Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína

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Immunology and Infection

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Summary

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.

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Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

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Abstract

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib). Dados recentes sugerem que as moléculas de Qa-1 desempenham papéis importantes em Agrimensura células para integridade estrutural e funcional, induzindo o Regulamento imune e limitando a resposta imune a infecções virais. Além disso, funcional aumento de CD8 Qa-1-restrito+ T células através do epítopo imunização tem mostrado efeitos terapêuticos em vários modelos animais doença auto-imune, por exemplo, experimental encefalomielite alérgica, artrite induzida por colágeno e diabetes não-obesos. Portanto, há uma necessidade urgente de um método que pode eficientemente e rapidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionais em uma proteína. Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza o CD8 Qa-1-restrito+ célula T linhas específicas para uma biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas para determinar os resumos de Qa-1 em uma proteína. Esta biblioteca OLP contém 15-mer sobreposição peptídeos que cobrem todo o comprimento de uma proteína, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos. Usando este protocolo, identificamos recentemente um epítopo de Qa-1 9-mer em glicoproteína oligodendrocyte de mielina (MOG). Este recém mapeada epítopo MOG Qa-1 foi mostrado para induzir CD8 epítopo específico, Qa-1-restrito+ T células desse regulamento imune reforçado de mielina específicos. Portanto, o presente protocolo é útil para futura investigação de novos objectivos e funções de CD8 Qa-1-restrito+ T células.

Introduction

QA-1 pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib) em camundongos. Seu homólogo humano é HLA-E. Provas anteriores tem demonstrou que as moléculas de Qa-1 tem importantes funções biológicas. Em primeiro lugar, Qa-1 moléculas desempenham um papel importante no levantamento de células para a integridade estrutural e funcional. Neste aspecto, Qa-1 moléculas evoluíram diversas estratégias para monitorar a função normal de uma célula. Uma tal estratégia permite Qa-1 moléculas para formar complexos com um peptídeo líder transformados (epítopo), ou seja, o Qa-1 determinante modificador (Qdm) é processado a partir de moléculas de MHC-i clássicas no retículo endoplasmático1. Estes complexos de Qa-1/Qdm depois exibir na superfície de uma célula e ligam aos receptores inibitórios de NKG2A em células NK para inibir NK matar atividade2. Se a expressão de moléculas de MHC-i é perdida, uma célula (por exemplo, uma célula maligna) torna-se sensível para NK matar2. A outra estratégia permite Qa-1 moléculas formar novos complexos de Qa-1/epítopo na superfície de uma célula que é deficiente em TAP (transporte associado ao processamento de antígeno)3 e/ou ERAAP (retículo endoplasmático aminopeptidase associado processamento do antígeno)4 (ambas as deficiências muitas vezes ocorrem em células malignas). A célula que expressa estes novos complexos de Qa-1/epítopo pode ser reconhecida e eliminada pelo epítopo específico CD8 Qa-1-restrito+ T células. Em segundo lugar, moléculas de Qa-1 induzem Regulamento imune5. Neste aspecto, Qa-1/epítopo complexos têm sido mostrados para estimular CD8+ pilhas de T (Treg) reguladoras que são importantes para a prevenção do dano imune-mediada de autotecidos6,7,8 ,9,10. Em terceiro lugar, CD8 Qa-1-restrito+ Treg células têm sido mostradas para limitar as respostas imunes contra infecção viral11.

Portanto, aumento do específico do epítopo específico CD8 de Qa-1-restrictred+ T células é uma estratégia potencialmente promissora para a eliminação de células anormais, para o aprimoramento do Regulamento imune e para o controle da magnitude do induzida por vírus respostas imunes. Enquanto não tiver sido determinado se aumento de epítopo específico CD8 Qa-1-restrito+ T células podem reforçar a vigilância imunológica e limitar as respostas de imune induzida por vírus, nossos laboratórios e outros demonstraram claramente que imunização com resumos de Qa-1 pode aumentar a função de Qa-1-restrito CD8+ Treg células específicas para CD4 auto-imune patogénicos+ T células, levando ao controle eficiente de CD4+ doenças auto-imune mediada por células T em um variedade de animal modelos tais como encefalomielite alérgica experimental (um modelo animal do humano esclerose múltipla)6,10, artrite induzida por colágeno (um modelo animal de artrite de reumatoide humana)7, e diabetes não-obesos (um modelo animal de diabetes do tipo humano 1)8. Além disso, descobrimos que a imunização com um epítopo de Qa-1 tecido-específica leva a controle específico de inflamação imune-mediada em que o tecido através de aumento de CD8+ Treg células12. Os sucessos acima dos estudos pré-clínicos indicam a necessidade de uma avaliação completa de Qa-1 epítopo imunização para o tratamento de doenças de tecido-específica imune-mediada e potencialmente para o tratamento de outras doenças associadas com deficiências na TAP e ERAAP.

Nesse sentido, há uma demanda por uma tecnologia que pode confiantemente e rapidamente analisar resumos de Qa-1 em uma proteína. A este respeito, foi descrito um número limitado de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes. A maioria destes resumos de Qa-1 foram identificada por acaso durante o estudo de CD8+ T célula respostas para bactérias13, células deficientes em torneira3, células deficientes em ERAAP4e células que causam EAE6, 9. Portanto, uma técnica de alta taxa de transferência é desejável para a identificação de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes em uma proteína definido. A seguir, descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas que mapeia funcionais epitopos de Qa-1 em uma proteína usando CD8 Qa-1-resrticted+ célula T linhas específicas para o pool OLP (OLP_pool) de uma proteína.

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Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com um protocolo de uso aprovado pelo Comité de uso, a Universidade do Texas em El Paso e a Universidade de Loma Linda e cuidado Animal e institucional Cuidado Animal.

1. geração de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína

  1. Projete uma biblioteca da OLP na qual todos os peptídeos são mer-15 de comprimento, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos.
    Nota: No estudo MOG OLP, sequência do precursor MOG [Mus musculus] foi obtida em banco de dados da proteína NCBI, seguindo este link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Utilizou-se o precursor MOG (247 aminoácidos), que continha tanto sinal e péptidos maduros, porque a maioria de epitopos de Qa-1 (HLA-E) relatados localizavam-se em peptídeos de sinal (por exemplo, Qdm1). Começando na sua extremidade N-terminal, as sequências de peptídeos mer-15 foram identificadas tais que dois peptídeos adjacentes sobrepunham por 11 aminoácidos (Figura 1). Daí, exatamente 59 OLPs foram identificados no 247 aminoácido precursor MOG. No entanto, a última OLP pode variar de 12 a 15-mer dependendo do comprimento da proteína. Além disso, nós escolhemos 15-mer biblioteca porque nós e outros mostraram que 15-mer peptídeos, quando adicionado em células dendríticas (DCs) ou macrófagos, podem ser eficientemente transformadas em resumos de reconhecimento CD8+ T células14,15 .
  2. Compre cada peptídeo individual comercialmente. 5 mg / peptídeo deve ser suficiente para o rastreio. OLPs e peptídeos truncados (etapa 6.1) podem ser demolhados peptídeos (pureza é aproximadamente 50-70%). A pureza do ideal do peptide (passo 6.2) que será usado para a geração de tetrâmero e para futuras análises biológicas deve ser > 90%. Reconstitua os peptídeos sob condição estéril.
  3. Faça 50 mg/mL existências individuais peptídeo em 100% DMSO. 5 mg de cada peptídeo, adicionar 100 μL de DMSO em cada tubo, misture e armazenar os peptídeos a-20 ° C. Essas ações serão usadas para fazer um estoque de OLP_pool para a geração de CD8+ célula T linhas reativa para o OLP_pool. Além disso, essas ações também serão usadas para fazer 10 mg/mL estoques de peptídeo individuais para determinar a capacidade de cada peptídeo individual para estimular uma resposta Qa-1-restrito em um OLP_pool-reativa CD8+ linha de células T.
  4. Estoque de OLP_pool fazer adicionando um volume igual de cada peptídeo em um tubo de fresco. Este estoque de OLP_pool contém 100% DMSO. No estudo de MOG OLP, havia 59 OLPs12. Portanto, a concentração de cada peptídeo no OLP_pool era 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. Fazer 10 mg/mL existências individuais peptídeo por diluição (5x) o estoque de 50 mg/mL em estéril H2O em um prato fundo-V 96 poços (este estoque contém 20% DMSO). Faça estes estoques em uma placa de 96 poços, porque a determinação da resposta de cada indivíduo peptídeo Qa-1-restrito será executada em uma placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal 8 ou 12 canais.
    Nota: Todos os peptídeos, incluindo OLPs e peptídeos truncados, devem ser diluídos em ou uma placa de 96 V-inferior ou um rack de amostra de 96 poços preenchido com tubos de 1 mL, desde que o rastreio de biblioteca de peptídeo é realizado em placas de 96 poços, com uma pipeta multicanal. Se é difícil diluir um peptídeo, adicione 1 gota de NaOH N sábia ajudar a dissolver o peptídeo.

2. preparação de Kb-/- Db-/- CD8+ células T com o K pulsada OLP_poolb-/- Db-/- células dendríticas (DCs).

Nota: Existem dois alelos de Qa-1 principais: uma é Qa-1um, e o outro é Qa-1b. Desde os animais usados para pesquisa acadêmica, por exemplo C57BL/6 e camundongos Balb/c, carregam Qa-1b, este protocolo descreve o procedimento para mapeamento Qa-1b resumos em uma proteína. CD8+ T células utilizadas neste protocolo são purificadas de Kb-/-Db-/- ratos (fundo C57BL/6), no qual CD8+ T células são restritos principalmente por moléculas de MHC-Ib não-clássica incluindo Qa-1.

  1. Produzi derivados da medula óssea DCs como descrito anteriormente,12.
    1. Brevemente, cultura suspensões de única célula da medula óssea (1 x 106 células/mL) em meio RPMI-10 (RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 5,5 x 10-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e aminoácido não essencial de 0,1 mM) contendo 10 U/mL de IL-4 e 100 U/mL de GM-CSF em uma 6-placa (4 mL/poço) a 37 ° C, 5% de CO2.
    2. Dois dias depois, remover as células não-aderentes com cuidado e adicionar mídia fresca e citocinas.
    3. Após o cultivo das células por mais dois dias, transferi células não-aderentes que contém a mídia fresca e citocinas em uma nova placa de 6.
    4. Cultura das células por mais dois dias e reabastecido com mídia fresca e citocinas contendo LPS (0,1 µ g/mL) para ativar os DCs.
    5. 24h depois, recolher os DCs para experimentos.
  2. Irradiar os DCs com 3000 Rads.
    1. Alternativamente, tratar os DCs (5 x 107 células/mL) com mitomicina C (50 μg/mL) em PBS a 37 ° C por 20 min. Adicionar RPMI-0 (RPMI 1640 sem soro) para encher o tubo (~ 12 mL) e girar as células por 10 min em uma centrífuga de mesa em 300 x sobrenadantes de descarte de g. e FOS t o procedimento de lavagem mais duas vezes. Estes três lavagens são críticas porque qualquer quantidade de rastreamento de mitomicina C pode inibir a resposta de CD8+ T células durante a co-cultura de células de DC-T.
  3. Ajuste a concentração de DC a 5 x 106 células/mL em meio livre de soro (AIM-V isento de soro suplementado com 5,5 x 10-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e aminoácido não essencial de 0,1 mM).
  4. Adicione a solução estoque de OLP_pool, que contém 100% DMSO, para os DCs, tal que a concentração de DMSO final será de 0,5% (200x). No estudo de MOG OLP, a concentração de cada OLP no OLP_pool foi 847.46 μg/mL; Portanto, a concentração final de cada OLP na cultura DC foi 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
No entanto, esta concentração pode ser escalada até 100 μg/mL, enquanto a concentração de DMSO na cultura de pilha permanece inferior a 1%.
  • Incubar os DCs em temperatura ambiente por 3 h e agite as células a cada 15 min.
  • Durante este período de incubação, purificar CD8+ T células do baço colhido ou linfonodos de Kb-/-Db-/- ratos usando um comercial CD8+ T kit de purificação de células, ajustar a concentração de células de 10 x 106 células/mL em o meio livre de soro contendo 50 U/mL interleucina 2 (IL-2) e 100 U/mL de IL-7.
  • Agora, adicione o CD8+ T células em uma placa de 48 como 0,5 mL/poço (após a adição de 0,5 mL/bem de DCs OLP_pool pulsada em passo 2.8, a concentração final do CD8+ T células será 5 x 106 células/mL).
    Nota: CD8+ T células de baço de rato e linfonodos podem ser purificadas usando o Kit de isolamento positivo CD8, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. CD8+ T células obtidas são livres de grânulos.
  • Girar para baixo os DCs OLP_pool Pulsada (300 x g, 10 min) no RT. reconstituir os DCs OLP_pool pulsada a 2 x 106 células/mL no meio livre de soro e adicionar 0,5 mL/cavidade para a placa de 48 que contém o CD8+ T células (concentração final da OLP _pool-pulsado DCs é 1 x 106 células/mL, concentração final de CD8+ T células é de 5 x 106 células/mL, concentração final de Il-2 é de 25 U/mL e a concentração final de IL-7 é de 50 U/mL). Cultura de células em 37 ° C e 5% de CO2.
  • No dia 4, remover e descartar cerca de 400 μL do meio de cultura e adicionar 500 μL do meio livre de soro fresco contendo 100 U/mL IL-2 e 100U/mL de IL-7 para cada poço. Incube as celulas em 37 ° C e 5% de CO2.
  • No dia 7 ou 8, re-estimular o CD8 aprontado-OLP_pool+ T células com o OLP_pool.
  • 3. restimulation do CD8 aprontada+ T células com macrófagos pulsado com o OLP_pool

    1. Quatro dias antes de re-estimulação do CD8 aprontado-OLP_pool+ T células, preparar a solução de grânulo de poliacrilamida de 2% (v/v): lavar 2 g de grânulos de poliacrilamida duas vezes em 20 mL livre de endotoxinas H2O ou PBS. Os grânulos de poliacrilamida de pelotas por centrifugação (400 x g) durante 5 min e ressuspender em 100 mL de PBS. Autoclave a 15 lb/m de 20 min. armazenar à temperatura ambiente.
    2. Injete camundongos intraperitonealmente com 1 mL/mouse da estéril 2% solução do grânulo poliacrilamida para atrair a migração de monócitos/macrófagos para a cavidade peritoneal,16.
    3. Quatro dias depois, sacrificar os animais por overdose de CO2 .
      1. Sob condições estéreis, cortar uma pequena abertura no centro do abdômen tais que a abertura é suficiente para a passagem de uma pipeta de transferência de 5 mL. Encher a pipeta de transferência com RPMI-0 e introduza a pipeta na cavidade abdominal através da abertura.
      2. Enxague a cavidade do abdômen por pipetagem. Pipetar para fora tanto líquido quanto possível da cavidade abdominal para um tubo estéril (estes são os macrófagos peritoneais). Repita a etapa de lavagem 4 - 5 vezes.
    4. Irradiar os macrófagos peritoneais com 3000 Rads.
      1. Alternativamente, trate os macrófagos peritoneais com mitomicina C (siga o procedimento descrito no passo 2.2).
    5. Ajuste a concentração de macrófagos peritoneais para 5 x 106 células/mL no meio livre de soro. Adicione o caldo de OLP_pool (a concentração final de DMSO é inferior a 1%) e M-CSF (concentração final = 100 U/mL).
      Nota: Neste estudo MOG OLP, usamos 0.5% DMSO. Assim, OLP_pool MOG estoque foi diluído 200X (por exemplo, 1 μL de MOG OLP_Pool estoque foi adicionado em 199 μL de macrófagos peritoneais). Portanto, a concentração final de cada OLP era 4.2 μg/mL).
    6. Adicionar 200 μL/poço (1 x 106 células/poço) em uma placa de cultura de tecidos de 48-bem e incubar a placa a 37 ° C por 4 h.
    7. Remova as células não-aderentes e os grânulos de poliacrilamida por lavagem suave com 200 μL/poço do 0-RPMI pré-aquecido.
    8. Coletar e piscina a OLP_pool aprontadas CD8+ T células de passo 2.10. Ajustar o OLP_pool aprontadas CD8+ concentração de células T a 1 x 106 células/mL no meio livre de soro contendo 25 U/mL IL-2 e 50 U/mL de IL-7. Adicione 1 mL/cavidade para a placa de 48 que contém os macrófagos peritoneais pulsada OLP_pool.
    9. Quatro dias depois, reabastecer o médio na placa de 48. Remova e descarte a cerca de 400 μL do meio de cultura nas placas de cultura de 48-bem. Adicione 500 μL de fresco médio isento de soro contendo 100 U/mL IL-2 e 100 U/mL de IL-7 em cada poço. Cultura de células em 37 ° C e 5% de CO2.
    10. Três ou quatro dias depois, examinar o CD8 OLP_pool-restimulated+ T células de resposta específicos OLP_pool, Qa-1-restrito por meio de ensaio enzima-lig immunospot (ELISPOT). Após este ponto, re-estimular o CD8+ T células a cada 7-10 dias.
      Nota: Os macrófagos são preferidos para a re-estimulação do CD8 OLP_pool-preparado+ T células. Notamos que CD8+ T células re-estimulados por macrófago cresceram melhores DCs em vitro.

    4. determinação de OLP_pool específicos, Qa-1-restrito a resposta em um CD8 OLP_pool-restimulated+ linha de células T

    Nota: Resposta específicos OLP_pool, Qa-1-restrito em um CD8 OLP_pool-restimulated+ linha de célula T é determinada pela secreção de relato após estimulação pelo OLP_pool na presença de C1R ou C1R. QA-1b células usando um ensaio IFNγ ELISPOT. C1r células podem ser obtidas comercialmente. C1R. QA-1b células podem ser geradas por transducing as células C1R com o vetor de Lentivirus Qa-1.

    1. Adicione 100 μL/poço de um anticorpo anti-IFN-γ de captura diluída em tampão de revestimento (PBS) em poços de uma placa ELISPOT.
    Selar e incubar a placa a 4 ° C durante a noite.
  • No segundo dia, descartar o buffer de revestimento contendo o anticorpo anti-IFN-γ de captura e adicionar 200 μL/bem-blocking solução (meio livre de soro) e incubar a placa por 2h, à temperatura ambiente.
  • Irradiar o C1R e C1R. QA-1b células com 9.600 Rads.
    1. Alternativamente, trate o C1R e C1R. QA-1b células com mitomicina C, conforme descrito no passo 2.2, exceto que o tempo de tratamento será de 30 min.
  • Ajuste o C1R e C1R. QA-1b células no meio livre de soro a 4 x 106 células/mL.
  • Descartar a solução de bloqueio no prato e adicionar o C1R e C1R. QA-1b células em 50 μL/poço (200.000 células/poço) e misture.
  • Adicionar 50 μL/poço de 100 x diluído OLP_pool estoque (no meio livre de soro) e misture bem. Incube a placa na temperatura de quarto para 2-3 h.
  • Ajustar o CD8 OLP_pool-restimulated+ T células de 1-2 x 106 células/mL no meio livre de soro contendo 150 U/mL de IL-7 e adicionar 50 μL/poço (50.000-100.000 células/poço) para a placa. Centrifugue a placa (58 x g), por 5 min.
  • Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO2 durante a noite.
  • Aspire a suspensão de células. Lave os poços 2 vezes com deionizada (DI) (250 μL/poço). Permitir que poços de molho por 5 min em cada etapa de lavagem.
  • Poços de lavar 3 vezes com tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% Tween20). Permitir que poços de molho por 1 minuto em cada etapa de lavagem. Descarte o tampão de lavagem.
  • Adicione 100 μL de anticorpo de detecção diluído em um tampão de diluição (PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS)).
  • Incube as placas em temperatura ambiente por 2 h.
  • Descarte a solução de anticorpo da deteção. Lave os poços 3 vezes com 250 µ l/poço lavar Buffer I. permitir poços de molho por 1 minuto em cada etapa de lavagem.
  • Adicione 100 μL/poço do conjugado enzima (Streptavidin-HRP) diluído no tampão de diluição na diluição de 1: 100.
  • Incube as placas por 1h à temperatura ambiente.
  • Descarte a solução de conjugado enzima. Lave os poços 4 vezes com 250 µ l/poço lavar Buffer I. permitir poços de molho por 1 minuto em cada etapa de lavagem.
  • Lave os poços 2 vezes com 250 µ l/poço lavar Buffer II (PBS).
  • Adicione 100 µ l de solução de substrato (mistura 1 gota = 20 µ l de cromogénio AEC com 1 mL de substrato AEC) a cada poço. Monitorar o desenvolvimento local de 5 a 60 min.
  • Quando os resultados desejados começam a aparecer, pare a reacção do substrato por lavagem poços com água destilada.
  • As placas em temperatura ambiente por 2 h secar ao ar livre ou durante a noite até que esteja completamente seco. Remoção da bandeja de plástico sob as placas irá facilitar a secagem. Armazenar as placas em um saco plástico selado no escuro até está analisada.
  • Enumere pontos manualmente inspecionando um microscópio dissecação ou usando um leitor de placas ELISPOT. Veja o resultado representativo na Figura 2.
  • 5. determinação de peptídeos individuais no OLP_pool que estimulam para a secreção de IFN-γ Qa-1 restrito em um CD8 específicas OLP_pool+ linha de células T

    1. Determinar os peptídeos individuais que estimulam a OLP_pool específicas, secreção de IFN-γ de Qa-1-restrictred em um OLP_pool específicos CD8+ linha de célula T usando o acima descrito o ensaio ELISPOT de IFN-γ (concentração final de cada individual peptídeo usado para o ELISOPT assay é 10 μg/mL). Ver resultados representativos na Figura 3.
      Nota: Um OLP-específicas, restircted-Qa-1 resposta é definida como uma resposta que é pelo menos três vezes da resposta na presença de C1R. QA-1b células mas sem a OLP. No estudo de MOG OLP, OLP68, OLP96 e OLP105 todos conhecem este critério. Portanto, todos os três OLPs potencialmente contenham resumos de Qa-112 (Figura 3). No entanto, o OLP105 consistentemente deu a resposta mais forte; Portanto, realizamos uma análise detalhada da OLP105 (Figura 4 e Figura 5)12.

    6. identificação do epítopo Qa-1 ideal em uma OLP 15-mer, que estimula a resposta epítopo específico, Qa-1-restrito em um CD8 específicas OLP_pool+ linha de células T

    1. Sintetiza péptidos C - e N-terminal truncado de um 15-mer OLP como mostrado na Figura 4.
    2. Examinar a secreção de IFN-γ em um OLP específicos CD8+ linha de célula T, estimulando o CD8+ T células com cada um dos peptídeos truncados, bem como a OLP parental 15-mer, na presença de C1R ou C1R. QA-1b células usando o acima descreveram o ensaio ELISPOT de IFN-γ. A concentração final de cada peptídeo individual utilizado para o ensaio ELISPOT é 10 μg/mL. Um peptídeo é definido como o epítopo Qa-1 ideal se o peptídeo: 1) consistentemente dá resposta de IFN-γ semelhante ou mais forte, em comparação com o original do peptide 15-mer, na presença de C1R. QA-1b células; 2) é entre 8 - 10-mer (9-mer peptídeo preferido) que são os comprimentos de peptídeo ligados a MHC-eu moléculas15,17. Ver Resultados de representante na Figura 5.

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    Representative Results

    Projeto de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína

    Começando no N-terminal de uma proteína, cada peptídeo é 15 aminoácidos (15-mer). Portanto, o primeiro peptídeo abrange a posição 1 para a posição 15. N-terminal do peptide segundo se sobrepõe com o C-terminal do peptide primeiro por 11 aminoácidos. Portanto, o segundo peptídeo abrange a posição 5, a posição 19. Desenha o resto dos peptides à extremidade do C-terminal da proteína (Figura 1). Escolhemos a biblioteca 15-mer porque nós e outros mostraram que 15-mer peptídeos, quando adicionado em células dendríticas (DCs) ou macrófagos, podem ser eficientemente transformadas em resumos de reconhecimento CD8+ T células14,15. O número de OLPs em uma biblioteca depende do comprimento de uma proteína. Além disso, a última OLP pode variar de 12 a 15-mer dependendo do comprimento da proteína. Por exemplo, glicoproteína de mielina oligodendrocyte (MOG) tem um comprimento de 247 aminoácidos. A biblioteca de MOG OLP contém 59 OLPs12. Resultados representativos apresentados neste manuscrito são a partir da análise da biblioteca MOG OLP.

    Determinação de resposta específicos OLP_pool, Qa-1-restrito em um OLP_pool-estimulada CD8+ linha de células T

    Geramos um CD8+ linha de células T que foi preparada por Kb-/-Db-/- DCs pulsado com MOG OLP_pool (MOG_pool) e restimulated por MOG_pool pulsada Kb-/-Db-/- macrófagos peritoneais conforme descrito na referido protocolo (1, 2 e 3). Para determinar a resposta potencial específico MOG_pool, Qa-1-restrito neste CD8+ linha de célula T, examinamos a resposta de CD8 esta+ linha de células T para o MOG_pool na presença de C1R ou C1R. QA-1b células usando o ensaio ELISPOT de IFN-γ (Figura 2) (etapa 4 do protocolo). Nossos dados mostraram que o CD8 estimulou-MOG_pool+ linha de célula T secretado um baixo nível de IFN-γ na presença de C1R. QA-1b células (32 ponto formando células ou SFCs) mas não C1R células (2 SFCs), sugerindo a presença de CD8+ T células que respondeu a epitopos de vinculação Qa-1 derivados de células C1R (C1R são humanos B lymphoblastoid células). SFCs foram aumentados quando o MOG_pool foi adicionado para o poço que continha células C1R (78 SFCs), sugerindo a presença de CD8+ T células que respondeu a epitopos-Qa-1. SFCs aumentaram drasticamente quando o MOG_pool foi adicionado para o poço que continha C1R. QA-1b células (320 SFCs), sugerindo a presença de CD8+ T células que respondeu a peptídeos Qa-1-vinculação. Os dados também demonstram que o MOG_pool contém epitope(s) Qa-1-vinculação.

    Determinação de peptídeos individuais no OLP_pool, que contribuem para a secreção de IFN-γ Qa-1-restrito em um OLP_pool-reativa CD8+ linha de células T

    Para determinar os peptídeos no OLP_pool, que estimulou a secreção de IFN-γ Qa-1-restrito em um MOG_pool-reativa CD8+ linha de células T, estimulou o CD8 reativo-MOG_pool+ T células com individuais 59 OLPs na presença de qualquer C1R ou C1R. QA-1b células (Figura 3) (etapa 5 do protocolo). Nossos dados mostraram que alguns SFCs foram observados em poços que continha células C1R e os OLPs. Em contraste, SFCs aumentaram em todos os poços que continha C1R. QA-1b células e os OLPs. Da Figura 2, aprendemos que CD8+ T células na presença de C1R. QA-1b sozinho também formou SFCs. Portanto, SFCs aumentados na maioria dos poços podem ser devido à estimulação inespecífica como resultado a apresentação de resumos de Qa-1 derivados de proteínas intracelulares em células C1R por moléculas o Qa-1. No entanto, os OLPs em 3 poços emoldurados em Figura 3 (B8, D12 e E9), que corresponde a 3 OLPs na Figura 3A (OLP68, OLP96 e OLP105), destacou, conheceu o critério para definir uma resposta de IFN-γ OLP específicos, Qa-1-restrito como descrito no protocolo passo 5.112. Os dados sugerem que o 3 OLPs contenham Qa-1 epitope(s). Desde que o OLP105 produzido consistentemente a resposta mais alta, realizamos uma análise detalhada do OLP10512.

    Projeto de uma biblioteca de peptídeo truncado para um OLP 15-mer

    Uma OLP 15-mer, que foi determinada a estimular a secreção de IFN-γ Qa-1-restrito no CD8 OLP_pool-reativo+ linha de célula T, precisa ser analisado para o epítopo ideal usando uma biblioteca de peptídeo truncado. Destina-se a tal biblioteca peptídeo truncado truncando progressivamente a OLP 15-mer por 1 aminoácido em seu N - e C-termini (Figura 4). Semelhante a outros MHC classe I moléculas, moléculas de Qa-1 principalmente bind para 8 - 10-mer peptídeos. Portanto, recomenda-se que o menor peptídeo truncado 6-mer de comprimento.

    Identificação do epítopo Qa-1 ideal em um 15-mer OLP que estimula a secreção de IFN-γ Qa-1-restrito em um OLP_pool-reativa CD8+ linha de células T

    Os peptídeos N - e C-terminal truncado acima são testados para a força do estimulante secreção de IFN-γ em um CD8+ linha de células T específica para o OLP_pool ou a OLP 15-mer usando o IFN-γ ELISPOT descrito acima. No estudo de epitopos de Qa-1 em MOG12, geramos um CD8+ linha de células T que foi específica para o OLP105 de MOG (Figura 5A). Uma análise mais aprofundada demonstrou que o N-terminal peptídeo 9-mer truncado conheceu os dois critérios para um epítopo ideal como descrito na etapa de protocolo 6.2 (Figura 5B). Portanto, concluímos que o N-terminal truncado 9-mer peptídeo foi o ideal epítopo Qa-1.

    Figure 1
    Figura 1: projeto de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína. Começando no N-terminal, peptídeos de 15 Duração de aminoácido (15-mer) foram identificados.N-terminal de cada peptídeo, exceto o primeiro peptídeo, sobreposto com o C-terminal do peptide anterior por 11 aminoácidos.

    Figure 2
    Figura 2: MOG_pool-estimulada CD8+ T células foram parcialmente MOG_pool específico e restrito Qa-112. In vitro CD8+ T células estimuladas por OLP_pool o MOG (MOG_pool) foram examinadas para a resposta para o MOG_pool na presença de C1R ou C1R. QA-1b células como células usando um ensaio de IFN-γ ELISPOT apresentadoras. Imagens de ELISPOT representante são mostradas. Números de ponto-formando células (SFCs) são mostradas nos cantos superiores esquerdos de cada poço. CD8+ T células: 50.000 células/poço. C1r ou C1R. QA-1b células: 200.000 células/poço.

    Figure 3
    Figura 3: análise dos OLPs no MOG_pool, que foram responsáveis para o Qa-1 restrito resposta. (A) Layout da placa de fundo V 96 poços que continha a 10 mg/mL OLPs individuais de MOG. Os números dos poços representados OLP IDs. Destaque 3 poços continham os OLPs que conheci o critério para uma resposta de IFN-γ OLP específicos, Qa-1-restrito conforme descrito na etapa 5.1 protocolo12. (B) representante SFCs em cada poço que continha uma OLP (concentração final = 4.2 μg/mL, OLP ID igualou a em "A"), o CD8 MOG_pool-reativo+ T células (50.000 células/poço) e células C1R (200.000 células/poço). (C) representante SFCs em cada poço que continha uma OLP (concentração final = 4.2 μg/mL, OLP ID igualou a em "A"), o CD8 MOG_pool-reativo+ T células (50.000 células/poço) e C1R. QA-1b células (200.000 células/poço). 3 poços emoldurados continham os OLPs que conheci o critério para um específico OLP, Qa-1-restrito IFN-γ resposta12. A figura foi adaptada de referência12Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 4
    Figura 4: projeto de peptídeos truncados de um peptídeo de 15-mer. Um peptídeo 15-mer progressivamente foi truncado em seu N - e C-termini por 1 aminoácido para 6-mer. A 15-mer e seus peptídeos truncados foram então sintetizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 5
    Figura 5: análise do epítopo Qa-1 ideal no OLP105. (A) um OLP105-estimulada CD8+ linha de células T foi examinado para resposta ao OLP68, OLP96 e OLP105 na presença de C1R ou C1R. QA-1b células usando um ensaio ELISPOT de IFN-γ. Representante de IFN-γ SFCs (números nos cantos superiores esquerdos) são mostrados. (B) o CD8 específicas OLP105+ linha de células T, como mostrado em (A), foi examinada a resposta para os peptídeos individual N - e C-terminal truncado, como mostrado na Figura 4, na presença de C1R. QA-1b células usando o ensaio ELISPOT de IFN-γ. OLP105: um OLP 15-mer. 14-N6: N-terminal truncado peptídeos OLP105. C6-14: C-terminal truncado peptídeos OLP105. CD8+ T células: 50.000 células/poço. C1R. QA-1b células: 200.000 células/poço. Os números na parte superior esquerda cantos foram SFCs por 50.000 CD8+ de células T. Retângulo vermelho marcado o poço que preencheram os critérios para definir o epítopo Qa-1 ideal em uma OLP, conforme descrito na etapa de protocolo 6.2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

    Aqui, descrevemos um protocolo para a análise de resumos de Qa-1 em uma proteína. Em relação ao presente protocolo, várias outras estratégias também foram relatadas anteriormente. Em primeiro lugar, alogênico CD8+ linhas de células T e clones foram utilizados para a identificação do Qdm1. Em segundo lugar, um putativo Qa-1-motivo da análise de Qdm foi usado para a identificação da HSP60p216-224 e um epítopo TCRBV8.19,18. Terceiros, individuais sobreposição peptídeos de uma proteína foram utilizados para imunizar os animais. Posteriormente, CD8+ T células isoladas de animais imunizados foram usadas para identificar o TCRBV8.2 peptídeo p42-50 que foi posteriormente confirmado para a ligação com Qa-16,10,19. Quarta, funcional CD8+ célula T linhas em combinação com a biblioteca de cDNA exibição foram utilizadas para a identificação do epítopo FL9 Qa-14.

    Em referência as técnicas anteriores, o uso de células alogénicas CD8+ célula T linhas e clones maio não ser adequado para a análise de epitopos de Qa-1 que são apresentados durante fisiológicas respostas imunes. Além disso, acumulando dados sugerem que o motivo descrito anteriormente só parcialmente pode representar a capacidade de ligação peptídica das moléculas do Qa-1. Portanto, o motivo de Qa-1-vinculação a exata ainda não é conhecido4. Além disso, a imunização com peptídeo individual para a identificação de epitopos de Qa-1 é trabalhosa. Finalmente, estratégia de biblioteca do cDNA exposição envolve a construção de muitos vetores que transportam comprimentos diferentes de peptídeo para transfeccao de célula. Em contraste, a estratégia de biblioteca OLP descrita aqui é simples, e os peptídeos mapeados são conhecidos por estimular o CD8 Qa-1-restrito+ T células. Portanto, a nossa estratégia tem uma vantagem única.

    A estratégia descrita aqui usa CD8 específicas OLP_pool+ T células que são gerados em vitro escorva e restimulation. Uma fonte alternativa do CD8+ T células podem ser de drenagem dos gânglios linfáticos de um kb-/-Db-/- mouse que é imunizada com a fonte de proteína20. Tais imune CD8+ T células podem então ser examinadas para respostas de IFN-γ OLPs e peptídeos truncados para a identificação de epitopos de Qa-1. Teoricamente, o na vivo imune CD8+ T células estão mais próximos à condição fisiológica do em vitro gerado CD8+ T células. No entanto, descobrimos que a resposta imune CD8+ T células diretamente purificadas de camundongos imunizados foi fraco e muitas vezes necessária em vitro restimulations para um peptide satisfatório resultado de rastreio. Além disso, este protocolo é projetado para a futura tradução para estudo humano de epitopos de HLA-E em que a imunização na vivo não é prática.

    Tecnicamente, a parte crítica do presente protocolo é a geração de CD8+ célula T linhas que são específicas para o OLP_pool ou um OLP individual. Desde complexos peptídeo/Qa-1 são instáveis em comparação a clássica complexos MHC-e/peptídeo21, depois apresentando células antígeno são pulsadas com os OLPs ou um peptídeo, as células pulsadas não devem ser lavadas extensivamente. Encontramos que células de peptídeo-pulsado, se lavou extensivamente, perdem ou reduzem significativamente a capacidade de estimular o CD8+ T células. Portanto, recomendamos lavar o antígeno do peptide-pulsado apresentando células uma vez imediatamente antes que eles são co cultivados com CD8+ T células.

    Também, devido a instabilidade dos complexos peptídeo/Qa-1, recomendamos a utilização de um meio livre de soro para o peptídeo pulsando e a estimulação de CD8+ T células. Além disso, acrescentamos rotineiramente 50 U/mL de IL-7 durante CD8+ T a cultura de células, bem como durante o IFN-γ ELISPOT do ensaio. O objetivo da IL-7 é manter a viabilidade e a função de CD8+ T células. IL-7, por si só não estimula CD8+ T células para a produção de IFN-γ.

    Semelhante a todas as estratégias, Qa-1 epitopos mapeados por esta estratégia também exigem mais investigação para significado biológico. Por exemplo, uma questão importante é se o epítopo mapeado pode ser apresentado fisiologicamente. Para resolver esta questão, a DCs podem ser transfectadas com um vetor de Lentivirus que exprime a proteína de origem epítopo (por exemplo, estudo de MOG em the MOG OLP). Posteriormente, a resposta de CD8 o epítopo específico+ T células para os DCs transduzidas é examinado. Uma resposta positiva sugere que o epítopo pode ser fisiologicamente processado e apresentado pela DCs. Além disso, consequências funcionais como resultado o reconhecimento de epítopo por CD8+ T células devem ser mais investigadas. A este respeito, as análises de epítopos Qdm e FL9 Qa-1 levaram à conclusão de que as moléculas de Qa-1 são importantes para vigilância imune1,4. Além disso, os estudos de HSP60p216, TCRBV8.1 peptídeo, a p42-50 que conduziram à conclusão de que CD8 Qa-1-restrito+ T células regulam respostas imunes através de direcionamento patogénicos CD4 células de+ T 6,7 ,9,19. Além disso, o estudo de MOG196 tem para a primeira vez que revelou CD8 Qa-1-restrito+ T células poderiam regular respostas imunes ao direcionar diretamente um tecido para impedir danos por células auto-imunes potencialmente patogénicos12 . Finalmente, análise funcional de um epítopo específico, Qa-1-restrito CD8+ célula T pode ser assistido por tetrâmero. Tal tetrâmero pode ser produzido em instalação de núcleo de tetrâmero de NIH (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) ou uma empresa. Para solicitar a geração de um tetrâmero, pode-se enviar os dados funcionais que suportam a vinculação do epítopo de Qa-1 ideal recentemente mapeado a proteína GQ-1 para a sua aprovação para a geração de um tetrâmero de Qa-1.

    Em conclusão, estudos anteriores demonstraram que CD8 Qa-1-restrito+ T células desempenham um papel importante na regulação das respostas imunes locais12. A este respeito, os danos do tecido podem ser causados por uma resposta imune que alveja diretamente o tecido. Além disso, os danos colaterais podem ser causados por uma resposta imunológica que tem como alvo um patógeno invasor. Portanto, compreender o papel da Qa-1-restrito CD8+ T em células estes dois tecidos diferentes danos é importante para suas aplicações clínicas.Para alcançar este objetivo, uma análise minuciosa dos resumos de Qa-1 em um autotecido ou um patógeno invasor é necessária. O presente protocolo será apropriado para essas análises.

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    Disclosures

    Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

    Acknowledgements

    Agradecemos a Penelope Garcia para a assistência técnica e preparação deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma pesquisa inovação Grant (RIG) do departamento de medicina da Universidade de Loma Linda (681205-2967) e uma concessão piloto da sociedade nacional de esclerose múltipla (PP1685) de XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

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    References

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