamiento y cultivo de nado libre cercariae de S. mansoni a facilitar en vitro la transformación a los mamíferos esquistosómula etapa21, para eventual cultivo a ovígeras adulto gusanos22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Financiado en parte por subvenciones de NIH RO1AI015503. Ratones infectados de schistosome fueron proporcionados por del NIAID esquistosomiasis Resource Center en el Instituto de investigaciones biomédicas (Rockville, MD) a través de NIH NIAID contrato HHSN272201000005I para la distribución a través de recursos del BEI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
  2. WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5, (90), 25-32 (2015).
  3. Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
  4. Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165, (1), 8-18 (2009).
  5. Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. Springer. New York. 159-189 (2011).
  6. Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46, (1), 5-16 (2015).
  7. Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
  8. McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
  9. Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58, (4), 699-704 (1972).
  10. Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75, (2), 168-175 (1992).
  11. Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
  12. Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60, (6), 935-941 (1974).
  13. Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
  14. Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
  15. DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60, (5), 757-763 (1974).
  16. Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. Academic Press. New York. 75-97 (1976).
  17. Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81, (5), 714-722 (1995).
  18. Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
  19. Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
  20. Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
  21. Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
  22. Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67, (2), 186-190 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics