Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver här en enkel och snabb metod för isolering av Salmonella typhimurium-innehållande phagosomes från makrofager beläggning bakterierna med biotin och streptividin.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gutiérrez, S., Wolke, M., Plum, G., Robinson, N. Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (128), e56514, doi:10.3791/56514 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Salmonella typhimurium är en fakultativt intracellulär bakterie som orsakar gastroenterit hos människor. Efter invasionen av lamina propria, S. typhimurium bakterier snabbt upptäcks och phagocytized av makrofager, och som ingår i blåsor som kallas phagosomes för att degraderas. Isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes har använts i stor utsträckning att studera hur S. typhimurium infektion förändrar processen av phagosome mognad att förhindra bakteriell nedbrytning. Klassiskt, isolering av bakterier-innehållande phagosomes har utförts av sackaros gradient centrifugering. Men denna process är tidskrävande och kräver specialutrustning och viss fingerfärdighet. Beskrivs här är en enkel och snabb metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes från makrofager beläggning bakterierna med biotin-streptividin-konjugerad magnetiska pärlor. Phagosomes som erhålls med denna metod kan avbrytas i någon buffert val, så att utnyttjandet av isolerade phagosomes för ett brett spektrum av analyser, såsom protein, metabolit och lipid analys. Sammanfattningsvis, denna metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes är specifika, effektiv, snabb, kräver minsta utrustning och är mer mångsidig än den klassiska metoden för isolering av sackaros gradient-ultracentrifugering.

Introduction

Makrofager cirkulerande specialiserade Fagocytos celler som upptäcka, uppsluka och försämra någon främmande partikel i perifera vävnader, alltifrån apoptotiska celler till invaderande mikroorganismer såsom bakterier. Vid ytan receptormedierad erkännande av patogen specifika markörer ofta finns på ytan av mikroorganismer (känd som patogen-associerade molekylära mönster eller PAMPs), initiera makrofager en komplicerade omorganiseringen av cellulära membran i för att omringa och fagocytera patogen1.

Uppslukas patogen då innehålls av makrofager i en intracellulär vesikler som kallas phagosome. Genom en serie av fusion och fission händelser med andra blåsor som endosomes och lysosomer förvärvar patogen-innehållande phagosome en uppsättning av proteiner som krävs för eliminering av phagosomal innehåll. Enzymatisk sammansättningen av phagosome är därför mycket varierande under denna process, som kallas phagosome mognad2.

Strax efter fagocytos, den multimeric komplexa vakuolär ATPas (v-ATPas) införlivas i den phagosome membranen av fusion med endosomes3. Detta komplex använder tredjeparts ATP till pumpen protoner från cytosolen till lumen av phagosome4. Försurning av phagosome är viktigt för fusion händelser med andra blåsor5 och för aktivering av ett stort antal pH-beroende nedbrytningsvägar enzymer6. En annan multimeric enzymatisk komplex som monteras snabbt på phagosome membranet är NADPH-oxidas (NOX) komplex. NOX komplexa oxiderar NADPH för att producera reaktiva syreradikaler (ROS) som utsöndras i phagosome lumen och som väsentligt bidrar till dödandet av uppslukas mikroorganismer7.

Under de första stegen av mognad presenterar phagosomes markörer vanligtvis såsom Rab5 och Rab7 av tidiga och sena endosomes respektive tillsammans med den V0 subuniten av v-ATPas8. Fusion av phagosomes med lysosomer och sena endosomes resulterar i fagocyterat patogenen exponering för ett brett utbud av Hydrolytiska enzymer som cathepsin proteaser, lipaser och β-galaktosidas9. Försurning av lumen krävs också för aktivering av dessa enzymer. Exempelvis är klyvning av cathepsin D att producera den aktiva korta formen pH-beroende10. Dessa enzymer försämras patogenen och förmedlar produktion av patogen-derived kort peptider som presenteras av de makrofag stora histocompatibility komplex (MHC) klass II molekylerna att T-celler att utlösa en adaptiva immunsvaret11.

Därför phagosome mognad är avgörande för medfödda immunsvaret och länkar medfödd och adaptiv armarna av immunsystemet. Det är ingen överraskning att patogener har utvecklats strategier för att övervinna eliminering av makrofager genom den ovan beskrivna processen av phagosome mognad. Exempelvis hindra de intracellulära bakterierna Mycobacterium tuberculosis och Legionella pneumophila phagosome mognad av hämmande v-ATPas montering och åtföljande lumen försurning12,13 . Andra bakterier, till exempel Listeria monocytogenes eller Shigella flexneri framkalla pore bildas i phagosome membranet att fly till cytosolen14,15. Å andra sidan, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) kan ändra egenskaperna för phagosome inom den vakuol omvandla den till en lämplig plats för dess replikering16. Denna förmåga gör S. typhimurium en mycket intressant modell för att studera patogen-medierad störningar av phagosome mognad.

S. typhimurium är en fakultativt intracellulär bakterie som orsakar gastroenterit hos människor. Efter invasionen av lamina propria, S. Typhimurium bakterier snabbt upptäcks och phagocytized av makrofager, och som ingår i phagosomes17. Vissa rapporter har tidigare beskrivit att S. typhimurium-innehållande phagosomes presentera beslutsfattare för både endosomes och lysosomer18, och andra studier har funnit phagosome-Lysosomen fusion förhindras vid S. Typhimurium infektion19.

Inledningsvis phagosome mognad vid S. typhimurium infektion har undersökts med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Utvecklingen av teknik för isolering av bakterier-innehållande phagosomes aktiverat en noggrannare studie av phagosome innehållet när det gäller endosome och Lysosomen markörer. Hittills är den huvudsakliga metoden som används för isolering av bakterier-innehållande phagosomes är den subcellulär fraktioneringen på sackaros steg övertoningar18,20. Denna metod kräver dock flera centrifugering steg som kan orsaka mekaniska skador på phagosomes, kan påverka stabiliteten i phagosomal komponenter (proteiner och lipider) och är tidskrävande. Dessutom, det kräver användning av en ultracentrifugen: specialiserad utrustning som inte är tillgänglig för varje laboratorium.

Nyligen har en ny strategi har tillämpats på isoleringen av bakteriell-innehållande phagosomes, där bakteriella patogener är märkta med biotinylerade lipopetide (Lipobiotin) och senare extraheras med hjälp av streptividin-konjugerad magnetiska pärlor21 . Vi föreslår en alternativ kompletterande metod av märkning bakteriella surface amine-innehållande makromolekyler med NHS-Biotin följt av streptividin-konjugerad magnetiska pärlor. Phagosomes som erhålls med denna metod är mycket berikad med endosome och Lysosomen markörer och kan användas för ett brett spektrum av analyser, från proteinanalys omics analys. Dessutom kräver det inte specialutrustning såsom ultracentrifuges. Dessutom genom att eliminera centrifugering stegen, är både den mekaniska skadan phagosomes och mängden tid som anställd betydligt lägre. Denna metod kan lätt anpassas för isolering av phagosomes som innehåller andra bakterier, såsom den grampositiva stafylokocker, också ingår i detta manuskript. Sammanfattningsvis, denna metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes är en enkel, kostnadseffektiv och mindre tidskrävande än den klassiska isoleringen av sackaros gradient-ultracentrifugering, rendering högt berikad bakterier-innehållande phagosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alla steg som innebär användning av patogena S. typhimurium måste utföras i en BSL-2 eller högre biologisk säkerhet nivå anläggning. Kultur och beläggning av S. Typhimurium, liksom infektionen av benmärgen-derived makrofager (BMDMs) måste utföras under en LAF att förhindra kontaminering. Isolering av S. typhimurium-som innehåller phagosomes kan utföras på någon BSL-2 arbetsbänk.

utvinning av benmärg från möss för dess differentiering i makrofager utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer om djurskydd och godkänts av den Nordrhein-Westphalian statliga byrån för naturen, Miljö och konsumentskydd [Landesamt für Natur, Umwelt och Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Fil nr: 84-02.05.40.14.082 och 84-02.04.2015.A443] och universitetet i Köln.

1. Culturing S. typhimurium

  1. Inoculate S. typhimurium (SL1344 stam) från en enda bakterie koloni i 5 mL av hjärnan hjärtat infusion (BHI) buljong med en bakteriell loop.
  2. Inkubera bakteriesuspensionen i en inkubator vid 37 ° C över natten med skakning.
  3. Den följande dagen, överför 1 mL av bakteriesuspensionen till 19 mL BHI buljong i en konisk kolv och inkubera vid 37 ° C i en inkubator med skakning.
  4. Övervaka den S. typhimurium tillväxt genom att mäta den optiska densiteten (OD) på 600 nm (OD 600) med en spektrofotometer. Mätningar bör göras ungefär var 30: e min.
  5. När OD 600 når 1.0, bort bakteriesuspensionen från inkubator och överföring till 50 mL tub. Centrifugera bakterier vid 5 400 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
  6. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 10 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
  7. Centrifugera vid 5 400 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
  8. Avlägsna supernatanten och återsuspendera bakterierna i 4,9 mL steril PBS.

2. Beläggning av S. typhimurium med NHS-Biotin/streptividin-konjugerad magnetiska pärlor

  1. Tillsätt 100 µL av 10 mg/mL biotin länka lösning (NHS-Biotin upplöst i dimetyl sulfoxid, DMSO) nyberedd, till bakteriesuspensionen förberett i föregående steg. Till exempel Späd 5 mg av NHS-Biotin i 0.5 mL steril DMSO. Blanda ordentligt genom pipettering upp och ner flera gånger.
  2. Dela upp blandningen i fem 1,5 mL rör.
  3. Inkubera i 2 h i rumstemperatur (RT) på en thermoblock med konstant skakning vid 350 rpm.
  4. Centrifugera rören vid 15 000 x g i 10 min på RT och kasta bort supernatanten.
  5. Omsuspendera i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, Centrifugera vid 15 000 x g under 10 minuter vid RT och kasta bort supernatanten.
  6. Upprepa steg 2.5 två gånger att helt ta bort den överskjutande biotin länka lösning.
  7. Efter den sista tvättningen, återsuspendera pelleten i 1 mL steril PBS.
  8. Överför 100 µL 10 mg/mL streptividin-konjugerad magnetiska pärlor lösning i en 1,5 mL tub och lämna den på det magnetiska racket för 5 min.
  9. Bort lösningsmedlet med en pipett, ta streptividin-konjugerad magnetiska pärlor lösningen från magnetiska rack och resuspendera det med 1 mL biotin belagda-bakteriell suspension bereddes i steg 2,7.
  10. Inkubera i 1 h på RT på en thermoblock med konstant skakning vid 350 rpm.
  11. Placera lösningen på det magnetiska racket; vänta 5 min och ta sedan bort med en pipett bakterier som inte klibbade på väggen (hålla det i en tub märkt som " icke-belagda bakterier "). Den del som ansluter sig till väggen i röret i kontakt med magneten är biotin/streptividin-belagda bakterier.
  12. Ta bort röret som innehåller de märkta bakterierna från magnetiska rack och resuspendera i 1 mL steril PBS.
  13. Placera det igen på det magnetiska racket, vänta 5 min och Använd en pipett för att avlägsna PBS.
  14. Upprepa steg 2.13 och 2.14 två gånger att ta bort alla bakterier som inte är belagda med streptividin-konjugerad magnetiska pärlor.
  15. Efter den sista tvättningen, Återsuspendera belagda-bakterierna i 500 µL sterilt PBS och Märk röret som " belagda bakterier ".
  16. Räkna de kolonibildande enheter (cfu) av båda " icke-belagda bakterier " och " belagda bakterier " lösningar av plätering seriespädningar på BHI agarplattor. Cirka 2 x 10 8 cfu/mL av belagda-bakterier erhålls från 20 mL av inledande bakteriesuspensionen med OD 600 1.0. Hålla belagda-bakteriell suspensionen vid 4 ° C för att användas på följande dag för att infektera makrofager.

3. Infektion i BDMDs

  1. samma dag när bakterierna är belagda med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor, plåt fullt differentierade BMDMs 22 i 6 cm rätter på en densitet på 5 x 10 6 celler per maträtt.
  2. På den nästa dagen, Centrifugera belagda-bakteriell suspensionen vid 15 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
  3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) med en koncentration på 10 x 10 6 cfu/mL.
  4. Att infektera makrofager vid en multiplicity av infektion (MOI) 10, ta bort mediet från BMDMs och tillsätt 5 mL av belagda-bakteriell suspension beredd. Optimal MOI kan bedömas för varje celltyp eller experimentella syftet de isolerade phagosomes.
  5. Inkubera vid RT för 10 min att synkronisera fagocytos.
  6. Inkubera vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator för 30 min att inleda fagocytos. Andra celltyper kan kräva olika inkubationstider att säkerställa internalisering av bakterien.
  7. Ta bort mediet som innehåller bakterier från rätter och tvätta cellerna med RPMI tre gånger att ta bort icke-internaliserat bakterier.
  8. Slutligen tillsätt 10 mL av RPMI innehållande 10% FBS och 50 µg/mL gentamycin att döda alla icke-phagocytized bakterier.
  9. Inkubera de infekterade BMDMs vid 37 ° C med 5% CO 2 tills önskad tid pekar. Den önska tidpunkten måste bestämmas experimentellt enligt bakterierna och celltyp som används och syftet med analysen. För att studera tidiga phagosome-endosome fusion händelser i S. Typhimurium-infekterade BMDMs, en 30 minuters inkubation rekommenderas. För analys av senare händelser, kan phagosomes extraheras efter 2 h eller 4 h inkubation. Långvarig inkubering av makrofager med S. Typhimurium utöver 24 h resulterar i döden av makrofager. Utökad intracellulära infektion innan phagosome utvinning skulle förmodligen leda till nedbrytning av biotin molekyler. Men vi inte iakttog förlust av biotin på belagda-bakterier till 24 h.

4. Isolering av S. typhimurium-innehållande Phagosomes

  1. Förbered volymen av krävs phagosome isolering buffert en (50 mM rör, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) genom att lägga Ditiotreitol (DTT) till en slutlig koncentration på 1 mM, Cytochalasin B till en slutlig koncentration av 10 µM, och proteas och fosfatas-hämmare som rekommenderas av tillverkaren.
    Obs: DTT och Cytochalasin B måste läggas till phagosome isolering bufferten A alltid omedelbart före användning. Cytochalasin B stör cytoskelettet, underlätta bristning av cellmembranet.
  2. Vid önskad tid pekar, ta bort mediet från de infektera cellerna och tvätta med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning värmas till RT.
  3. Lägg till 750 µL av phagosome isolering buffert A per maträtt och inkubera 20 min på is. När du använder olika cell nummer, volymen av isolering buffert A bör justeras proportionellt.
  4. Lägga till 250 µL av phagosome isolering buffert B (50 mM rör, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol och 68 mM sackaros). Rock plattan att säkerställa att bufferten når hela ytan av skålen. När du använder olika cell nummer, volymen av isolering buffert B bör justeras proportionellt.
  5. Ta bort celler från skålen genom att försiktigt skrapa med en gummi-polis och överföra dem till en pre kylda 1,5 mL tub.
  6. Passerar cellsuspensionen 26G nål med en 1 mL spruta minst 15 gånger (en aspiration plus en utskjutning cell suspension som räknas som en gång). Detta är tillräckligt för att frigöra cytosoliska innehållet i BMDMs. Antalet passeringar genom nålen måste optimeras för varje celltyp.
  7. Placera cellsuspension på det magnetiska racket och vänta 5 min. Partiklarna bifogas magneten är de phagosomes som innehåller belagda - S. Typhimurium. Suspensionen innehåller resten av de cellulära komponenterna.
  8. Överför till en 1,5 mL tub märkt som " cytosol ".
  9. Ta bort röret med de isolerade phagosomes från magnetiska rack och resuspendera dem i 1 mL steril PBS.
  10. Placera phagosome fjädringen på det magnetiska racket, vänta 5 min och ta bort PBS.
  11. Upprepa steg 4.9 och 4.10 att tvätta den isolera S. typhimurium-innehållande phagosomes.
  12. Slutligen bort PBS och resuspendera phagosomes i krävs bufferten, till exempel i en radioimmunoprecipitation analysbuffert (RIPA) för proteinanalys. Ca 50-200 µg protein erhålls per urvalet enligt detta protokoll, beroende på det ursprungliga beloppet av celler och MOI infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av bakterier-innehållande phagosomes av detta protokoll kräver biotinylation av bakterier som ett första steg. Vi bedömde därför effektiviteten av S. typhimurium biotinylation konfokalmikroskopi analys av BMDMs infekterade med biotinylerade mCherry -S. typhimurium märkt med Cy5-streptividin. BMDMs var kort, infekterade som beskrivs i detta protokoll med mCherry -S. typhimurium tidigare biotinylerade men inte inkuberas med streptividin-konjugerad magnetiska pärlor. Efter inkubation vid 37 ° C i 30 min, var cellerna tvättas med varmt PBS och fast med 4% formaldehyd för 20 min på RT. fixering stoppades av omfattande tvätt med PBS. Cellerna var sedan permeabilized med 3% Triton i PBS för 5 min på RT. infekterade BMDMs var sedan inkuberas med Cy5-streptividin i 20 min vid 4 ° C. Efter omfattande tvätt utarbetades proverna för analys av konfokalmikroskopi (figur 1). Inte biotinylerade mCherry -S. Typhimurium användes som negativ kontroll. Fluorescerande signal från Cy5-streptividin observerades uteslutande i biotinylerade mCherry -S. typhimurium, bekräftar att biotinylation av bakterier var framgångsrik. Mikroskopiska analys genomfördes på confocal Mikroskop med ”60 X O2 NA: 1,40” mål. Magnetiseringen våglängder för fluorokromer var 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry), och 635 nm (Cy5) och PMT spänning var inställd på 574v, 565v och 443v, respektive.

