성장과 재생산 꼬마 선 충 의 화학 물질의 효과 측정

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Summary

모델 동물, 꼬마 선 충, 화학 물질의 독성을 평가 하는 기본 프로토콜을 설명 합니다. 방법은 편리 하 고 다양 한 환경 오염 물질의 위험 평가 관해서는 뿐만 아니라 의약품의 개발에 유용 합니다.

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Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (128), e56437, doi:10.3791/56437 (2017).

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Abstract

독물학 평가 기초 및 응용 생명과학 분야에서 살아있는 유기 체에 화학 물질의 효과 이해 결정적 이다. 라운드 비 포유류 땅 벌레, 꼬마 선 충, 독성 연구 편의 및 동물 윤리 문제 포유류 동물 시스템과 비교의 부족에 대 한 귀중 한 모델 생물 이다. 이 프로토콜에서 C. 선 충 에서 화학 물질의 독성 평가의 상세한 절차를 설명 합니다. 임상 항 암 약물, etoposide 인간의 topoisomerase II를 대상으로 하 고 인간 암 세포의 DNA 복제를 억제, 화학 테스트 모델로 선정 됐다. 나이-동기화 C. 선 충 알 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 또는 etoposide에 노출 됐다 고 다음 C. 선 충 의 성장 스테레오 현미경 관찰에 의해 4 일 동안 매일 모니터링 했습니다. C. 선 충 DMSO로 치료에서 계란의 총 수 고 또는 etoposide 또한 스테레오 현미경을 사용 하 여 계산 되었다. Etoposide 치료 성장과 C. 선 충의 번 식에 크게 영향을 받습니다. 비교 하 여 화학 물질의 다른 치료 기간을 가진 벌레에서 누워 계란의 총 수의 그것 수 있습니다 결정 C. 선 충 재생산에 화학 물질의 생식 독성은 가역 또는 돌이킬 수 없는. 이러한 프로토콜 모두는 다양 한 약물의 개발과 환경 유독의 위험 평가 대 한 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

독성 평가의 영양 보충 식품, 약품과 cosmeceuticals, 개발 뿐만 아니라 다양 한 환경 독 소의 위험 평가 대 한 필수적입니다. 설치류 모델은 시스템 중 하나는 가장 인기 있는 vivo에서 실험이 독성 연구; 또는, C. 선 충 등 비 포유류 유기 체는 또한 널리 이용 된다. 비 포유류 독성 평가 모델 동물 윤리 문제 뿐만 아니라 그들의 편의 비용 효율성, 관리 용이성, 속도, 및 재현성1,2 고려 하는 유용성 때문에 도움이 됩니다. ,,34.

C. 선 충, 토양에서 다양 한 기초 및 응용 생물학 및 화학 연구 모델 동물로 악용 되어 웜, 라운드. 그것은 긴 1 m m, 투명 한 선 충 류는 단순히에 고체 또는 액체 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 세균성 긴장 대장균 OP50 먹이 유지. C. 선 충 은 짧은 라이프 사이클, 그리고 야생-타입 N2 C. 선 충 약 300 알을 낳는. 따라서, 그것은 쉽게 실험 자료3,,45로 사용 될 전파 됩니다. C. 선 충 또한 널리 많은 약물과 환경 오염 물질6,7,,89의 독물학 연구에 사용 되었습니다.

빠르게 분열 하는 암 세포를 대상으로 많은 항 암 약 하기 때문에 그들은 또한 급속 하 게 나누어 골, 장 상피 세포, 머리카락 세포 등 정상 세포 손상 수 있습니다. 예를 들어 topoisomerase 억제 항 암 제 약물 표적 암 세포;의 DNA 복제 과정 따라서, 그들은 또한 빠르게 정상 세포 분열 억제. 모든 살아있는 유기 체는 topoisomerases, 그리고 이러한 topoisomerase 억제제 대부분 영향 환경 생태계6,,1011. 따라서, 약물 독성 평가 플랫폼 모델 동물을 사용 하 여 의약품 개발 환경 위험 평가 모두에 대 한 가치가 있다.

이 문서에서는, 우리 모델 C. 선 충에 독성 화학 제품으로 그 대상 topoisomerase II, 임상 항 암 에이전트 etoposide의 독성을 테스트 하는 자세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 위해 몸 크기와 선 충 C. etoposide 치료에 누워 계란의 총 수의 측정 방법을 설명 합니다.

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Protocol

참고: 전체 실험 20 ° c 낮은 먼지와 벌레와 세균 처리 하는 동안 오염 최소화 유지 깨끗 한 격리 된 실험실에서 수행 해야 합니다. 이 위해 실험 깨끗 한 벤치를 사용 하 여 알코올 램프의 불꽃에서 수행 해야 합니다.

1. C. 선 충 및 화학 시험에 대 한 계란 준비 유지 보수

  1. 유지 선 충 C. N2 (브리스톨 그리고 var) 품고 NGM 한 접시에 20 ° C에서 대장균 OP50 라이브 12 , 13.
  2. 준비 나이 동기화 계란 중 하나를 사용 하 여 표백 솔루션 치료 5 또는 시간 달걀 누워 방법 6 , , 14 15.
    참고: 전에 계란 준비, 코트와 etoposide 포함 NGM 플레이트 열 비활성화 대장균 OP50 아래 설명 된 대로. 열 비활성화 전자 대장균 OP50 대장균 6 , 16의 신진 대사 활동을 최소화 하는 데 사용 됩니다.

2. 열 비활성화 대장균의 준비 피드 OP50 C. 선 충 독성 테스트 동안

  1. 표 1에 설명 된 대로 이중 효 모 tryptone (DYT) 매체의 500 mL를 준비 하 고 대장균 OP50 경작에 한 식민지를 예방 Luria Bertani (파운드) 한 접시 5.
  2. 14 h 37 ° C에서와 150 rpm 떨고 인큐베이터에서 대장균 OP50를 품 어.
  3. 3,220 x g와 20 ° C에서 30 분 동안 원심 분리 후 모든 표면에 뜨는 DYT 매체를 제거 하 고 S-버퍼, 1 M MgSO 4, 250 µ L 5 mg/mL 콜레스테롤 (에탄올에 용 해)의 25 µ L의 25 mL의 사전 혼합 추가. 이러한 모든 솔루션은 살 균.
  4. 박테리아 resuspend와 50 mL 일회용 플라스틱 튜브에 그들을 전송.
  5. 열 비활성화에 대 한 알을 품는 resuspended 65에서 30 분 동안 물 욕조에 대장균 OP50 ° c.
  6. 차가운 실내 온도와 저장소 사용까지 4 ° C에서. 이 최대 한 달 동안 저장 될 수 있다.

3. NGM 접시 포함 하 중 1 %DMSO 또는 750 µ M의 준비 Etoposide

  1. 준비 두 깨끗 한 200 mL 유리병. 0.6 g의 NaCl, 펩, 한 천, 그리고 증류수, 195 mL는 자력의 3.4 g의 0.5 g 한 병에 추가 합니다. 다른 빈 병에는 자력을 추가.
  2. 121 ° C, 그리고 55에서 30 분 동안 물 욕조에 병 다운 멋진 15 분 압력솥이이 두 병 ° c.
  3. 0.2 mL의 1 M CaCl 2, 5mg/mL 콜레스테롤의 0.2 mL, 0.2 mL의 1 M MgSO 4, 및 1 M KPO 4 (이러한 모든 솔루션은 살 균)의 5 mL을 추가 하 고 다음 55에서 뜨거운 접시에 자석 교 반에 의해 혼합 ° c.
  4. 같은 볼륨 (각 100 mL) 2 병 혼합된 NGM 매체를 나눕니다. 다음, DMSO의 1 mL 한 병 추가, 자석 교 반을 사용 하 여 다시. 다음 단계까지 55 ° C에 물 목욕에 다른 병을 저장 합니다. Aliquot 3 mL 각 35 x 10 m m 2 페 트리 접시에 DMSO를 포함 하는 매체의. 이 단계에서 약 33 DMSO 포함 NGM 접시를 만들 수 있습니다.
  5. 자기 교를 사용 하 여 다른 병을 혼합, 75mm etoposide (재고 DMSO에 용 해)의 1 mL를 추가, 다시, 혼합 고 aliquot 절차 (3.4 단계)를 반복 합니다. 약 33 etoposide (750 µ M)-NGM 접시를 포함 하는이 단계에서 만들 수 있습니다.
    참고: 관련 된 이전 종이 6, 우리가 테스트 0, 250, 500 및 1000 µ M etoposide의. 그 데이터를 바탕으로, 우리는 선택 했다 etoposide 복용량의 750 µ M이이 종이에서.
  6. 차가운 실내 온도에 화학 포함 NGM 판 약 3 시간, 실 온에서 그들을 두어서 고 사용까지 4 ° C에서 저장.
    참고: 빛 유도 된 분해를 최소화 하기 위해 빛을 밖으로 차단, 빛에 민감한 화학 물질의 경우.
    참고: 필요에 따라 확인 누워 분석 결과, 아래와 같이 두 개의 서로 다른 화학 치료 조건을 사용 하 여 실행 될 수 있는 계란에 대 한 화학 물질 없이 정상적인 NGM 접시.
  7. 추가 100 µ L의 (설명된 단원 2)로 대장균 OP50 열 비활성화 하 고 각 NGM 접시에 확산. 화학 테스트에 대 한 20 ° C에 C. 선 충 부 화기에 건조 하룻밤 허용

4. C. 선 충 성장의 측정

  1. 이전 나이 동기화 C. 선 충 계란 1 %DMSO 750 µ M etoposide 보충 NGM 접시.
  2. C. 선 충 4 일 동안 20 ° C에서 인큐베이터에서. 스테레오 현미경을 사용 하 여 벌레를 관찰 하 고 미세한 이미지를 매일 가져가 라. 보통 20 X 배율 (1x 객 관 렌즈, 2 배 줌 확대, 그리고 10 배 접 안 렌즈 렌즈)는 C. 선 충의 성장 관찰에 적합 합니다. 또한 웜 크기 조정에 대 한 현미경 스테이지 마이크로미터의 미세한 이미지를 걸릴.
    참고: 기아 독성 시험을 적용 됩니다. 따라서, 충분 한 박테리아와 피드 또는 전송된 선 충 C. 조정 시작 부분에 숫자를 계란. 굶주림의 가능성을 제외 하려면 3 일까지 관찰.
  3. DMSO와 etoposide ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 각 시간 지점에서 치료 C. 선 충의 몸 길이 측정.
    참고: 각 샘플 측정을 위한 50 웜 통계 분석에 대 한 충분 한 있습니다.
    1. ImageJ에서 현미경 스테이지 마이크로미터 이미지를 열고 (' 파일 ' → ' 열 ').
      참고: 마이크로미터 이미지 및 웜 이미지 (4.2 단계) 같은 확대 되어야 합니다.
    2. 마이크로미터 보정 이미지에 사용 하 여 1000 µ m의 라인을 끌어 ' 직선 ' 도구.
    3. 클릭 ' 분석 ' → ' 비율 설정 ' 1000 µ m으로 입력 하 고는 ' 거리 알려진 ' 상자와 '의 길이 단위 ' 상자, 각각. 체크 ' 글로벌 ' 클릭 합니다 ' 확인 '.
    4. 벌레 이미지를 엽니다 (' 파일 ' → ' 오픈 '). 사용 하 여 각 벌레의 기능에 따라 선을 그릴 ' 자유형 선 ' 도구. 클릭 하 여 본문 길이 데이터를 가져오는 ' 분석 ' → ' 측정 '.
    5. 50 벌레에 대 한이 단계를 반복.

5. C. 선 충 달걀 누워 분석 결과

는 NGM에
  1. 품 나이 동기화 계란 접시 포함 하는 DMSO 또는 64 h etoposide (첫 번째 출생) 전 20 젊은 성인 단계까지 ° c.
    참고: 그것은 성장 측정 실험에서 벌레를 사용 하 여 선택 사항입니다. 그것은 성장을 측정 하 고 달걀 누워 분석 결과 함께 편리.
  2. 화학 물질 (조건 1, 계란 젊은 성인 단계에서 시간을 특정 기간 내 화학 치료) 없이
  3. 새 NGM 전송 5 어른 벌레 또는 화학 같은 전처리 (조건 2, 지속적인 노출의를 포함 하는 새로운 NGM 플레이트 전체 실험 기간을 통해 화학), 그리고 다음 24 헤에 대 한 그들을 품 어
    참고: 그것은 만드는 것이 좋습니다 각 치료; 대 한 3-5 NGM 플레이트를 사용 하 여 복제 이러한 복제 통계 분석에 사용할 수 있습니다.
  4. 위에서 설명한 대로 새로운 NGM 접시에 전송 및 매일 계란의 수를 계산. 계산에서 크롤 링, 사망 했으며 내부적으로 해치는 벌레ed.
  5. 벌레 아니 더, 일반적으로에 알 5 일 때까지이 단계를 반복.
  6. 계란 각 접시에서 벌레 당 배치의 수를 계산 하 고 합계이 값이 누워 계란의 총 수를 결정 하기 위해 5 일 동안 매일.
    참고: 제외 크롤 링 하는 벌레의 수 떨어져와 내부 계산에서 부 화.

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Representative Results

Etoposide (h 24-96)의 치료는 크게 C. 선 충의 성장을 지체. 외피의 96 h 후 웜 etoposide 취급 차량 취급 웜 1.04 m m (그림 1) 성장 하는 동안 몸 길이 0.86 m m 성장 했다. 성장 지체도 분명히 스테레오 현미경 관찰 (그림 2)에서 관찰 되었다. 우리 보육의 72 h에 차량 처리 벌레에서 계란을 보고 시작. 다른 한편으로, 계란 96 h etoposide 치료 후 관찰 되었다. 이러한 데이터에서 우리가 추측 etoposide 치료 C. 선 충의 첫 번째 출생 시간 지연.

누워 계란의 지연 뿐만 아니라 etoposide 치료는 크게 웜 (그림 3) 당 누워 계란의 총 수를 감소. 생식 독성, etoposide 치료 총 계란 수의 감소는 젊은 성인 웜 (그림 3B) 유무 (그림 3A) 연속 etoposide 치료에서 교양 때 관찰 되었다. 두 실험 조건 하에서 제어 처리 벌레 사이 상당한 차이가 있었다. 웜 (젊은 성인 단계에 계란)에서 일정 기간에 대 한 치료에서 계란의 총 수 웜 etoposide 지속적으로 치료의 크게 다른 아니었다. 이 비교에 대 한 통계 분석은 단방향 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 다중 비교 테스트에 의해 다음에 의해 수행 되었다.

Figure 1
그림 1: C. 선 충 에 성장의 측정 etoposide 치료. 나이-동기화 C. 선 충 계란 NGM 접시 DMSO (1%, 차량 제어)와 보완에 성장 했다 또는 etoposide (750 µ M) 24-96 h. Photomicrographs ( 그림 2참조)에 대 한 매일 찍은 그리고 몸 길이 사용 하 여 측정 되었다 ImageJ 소프트웨어입니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 됩니다 (n = 50, 그룹당 50 벌레). p < 0.01, 각 시간 지점에서 차량 제어 및 etoposide 치료 사이의 중요 한 차이점에 대 한. 학생의 t를 사용 하 여 통계 분석 수행-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 스테레오 현미경 이미지 C. 선 충 의 치료 etoposide. 그림 1 에 설명 된 대로 C. 선 충 치료 (눈금 막대 = 1 m m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 선 충 C. etoposide 치료에서 계란의 총 수 고. 나이-동기화 C. 선 충 계란 NGM 접시 포함 된 DMSO (1%, 차량 제어)에 incubated 했다 또는 64 h etoposide (750 µ M). 다음으로, 누워 계란의 총 수는 부재 (A) 또는 (B) 5 일 동안 연속 화학 치료의 존재에서 관찰 되었다. 웜 전송 매일 정상적인 NGM 플레이트 (A), 또는 NGM 접시 같은 화학 물질과 보충: 1 %DMSO 또는 etoposide (750 µ M) (B). 달걀 누워 수 계산 되었고 벌레 당 누워 계란의 수를 계산 하려면 매일 벌레의 총 수로 나눈 값. 벌레 당 계란의 모든 숫자는 5 일 동안 표현 했다. 데이터는 quadruplicate 실험에서 평균 ± SD로 표현 됩니다. p < 0.01, 차량 제어 및 etoposide 치료 사이의 중요 한 차이점에 대 한. 학생의 t를 사용 하 여 통계 분석 수행-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보통 NGM agar 미디어-유지 관리, 그리고 달걀 누워 연속 화학 처리 없이 분석 결과 대 한 1000 mL
1. 유리병에 펩의 2.5 g, NaCl의 3 세대, 한 천의 17 g, 증류수의 975 mL를 추가 합니다.
2. 압력솥 121 ° c.에서 15 분
3. 55 ° C에서 30 분 동안 물 욕조에 진정 고 1 mL의 1 M CaCl2, 5mg/mL 콜레스테롤 (에탄올에 용 해)의 1 mL, 1 M MgSO4, KPO4의 25 mL의 1 mL를 추가 합니다.
4. 접시 (유지 보수에 대 한 90 x 15 m m 요리, 달걀 누워 분석 결과 대 한 35 x 10 m m2 요리)에 자석 교 반, 그리고 약 수와 혼합.
5. 사용까지 4 ° C에서 NGM 접시를 저장 합니다.
대장균 OP50-500 mL의 경작을 위한 DYT 미디어
1. 2.5 g의 효 모 5 g, NaCl의 추출, 펩의 8 g 그리고의 485 mL를 삼각 플라스 크에 증류수를 추가 합니다.
2. 압력솥 121 ° c.에서 15 분
3. 진정 하 고 사용까지 실내 온도에 저장 합니다.
S-버퍼-1000 mL
1. 유리병에 5.85 g의 NaCl, KH24의 6 g, K2HPO4, 1 g 및 987 mL의 증류수를 추가 합니다.
2. 6.0 솔루션의 pH를 조정 합니다.
3. 고압 121 ° c.에서 15 분
4. 진정 하 고 사용까지 실내 온도에 저장 합니다.

표 1: Receipes 문화 성장 매체 및 버퍼의.

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Discussion

이 문서에서는, 우리는 C. 선 충, 토양 선 충 류, toxicant 사례로 etoposide를 사용 하 여 화학 물질의 독성 평가 설명 합니다. 이 두 실험 조건 사용 했습니다. 첫 번째 세트에서 C. 선 충 etoposide 젊은 성인 단계에서 계란 접시 포함 하에 성장 했다 하 고 벌레 화학 물질 없이 정상적인 NGM 접시에 알 수 있었습니다. 두 번째 실험 세트에서 C. 선 충 전체 실험 기간 내내 etoposide와 지속적으로 치료 했다. 비교 하 여 두 실험 조건 사이 그 숫자의 우리 생식 독성 시험된 화합물의 가역 되었거나 돌이킬 수 없는 여부를 결정할 수 있습니다. Etoposide 크게 두 실험 조건 (그림 3)에서 누워 계란의 총 수를 감소. 이러한 데이터 암시는 초기 성장 단계 동안 etoposide의 전처리 생식 기관에 손상을 유발 하기에 충분 한, 포함 한 생식 세균 세포6; 이러한 데이터를 바탕으로, 우리 etoposide 치료 레스터 C. 선 충에서 생식 독성 유발 추측 수 있습니다.

이 방법 문서에 설명 된 선 충 C. 실험 이외에 다른 독성 테스트와 같은 수명 시험14,15, 생식 생식 세포6,17, 현미경 관찰 인 두 펌핑 속도 움직임 분석18,19 의 측정 또한 화학 독성 평가 C. 선 충에 대 한 사용할 수 있습니다. 체 외에서 배양 인간 세포 선, 1 차 셀, 줄기 세포, 및 3D 회전 타원 체 문화는 선 충 C. 실험1의 한계를 증가 시키기 위해 다양 한 화학 물질의 독성을 평가 하기 위한 다른 가능한 옵션 6,,2021.

C. 선 충에 필수적인 유전자의 진화 보존 비록 비 포유류 유기 체는 다른 단백질 시퀀스의 관점에서 인간는 소화와 장 시스템, 물질 대사, 뿐만 아니라 그것은 많은 유전자 부족. 따라서, 포유류 동물 실험과 임상 화학 물질의 독성의 전체 평가 위해 필요 합니다. 그러나, 편 및 동물 윤리 문제의 장점을 고려 하면 선 충 C. 독성 테스트 플랫폼 다양 한 화학 물질의 독성 평가 대 한 유용 하 고 실용적인 솔루션 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 연구는 한국 과학 기술과 교내 연구 그랜트 (2E27513)와 높은 부가 식품 기술 개발 프로그램 (IPET) 농업, 음식 및 시골 사변 (315067-03)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Affymetrix, USA 10906
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type
Cholesterol Sigma, USA C3045
Dimethyl sulfoxide Sigma, USA D2650
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Etoposide Sigma, USA E1383
Image J software (ver 1.4) Natinoal Institute of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Microscope camera Jenopitk, Progress Gryphax, Germany
Peptone Merck, USA 107213
35 × 10 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10035
90 × 15 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10090
Stereo microscope Nikon, Japan SMZ800N
Yeast extract Becton Dickinson, USA 212750

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References

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