Medir el efecto de productos químicos sobre el crecimiento y reproducción de Caenorhabditis elegans

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Summary

Se describe un protocolo básico para evaluar la toxicidad de productos químicos en un animal modelo, elegans de Caenorhabditis. El método es conveniente y útil para el desarrollo de productos farmacéuticos, así como para la evaluación del riesgo de diversos contaminantes ambientales.

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Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (128), e56437, doi:10.3791/56437 (2017).

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Abstract

Evaluación toxicológica es crucial para entender los efectos de sustancias químicas en los organismos vivos en los campos de la ciencia biológica básica y aplicada. Un suelo no mamíferos ronda gusano, Caenorhabditis elegans, es un organismo modelo valioso para estudios de Toxicología por su comodidad y la falta de temas de ética animal en comparación con sistemas de animales mamíferos. En este protocolo, se describe un procedimiento detallado de evaluación toxicológica de sustancias químicas en C. elegans . Un medicamento contra el cáncer clínico, etopósido, que dirige humano topoisomerasa II e inhibe la replicación del ADN de las células cancerosas humanas, fue seleccionado como modelo de pruebas químicas. Edad-sincronizado C. elegans huevos estaban expuestos a dimetilsulfóxido (DMSO) o etopósido, y entonces el crecimiento de C. elegans fue monitoreado cada día durante 4 días por la observación del microscopio estéreo. El número total de huevos puestos de C. elegans tratados con DMSO o etopósido también fue contado utilizando el microscopio estéreo. Etoposide tratamiento afectó significativamente el crecimiento y la reproducción de C. elegans. Por la comparación del número total de huevos de gusanos con períodos diferentes de tratamiento de productos químicos, se puede decidir que la toxicidad para la reproducción de productos químicos en la reproducción de C. elegans es reversible o irreversible. Estos protocolos pueden ser útiles para ambos el desarrollo de varias drogas y evaluación de riesgos de sustancias tóxicas ambientales.

Introduction

Evaluación toxicológica es esencial para el desarrollo de productos farmacéuticos y nutracéuticos, cosmecéuticos, así como la evaluación del riesgo de varias toxinas ambientales. El modelo de roedor es uno de los sistemas más populares en vivo experimentales para este estudio de la toxicología; por otra parte, organismos no mamíferos como C. elegans son también ampliamente utilizados. Modelos de evaluación toxicológica de mamíferos no son beneficiosos debido a no sólo animal cuestiones éticas, pero también su conveniencia y utilidad considerando rentabilidad, mantenimiento, velocidad y reproducibilidad1,2 ,3,4.

C. elegans, un suelo redondo gusano, ha sido explotado como un animal modelo en varios Investigación Biología y química básica y aplicada. Es un 1 mm de largo, nematodo transparente, que simplemente se mantiene en sólidos o líquidos nematodo crecimiento medios (NGM) alimentados con la cepa bacteriana de Escherichia coli OP50. C. elegans tiene un corto ciclo de vida y tipo N2 C. elegans pone unos 300 huevos. Por lo tanto, se reproduce fácilmente para ser utilizado como material experimental3,4,5. C. elegans ha sido también ampliamente utilizado en los estudios toxicológicos de muchos fármacos y contaminantes ambientales6,7,8,9.

Porque muchas drogas anticáncer destino rápidamente dividir las células cancerosas, también pueden dañar rápidamente dividiendo las células normales como médula ósea, epitelio intestinal y las células del folículo del pelo. Por ejemplo, fármacos antineoplásicos inhibidores topoisomerasa blanco el proceso de replicación del ADN de las células cancerosas; por lo tanto, inhiben rápidamente dividiendo las células normales. Todo organismo vivo tiene Topoisomerasas y estos topoisomerase inhibidores más probable impacto ambiental de los ecosistemas6,10,11. Así, una plataforma de evaluación toxicológica de drogas usando un animal modelo es valiosa para ambos el desarrollo de fármacos y evaluación del riesgo medioambiental.

En este artículo, se describen los protocolos detallados para probar la toxicidad de etopósido, que es un agente contra el cáncer clínico objetivos del topoisomerase II, como una sustancia química tóxica de modelo en C. elegans. Para ello, describiremos el método de medición del tamaño corporal y el número total de huevos puestos en C. elegans tratados con etopósido.

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Protocol

Nota: todo el experimento debe realizarse en un laboratorio aislado limpio mantenido a 20 ° C con poco polvo y con minimización de contaminación durante el gusano y manejo bacteriana. Para ello, deben realizarse experimentos bajo la llama de una lámpara de alcohol o de usar un banco limpio.

1. mantenimiento de C. elegans y huevo preparación para la prueba de química

  1. mantenimiento C. elegans N2 (var. Bristol) en una placa de agar NGM hartos de vivir OP50 de e. coli a 20 º C 12 , 13.
  2. Prepare Huevos sincronizados de edad mediante lejía solución tratamiento 5 o el tiempo del huevo colocación método 6 , 14 , 15.
    Nota: antes de la preparación de huevo, capa de la placa NGM que contienen etopósido con e. coli OP50 como se describe a continuación inactivadas por calor. E. coli inactivadas por calor OP50 se utiliza para reducir al mínimo la actividad metabólica de e. coli 6 , 16.

2. Preparación de inactivadas por calor de e. coli OP50 a Feed C. elegans durante la prueba de toxicidad

  1. preparar 500 mL de medio de doble levadura triptona (DYT) como se describe en la tabla 1 y sembrar una sola Colonia de e. coli OP50 cultivadas en placa de un agar Luria-Bertani (LB) 5.
  2. Incubar el OP50 de e. coli en un incubador de agitación de 14 h a 37 ° C y 150 rpm.
  3. Después de la centrifugación durante 30 min a 3.220 x g y 20 ° C, quitar medio DYT todo sobrenadante y agregar una premezcla de 25 mL de tampón de S, 250 μl de 1 M MgSO 4 y 25 μl de colesterol 5 mg/mL (disuelto en etanol). Todas estas soluciones son estériles.
  4. Resuspender las bacterias y transferirlos a un tubo de plástico desechable de 50 mL.
  5. Para la inactivación de calor, incubar el resuspendido OP50 de e. coli en un baño de agua durante 30 min a 65 ° C.
  6. Enfriar a temperatura ambiente y almacenar a 4 ° C hasta su uso. Esto puede conservarse hasta un mes.

3. Preparación de NGM placas que contienen ya sea 1% DMSO o 750 μm Etoposide

  1. preparar dos botellas de vidrio de 200 mL limpia. Añadir 0,6 g de NaCl, 0.5 g de peptona, 3,4 g de agar y 195 mL de agua destilada y un agitador magnético a una botella. Añadir un agitador magnético a la otra botella vacía.
  2. Botellas de autoclave estos dos durante 15 min a 121 ° C y después de enfriamiento las botellas en un baño de agua durante 30 min a 55 ° C.
  3. Añadir 0,2 mL de 1 M CaCl 2, 0,2 mL de colesterol 5 mg/mL, 0.2 mL de 1 M MgSO 4 y 5 mL de 1 M KPO 4 (todas estas soluciones son estériles) y luego las mezcle por agitación magnética en un plato caliente a 55 ° C.
  4. Divide el medio mixto de NGM en dos botellas con el mismo volumen (100 mL). A continuación, añadir 1 mL de DMSO a un frasco, mezcla con agitación magnética. Guarde la otra botella en un baño de agua a 55 ° C hasta el siguiente paso. Alícuota 3 mL del medio que contiene DMSO a cada 35 x 10 mm 2 caja de Petri. Aproximadamente 33 planchas NGM que contiene DMSO pueden hacerse de este paso.
  5. Mezcla la otra botella con agitación magnética, añadir 1 mL de etopósido 75 mM (caldo disuelto en DMSO), mezclar nuevamente y repita el procedimiento alícuota (paso 3.4). Aproximadamente 33 etopósido (750 μm)-que contienen planchas NGM se puede hacer de este paso.
    Nota: En la correlación anterior papel 6, probamos 0, 250, 500 y 1.000 μm de etopósido. Basado en los datos, elegimos la 750 μm de etoposide dosis en este papel.
  6. Fresco abajo las placas NGM que contienen el producto químico a temperatura ambiente dejando a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 h y almacenarlos a 4 ° C hasta su uso.
    Nota: En el caso de productos químicos sensibles a la luz, bloquear la luz para minimizar la descomposición inducida por la luz.
    Nota: Opcionalmente, hacer una placa NGM normal sin productos químicos para el análisis, que pueden realizarse mediante dos condiciones diferentes de tratamiento químico como se describe a continuación ponedora.
  7. Agregar 100 μl de inactivadas por calor OP50 de e. coli (como se describe en sección 2) y extensión en cada plato NGM. Permita que seque durante la noche en una incubadora de C. elegans a 20 ° C para la prueba química

4. Medición del crecimiento de C. elegans

  1. transferencia el sincronizado de edad C. elegans los huevos al plato de NGM suplementado con 1% DMSO o 750 μm etopósido.
  2. C. elegans de incubar en una incubadora a 20 ° C durante 4 días. Observar los gusanos usando un microscopio estéreo y toma imágenes microscópicas de todos los días. 20 aumentos (1 X objetivo zoom de 2 aumentos y ocular de 10 X) suele ser apropiado para la observación del crecimiento de C. elegans. También tomar una imagen microscópica del micrómetro de microscopio para la calibración de gusano tamaño.
    Nota: El hambre afecta la prueba de toxicidad. Por lo tanto, la alimentación con suficientes bacterias o ajustar el transferido C. elegans números al principio del huevo. Observar hasta 3 días para excluir la posibilidad de hambre.
  3. Medir la longitud del cuerpo de C. elegans tratados con DMSO o etopósido en cada momento utilizando el software ImageJ.
    Nota: Para cada medida de la muestra, 50 gusanos son suficientes para el análisis estadístico.
    1. El ImageJ en, abra la imagen de micrómetro de etapa de microscopio (' archivo ' → ' abrir ').
      Nota: La imagen del micrómetro y el gusano imágenes (paso 4.2) deben ser el mismo aumento.
    2. Arrastre una línea de 1.000 μm en la imagen de calibración del micrómetro mediante el uso de ' recta ' herramienta.
    3. Haga clic en ' analizar ' → ' escala Set ' y entrada 1.000 μm en la ' conocida distancia ' caja y ' unidad de longitud ' de la caja, respectivamente. Compruebe ' Global ' y haga clic en ' OK '.
    4. Abrir las imágenes de gusano (' archivo ' → ' Open '). Dibujar una línea a lo largo de la característica de cada gusano utilizando ' línea a mano alzada ' herramienta. Obtener los datos de longitud de cuerpo haciendo clic en ' analizar ' → ' medida '.
    5. Repita estos pasos para 50 gusanos.

5. Ensayo de poner huevo de C. elegans

  1. edad-sincronizado de incubar huevos en el NGM la placa que contiene DMSO o etopósido para 64 h (antes del primer parto) hasta la etapa adulta joven a los 20 ° C.
    Nota: Es opcional para utilizar los gusanos de los experimentos de medición de crecimiento. Es conveniente hacer la medición de crecimiento y ensayo de puesta de huevo juntos.
  2. Transferencia 5 gusanos adultos a la NGM nuevas placas sin químicos (condición 1, tratamiento químico dentro de cierto período de tiempo, de los huevos a etapa de adulto joven) o placa NGM nueva con el mismo pretratamiento químico (condición 2, la exposición continua de productos químicos durante el periodo experimental en general) y luego les incube durante 24 h.
    Nota: Se recomienda hacer repeticiones con 3-5 placas NGM para cada tratamiento; estas repeticiones pueden utilizarse para el análisis estadístico.
  3. Transferir a la nueva placa NGM como se describió anteriormente y contar el número de huevos cada día. Cuenta los gusanos que se arrastró fuera, murieron y fueron los hatchEd.
  4. Repita estos pasos hasta que los gusanos no ponen más huevos, generalmente en 5 días.
  5. Calcular el número de huevos puestos por gusano de cada placa y sumar estos valores cada día durante 5 días para determinar el número total de huevos puestos.
    Nota: Excluye el número de gusanos que se arrastró apagado e internamente tramado del cálculo.

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Representative Results

El tratamiento de etopósido (24-96 h) había retarda significativamente el crecimiento de C. elegans. Después de 96 h de incubación, gusanos tratados con etopósido crecieron 0,86 mm de longitud corporal, mientras que los gusanos tratados con vehículo crecieron a 1,04 mm (figura 1). Retraso de crecimiento se observó también al parecer bajo observación microscopio estéreo (figura 2). Empezamos a ver los huevos de los gusanos tratados con vehículo a las 72 h de incubación. Por otro lado, se observaron huevos después de 96 h de tratamiento de etopósido. De estos datos, especulamos que el etopósido tratamiento retrasa el primer tiempo del nacimiento de C. elegans.

Además de la demora de la ponedora, etopósido tratamiento disminuyó significativamente el número total de huevos puestos por gusano (figura 3). La toxicidad reproductiva, la disminución del número de huevos total por tratamiento de etopósido, observó cuando los gusanos adultos jóvenes fueron cultivados en la presencia (figura 3B) o ausencia (Figura 3A) de etopósido continuo tratamiento. No hubo diferencias significativas entre los gusanos tratados con control bajo ambas condiciones experimentales. El número total de huevos de gusanos tratados durante un tiempo (de los huevos a la etapa de adulto joven) no fue significativamente diferente de la de gusanos continuamente tratados con etopósido. Para esta comparación, el análisis estadístico se realizó por una vía análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Figure 1
Figura 1: Medición del crecimiento en C. elegans tratados con etopósido. Edad-sincronizado C. elegans huevos fueron cultivados en placas de NGM complementadas con DMSO (1%, el control del vehículo) o etopósido (750 μm) por 24-96 h. Microfotografías (se muestra en la figura 2) fueron tomados todos los días, y se midió la longitud del cuerpo con Software ImageJ. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (SD) (n = 50, 50 lombrices por grupo). p < 0.01, de diferencias significativas entre el tratamiento control y etopósido del vehículo en cada momento. El análisis estadístico fue realizado usando el estudiante t-pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes de microscopio estéreo de C. elegans trataron con etopósido. C. elegans fueron tratados como se describe en la figura 1 (barra de escala = 1 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Número Total de huevos puestos de C. elegans tratados con etopósido. Edad-sincronizado C. elegans huevos se incuban en placas, NGM con DMSO (1%, el control del vehículo) o etopósido (750 μm) 64 h. A continuación, el número total de huevos se observó en la ausencia (A) o presencia (B) del tratamiento químico continuo durante 5 días. Gusanos se transfirieron todos los días a la placa NGM normal (A), o placa NGM complementada con los mismos productos químicos: 1% DMSO o etopósido (750 μm) (B). El número de huevos puestos fue contado y dividido por el número total de gusanos todos los días para calcular el número de huevos puestos por gusano. Se suman todos los números de huevos por gusano para 5 días. Los datos se expresan como la media ± SD de experimentos cuatriplicados. p < 0.01, de diferencias significativas entre el tratamiento control y etopósido de vehículo. El análisis estadístico fue realizado usando el estudiante t-pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medios de agar normal NGM – 1.000 mL para mantenimiento y análisis sin tratamiento químico continuo de postura
1. Agregar 2,5 g de peptona, 3 g de NaCl, 17 g de agar y 975 mL de agua destilada en una botella de vidrio.
2. autoclavar durante 15 min a 121 ° C.
3. enfriar en baño de agua durante 30 min a 55 ° C y añadir 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg/mL (disuelto en etanol) 1 mL de 1 M MgSO4, 25 mL de KPO4.
4. mezclar con agitación magnética y, a continuación, alícuota en placas de Petri (platos 90 x 15 mm para el mantenimiento; platos de 35 x 10 mm2 para el ensayo de ponedora).
5. Almacene las planchas NGM a 4 ° C hasta su uso.
Medios para el cultivo de e.coli OP50 – 500 mL de DYT
1. Agregar 2,5 g de NaCl, 5 g de levadura extracto, 8 g de peptona, y 485 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer.
2. autoclavar durante 15 min a 121 ° C.
3. enfriar y almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.
S-buffer – 1.000 mL
1. Añadir 5,85 g de NaCl, 6 g de KH2PO4, 1 g de K2HPO4y 987 mL de agua destilada en una botella de vidrio.
2. ajustar el pH de la solución a 6.0.
3. autoclave durante 15 min a 121 ° C.
4. enfriar y almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.

Tabla 1: Recetas de medios de crecimiento de cultivo y buffers.

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Discussion

En este artículo, se describe la evaluación de la toxicidad de productos químicos en C. elegans, un nematodo de suelo, uso de etopósido como un ejemplo de sustancias tóxicos. Para ello, se utilizaron dos condiciones experimentales. En el primer set, C. elegans fueron cultivadas en etopósido que contiene placas de huevos a la etapa de adulto joven, y entonces los gusanos podían poner huevos en las placas NGM normales sin productos químicos. En el segundo set experimental, C. elegans fueron tratados continuamente con etopósido durante todo el período experimental todo. Por la comparación de los números de huevos entre las dos condiciones experimentales, podemos decidir si la toxicidad para la reproducción de los compuestos probados es reversible o irreversible. Etoposide disminuyó significativamente el número total de huevos puestos en ambas condiciones experimentales (figura 3). Estos datos implica que el tratamiento previo de etopósido durante la primera etapa de crecimiento fue suficiente para inducir el daño a los órganos reproductivos, incluyendo germinales gónada células6; basado en estos datos, podríamos especular que el etopósido tratamiento irreversible indujo toxicidad para la reproducción en C. elegans.

Además de los experimentos de C. elegans que se describe en este artículo de método, otros efectos tóxicos de pruebas tales como análisis de la vida útil14,15, observación microscópica de las células germinales gónada6,17, medición de la tasa de bombeo faríngeo y movimiento análisis18,19 puede utilizarse también para la evaluación de la toxicidad química en C. elegans. Líneas de células humanas in vitro cultivados, células primarias, células madre y esferoide 3D cultura son otras posibles opciones para la evaluación de la toxicidad de productos químicos diversos para aumentar la limitación de los experimentos de C. elegans 1, 6,20,21.

Aunque hay conservación evolutiva de genes esenciales en C. elegans, el organismo de mamíferos no es diferente de los seres humanos en términos de secuencias de la proteína, el digestivo y los sistemas intestinales, metabolismo, así como carece de muchos genes. Por lo tanto, los mamíferos experimentos animales y ensayos clínicos son necesarios para la evaluación completa de la toxicidad de productos químicos. Sin embargo, teniendo en cuenta las ventajas de la comodidad y el animal cuestiones éticas, una toxicidad de C. elegans pruebas plataforma será una solución útil y práctica para la evaluación toxicológica de productos químicos diversos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por el Instituto Coreano de ciencia y tecnología beca de investigación intramuros (2E27513) y el alto valor agregado alimentos tecnología desarrollo programa (IPET) financiado por el Ministerio de agricultura, alimentación y asuntos rurales (315067-03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Affymetrix, USA 10906
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type
Cholesterol Sigma, USA C3045
Dimethyl sulfoxide Sigma, USA D2650
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Etoposide Sigma, USA E1383
Image J software (ver 1.4) Natinoal Institute of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Microscope camera Jenopitk, Progress Gryphax, Germany
Peptone Merck, USA 107213
35 × 10 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10035
90 × 15 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10090
Stereo microscope Nikon, Japan SMZ800N
Yeast extract Becton Dickinson, USA 212750

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