Eftersom immunsvaret utlöses i makrofager av S. typhimurium är till stor del beroende av makrofag ytan receptor aktiveringen av bakteriell ligander, vi testade nästa om beläggning av S. typhimurium med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor kunde ändra medfödda immunsvaret i infekterade BMDMs. Vi bedömt först om beläggning av S. typhimurium kunde ändra BMDMs fagocytos kapacitet av konfokalmikroskopi. BMDMs var smittade som beskrivs i detta protokoll med mCherry -S. Typhimurium bestrukna med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor eller obestruket mCherry -S. typhimurium. Efter inkubation vid 37 ° C i 30 min, var cellerna tvättas med varmt PBS och fast med 4% formaldehyd i 20 min på RT. Efter omfattande tvätt med PBS utarbetades proverna för analys av konfokalmikroskopi. I figur 2visas phagocytized makrofager bestruket och obestruket mCherry -S. typhimurium lika.

Nästa, vi analyserat den inflammatoriska reaktionen utlöses av S. typhimurium belagd med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor (figur 3). Supernatanterna från de BMDMs som angripits av bestrukna och obestrukna S. typhimurium samlades efter 24 h av infektion för enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) utsöndras interleukin-6 (IL-6). Beläggning av S. typhimurium med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor förändrade inte signifikant den inflammatoriska responsen av makrofager.

För att bedöma renheten av de bakterier som innehåller phagosomes erhålls genom att anställa detta protokoll analyserade vi isolerade mCherry -S. typhimurium-innehållande phagosomes immunoblotting. Med specifika antikroppar mot taggen mCherry, hittade vi betydande anrikningen av mCherry-uttryckande S. typhimurium i isolerade phagosomes i jämförelse med den cytosoliska fraktionen som erhålls från samma prov (figur 4). Isolerade phagosomes innehållande mCherry - S. typhimurium som tidigare inte var belagd med biotin användes som en negativ kontroll. Dessa resultat visar att detta protokoll tillåter för rening av phagosomes som är höganrikat i bakterier.

Vi nästa utfört immunoblot analys av endosome och Lysosomen markörer i isolerade phagosomes innehållande S. typhimurium (Figur 5). De flesta av de endosome och Lysosomen markörerna observerades tydligt i phagosomes isolerad på 4 h efter infektion jämfört med 30 min. Anrikningen av endosomal markörer Rab5 och Rab7, samt Lysosomen markörer v-ATPas (V0 och V1 subenheter) och cathepsin D, observerades. Intressant, observerades endast klyvs form av cathepsin D i isolerade phagosomes på 4 h efter infektion. Klyvning av Pro cathepsin D (48 kDa) att producera korta aktiva form (33 kDa) uppstår endast i phagosomes men inte i cytosolen, visar specificiteten av detta protokoll för phagosome isolering.

Eftersom markörer från organeller som mitokondrier eller endoplasmatiska nätverket (ER) upptäcks ofta i förberedelserna av bakterier-innehållande isolerad phagosomes, S. typhimurium-innehållande isolerad phagosomes var utforskad med specifika antikroppar mot mitokondriella transportören Tomm20 och den ER protein calnexin (figur 6). Vi testade också dem med en antikropp mot enzymet glykolys GAPDH att bedöma cytosoliska kontaminering i de isolerade phagosomes. Vi hittade både mitokondrier och ER markörer i S. typhimurium-isolerade phagosomes men ingen cytosoliska förorening.

För att studera mångsidigheten av protokollet för isolering av bakterier-innehållande phagosomes, biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor tillämpades beläggning förfarande på grampositiva bakterien S. aureus. Genom att anställa samma fixering och färgning protokoll som beskrivs för mCherry -S. typhimurium (Figur 1) bekräftade vi framgångsrika biotinylation av grönt fluorescerande protein (GFP) uttrycker -S. aureus (figur 7). Dessutom upptäckte vi anrikning av endosome markören Rab7 och den Lysosomen markörer v-ATPas (V0 subunit) och cathepsin D immunoblot analys av isolerade GFP -S. aureus-innehållande phagosomes (figur 8). Klyvning av cathepsin D till sin mogna form var endast upptäckas efter 4 h av infektion i de isolera phagosome proverna men inte i de cytosoliska fraktionerna. Isolerade S. aureus-innehållande phagosomes var fri från cytosoliska föroreningar som visas av immunodetection av GAPDH.

Sammanfattningsvis har vi visat att våra phagosome isolering protokoll gör det möjligt för isolering av höganrikat bakterier-innehållande phagosomes, cytosoliska förorenade. De isolerade phagosome preparat kan användas för analys av endosome och Lysosomen markörer för att studera phagosome mognad. Dessutom visades det att detta protokoll kan användas för både gramnegativa och grampositiva bakterier och att märkning förfarandet inte påverkar immunsvaret av makrofager.

Figure 1
Figur 1: Fluorescence mikroskopi analys av biotinylerade S. typhimurium använder Cy5-streptividin. BMDMs var smittade i 30 min med mCherry -S. typhimurium som var biotinylerade (”biotinylerade S. T.”), som beskrivs i detta protokoll. Inte biotinylerade mCherry -S. typhimurium (”Inte biotinylerade S. T.”) användes som en negativ kontroll. Efter fixering och permeabilisering av cellerna inkuberades prover med Cy5-streptividin under 20 minuter vid 4 ° C. Fluorescens signal från kärnan (DAPI), mCherry -S. typhimuriumoch Cy5-streptividin analyserades med konfokalmikroskopi. Signalen från den Cy5-streptividin kan endast upptäckas i bakterier tidigare märkt med biotin, vilket bekräftar effektiv biotinylation. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopiska analys av BMDMs infekterade med mCherry -S. typhimurium belagd med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor. BMDMs var infekterade med mCherry -S.typhimurium märkt med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor som beskrivs i detta protokoll. Efter att makrofager att fagocytera bakterierna i 30 min, var celler fast med 4% formaldehyd i 20 min på RT. Belagda bakterierna phagocytized av makrofager var sedan analyseras av konfokalmikroskopi. Analysen visade att intag av belagda bakterier (”Coated S. T.”) är jämförbar med intaget av omärkta mCherry bakterier (”ej belagd S. T.”), visar att märkning med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor förändrar inte fagocytos av S. typhimurium av makrofager. Atomkärnor var fläckade DAPI för mikroskopi visualisering. Uppgifterna presenteras som menar ± S.E.M., och den statistiska signifikansen beräknas student t-test representeras * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Skalstapeln = 40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: IL-6 sekretion av BMDMs infekterade med biotin-och-streptividin-konjugerad magnetiska pärlor, märkt S. typhimurium jämfört med omärkt S. typhimurium . BMDMs var infekterade med S. typhimurium belagd med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor som beskrivs i detta protokoll. Efter 24 h av infektion samlades supernatanterna för vidare analys av IL-6 sekretion av ELISA. Supernatanterna bildar BMDMs smittade med obestruket S. typhimurium användes som kontroll. Induktion av IL-6 sekretion av belagda S. typhimurium var inte signifikant jämfört med obelagda S. typhimurium. Data visas som menar ± S.E.M., och den statistiska signifikansen beräknade med student t-test representeras * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: bakteriell anrikning i isolerade phagosomes. Anrikning av mCherry-märkta S. typhimurium i isolerade phagosomes samlas in efter 30 min och 4 h av infektion jämfördes den cytosoliska fraktionen. Β-aktin användes som en lastning kontroll. Den negativa kontrollen refererar till phagosomes isolerade använder obestruket S. typhimurium på 30 min efter infektion. Som förväntat, den slutliga utmatningen av phagosome isolering med omärkt S. typhimurium medför inte betydande mängder mCherry- eller β-aktin, visar specificiteten av protokollet. 20 µg protein lästes per prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Analys av endosome och Lysosomen markörer i isolerade S. typhimurium-innehållande phagosomes. Anrikningen av endosome markörer Rab5 och Rab7, och Lysosomen markörer v-ATPas (V0 och V1 subenheter) och cathepsin D analyserades i isolerade S. typhimurium-innehållande phagosomes extraheras efter 30 min och 4 h av infektion. Β-aktin användes som en lastning kontroll. 20 µg protein lästes per prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Analys av mitokondrier, ER och cytosoliska markörer i isolerade S. typhimurium-innehållande phagosomes. Den cytosoliska markören GAPDH, den ER markör calnexin och mitokondrie markören Tomm20 i S. typhimurium phagosomes isolerad på 30 min och 4 h efter infektion var analyseras av immunoblotting och jämfört motsvarande cytosoliska fraktioner. 20 µg protein lastades per prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Mikroskopiska analys av GFP -S. aureus infekterade makrofager. BMDMs var infekterade med S. aureus uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) märkt wiTh biotin enligt beskrivningen i metod för märkning S. typhimurium. Efter att makrofager att fagocytera bakterierna i 30 min, fixerades cellerna. Obestruket S. aureus (”inte biotinylerade S. A.”) användes som negativ kontroll. Efter fixering och permeabilisering av cellerna inkuberades prover med Cy5-streptividin under 20 minuter vid 4 ° C. Fluorescerande signalen från kärnan (DAPI), GFP -S. aureusoch Cy5-streptividin analyserades av konfokalmikroskopi. Signalen från Cy5-streptividin kunde bara ses i bakterier tidigare märkt med biotin, bekräftar effektiv biotinylation. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Analys av endosome och Lysosomen markörer i isolerade S. aureus-innehållande phagosomes. S. aureus-innehållande phagosomes isolerad på 30 min, 2 h och 4 h efter infektion, analyserades av immunoblotting för phagosomal markörer Rab5, Rab7 och v-ATPas jämfört med motsvarande cytosoliska fraktioner. 20 µg protein lastades per prov. Prover testades också med en specifik antikropp mot GAPDH, visar som isolerade S. aureus-innehållande phagosomes är fri från cytosoliska föroreningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En ny metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes beläggning bakterierna med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor beskrivs här. Efter varsam avbrott i cellmembranet, kan som innehåller bakterier phagosomes enkelt utvinnas med hjälp av en magnetisk rack. Vi visar att märkning av bakterierna bevarar patogenen förmåga att inducera inflammation och ändrar inte egenskapen fagocytos av värdcellen. Allt phagosomes som erhålls med denna metod är berikad med bakterier och endosome/Lysosomen markörer och saknar cytosoliska kontaminering.

Denna metod ger flera fördelar jämfört med den traditionella phagosome isolering metod som sysselsätter sackaros gradient separation. Det eliminerar den tidskrävande flera centrifugering steg, så att forskaren att hantera fler prover på kortare tid och få renare phagosome prover genom att enkelt öka antalet tvätt steg. Användning av detta protokoll eliminerar behovet av specialiserade och känslig utrustning, såsom ultracentrifugering. Hög hastighet centrifugering kan förändra egenskaperna hos blåsor och minska den slutliga avkastning22, som undviks i detta protokoll. Vi har också visat att beläggningen av S. typhimurium med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor förändrar inte den fagocytos kapaciteten av makrofager. Dessutom märkt induktion av IL-6 av makrofager som angripits av S. typhimurium var oförändrat jämfört med makrofager infekterade med omärkt bakterier. Därför, beläggning av S. Typhimurium inducerar inte betydande förändringar i deras patogenicitet. Till vår kunskap, beläggning av S. typhimurium utgör inte ett hinder för användningen av de isolerade phagosomes för någon av de vanliga laboratorietekniker för analys.

S. typhimurium-innehållande phagosomes isoleras genom denna metod är berikad med bakterier och nuvarande typiska endosomal och lysosomala markörer, såsom v-ATPas subenheter V0 och V1 och den kluvna mogen proteasen Cathepsin D, vilket kan upptäckas endast i de isolera phagosome fraktionerna. Dessutom, hittade vi mitokondrier och ER markörer i isolerade S. typhimurium-som innehåller phagosomes. Samspelet mellan phagosomes med ER har undersökts allmänt även om mängden proteiner från akuten i patogen-innehållande phagosomes kan variera med den patogen som studerade och celltypen. Exempelvis är phagosomes som innehåller Brucella abortus isolerade från nonprofessional fagocyter rika på ER markörer23 men inte de isolerade från makrofager24. Calnexin har upptäckts tidigare i S. Typhimurium-innehållande phagosomes isolerats av sackaros lutning18. Nära samverkan av inert pärla-innehållande phagosomes och mitokondrier har också tidigare rapporterade25, förklarar förekomsten av Tomm20 i isolerade phagosomes. Mitokondrie proteiner har hittats i isolerade phagosomes innehållande L. pneumophila26 eller Mycobacterium27. Dock upptäckt av mitokondrier komponenter i förberedelserna av isolerade patogen-innehållande phagosomes med hjälp av sackaros gradient centrifugering metoden har ofta varit tros bero på liknande tätheten av denna organell och patogen-innehållande phagosome och därmed ospecifika28. Vår metod undviker sådan kontaminering fråga och ger mer tillförlitlig information tyder på att mitokondriell membran kan mingla med phagosomal membran. Sammanfattningsvis blir det svårt att undvika ER och mitokondrie markörer i patogen-innehållande isolerad phagosomes preparat, beroende på mottagande cell och patogen. Den rekommenderade metoden för verifiering av renhet av de isolerade phagosomes är att använda etiketten-bakterier och specifik tagg antikroppar för påvisande av bakterier genom Western Blot. Vi visar också att denna isolering metod kan anpassas för andra mikroorganismer med tillgängliga ytan amine grupper som kan vara biotinylerade. Som ett exempel, vi har framgångsrikt tillämpat våra protokoll för att isolera S. aureus-som innehåller phagosomes. Phagosomes innehållande S. aureus isolerats med detta protokoll är berikad med Lysosomen och endosome markörer som v-ATPas (V0 subunit) och Rab7, respektive, men uppvisar inte cytosoliska markörer såsom GAPDH.

Endosomal/phagosomal blåsor ge unika miljöer för degraderingen av patogener, men bevara antigenerna för signalering det adaptiva immunsystemet. Även om phagosomes och mognadsprocessen har studerats i större omfattning, återstår i närmiljön i phagosome vid värd olika patogener svårfångade. Det är också oklart hur metabola förändringar i cellerna förändra phagosome mognad och dess innehåll. Därför ger protokollet beskrivs här fler möjligheter att studera phagosome biogenes och dess funktion i samband med olika sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Forskning i Robinson's lab stöds av finansiering från Köln Excellence kluster på cellulär Stress svaren i Aging-Associated sjukdomar, universitetet i Köln, Tyskland (CECAD; finansieras av DFGEN inom Excellence initiativ av den tyska federalt och statliga regeringar) och anslag från Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB 670), Köln Fortune och Maria-Pesch Foundation vid universitetet i Köln, Tyskland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link NHS Biotin Thermo Fisher Scientific 20217
FluidMag Streptavidin Chemicell 4205
PIPES Carl Roth 9156.2
MgCl2 Carl Roth A537.4
EGTA Carl Roth 3054.3
Sucrose Carl Roth 4621.1
Mannitol Carl Roth 4175.1
DTT Sigma 43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 1861280
Cytochalasin B Sigma C6762
DYNAL or DynaMag Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
SmartSpec 3000 Spectrophotometer Bio-Rad 170-2501
Bacterial loop (10µl) Sarstedt 86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMI Biochrom FG1415
PBS Biochrom L1825
Cy5-streptavidin Invitrogen SA1011
anti-beta-actin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-47778
anti-mCherry antibody Thermo Fisher Scientific PA5-34974
anti-Rab5 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46692
anti-Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20943
anti-cathepsin D antibody Santa Cruz Biotechnology sc-6486
anti-Tomm20 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-17764
anti-calnexin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46669
anti-GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20357

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9, (10), 781-795 (2008).
  3. Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3, (7), e2758 (2008).
  4. Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8, (11), 917-929 (2007).
  5. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20, (4), 415-426 (2008).
  6. Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78, (10), 739-748 (1999).
  7. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87, (1), 245-313 (2007).
  8. Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8, (4), 311-330 (2007).
  9. Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193, (3), 137-152 (2003).
  10. Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824, (1), 68-88 (2012).
  11. Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12, (4), A589-A589 (1998).
  12. Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9, (11), 1936-1947 (2008).
  13. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68, (9), 5154-5166 (2000).
  14. Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63, (11), 4231-4237 (1995).
  15. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41, (3), 188-202 (2008).
  16. Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166, (9), 5741-5748 (2001).
  17. Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
  18. Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77, (1), 35-47 (1998).
  19. Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59, (7), 2232-2238 (1991).
  20. Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, (4), 329-341 (2000).
  21. Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14, (3), 321-336 (2013).
  22. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  23. Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27, (5), 317-328 (1990).
  24. Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68, (7), 4255-4263 (2000).
  25. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, (7344), 476-480 (2011).
  26. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10, (22), 4098-4116 (2010).
  27. Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2, (3), 233-247 (2009).
  28. Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104, (47), 18520-18525 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics