إشارات جيل التوافقي الثاني في أرنب الصلبة كأداة للتقييم للأنسجة العلاجي العابرة للربط (TXL) لقصر النظر

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويصف هذا البروتوكول تقنيات لتقييم المواد الكيميائية العابرة للربط من الصلبة أرنب باستخدام التصوير الجيل الثاني متناسق و فرق المسح القياس.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وتشمل أساليب لتعزيز الأنسجة بإدخال روابط كيميائية (العابرة للربط غير الانزيمية) البروتينات الهيكلية (فيبريلار كولاجينس) للعلاج الضوئية العابرة للربط والأنسجة العابرة للربط (TXL) أساليب. تستخدم هذه الأساليب لإحداث تغييرات الخاصية الأنسجة الميكانيكية للقرنية في اضطرابات ترقق القرنية (أضعفت ميكانيكيا) مثل القرنية المخروطية، فضلا عن الصلبة في قصر النظر التقدمية، حيث ترقق وضعف الخلفي يحدث الصلبة والمرجح أن يساهم إلى استطالة محورية. البروتينات المستهدفة في المقام الأول لتعزيز مثل هذه الأنسجة هي كولاجينس فيبريلار التي تشكل الغالبية العظمى من البروتينات الوزن الجاف في القرنية والصلبة العينية. مصادفة، كولاجينس فيبريلار هي المصدر الرئيسي للإشارات جيل التوافقي الثاني في الفضاء خارج الخلية في الأنسجة. ولذلك يمكن أن يحتمل أن الكشف عن إدخال تعديلات على بروتينات الكولاجين، مثل تلك التي يتسبب فيها عن طريق العابرة للربط العلاجات، وكوانتيتاتيد عن طريق استخدام الفحص المجهري متناسق الجيل الثاني (شجم). رصد شجم إشارات عن طريق استخدام ليزر مسح نظام الفحص المجهري مقرونا إثارة الأشعة تحت حمراء خفيفة المصدر هو أسلوب تصوير حديثة مثيرة التي تتمتع بالاستخدام على نطاق واسع في مجال العلوم الطبية الحيوية. وهكذا، أجريت الدراسة الحالية بغية تقييم استخدام الفحص المجهري شجم كوسيلة لقياس الناجمة عن الآثار العابرة للربط في السابقين فيفو الصلبة الأرنب، بعد حقن مادة كيميائية العابرة للربط عامل في الفضاء دون الحفرة تينون (ش)، حقن النهج هي الممارسة المعتادة لتسبب تخدير العين خلال الإجراءات السريرية طب العيون. من هذه المادة الكيميائية العابرة للربط عامل، هيدروكسيميثيلجليسيناتي الصوديوم (SMG)، من فئة من المواد الحافظة مستحضرات التجميل المعروف باسم فورمالدهايد الإفراج عن عملاء (فارس). Scleral التغييرات بعد رد فعل مع إس أم جي أدت إلى زيادات في إشارات SHG ويرتبط بالتغيرات في درجة الحرارة تمسخ الحرارية، أسلوب قياسي لتقييم فعل الأنسجة الآثار العابرة للربط.

Introduction

قصر النظر التدريجي هو افترض أن يكون علاجها عن طريق غير الانزيمية scleral العابرة للربط (الضوئية و/أو الكيميائية)، الأمر الذي يجعل الشعور نظراً إلى أن حجب العابرة الانزيمية للربط الكولاجين يمكن زيادة الحرمان النموذج التجريبي (FD)-التي يسببها 1من قصر النظر. ناقش الشيخ وفيليبس2 مؤخرا بجدوى وإمكانية استخدام القياسية إشعاع الأشعة فوق البنفسجية-أ (UVA)-بوساطة والريبوفلافين الضوئية العابرة للربط (المعروف أيضا ببروتوكول درسدن)، يختصر هنا ك (ريبوفلافين CXL) لتحقيق الاستقرار سكليرال الخلفي لوقف استطالة محورية في قصر النظر. هذا الأسلوب الضوئية قد استخدمت بنجاح لعلاج زعزعة استقرار سطح الكرة الأرضية الأمامية (أي، انتفاخ القرنية) رأيت في المخروطية ووظيفة-اسيك كيراتيكتاسيا. ومع ذلك، تطبيق هذا البروتوكول CXL الصلبة العينية يعوقه قضايا تتصل بالصعوبات في الوصول إلى الصلبة الخلفي مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، فضلا عن الحاجة إلى تعديل كبير أنسجة سطحية مساحة أكبر. أن يقال، أن النهج CXL قد استخدمت لوقف استطالة محورية في النموذج بصريا يحرم الأرانب (تارسورهافي)، على الرغم من أن مناطق متعددة من الخلفية الصلبة المطلوبة مناطق التشعيع منفصلة متعددة في تلك الدراسة3. على النقيض من ذلك، يمكن أن تمثل حقن عامل استقرار الكيميائية (أي، عامل العابرة للربط) عبر الفضاء ش طريقة أسهل لتعديل الخلفية الصلبة العينية، تجنب الحاجة إلى إدخال مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تقنية حقن هذا معروف كوسيلة مفيدة لتحريض التخدير العين خلال إجراءات طب العيون مثل إعتام عدسة العين جراحة4،،من56. وصف Wollensak7 سابقا استخدام حقنه ش باستخدام جليسيرالديهيدي (كيميائية cross-linking عامل مماثلة في مفهوم إلى فورمالدهايد الإفراج عن عملاء (فارس) الموصوفة في هذه الدراسة) تشديد الصلبة الأرانب وجينيبين وقد وقد تبين للحد من طول محوري في فد خنازير غينيا8،9. وقد أثبتت هؤلاء المحققين ميزة واضحة لاستخدام عامل كيميائية القابلة لذوبان عبر تقنية ككسل الضوئية. وهكذا، سكليرال العابرة للربط باستخدام عامل كيميائية القابلة لحقن لبعض الأنواع، بما في ذلك فارس (أي، TXL)10، يمكن أن توفر طريقة علاج ممكنة لوقف التقدم لاستطالة scleral ينظر في قصر النظر.

في البروتوكولات المقدمة هنا، نستخدم حلاً cross-linking كيميائية للصوديوم هيدروكسيميثيلجليسيناتي (SMG)، سلمت عن طريق حقن sT على الصلبة العينية من عيون الأرانب المأخوذة. وقد نفذنا بروتوكولات مماثلة سبق العابرة الكيميائية الموضعية للربط في القرنية. لا سيما في تلك الدراسات المبلغ عنها سابقا، تركيز تعتمد التأثيرات العابرة للربط يمكن الحصول عليها باستخدام SMG، مع مجموعة تأثير تمتد كذلك أعلاه التي يمكن تحقيقها مع CXL الضوئية كما يحددها التحليل الحراري تمسخ11 .

هنا يمكننا وصف بروتوكولات لتقييم تأثير cross-linking SMG تسليمها عن طريق الحقن ش scleral الأنسجة، تمسخ الحرارية باستخدام القياس المسح التفاضلي (DSC)، والفحص المجهري توليد النغمة التوافقية الثانية (شجم).

استخدام القياس المسح التفاضلي (DSC)، يعرف أيضا باسم التحليل الحراري، انتقال تمسخ حرارية يقاس، هو للأنسجة scleral يغلب استرشادا بخصائص كولاجينس فيبريلار، نظراً إلى أنها تشكل أغلبية الجزء الأكبر من البروتين. هذا الأسلوب يقوم بتقييم استقرار هيكل الجزيئية الكولاجين والسندات cross-linked ييفات الكولاجين، هيكل البروتين العالي الرئيسية إلى استقرار. أثناء التسخين في DSC، هو تحقيق درجة حرارة التحول حرجة التي ينتج عنها تمسخ جزيء الكولاجين، أسفر عن uncoiling الحلزون الثلاثي، عملية التي تشكل ما يعرف عادة باسم الجيلاتين. هذا تمسخ الحرارية يعطل السندات الهيدروجين على طول جزيء الكولاجين ويمكن أن تحول إلى درجات حرارة أعلى من خلال المستحث العابرة للربط أساليب12،13. وقد تم استخدام هذا الأسلوب لعقود عديدة، لا سيما في هذه الصناعة الحيوية، والعمليات التي تشمل صناعة الجلود. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب استخراج الأنسجة الصلبة ولذلك يمكن إلا تكون مفيدة كأسلوب السابقين فيفو .

الجيل الثاني-التوافقي مجهرية (شجم) يستند إلى الخصائص البصرية غير الخطية لمواد معينة، مع البيئات غير سينتروسيميتريك الجزيئية. في مثل هذه المواد، والضوء المكثف، على سبيل المثال الضوء المنتجة بالليزر، يولد إشارات SHG، الذي تضاعف في ضوء الحادث في التردد. هي المواد البيولوجية التي هي معروفة لإنشاء إشارات SHG الكولاجين، ميكروتوبوليس، والميوسين العضلية. على سبيل المثال، سوف تنبعث منها الكولاجين متحمس مع الأشعة تحت الحمراء من الطول الموجي نانومتر 860 إشارة SHG في النطاق المرئي مع الطول الموجي نانومتر 430. الثانية جيل التوافقي (SHG) إشارة التصوير وسيلة واعدة لتقييم العابرة الكولاجين العلاجية للربط. وقد كان معروفا منذ أكثر من 30 عاماً أن ييفات الكولاجين في أنسجة تنبعث منها إشارات SHG14. ومع ذلك، إلا في الآونة الأخيرة يمكن الصور عالية الدقة الحصول على15 في مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك وتر16، والجلد، والغضاريف17،18من الأوعية الدموية، والكولاجين الهلام19.

استناداً إلى هذه المعرفة، تقيم هذه الدراسة التغييرات إشارة SHG المستحث في الصلبة العينية عن طريق إس أم جي التي يسببها كيميائيا العابرة للربط من الكولاجين. النتائج تشير إلى أن تعديل SMG الصلبة العينية تزيد الإشارات SHG المنتجة من الأنسجة حزم ألياف الكولاجين (أعلى ترتيب هيكل رباعي يضم ييفات الكولاجين) وأيضا تنتج تغيير السمات هيكلية في الكولاجين شبكة الألياف، تنعكس في الألياف حزمة "استقامة."

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع الإجراءات باستخدام عيون الأرانب المأخوذة داخل رؤساء الأرنب أووتبريد سليمة. اتباع المبادئ التوجيهية جميع المسائل المؤسسية والوطنية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1-إعداد الحلول

  1. إعداد SMG TXL:
    1. إعداد 1 مل تركيز 0.2 M للحل الحل (ناكو3) بيكربونات الصوديوم باستخدام 0.0165 ز مسحوق NaHCO3 حله في 1 مل الماء المقطر.
    2. حل 0.1016 مغ من الصوديوم مسحوق هيدروكسيميثيلجليسيناتي (SMG) في 1 مل الماء المقطر للحصول على تركيز نهائي من 800 مم SMG. ضبط حل بيكربونات الصوديوم بتركيز نهائي ناكو 0.1 م3 و 400 مم SMG. تركيزات SMG تبعاً لتأثير cross-linking المرجوة. في البروتوكول الموصوفة هنا استخدمنا 40 و 100 و 400 مم SMG.

2-حقن سوبتينون TXL باستخدام SMG

  1. ملء اثنين 1 مل الأنسولين المحاقن (25 غ إبر) مع 400 ميليلتر مراقبة وحل SMG، على التوالي.
  2. وضع الرأس للأرنب في طائرة الشخصية مع المساعدة من وسادة. يمكن استخدام الستايروفوم أو كومة ورق إصلاح الرأس في وضع أفضل.
  3. سحب الجفون مع منظار عين طب أطفال.
  4. قياس ضغط العين الأولى (IOP) باستخدام جهاز تونوميتري أبلانيشن.
  5. علامة موقع الحقن المقصود في الجزء الأوسط العلوي من ليمبوس مع علامة أنسجة.
  6. سحب الملتحمة المحيطة بموقع الحقن ملقط مايوجد (أو أي الملقط مع تلميح جولة مسنن) وإدخال إبرة عن طريق الملتحمة، دخول الكبسولة في الحفرة تينون قليلاً خارج الموقع حوفي ملحوظ (أي، 2-3 مم من ليمبوس). يمكن أيضا إجراء شق صغير في الملتحمة مع قزحية مقص بغية تسهيل مرور الإبرة عبر الكبسولة في الحفرة تينون.
  7. مرة واحدة داخل الكبسولة في الحفرة تينون، تأكد من أن الإبرة بحرية متنقلة بأنها تتحرك جنبا إلى جنب. خلال هذا الوقت، لا ينبغي تحريك الكرة الأرضية. ويؤكد هذا الموضع السليم من الإبرة أعلاه الصلبة العينية في sub-الحفرة تينون في (ش) الفضائية.
  8. حقن المحلول من المحاقن وتجاهل الإبرة. فورا بعد الحقن، سوف تتراكم السوائل في الفضاء ش خلق انتفاخ أمامي ينظر إليها عن طريق الملتحمة (أي، تشيموسيس).
  9. كرر قياس IOP بغية التأكد من أن أنها لم تتغير بسبب انثقاب غير مقصود من أنحاء العالم.
  10. إزالة منظار الغطاء، وإجراء تدليك الرقمية من خلال الجفون المغلقة لحوالي 2-3 دقيقة.
  11. مغادرة الرئيس لفترة حضانة من ح 3.5 (درجة حرارة الغرفة = 18 درجة مئوية)، وقبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

3-الأنسجة إعداد

  1. سحب الجفون باستخدام منظار جفن من أجل تحسين الوصول إلى أنحاء العالم. حدد منظار الحجم الأمثل وفقا لحجم العين.
  2. فصل الملتحمة المحيطة ليمبوس. إذا كان ذلك الفعل قد تم قطعي قرب موقع الحقن، circumferentially توسيع الحدود حيث أنه سيحتوي على حجم العدوى من 1 × 1 سم تقريبا.
  3. قص العضلات خارج العين في مواقعهم للإدراج scleral.
  4. رفع مقلة العين بالملقط، دفعها من الجانب الخلفي. هذا يوفر الوصول إلى أنحاء العالم الخلفي، وسوف تيسر قطع العصب البصري بالعيون الشريان والوريد تقع بالقرب من القطب الخلفي من أنحاء العالم.
  5. قطع كورنيوسكليرال المعقدة، مع الحد الخارجي بما في ذلك موقع الحقن ملحوظ. ينبغي أن تكون وصمة عار لا تزال مرئية على الجزء المتبقي من الصلبة العينية.
  6. إزالة بيتروس الإحضار وكل الطبقات التي تعلق على الجانب الداخلي من الصلبة العينية عن طريق تطبيق الجر مع ملقط الأنسجة.
    ملاحظة: خطوات أخرى تعتمد على الإجراءات التالية التي يجري تنفيذها: 4--تحليل DSC، 5--SHG المجهري.

4-وبالنسبة للتحليل الإقليمي DSC

  1. للعين المعالجة: قطع أربعة قطاعات سكليرال من كأس scleral المتبقية مع المقص حيث أنه يقع في القطاع العلوي موقع الحقن والانحياز مركزياً. قص القطاعات الثلاثة المتبقية من كلا الجانبين الأفقي (أيالآنف والزمانية)، والجزء السفلي.
    ملاحظة: الترقيم من القطاعات (1-4) التي تنقسم كذلك إلى المربعات (1-16) يتجلى في الشكل 1A.
  2. قص القطاع scleral (1-4) إلى مربعات صغيرة (1-16) حوالي 4 x 4 مم من كل. ينبغي تقسيم القطاع 1 إلى 9 مربعات (جعل الموقع الدقيق لحقن مربع فردية [ساحة 2]). تقسيم القطاعات 2 و 3 إلى 2 الساحات (المربعات 10-11 و 12-13) والقطاع 4 إلى 3 مربعات (المربعات 14-16).
  3. تعيين رقم لكل مربع، كما هو مبين في الشكل 1 ألف، من أجل ترجمة المسافة من تحليل الأنسجة من موقع منطقة حقن.
  4. للعين التحكم: بعد تقسيم الأنسجة إلى أربعة قطاعات سكليرال (مشابهة للأنسجة المعالجة) قطع قطعة مربعة من الأنسجة من المواقع التالية: 3 مربعات من القطاع الأعلى (القطاع الأول)، 1 من كل جانب (القطاعات 2 و 3)، و 1 من أسفل القطاع (4).
  5. كشط قبالة طبقات الشبكية وتشورويدال المتبقية ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد في كل مرة، ترك القطع الغارقة في حل لما يقرب من 10 ثانية في وقت واحد.

5-وبالنسبة لتصوير SHG

  1. قص الجزء الأعلى من الصلبة استخدام مقص لإنشاء مساحة 1 × 1 سم مع الموقع لحقن الانحياز مركزياً.
  2. كشط قبالة طبقات الشبكية وشرويد المتبقية ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد في كل مرة ترك القطع في حل لما يقرب من 10 s.
  3. وضع الأنسجة في أنابيب 1 مل مليئة بحل برنامج تلفزيوني للنقل إلى مرفق التصوير. ينبغي القيام بكل الإجراءات، بعد فترة الحضانة، وبدءا بالتشريح من مقلة العين في غضون ساعة.

6-الفحص المجهري البروتوكول

ملاحظة: هذا البروتوكول للتصوير منتشرة في ظهره إشارة SHG من الكولاجين أنسجة الصلبة مصمم خصيصا لليزر المسح الضوئي المجهر.

  1. إعداد الفحص المجهري
    1. إلى أقصى حد ممكن إشارة والقرار عند إجراء الفحص المجهري SHG استخدام عدسة الهدف الأمثل لإرسال الأشعة تحت الحمراء الضوء ومع فتحه عددية عالية (غ). وهدفنا هو نيكون Apo LWD 25 x/NA1.1 الماء الغمر.
    2. ضبط ذوي الياقات البيضاء تصحيح العدسة لتتناسب مع عمق العينة، وفي هذه الحالة هو سمك ساترة، 0.17 ملم.
    3. جبل عدسة الهدف 25 x وإضافة كمية سخية من التشحيم هلام المستندة إلى الماء لتغطية سطح التصوير قبل تركيب العينة. هلام المياه على أساس سوف لا تتبخر أثناء التجربة ومن ثم سيتم الحفاظ على جودة الصورة.
    4. ضع الأنسجة سكليرال من أنبوب 1 مل مع برنامج تلفزيوني دون تجفيف بين اثنين كوفيرسليبس جولة 25 مم (ابيسكليرال الجانب الأسفل) توفير الاتصال القصوى بين ابيسكليرا والسطح ساترة.
      ملاحظة: الأنسجة يمكن أيضا وضع كشف على ساترة. ينبغي الحفاظ كمية لا بأس بها من برنامج تلفزيوني الأنسجة رطبة أثناء التصوير. وفي هذه الحالة، إضافة قطعة النسيج، وبرنامج تلفزيوني بعد تجميع سيلتشامبير.
    5. تجميع الدائرة الخلية عن طريق وضع ساترة جولة 25 مليمترا واحد أو في تقنية ساندويتش، في الجزء السفلي من الدائرة والمسمار في الجزء العلوي إلى أسفل من أجل إنشاء مختومة جولة الدائرة. لا المسمار أسفل محكم عند استخدام ساترة أعلى، بغية تجنب التسطيح مصطنع وتلف في الأنسجة.
    6. جبل قاعة الخلية مع عينات الأنسجة في مرحلة المجهر.
    7. تعيين المجهر لرأي العين مع الضوء المنقولة.
    8. ضع المرحلة وضبط ارتفاع الهدف مثل السطح السفلي للعينة في التركيز، كما يحددها التفتيش الميداني مشرق من خلال قطعة العين.
    9. إيقاف تشغيل كافة أضواء ما عدا شاشة الكمبيوتر ومنع الكثير من الضوء من رصد قدر الإمكان مع أوراق رقائق الألومنيوم رايات على مرحلة مجهر. التقليل إلى أدنى حد من أي ضوء شارد التوصل الكشف سيكفل اقتناء منخفضة الضوضاء، كما كشف ند جاسب لديها حساسية عالية.
    10. في لوحة لوحة Ti من البرنامج، تحقق من أن تعريف العدسة بشكل صحيح.
    11. في لوحة A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية، اختر ليزر الأشعة تحت الحمراء للتصوير وحدد كاشفات ند واختر قناة DAPI أنه مجهز بفلتر ممر الموجه 400-450 نانومتر.
    12. في لوحة A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية، قم بتعيين الطول الموجي لليزر الأشعة تحت الحمراء إلى 860 نانومتر وفتح المصراع.
    13. مجموعة ليزر المسح الشروط في لوحة واجهة المستخدم الرسومية المدمجة A1 كما يلي. حدد: الماسح الضوئي (أ) جالفانو، المسح الضوئي (ب) أحادي الاتجاه، المايكروثانيه الوقت 6.2 يسكن بكسل (ج)، (د) الإطار الحجم 1,024 x 1,024 بكسل، (ه) الخط المتوسط 2 x
      ملاحظة: جالفانو الماسح الضوئي والمسح الضوئي أحادي الاتجاه يضمن دقة نقطة بنقطة المحاذاة. حجم 1,024 x 1,024 لمجال الرؤية الكاملة يترجم حجم بكسل من 0.5 ميكرو/pixel. الخط المتوسط سيتم الحد من الضوضاء النار في الصورة.
    14. الحصول على تعيين شروط التصوير في لوحة A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية عن طريق تعديل قوة الليزر وكاشف. افتح لوحة "تبدو أعلى الجدول" (طرفيات المستعملين المحليين) يعرض رسم بياني لقيم كثافة البيكسل في الصورة الحالية. بدوره على تصوير يعيش في وضع "البحث" وتعظيم نطاق قيم بكسل تم الكشف عنها عن طريق ضبط كسب السلطة وكاشف ليزر. تجنب التشبع. القيم النموذجية طاقة الليزر 2.5 في المائة، من إجمالي 2.35 ث في 860 نانومتر، و 100 HV (كاشف كسب).
    15. ملاحظة: هذا الإعداد، لقوة الليزر تقاس مقياس طاقة داخلية هو 5.2 ميغاواط. في كل مرة يتم إجراء تجربة، إعادة ضبط النسبة المئوية الليزر أن قياس الطاقة الداخلية ثابت في 5.2 ميغاواط بين دورات التصوير. وينبغي توخي الحذر عند وضع طاقة الليزر. ثانيا الحرباء الليزر ليزر ث 3 800 نانومتر ونسبة 10 في المائة أو أعلى سلطة يمكن الحث على احتمال تلف الأنسجة.
  2. الحصول على الصور
    1. في وضع المعاينة، مسح منطقة الأنسجة باستخدام أداة لمحة عامة XYZ.
    2. تعيين التصوير إلى دقة أقل (256 × 256 بكسل ولا الخط المتوسط) لتسريع الحصول على الصور في هذا الوضع.
    3. القبض على 5 × 5، 3 × 3، أو الحقول لعرض واحد لتغطية كامل سطح النسيج. في كل مكان، قبل الاستيلاء على نظرة عامة، قم بتشغيل وضع "المسح الضوئي" يعيش وتجلب الأنسجة في التركيز. علما بأن مناطق مختلفة من الأنسجة سيكون لها مواقف مختلفة قليلاً في اتجاه محوري.
    4. البحث عن مساحة شقة حيث ينظر في كامل مجال الرؤية ألياف الكولاجين وانقر نقراً مزدوجاً فوق ذلك الموقف في أداة لمحة عامة لنقل المسرح إلى أن موقع معين.
    5. تشغيل وضع "المسح الضوئي" حية وضبط الموضع Z الهدف مثل أن الطائرة أسفل في التركيز، وفي لوح Ti، استخدام محرك الأقراص Z لنقل الطائرة الضوئية ميكرومترات 10-15 أعلاه هذه الطبقة السفلي.
    6. الحصول على صورة بدقة عالية مع 1,024 x 1,024 بكسل وخط x 2 في المتوسط، باستخدام الزر "التقاط".
    7. حفظ الموقع في نظرة عامة XYZ باستخدام زر "+". وهذا ما يضمن أن لا يتم استعادت نفس المنطقة من الأنسجة.
    8. لكل قطعة من الأنسجة التقاط الصور 10 غير متداخلة الحقول من طريقة العرض.

7-DSC البروتوكول

ملاحظة: انتقل إلى هذه الخطوة بمجرد اكتمال إعداد الأنسجة، لتحليل DSC إقليمي، أو بعد التصوير الأنسجة عند إجراء شجم.

  1. إعداد الأحواض DSC، وزنه، والمسمى.
    ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن يتم قبل تشريح الأنسجة بغية تقليل جفاف الأنسجة.
  2. الجاف لكل ساحة سكليرال مع أنسجة ماصة ووضع مسطح على الجزء السفلي من عموم DSC استخدام ملقط مسنن.
  3. وزن العموم مع الأنسجة داخل وغطاء مجعد وتغطية للحصول على الأنسجة الرطب الوزن (يجب أن تكون كتلة من العينات في المجموعة من 5 إلى 11 ملغ).
    ملاحظة: ختم كل عموم استخدام المكشكش قبل الانتقال إلى التالي عينة الأنسجة. الأحواض هي مغلقة، منع أي خسارة المياه قبل التحليل الحراري.
  4. مرة واحدة هو مجعد العينة، وضعه على موقعة المعين على علبة DSC. ينبغي أن يكون هناك 6 عينات لعنصر التحكم و 16 للعين المعالجة.
  5. إنشاء أسلوب باستخدام أداة إدارة البرامج، وتحديد وزن الأنسجة، وتشغيل التحليل الحراري باستخدام المعلمات التالية: درجة حرارة تتراوح من 40 إلى 80 درجة مئوية، ومعدل التسخين: 1 درجة مئوية/دقيقة، وتدفق الحرارة: 17.37 ميغاواط، وتدفق الغاز (ن2): 19.8 مل/دقيقة، ضغط الغاز: شريط 2.2.
  6. وبمجرد الانتهاء، تحليل البيانات الخاصة بكل نموذج باستخراج ذروة درجة حرارة التحول في تمسخ الحرارية التي تحدث باستخدام أداة إدارة البرامج.

8. تحليل الصورة

  1. إشارة SHG
    1. حدد على الأقل 5-10 من الصور الأكثر تمثيلاً من كل معاملة وسيطرتها، مثل أن تحتل منطقة الصورة من ألياف الكولاجين معظمها.
    2. تحميل كل الصور في برامج إيماجيج وقياس كثافة بكسل المتوسط عن طريق تحديد تحليل > قياس للصورة النشطة.
    3. فترد بكثافة بكسل يعني القيم المستخرجة ويمكن أن تظهر أيضا برسم الرسم البياني كثافات بتحديد من القائمة تحليل > الرسم البياني.
    4. استخدام ورقة أكسل، إنشاء جدول لتوثيق جميع البيانات المقاسة تبعاً لذلك إلى نموذج معرف.
    5. حساب المتوسط والانحراف المعياري لكثافة بكسل لكل شرط المعاملة والتحكم.
    6. الطالب باستخدام اختبار t، مقارنة الاختلافات لكل المقارنات العشوائية لتركيزات (أي40 مم SMG مقابل 0 و 400 مم SMG مقابل 0). [P≤0.05].
  2. الأغطية
    1. حدد صورة تعرض ألياف الكولاجين. يجب أن يتم تحليل الصور على الأقل 10 كل عينة (بما في ذلك نموذج تحكم لكل تركيز-40 على الأقل في المجموع).
    2. فتح إيماجيج > ملحقات > نيروني. نيروني يتطلب التثبيت السابقة.
    3. تحميل جميع إيماجيسبي السحب إلى فتح إطار نيروني .
    4. إنشاء خطوط التتبع على طول الألياف، عقب كفاف فيبريل مع الماوس (يمكن استخدام قلم الرسم أقراص)، انقر فوق M لقياس مسافة طول إجمالي الألياف.
    5. حدد "الخيار" لرسم خط مستقيم عرضية والاتصال البداية ونهاية المنحنى الألياف مرسومة مسبقاً. الآن انقر فوق M لقياس طول نهاية إلى نهاية.
    6. كرر الإجراء نفسه على مالا يقل عن 10 ييفات كل صورة.
    7. جمع تلك القياسات اثنين من كل مجموعة من 10 ييفات وإدخال البيانات في جدول بيانات excel، معربا عن طول إجمالي الألياف (contour) ونهاية إلى نهاية المدة (الربط بين خط مستقيم) كطول منحنى [] وطول [الخطي]، على التوالي.
    8. حساب مؤشر الأغطية (W) باستخدام الصيغة: W = طول منحنى []/[الخطي] الطول.
    9. حساب النسبة المئوية للأغطية مقارنة البيانات من صور samples(SMG) تعامل مع الصور من عينات التحكم باستخدام الصيغة: (ث [SMG]-1)/(ث [السيطرة]-1)
    10. إجراء اختبار t عشوائية لمؤشر الأغطية (W) من أجل تحديد الاختلافات الإحصائية (p-القيم) مورفولوجيا ألياف الكولاجين بين شروط معاملة مختلفة والتحكم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمسخ الحرارية درجة الحرارة (Tm) كطريقة تحليل تقييم TXL العابرة للربط أثر: واستخدمت مجموعة أزواج 16 من عيون الأرانب في هذه التجارب للإجراء TXL. كجزء أولى من هذه الدراسة، تم تقييم التعريب العابرة للربط الأثر الناجم عن حقنه واحدة من SMG وكيل العابرة للربط عبر الفضاء ش في الرأس أرنب المأخوذة. هذا النوع من التجربة له صلة بالعلاج السريري للمرضى، ونظرا للحقن في مكان واحد أو أكثر يمكن أن يكون ضروريا لتحقيق الاستقرار في منطقة المرجوة من الصلبة.

كما سوف يمكن التنبؤ بها على أساس المبادئ الأساسية الانتشارية، كان التأثير الأكبر في موقع الحقن مع الآثار التي يسببها في المناطق المجاورة، وكذلك، تبعاً للتركيز الحلول. يمثل الشكل 1A التخطيطي موقع scleral القطاعات (1-4 في الخط الأحمر رقم جوفاء) (كذلك مقسمة إلى مربعات (1-16 في الخط رقم رقيقة سوداء)) التي خضعت للتحليل تمسخ الحرارية منفصلة بعد حقنه واحدة ش مع فهرس تعيين الألوان. ويبين الجدول 1 التغيير في القيم Tm لكل قطاع مرقمة بالمقارنة مع عنصر التحكم المطابق لها. قيم لحقن 40 مم و 400 مم وتشمل الخطأ المعياري للمتوسط المحسوب لحد أدنى من ثلاثة قرارات مستقلة.

الأرقام 1B تمثيل النتائج باستخدام تركيزات مختلفة اثنين من SMG، (الشكل 1B) 40 و 400 ملم (الشكل 1). وأظهرت العينة 40 مم تركيز أقل في الشكل 1 باء، تحولاً معتدل في Tm الذي لوحظ في ساحة 2 (الحقن). وشوهدت تحولات مماثلة في المربعات المجاورة 1 و 3 (الأزرق أخف). وتعتبر تحولات هامشية في المربعات 4 إلى 6 و 7 إلى 9 دون فروق معتد بها إحصائيا من ساحة حقن. وشهدت الساحات أقل 14 إلى 16، التي تمثل القطاع الأكثر بعدا بعيداً عن موقع الحقن لا تحول Tm.

كما هو مبين في الشكل 1، كان تركيز أعلى (400 ملم) أثر cross-linking إحصائيا بالغة أهمية (يشار إليها كظلال من اللون البرتقالي). ولوحظت تحولاً كبيرا في Tm مع الانحراف المعياري الصغيرة المرتبطة بها وف < 0.05، مما يعكس اختلاف كبير في تأثير 400 مم مقارنة بانخفاض 40 مم تركيز. ولوحظت الآثار الأكثر درامية في القطاع 1 في العالم العلوي. فيما يتعلق بالقطاعات المتبقية، وقد لوحظ تأثير أقل في المربعات 10 و 14 (والذي قد يكون بسبب بعض تتبع السائل العابرة للربط الخلف) ولم يلاحظ أي تأثير في المربعات 11، 12، 13، 15، و 16. عموما، كانت آثار cross-linking هامشيا في القطاعات 2 و 3 مع أي تأثير في القطاع 4 (أي، الموقع الأكثر بعدا من موقع الحقن)، مماثلة للعينة 40 مم. وأشارت هذه النتائج إلى أن هناك '' منطقة التأثير ''، وأنه لا يمكن توقع هذا النوع من نمط عقب حقن ش العابرة للربط عامل. يمكن أن يشير هذا إلى الحاجة للحقن في عدة مواقع من أجل حمل الآثار على مساحة واسعة من الأنسجة.

وأجريت أيضا دراسة آثار cross-linking التي يسببها في عيون سليمة تقييم TXL مع تركيزات اثنين من SMG. وأجرى التحليل تمسخ الحرارية للأنسجة التي خضعت هذه العابرة للربط سكليرال. العابرة للربط وقت كان ح 3.5 ل TXL باستخدام ثلاثة تركيزات مختلفة، 40 (Tm = 1.11 +/-1، 2)، 100 (Tm = 5.12 +/-2.9)، و 400 (Tm = 14.34 +/-1، 1) مم SMG. أظهرت النتائج أن هناك تأثير يعتمد تركيز النظر في الأنسجة cross-linked SMG.

ثانيا جيل التوافقي (SHG) التصوير كوسيلة لتقييم TXL العابرة للربط أثر:

تحليل مجهرية SHG الصور كانت سواء بالنسبة لكثافة بكسل من الأغطية حزمة SHG إشارة والألياف. واستخدمت فترة زمنية واسعة العابرة للربط تركيزات (من 40 إلى 400 مم) بغية استكشاف SHG إشارة التغيرات التي قد تحدث على نطاق واسع من الآثار العابرة للربط. استخدام القدرة على تحليل الرسم البياني المدرجة في البرنامج20معالجة الصور فيجي، كان من الممكن كوانتيتاتي إشارة SHG تنتج في الأنسجة سكليرال بالحقن ش، مقارنة آثار على 40 مم لتلك التي يسببها استخدام 400 مم. كانت متوسط الفرق في إينتيسيتيس بكسل يعني في 40 مم ± 66.3 27.7 بالمقارنة إلى ± 361.4 28.3 للعينات 400 مم، بزيادة ما يقرب من 6-fold. وهذا يتوافق مع زيادة في الأنسجة العابرة للربط، حيث لوحظت زيادات مقابلة في الخرائط المواضيعية أيضا في ظل هذه الظروف. ويبين الشكل 2 الممثل صور SHG الصلبة مأخوذة من عنصر التحكم (الشكل 2A)، 40 (الشكل 2)، و 400 ملم (الشكل 2). ويرد أيضا تحليل الرسم البياني المصاحبة لها، بما في ذلك متوسط السطوع (أو كثافة بكسل). وكان العدد الإجمالي للصور التي تم تحليلها: 120 ل 40 ملم و 98 لسيطرتها؛ 121 400 ملم و 94 لعنصر التحكم الخاص به. وكان عمق الأنسجة تصوير 10 إلى 15 ميكرون من سطح ابيسكليرال. نتائج تحليل الرسم البياني، التي تشارك في المتوسط العديد من حقول الصورة، أشارت إلى أن تركيزات أعلى من العابرة للربط تأثير (الشكل 3) تنتج أكبر كثافة بكسل.

كما هو موضح في الشكل 4، كما أجرى تحليل صورة مع الأساليب المعتمدة من المؤلفات الأوعية الدموية القلبية الوعائية واستخدام البرنامج المساعد إيماجيج ''ي العصبية''21. قدرنا أن العامل الأغطية W = طول منحنى [] طول [الخطي] ونحن الذي لوحظ أن العابرة للربط أدى إلى استقامة لحزم الألياف كما هو مبين بنسبة % انخفاض الأغطية في الصلبة cross-linked 40 و 400 ملم مقابل الصلبة التحكم غير المعالجة (W % = ([ث SMG]-1)/(W[control]-1)، الجدول 2). الفرق بين 40 و 400 مم SMG تعامل العينات في الأغطية لم يكن معتدا به إحصائيا.

Figure 1
الشكل 1 : تعريب تأثير TXL عبر ش استخدام حقن 40 و 400 مم SMG.
(أ)
التمثيل التخطيطي من 4 قطاعات سكليرال (أرقام 1-4 في خط أحمر أجوف كبير)، مع الصلبة مقسمة إلى مربعات [أرقام 1-16 في خط رقيق أسود أصغر] (عدم الانتباه إلى الجدول) التي خضعت للتحليل الحراري. موقع الحقن تناظر المربع (المربع 2) موقعا مركزياً في القطاع 1. تمسخ الحرارية العابرة للربط أثر TXL مع (1B) 40 مم SMG و (ج 1) 400 مم SMG. (د) لون مشفرة أسطورة مقياس درجة الحرارة على (ب) و (ج). لقد تم تعديل هذا الرقم من زيابليتسكايا et al. ، مع إذن22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : صور الممثل لزيادة تركيز تعتمد في SHG إشارة مستويات السطوع أنتجت بعد TXL باستخدام SMG عبر حقن ش الصلبة السابقين فيفو . وترد تركيزات SMG ك 40 مم من (ب) (ج) 400 مم. كل صورة تحتوي على 50 ميكرومتر مقياس بار (الزاوية السفلية اليمنى) وقيمة كثافة بكسل يعني (الزاوية اليمنى العليا)-القيم المطلقة. لقد تم تعديل هذا الرقم من زيابليتسكايا et al. ، مع إذن22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : مخطط شريطي للتغيير (Δ) في SHG إشارة كثافة بكسل (بالمقارنة مع عنصر تحكم مقترن من نفس رأس أرنب) في الكرات سليمة scleral تصميمهما عبر حقن sT (TXL) مع حلول SMG مم 40 و 400- كان متوسط القيم مع الخطأ المعياري للوسط: 66 ± 27.7 40 مم و ± 361 28.3 عن 400 مم. لقد تم تعديل هذا الرقم من زيابليتسكايا et al. ، مع إذن22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : مثال لتحليل الأغطية الألياف (على نحو ما أعرب عنه الخطي). صورة لنموذج عنصر تحكم لتركيز SMG 40 مم باستخدام مقياس 50 ميكرومتر بار (الزاوية السفلية اليمنى). وقد تم تعديل هذا الرقم من زيابليتسكايا وآخرون. مع22من الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : التمثيل التخطيطي لحقن ش. مناطق مرقمة 1-3 تطابق المناطق الممثلة في الشكل 1A. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

±Δ Tm
المنطقة 40 مم 400 مم
1 3.4 ±2.8 20.5 ± 0.6
2 3.4 ±0.53 ± 1.5 19.58
3 2.5 ±2.47 17.99 ±3.06
4 0.72 ±0.9 ±0.19 واقع 20.36
5 0.85 ±0.55 19.11 ±1.33
6 0.52 ±1.35 18.66 ±4.1
7 0.78 ±1.6 18.44 ±2.8
8 0.56 ±0.9 17.77 ±2.69
9 0.22 ± 0.6 18.92 ±2.6
10 0.46 ±0 8.75 ±10.56
11 0.47 ±0.18 0.63 ±1.84
12 0.11 ±0.08 0.66 ±1.52
13 0.08 ± 0.05 0.71 ±2.17
14 0.22 ±0.7 5.71 ±0.29
15 0.32 ± 0.2 0.29 ±0.7
16 0.24 ±0.73 0.26 ±0.79

الجدول 1: نتائج DSC للتعريب لدراسة تأثير TXL. التغير في درجة حرارة ذوبان الحراري (ΔTm) مع الأخطاء المعيارية لكل قطاع لعينات كما هو مبين في الشكل 1 ألف. كل قيمة يتم التعبير عنها كالفرق في أسكومباريد Tm لسيطرتها المزدوجة، وهو متوسط الحد الأدنى من 3 قرارات مستقلة.

إس أم جي، مم الأغطية الأغطية-% اختبار t مقابل [0 مم إس أم جي]
0 1.106 ± 0.044 100
40 1.067 ± يبلغ 0.017 63 ف < 0.02
400 1.059 ± 0.009 55 ف < 0.003
ألياف الخطي 1.000 0
(نظرية)

الجدول 2- نتائج التحليل في الأغطية الألياف. تم تحليل الصور SHG من منطقة الحقن TXL لدرجة من الأغطية الألياف باستخدام البرمجيات "ي العصبية". اختير عشرة ألياف من كل صورة، وتم تحليل إجمالي الألياف حوالي 100 درجة من الأغطية. يتم تضمين القيم متوسط مع الخطأ المعياري للوسط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أظهرت تجارب أجريت الأدلة المؤيدة لاستخدام الفحص المجهري إشارة SHG كأسلوب للتقييم للكولاجين العابرة للربط آثار في الصلبة العينية، زيادة إمكانية استخدام هذه التقنية كأداة رصد للعلاجات العابرة للربط أن استهداف بروتينات الكولاجين. من المذكرة، أداة بالفعل في الاستخدام السريري التي يحتمل أن التقاط هذه الإشارات SHG. على الرغم من أن هذا الصك صمم أساسا للتصوير من الأدمة الجلد البشري، أنها استخدمت بنجاح لصورة القرنية والصلبة العينية23.

أنه ضروري للحفاظ على مطابقة المسح الضوئي والتصوير الشروط عند مقارنة التحكم والتعامل مع العينات. جيل التوافقي الثاني مجهرية الكولاجين في الأنسجة الصلبة يتطلب مجهر الأسفار متوافقة مع التصوير المتعدد فوتون، نبضات الأشعة تحت حمراء ليزر الانضباطي في نطاق الطول الموجي نانومتر 800-900، وكشف حساسة للغاية مثل جاسب غير ديسكانيد للكشف عن (ند). المبادئ التوجيهية المبينة في هذه المخطوطة نقطة انطلاق. وينبغي أن تحدد الشروط خصيصا للتجارب الجديدة، أو للنظم المختلفة.

القرنية والصلبة العينية كما قيمت في نفس الوقت في الدراسات التي تستخدم هذا الأسلوب24،25،،من2627. مع العلم أن إشارة SHG تنتشر في اتجاهات كل من الأمام والخلف، بحثت دراسات عدة أنسجة القرنية بشكل مستقل في به الدولة الأصلية28،،من2930،31، 32،،من3334 وفي القرنية المخروطية35،36 عقب CXL (كما هو مبين أدناه). تشير نتائج هذه الدراسات إلى أن إشارة القرنية هو الأمثل في الاتجاه إلى الأمام متناثرة، الأمر الذي يجعل الشعور نظراً لشفافية القرنية وحقيقة أن يمر الضوء من خلال الأنسجة لضرب جهاز في نظم المتناثرة إلى الأمام. وبشكل نموذجي, إشارة SHG في النطاق المرئي الأزرق وسيخفض إلى حد كبير عندما يمر عبر أنسجة ونثر عالية مثل الصلبة العين. كنتيجة لذلك، يتطلب الكشف عن SHG متناثرة إلى الأمام قسم رقيقة من الأنسجة من 50 ميكرومتر أو أقل في السمك، فضلا عن هيكل بصرية خاصة. على النقيض من ذلك، يمكن التقاط إشارة منتشرة في العودة من خلال مسار الضوء العادية مجهر الأسفار دون تقطيع الأنسجة وبالتالي هذا الوضع المفضل عند التصوير الكولاجين في الأنسجة الصلبة سليمة على عمق 30-40 ميكرومتر. لاحظنا في هذه الدراسة، بزيادة تركيز تعتمد في كثافة إشارة. من الممكن تماما، بيد TXL قد يكون آثار إضافية ومماثلة على طبقات أعمق من الصلبة العينية، وأن التأثير يمكن أن يكون أكثر وضوحاً وتمتد إلى طبقات أعمق خاصة مع تركيز أعلى. ومع ذلك، نظراً لمحدودية SHG إشارة الاختراق في الصلبة العينية و لأغراض هذه الدراسة الأولية، اخترنا للعمل مع أفضل نوعية الصور، التي تم الحصول عليها من الصلبة الأكثر سطحية (15 ميكرون العمق). في المستقبل دراسات، سننظر في عمق تعتمد آثار اتباع الأساليب TXL كهذا قد توفر معلومات هامة إضافية بشأن لماذا وحتى الاختلافات أكبر لم تكن لوحظ بين 40 و 400 من العينات المعالجة مم.

وعلاوة على ذلك، فيما يتعلق باستخدام SHG لتقييم فيتامين بي CXL الناجمين عن الأنسجة العابرة للربط، والريبوفلافين SHG المجهري التصوير التالي CXL القرنية قد أبلغت عن عدة مجموعات37،،من3839 , 40 , 41-في دراسة أجراها ستيفن et al. 37، استقرار القرنية باستخدام تقنية CXL أسفرت عن '' تجانس '' الإشارات وفقدان الأنسجة '' طيات '' أو '' تموجاته '' ينظر في عينات غير الصليب مرتبطة. هذه الأنواع من التغييرات، ولكن أيضا لوحظت في دراسة لتقييم آثار التغيرات في IOP على القرنية SHG إشارات، وزيادة إمكانية التحف الفنية. تنظيميا من فيبريل فضلا عن أعلى ترتيب الألياف حزمة/رقائقي المنظمة وجهة نظر، الصلبة والقرنية مختلفة تماما، ويعرف الكثير عن هذه الاختلافات من دراسات المجهر الإلكتروني. تختلف الأنسجة اثنين فيما يخص فيبريل التعبئة والتغليف والتي تشمل فيبريل القطر التوزيع (ييفات موحدة صغيرة ييفات قطر القرنية ومتغير الصلبة العينية) وبين فيبريل التباعد (موحدة للقرنية ومتغير الصلبة). كذلك، تنظيم ترتيب أعلى في أوراق رقائقي (القرنية) مقابل حزم الألياف الصلبة (العينية) مختلفة تماما. وترد هذه الاختلافات الهيكلية في الإشارات SHG التي تنتجها هذه الأنسجة اثنين. وهكذا، قد يغير التغيرات التي تحدثها العابرة للربط إشارة SHG بطرق مختلفة ولكنها متوازية. وبعبارة أخرى، '' استقامة '' من الألياف في الصلبة العينية لوحظ في هذه الدراسة، و '' تجانس '' إشارة في القرنية ذكرت في الأدبيات، كانت على حد سواء نتيجة للكولاجين العابرة للربط التعديل. وهكذا، أثر '' التجانس '' في القرنية بطريقة يمكن مماثل لتأثير '' استقامة '' الصلبة تم الإبلاغ عنها هنا.

الآليات التي تؤدي إلى هذا التأثير استقامة تنتجها TXL غير واضحة تستند إلى الدراسة الحالية. يمكن أن يكون أحد الاحتمالات أن الأنسجة كانت إلى حد ما '' الثابتة '' في موقف ميكانيكيا '' تحميل ''. وهذا سيكون دعم الفكرة القائلة بأن فعل '' الاستقرار فيبريل والألياف '' قد حدث. لم تسهم التغيرات في ضغط العين يحتمل هذا الأثر منذ تم رصدها قبل وبعد حقن ش IOP وظلت مستقرة. وبوجه عام، أهمية هذه الملاحظات غير واضحة، وسيكون من الضروري إجراء المزيد من الدراسات. من المذكرة، منفصلة التصوير تقنيات مثل برلين مجهرية42، الذي ثبت لتوفير التدابير الكمية من العابرة للربط (كما يحدده معامل القص) عقب CXL الكيمياء الضوئية قد تكون مفيدة في تأكيد النتائج التي توصل إليها مع SHG التصوير في هذه الدراسة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استعماله بشدة تشتت الأنسجة مثل الصلبة43، يتطلب إجراء تعديلات تقنية ولم يتم التحقق من الأنسجة scleral cross-linked.

ليزر للاستقطاب والفحص المجهري SHG مسألة هامة. ضوء الليزر هو مستقطبا خطيا والموجه عمودي على اتجاه انتشار الإشارات SHG وبعض زاوية في س ص-الطائرة إلى كل ألياف الكولاجين. وهكذا، سوف تنتج الألياف في س ص-الطائرة التي يتم محاذاتها جيدا وعمودي تماما على ضوء الليزر الاستقطاب إشارة SHG أعلى من تلك في زوايا أخرى، بما في ذلك موازيا لضوء الحادث (أيz-الطائرة)، التي سوف تنتج أدنى إشارة SHG (بسبب التدخل المدمر). فيما يتعلق بالانسجة الصلبة، الكولاجين ألياف تتجه في زوايا مختلفة على مستوى المجهري، على الرغم من أن الألياف التشريحية المفضل توجهات معروفة موجودة استناداً إلى موقع الكرة الأرضية. وهكذا، منذ إشارة SHG أنتجت سيختلف حسب زاوية س ص-الطائرة كل الألياف، الإشارة الإجمالية ستكون أقل من تلك التي سيتم إنتاجها إذا كانت محاذاة جميع ألياف الكولاجين الضبط في نفس الزاوية (في أنسجة مثل الأربطة ، على سبيل المثال). وهكذا، في هذه الدراسة، نظراً لطبيعة العينة يجري تصويرها، باتجاه الاستقطاب لم يتحدد عمدا، لكن بقي ثابتاً في الدراسة. وعلاوة على ذلك، أخذنا رعاية للحصول على أنسجة من تعامل والتحكم في الكرات من المناطق scleral متطابقة، والتقليل إلى أدنى حد من أي اختلافات في اتجاه الألياف بين العينات. وأخيراً، قمنا بتحليل ما يزيد على 100 من الصور كل عينة بغية الحصول على قيم الكثافة. ينبغي أن يكون تطبيع هذا التقييم الشامل أي إشارات SHG الشاذة التي قد تم تسجيلها. ومع ذلك، فمن الممكن أن نتيجة "استقامة الألياف" لاحظنا أن العينات cross-linked (المذكورة أعلاه) ونسبة أكبر من "في المستوى البؤري" ألياف قد ساهمت الزيادة في SHG إشارة، فضلا عن زيادة SHG إشارات من أكبر طائرة xy المحاذاة. وسيكون كل من هذه الاحتمالات مظاهر الآثار العابرة للربط المتعمد.

وأجرى تحليل إقليمي العابرة للربط التغييرات (Tm) الناجم عن حقن ش SMG. كما هو متوقع، ومستوى العابرة للربط أثر تركزت في منطقة الحقن. ولوحظ أثر cross-linking قليلاً أو لا في المنطقة مقابل (أبعد بعيداً) مباشرة من الحقن، تمشيا مع ما هو معروف بشأن إضفاء الطابع المحلي على أثر بعد حقن sT كما هو موضح بالموجات فوق الصوتية ومسلم44، 45 وحسابها بالتصوير المقطعي46.

أخيرا، فيما يتعلق بالعلاج العابرة للربط وقصر النظر، الكولاجين العابرة للربط للقرنية هو العثور على استخدامها على نطاق واسع في علاج القرنية زعزعة الاستقرار بما في ذلك المخروطية، وظيفة اسيك كيراتيكتاسياس، انحطاط هامشية شفاف (الطبيب الخاص)، وكما مساعد للعمليات الجراحية الانكسارية47. وقد أدى النجاح لعلاج الأمراض القرنية مع العابرة للربط لاستكشاف تطبيق هذا النهج في المعاملة إلى الجزء الخلفي من العين، وعلى الأخص الصلبة العينية، للحد من استطالة محورية في قصر النظر العالية2، مفهوم الذي يعود إلى المراحل المبكرة جداً من مفهوم cross-linking العلاجية48،49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون تونجالب تيزيل، دكتوراه في الطب، للتشاور بشأن حقن ش؛ تيريزا سويني، دكتوراه، للتشاور بشأن الفحص المجهري SHG؛ وجيمي دونغ من التصميم والمورد الحيوي ومرفق بيوستاتيستيكال الأساسية للمعهد ايرفينغ في المركز الطبي بجامعة كولومبيا.

دعم في جزء من البحوث "منع العمى" والمعاهد الوطنية الصحية منح نكر UL1RR024156 نيي P30 EY019007، NCI P30 CA013696 و R01EY020495 نيي (DCP). جامعة كولومبيا يملك الملكية الفكرية ذات الصلة: الولايات المتحدة إصدار براءات الاختراع لا: 8,466,203 ولا: 9,125,856. الدولي البراءات المعلقة: PCT/US2015/020276.

تم جمع الصور في كونفوكال ومنح "المتخصصة مجهرية الموارد المشتركة" من مركز السرطان الشامل ايرفينغ هربرت في جامعة كولومبيا، تدعمها المعاهد الوطنية للصحة #P30 CA013696 (المعهد الوطني للسرطان). المجهر [كنفوكل] تم شراؤها مع المعاهد الوطنية للصحة منح #S10 RR025686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59, (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33, (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90, (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196, (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27, (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91, (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35, (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42, (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11, (2), 94 (1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88, (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215, (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10, (83), 20121004 (2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92, (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58, (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14, (6), 064040 (2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13, (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238, (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34, (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32, (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36, (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33, (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24, (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17, (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25, (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17, (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33, (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30, (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87, (3), 279-285 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics