चुंबकीय उत्तरदायी Lanthanide आयन Chelating फॉस्फोलिपिड सभाओं को डिजाइन करने के लिए निर्माण प्रक्रियाओं और Birefringence माप

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Summary

अत्यधिक चुंबकीय उत्तरदायी lanthanide आयन chelating polymolecular सभाओं के लिए निर्माण प्रक्रियाओं प्रस्तुत कर रहे हैं । चुंबकीय प्रतिक्रिया विधानसभा आकार, जो ट्विटर झिल्ली के माध्यम से बाहर निकालना द्वारा सिलवाया है द्वारा तय की है । ' विधानसभाओं चुंबकीय संरेखण और तापमान प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तन birefringence माप, परमाणु चुंबकीय अनुनाद और छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर करने के लिए एक मानार्थ तकनीक द्वारा निगरानी कर रहे हैं ।

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Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

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Abstract

Bicelles लिपिड मिश्रण की एक बड़ी विविधता से गठन polymolecular सभाओं की तरह स्वरित्र डिस्क रहे हैं । अनुप्रयोगों ऑप्टिकली सक्रिय और चुंबकीय स्विच जैल के गठन सहित nanotechnological घटनाओं के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) द्वारा झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक अध्ययन से लेकर । इस तरह की प्रौद्योगिकियों विधानसभा आकार, चुंबकीय प्रतिक्रिया और थर्मल प्रतिरोध के उच्च नियंत्रण की आवश्यकता है । 1, 2 का मिश्रण-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) और इसका lanthanide आयन (Ln3 +) chelating फॉस्फोलिपिड संयुग्म, 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) bicelles के रूप में अत्यधिक चुंबकीय उत्तरदायी सभाओं में इकट्ठा । bilayer परिणामों में कोलेस्ट्रॉल (चौल-OH) और स्टेरॉयड डेरिवेटिव का परिचय अद्वितीय फिजिको-रासायनिक गुणों की पेशकश विधानसभाओं के एक अन्य सेट में । एक दी लिपिड संरचना के लिए, चुंबकीय संरेखण bicelle आकार के लिए आनुपातिक है । Ln के परिसर में3 + दोनों परिमाण और संरेखण दिशा के संदर्भ में अभूतपूर्व चुंबकीय प्रतिक्रियाओं में परिणाम । हीटिंग पर बुलबुले में डिस्क की तरह संरचनाओं के तापमान प्रतिवर्ती पतन परिभाषित ताकना आकार के साथ झिल्ली फिल्टर के माध्यम से बाहर निकालना द्वारा विधानसभाओं के आयामों की सिलाई की अनुमति देता है । चुंबकीय संरेखित bicelles 5 डिग्री सेल्सियस, पुटिका पुरोगामी द्वारा परिभाषित विधानसभा आयामों में जिसके परिणामस्वरूप के लिए ठंडा द्वारा पुनर्जीवित कर रहे हैं । इस के साथ साथ, इस निर्माण प्रक्रिया और समझाया है विधानसभाओं के चुंबकीय संरेखण एक ५.५ टी चुंबकीय क्षेत्र के तहत birefringence माप द्वारा मात्रा है । birefringence संकेत, फॉस्फोलिपिड bilayer से उत्पंन, आगे bilayer में होने वाली polymolecular परिवर्तन की निगरानी सक्षम बनाता है । यह सरल तकनीक एनएमआर प्रयोगों है कि सामांयतः bicelles विशेषताएं करने के लिए कार्यरत है के लिए पूरक है ।

Introduction

Bicelles डिस्क की तरह polymolecular विधानसभाओं कई लिपिड मिश्रण से प्राप्त कर रहे हैं । 1 , 2 , 3 , 4 , 5 वे व्यापक रूप से एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किया जाता है । , 7 हालांकि, हाल के प्रयासों के लिए संभव अनुप्रयोगों के क्षेत्र का विस्तार उद्देश्य । 5 , 8 , 9 सबसे अधिक अध्ययन किया bicelle प्रणाली 1 का एक मिश्रण से बना है, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), विधानसभा के planar भाग का गठन, और 1, 2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DHPC) फॉस्फोलिपिड कवर एज । 1 , 2 , 3 bilayer रचना फॉस्फोलिपिड की आणविक ज्यामिति स्वयं इकट्ठे polymolecular संरचना की वास्तुकला हुक्म चलाना । 4 , DMPE के साथ DHPC की जगह 5 -DTPA अत्यधिक चुंबकीय उत्तरदायी और स्वरित्र bicelle प्रणालियों उत्पन्न करता है. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) bicelles की सतह पर कई और अधिक paramagnetic lanthanide आयनों (ln3 +) के साथ एसोसिएट, एक बढ़ाया चुंबकीय प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप । 10 इसके अलावा, DMPE-DTPA/Ln3 + के साथ पानी में घुलनशील DHPC अणुओं की जगह कमजोर पड़ने वाली प्रतिरोधी bicelles के गठन में सक्षम बनाता है । 11

planar polymolecular सभाओं की चुंबकीय संरेखण उनके समग्र चुंबकीय ऊर्जा द्वारा तय किया जाता है,

Equation 11)

जहाँ बी चुम्बकीय क्षेत्र की ताकत है, चुम्बकीय स्थिरांक, एन एकत्रीकरण संख्या और आणविक diamagnetic झेलते हुए anisotropy का रक्तदाब रचना bilayer. Equation 2 Equation 3 इसलिए, DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles के लिए चुंबकीय क्षेत्र की प्रतिक्रिया उनके आकार (कुल संख्या n) और आणविक diamagnetic संवेदनशीलता anisotropy Δχ द्वारा सिलवाया है । बाद आसानी से chelated Ln की प्रकृति को बदलने के द्वारा हासिल की है3 +12 , 13 , 14 , 15 शुरू कोलेस्ट्रॉल (चौल-OH) या bilayer में अंय स्टेरॉयड डेरिवेटिव दोनों कुल संख्या एन और विधानसभाओं के चुंबकीय संवेदनशीलता Δχ ट्यूनिंग की संभावना प्रदान करता है । 11 , 16 , 17 , 18 , 19 एक दिया लिपिड संरचना के लिए, बड़े विधानसभाओं और अधिक संरेखित प्रजातियों में जिसके परिणामस्वरूप, ईपत्रिका (बड़ा समग्र संख्या n) में योगदान करने में सक्षम अधिक लिपिड होते हैं । DMPC/DHPC bicelles के आकार, उदाहरण के लिए, पारंपरिक रचना लिपिड अनुपात या कुल एकाग्रता के अनुकूलन के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है । 20 , 21 , 22 हालांकि इस DMPC में संभव है/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, हीटिंग पर बुलबुले के लिए bicelle से उनके थर्मामीटरों-प्रतिवर्ती परिवर्तन प्रदान की गई है सिलाई विकल्प । झिल्ली फिल्टर के माध्यम से बाहर निकालना के रूप में यांत्रिक साधन बुलबुले के आकार देने की अनुमति देता है । चुंबकीय संरेखित bicelles 5 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा करने पर पुनर्जीवित कर रहे है और उनके आयामों पुटिका पुरोगामी से तय कर रहे हैं । 11 के साथ, हम DMPC/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) या DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) के साथ यांत्रिक निर्माण प्रक्रियाओं की क्षमता पर ध्यान केंद्रित संदर्भ प्रणालियों के रूप में । प्रक्रिया analogously काम करता है जब अंय Ln3 + से Tm3 +के साथ काम कर रहे । इन तकनीकों द्वारा की पेशकश की संभावनाओं की व्यापक रेंज में चित्रा 1 में प्रकाश डाला और बड़े पैमाने पर कहीं पर चर्चा कर रहे हैं । 23

Figure 1
चित्रा 1: संभव निर्माण प्रक्रियाओं का योजनाबद्ध सिंहावलोकन । का अध्ययन किया चुंबकीय संरेखित Ln3 + chelating polymolecular विधानसभाओं से बना रहे है या तो DMPC/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) या DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) । सूखी लिपिड फिल्म ७.४ की एक पीएच मूल्य पर एक ५० mm फॉस्फेट बफर के साथ हाइड्रेटेड है और कुल लिपिड एकाग्रता 15 मिमी है । लिपिड फिल्म के एक प्रभावी जलयोजन या तो गल चक्र फ्रीज (फुट) या हीटिंग और शीतलक चक्र (H & #38; C) की आवश्यकता है । ज & #38; ग चक्र पिछले फ्रीज गल कदम के बाद नमूनों को पुनर्जीवित करने के लिए आवश्यक हैं, या वे आगे बाहर निकालना बिना इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं, तो समय की एक लंबी अवधि में जमे हुए नमूनों को पुनर्जीवित करने के लिए. इन कदमों पर बड़े पैमाने पर चर्चा कर रहे है Isabettini एट अल23 अधिक से अधिक संरेखण polymolecular विधानसभाओं प्राप्त कर रहे हैं, लिपिड संरचना पर आधारित विभिन्न विधानसभा वास्तुकला प्रदान. bicelle आकार और चुंबकीय संरेखण ट्विटर झिल्ली फिल्टर के माध्यम से बाहर निकालना (Ext) द्वारा स्वरित्र है । प्रस्तुत संरेखण कारकों एकएफ 2 डी छोटे कोण न्यूट्रॉन कैटरिंग (बिना) एक DMPC के पैटर्न/चौल-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) नमूना या तो ८००, ४००, २००, या १०० एनएम के माध्यम से बाहर निकालना pores से गणना की गई । संस माप bicelle संरेखण है कि अधिक विस्तार में शामिल नहीं किया जाएगा के साथ साथ के एक पूरक साधन हैं । 11 , 16 एकएफ पर्वतमाला से-1 (समानांतर न्यूट्रॉन बिखरने या bicelles के सीधा संरेखण चुंबकीय क्षेत्र की दिशा के संबंध में) आइसोट्रोपिक कैटरिंग के लिए 0 ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

bicelles की संरचना बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन तकनीक की एक विस्तृत श्रृंखला के द्वारा अध्ययन किया गया है । 13 bicelles के संरेखण को एक चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में या तो एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी या छोटे कोण न्यूट्रॉन कैटरिंग (बिना) प्रयोगों का उपयोग करके मात्रा किया गया है । 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 हालांकि, बदलाव और एनएमआर 3 Ln की उपस्थिति में होने वाली चोटियों का विस्तार+ विधि के लिए गंभीर सीमाएं हैं । 15 , 26 , 27 , 28 हालांकि बिना प्रयोगों इस सीमा से ग्रस्त नहीं है, वैकल्पिक और अधिक सुलभ तकनीक समाधान में विधानसभाओं के चुंबकीय प्रेरित संरेखण की दिनचर्या ठहराव के लिए वांछनीय हैं. Birefringence माप एक व्यवहार्य और तुलनात्मक रूप से सरल विकल्प हैं । Analogously एनएमआर प्रयोगों के लिए, birefringence मापन लिपिड पुनर्व्यवस्थाओं और लिपिड bilayer में होने वाले चरणों पर बहुमूल्य जानकारी प्रकट करते हैं । इसके अलावा, ज्यामितीय बदलते तापमान के रूप में पर्यावरण की स्थिति को बदलने के साथ polymolecular विधानसभा में होने वाली परिवर्तनों पर नजर रखी है । 11 , 12 , 13 , 16 चुंबकीय प्रेरित birefringence Δn ′ फॉस्फोलिपिड प्रणालियों के विभिंन प्रकार के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । 13 , 29 , 30 Birefringence माप एक चुंबकीय क्षेत्र में चरण मॉडुलन तकनीक के आधार पर bicelles के उंमुखीकरण का पता लगाने के लिए एक व्यवहार्य तरीका है । 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , ३२ ३५ टी तक उच्च चुंबकीय क्षेत्र में birefringence के साथ bicelles की जांच की संभावना भी एम. Liebi एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया था । 13

जब ध्रुवीकरण प्रकाश एक अनिसोट्रोपिक सामग्री में प्रवेश करती है, यह एक साधारण और असाधारण तरंग में refracted हो जाएगा । 11 दो लहरों अलग वेग है और एक मंदबुद्धि δ द्वारा चरण में स्थानांतरित कर रहे हैं । मंदता δ की डिग्री मापा जाता है और एक birefringence संकेत में परिवर्तित करने के लिए सामग्री का उपयोग कर में anisotropy की डिग्री यों तो Equation 5

Equation 62)

जहां λ लेजर की तरंग दैर्ध्य है और डी नमूने की मोटाई है । फॉस्फोलिपिड ऑप्टिकली अनिसोट्रोपिक है और उनके ऑप्टिकल अक्ष उनके लंबे आणविक अक्षों के साथ मेल खाता है, हाइड्रोकार्बन पूंछ के समानांतर । 11 , 12 कोई मंदता अगर फॉस्फोलिपिड समाधान में बेतरतीब ढंग से केंद्रित है मापा जाता है । मंदबुद्धि मापा जाता है जब फॉस्फोलिपिड एक दूसरे के समानांतर गठबंधन कर रहे हैं । चुंबकीय प्रेरित birefringence चुंबकीय क्षेत्र में अणुओं के उंमुखीकरण के आधार पर एक सकारात्मक या नकारात्मक संकेत हो सकता है; Equation 5 चित्र 2देखें । x-अक्ष के समानांतर संरेखित फॉस्फोलिपिड एक ऋणात्मक में परिणाम देगा, जबकि z-अक्ष के साथ संरेखित एक धनात्मक में परिणाम होगा । Equation 5 Equation 5 कोई birefringence जब ऑप्टिकल अक्ष फॉस्फोलिपिड के रूप में प्रकाश प्रचार की दिशा के साथ मेल खाती है मनाया y-अक्ष के समानांतर संरेखित करता है ।

Figure 2
चित्रा 2: फॉस्फोलिपिड और चुंबकीय प्रेरित birefringence के इसी हस्ताक्षर के संरेखण Equation 12 मापा के हस्ताक्षर चुंबकीय क्षेत्र में फॉस्फोलिपिड के उंमुखीकरण पर निर्भर करता है । Equation 12 डैश्ड रेखाएं अणु के ऑप्टिकल अक्ष को इंगित करती हैं । प्रकाश ४५ डिग्री पर ध्रुवीकरण और y दिशा में प्रचारित है । चुंबकीय क्षेत्र बी जेड दिशा में है । यह आंकड़ा एम. Liebi से संशोधित किया गया है । 11 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

bicelles के एक आइसोट्रोपिक कोलाइडयन निलंबन के मामले में, bilayer में फॉस्फोलिपिड की व्यवस्था से प्रेरित अभिविन्यास खो जाएगा, मंदता δ zeroing... bicelles भी क्रम में अपने bilayers में ऑप्टिकली सक्रिय फॉस्फोलिपिड मालूम के लिए संरेखित करना चाहिए, ध्रुवीकरण प्रकाश की एक मंदता δ के कारण । नतीजतन, birefringence polymolecular विधानसभाओं के चुंबकीय संरेखण को यों तो एक संवेदनशील उपकरण है । Bicelles चुंबकीय क्षेत्र के लिए सीधा गठबंधन एक सकारात्मक उपज होगा, जबकि उन गठबंधन समानांतर एक नकारात्मक निकलेगा । Equation 5 Equation 5 हस्ताक्षर सेटअप के संरेखण पर निर्भर करता है और एक संदर्भ नमूने के साथ जांच की जा सकती है ।

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Protocol

1. DMPC/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) और DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) polymolecular विधानसभाओं के लिए निर्माण प्रक्रिया

  1. प्रारंभिक तैयारी
    1. इथेनॉल स्थिर क्लोरोफॉर्म (& #62; ९९% क्लोरोफॉर्म) और संकुचित हवा के साथ शुष्क के साथ एक बार निस्तब्धता द्वारा सभी कांच के बाहर धोने ।
    2. उत्पादन 2 अलग 10 मिलीग्राम/DMPC और DMPE-इथेनॉल में DTPA-स्थिर क्लोरोफॉर्म की स्टॉक समाधान (& #62; ९९% क्लोरोफॉर्म), चौल के 10 मिमी स्टॉक समाधान-ओह में इथेनॉल स्थिर क्लोरोफॉर्म (& #62; ९९% क्लोरोफॉर्म) और एक 10 मिमी स्टॉक समाधान में TmCl3 मेथनॉल.
    3. ७.४ के ०.१२१ ग्राम सोडियम dihydrogen फॉस्फेट डाईहाइड्रेट और ०.५९९ g of निर्जल di-सोडियम हाइड्रोजन फास्फेट के १०० एमएल में ultrapure एच2ओ के मिश्रण से ५० mM फॉस्फेट बफर एक पीएच मान पर तैयार करें ।
  2. शुष्क लिपिड फिल्म की तैयारी
    1. amphiphiles की आवश्यक मात्रा में वजन (DMPC, DMPE-DTPA, और वैकल्पिक चौल-OH) और एक २.५ मिलीलीटर ग्लास सिरिंज के साथ अलग 3 मिलीलीटर गिलास स्नैप-कप में3 + स्टॉक समाधान Ln ।
      1. DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1, कुल लिपिड एकाग्रता 15 मिमी) के एक 3 मिलीलीटर नमूना मात्रा के लिए, DMPC शेयर समाधान के ३.६४३५ ग्राम में वजन, DMPE के १.४७३१ जी-DTPA स्टॉक समाधान और TmCl के ०.७१२६ g3 स्टॉक समाधान ।
      2. एक 3 मिलीलीटर नमूना मात्रा के लिए DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5, कुल लिपिड 15 मिमी की एकाग्रता), DMPC स्टॉक समाधान के २.९१४८ ग्राम में वजन, DMPE के १.४७३१ जी-DTPA स्टॉक समाधान, चौल के १.०७४९ जी-ओह स्टॉक समाधान और के ०.७१२६ g TmCl3 स्टॉक समाधान ।
        चेतावनी: क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल कमरे के तापमान पर विषाक्त और अस्थिर कर रहे हैं । एक धुएं के हुड के नीचे काम और तुरंत बड़े पैमाने पर माप के साथ आगे बढ़ना ।
    2. एक 25 मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी करने के लिए स्नैप-कप की सामग्री स्थानांतरण । इसी विलायक के बारे में २.५ मिलीलीटर के साथ गोल नीचे कुप्पी में प्रत्येक स्नैप-कप फ्लश ।
    3. ४० डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी वाष्पन में वैक्यूम के तहत विलायक निकालें । ३० ००० फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए प्रारंभिक दबाव सेट जब तक विलायक के सबसे हटा दिया जाता है । दबाव को कम करने के लिए १०० पीए और एक ंयूनतम के लिए रोटेशन के तहत नमूने सूखी 2 एच । कुप्पी के कांच की दीवारों पर एक समान शुष्क लिपिड फिल्म प्राप्त करें ।
    4. 1 मिनट के लिए आर्गन की एक सतत धारा के तहत सूखी लिपिड फिल्म प्लेस हवा में लिपिड ऑक्सीकरण से बचने के लिए और निर्जलीकरण से पहले फ्रीजर में नमूना स्टोर ।
  3. शुष्क लिपिड फिल्म के जलयोजन
    1. 15 मिमी की कुल लिपिड एकाग्रता तक पहुंचने के लिए गोल नीचे कुप्पी के लिए फॉस्फेट बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. जब तक यह पूरी तरह से जम (तरल नाइट्रोजन उबलते बंद हो जाता है), तरल नाइट्रोजन में रोटेशन के तहत कुप्पी बढ़नेवाला द्वारा एक फ्रीज-गल (FT) चक्र बाहर ले, तो एक पानी स्नान में 5 मिनट के लिए नमूना रखने से ६० डिग्री सेल्सियस तक वापस गर्मी, कुप्पी लगातार घूमता सहायता पिघलने की प्रक्रिया । प्रत्येक ठंड चक्र से पहले भंवर के 30 एस लागू करें जब नमूना लिपिड फिल्म के जलयोजन सहायता तरल है ।
      नोट: कोई लिपिड फिल्म दूसरी फ्रीज गल चक्र के बाद कुप्पी दीवारों पर दिखाई जानी चाहिए ।
    3. दोहराएं कुल पांच बार 1.3.2 । एक टोपी के साथ कुप्पी बंद फॉस्फेट बफर के अनावश्यक वाष्पीकरण से बचने के लिए जब नमूना गर्म है. नमूना जम जाने पर प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।
    4. दो ताप और ठंडा करने के लिए आगे बढ़ें (ज & #38; ग) चक्र पिछले ठंड कदम से बाहर आ रहा है, या दो महीने के लिए जमे हुए रखने के लिए नमूना स्थिर करने के लिए । DMPC/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) या DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) के लिए ४० या ६० डिग्री के लिए नमूना गर्मी, क्रमशः, 1 ° c/न्यूनतम पर 5 ° c करने के लिए ठंडा करने से पहले, अधिकतम और कम से कम नमूना 5 मिनट बनाए रखें चक्र का तापमान ।
    5. अब, या तो एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र (चरण 2) में नमूने के birefringence संकेत का निर्धारण या आगे bicelle आयामों और चुंबकीय संरेखण (१.४ कदम) दर्जी के लिए नमूना बाहर निकालना ।
      नोट: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) नमूने मुख्य रूप से ७० एनएम के माध्य bicelles व्यास डीएच के साथ hydrodynamic से बना रहे है के रूप में एक संख्या 5 डिग्री सेल्सियस पर गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS) माप से प्राप्त वितरण से पता चला । ये नमूने भी एक तीव्रता वितरण से पता चला के रूप में ५०० एनएम के एक मतलब डीएच के साथ बड़ा polymolecular विधानसभाओं होते हैं । DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) नमूनों ठेठ तीव्रता वितरण ७०० एनएम के एक मतलब डीएच खुलासा के साथ आकार में अत्यधिक polydisperse हैं, जबकि संख्या वितरण एक छोटे से हावी आबादी प्रकट २०० एनएम के आकार सीमा में bicelles । अधिक विस्तृत आकार वितरण और इन नमूनों की क्रायो ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों Isabettini एट अल द्वारा सूचित किया गया है । 23
  4. polymolecular सभाओं के बाहर निकालना ।
    1. चित्रा 3में दिखाए गए के रूप में बाहर निकालना मशीन इकट्ठा । हैंडलिंग के लिए सिलिका ट्यूबों की रक्षा के साथ दस्ताने और चिमटी का प्रयोग करें । गीले फिल्टर पेपर (5) बफर की कुछ बूंदों के साथ झिल्ली फिल्टर (6) के एक इष्टतम स्थान के लिए अनुमति देने के लिए । सुनिश्चित करें कि कागज पर ओ-अंगूठी (7) शीर्ष पर रखने के बाद कोई परतों है ।
      नोट: बाहर निकालना प्रक्रिया झिल्ली फिल्टर (6) पर ८००, ४००, २०० और १०० एनएम के एक ताकना व्यास के साथ परीक्षण किया गया था; चित्र 7देखें ।
    2. ४० ° c के लिए DMPC/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) नमूनों या ६० ° c DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) नमूनों के लिए बाहर निकालना बुलबुले के गठन की गारंटी करने के लिए जल स्नान सेट करें ।
    3. एक दबाव नाइट्रोजन की बोतल एक उच्च दाब पीवीसी ट्यूब (& #62; 4 MPa) serto एडेप्टर से सुसज्जित है और झिल्ली के माध्यम से तरल पदार्थ बाहर निकालना का उपयोग करने के लिए बाहर निकालना मशीन कनेक्ट । दबाव के 1 MPa आमतौर पर झिल्ली फिल्टर के माध्यम से बाहर निकालना के लिए आवश्यक है (6) २०० एनएम और ऊपर की एक ताकना व्यास के साथ । 1.5-2.5 MPa छोटे झिल्ली फिल्टर (6) के लिए आवश्यक है १०० एनएम के एक ताकना व्यास के साथ ।
      नोट: झिल्ली फ़िल्टर बदलें यदि असामान्य रूप से उच्च दबाव (& #62; २.५ MPa) नमूना बाहर निकालना करने के लिए आवश्यक हैं (यह कॉलेस्ट्रॉल का पहला संकेत है).
    4. आवरण (10) खोलें और एक 2 मिलीलीटर ग्लास पिपेट का उपयोग कर नमूना डालें । तो कवर बंद (10) और दबाव वाल्व खुला (12) जबकि नमूना आउटलेट ट्यूब (2) पकड़े । दबाव वाल्व बंद (12) बाहर निकालना चक्र पूरा होने के बाद, वेंट और अगले चक्र के साथ जारी है ।
      नोट: गर्म जैकेट पोत (8) के साथ संपर्क में नमूना भी लंबे समय तक वाष्पीकरण से अत्यधिक नमूना नुकसान से बचने के लिए छोड़ नहीं है ।
30-60 s के लिए पर्याप्त समय है एक 3 मिलीलीटर नमूना बाहर निकालना में equilibrate करने के लिए दबाव वाल्व खोलने से पहले (12) ।
  • एक दिया झिल्ली ताकना आयाम के लिए 10 बाहर निकालना चक्र के लिए आगे बढ़ना के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । bicelle प्रणालियों के अधिकांश २०० और एक और 10 बार १०० एनएम के व्यास ताकना के साथ झिल्ली के माध्यम से झिल्ली के माध्यम से 10 बार बाहर निकाला जाता है, नमूना तुलना की गारंटी ।
  • अब, एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र (चरण 2) में नमूने के birefringence संकेत का निर्धारण ।
  • Figure 3
    चित्रा 3: प्रयोगशाला बाहर निकालना bicelle और पुटिका तैयारी के लिए इस्तेमाल किया । बाहर निकालना से ऊपर नीचे से इकट्ठे है: (1) माउंट, (2) नमूना एक २.४ मिमी (भीतरी व्यास) प्लास्टिक आउटलेट ट्यूब और ओ-अंगूठी के साथ अंतरिक्ष का संग्रह, (3) और (4) बड़े और छोटे स्थिर मेष, (5) फिल्टर कागज, (6) झिल्ली फिल्टर, (7) ओ-अंगूठी, (8) जैकेट पोत, (9 ) प्रवेश और दबाव कनेक्शन के साथ शीर्ष कवर, (10) कवर, (11) तितली शिकंजा, (12) दबाव वाल्व । इकट्ठे बाहर निकालना मशीन का एक संक्षिप्त वर्णन दाईं ओर के हाथ से दिखाया गया है । नाइट्रोजन गैस (एन2) एक दबाव पोत द्वारा आपूर्ति की है और जैकेट पोत (9) तापमान नियंत्रण के लिए एक पानी के स्नान से जुड़ा हुआ है । नमूना किसी भी दिया झिल्ली फिल्टर ताकना व्यास के लिए 10 बाहर निकालना चक्र (नमूना नीले रंग में दिखाया गया पथ) से गुजरती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    2. Birefringence मापन DMPC/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) और DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) polymolecular विधानसभाओं ।

    1. बनाएँ और चित्रा 4 में प्रस्तुत के रूप में birefringence सेटअप कनेक्ट और संबंधित इलेक्ट्रॉनिक तत्वों के लिए बिजली की आपूर्ति । इस मुकाम पर लेजर पथ में PEM, नमूना, और दूसरा ध्रुवीकरण न रखें । सतहों को प्रतिबिंबित कवर द्वारा वापस बिखरे हुए लेजर प्रकाश का पता लगाने से बचें, उदाहरण के लिए एल्यूमीनियम दर्पण धारकों, काले कागज के साथ ।
    2. डिटेक्टर पर लेजर तीव्रता को अधिकतम करने के लिए दर्पण को समायोजित करें, जो Equation 7 चित्रा 4Bमें कम पास फिल्टर से प्राप्त प्रत्यक्ष वर्तमान की तीव्रता के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है ।
      चेतावनी: उपयुक्त आंख संरक्षण पहनते है जब दर्पण का समायोजन और एक लेज़र सुरक्षा प्रशिक्षक के साथ परामर्श अगर पहली बार के लिए पराबैंगनीकिरण जोड़ तोड़ ।
    3. मुड़ें पहले रेखीय ध्रुवर (घटना लेजर बीम को सीधा बनाए रखा) को अधिकतम करने के लिए । Equation 7

    Figure 4
    चित्रा 4: birefringence सेटअप और ऑप्टिकल संकेतों के लिए कनेक्शन के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । क) एक superconducting विद्युत एक ५.५ टी चुंबकीय क्षेत्र की आपूर्ति । ६३५ एनएम पर एक डायोड लेजर से प्रकाश ध्रुवकों को पार कर दो से ध्रुवीय है । एक photoelastic मॉडुलन PEM-९० ५० KHz पर एक आयाम के साथ चल रही है0 २.४०५ राड और दो ध्रुवकों के बीच रखा. नमूना PEM और दूसरा ध्रुवीकरण के बीच चुंबक में निहित है । गैर ध्रुवीकरण दर्पण विभिन्न तत्वों के माध्यम से प्रकाश गाइड और अंत में एक फोटो डिटेक्टर से पता चला है. पहली और दूसरी हार्मोनिक और एसी संकेत की निगरानी कर रहे हैं, Ln Equation 10 Equation 11 3 + chelating polymolecular विधानसभाओं की चुंबकीय संरेखण के बारे में जानकारी देने birefringence संकेत की गणना की अनुमति. नमूना cuvette तापमान नियंत्रण (नीला) के लिए एक बाहरी जल स्नान करने के लिए जुड़ा हुआ है । तापमान जांच (लाल) के साथ नमूने के तापमान पर नजर रखी जाती है । ख) फोटो डिटेक्टर से संकेत एक दूसरे क्रम में खिलाया जाता है Sallen-कुंजी कम पास फिल्टर (24 वी एसी बिजली की आपूर्ति) के साथ एक कट-ऑफ आवृत्ति ३६० हर्ट्ज के माध्यम से एक ± 12 वी डीसी बिजली की आपूर्ति ब्रैड केबल (3). कम पास फिल्टर डीसी घटक अर्क और पीसी के लिए यह उद्धार-अंतरफलक (4) एक BNC ५० Ω केबल के माध्यम से । Equation 7 फोटो डिटेक्टर से संकेत एक BNC ५० Ω केबल (1) & #38; (2) के माध्यम से दो लॉक-एम्पलीफायरों (जो पहले और दूसरे हार्मोनिक और) को निकालने के लिए वितरित किया जाता है । Equation 10 Equation 11 हार्मोनिक तीव्रता एक चरण के प्रति संवेदनशील का पता लगाने के द्वारा पाया जाता है । नतीजतन, PEM संकेत के लिए संदर्भ संकेत के रूप में प्रयोग किया जाता है अवरोध-एम्पलीफायरों में (1f-PEM के उत्पादन में पहला ताला में एम्पलीफायर और 2f-उत्पादन में दूसरा, BNC ५० Ω केबल के साथ जुड़ा हुआ). उत्पादन संकेतों BNC ५० Ω केबल के माध्यम से पीसी अंतरफलक इकाई को दिया जाता है । एनालॉग अधिग्रहण इकाइयां-एअर इंडिया-११० और digitalize-CB-1, मॉनिटरिंग के लिए २३२ केबल के माध्यम से कंप्यूटर को स्थानांतरित किया जाता है जो संकेत है । प्रकार K तापमान जांच भी पीसी-अंतरफलक इकाई से जुड़ा हुआ है जहां एनालॉग अधिग्रहण इकाइयां विनिर्मित-सीबी-3 और digitalize-TC-१२० को निगरानी के लिए २३२ केबल के माध्यम से कंप्यूटर में स्थानांतरित करने से पहले संकेत दे रही है । ग) योजनाबद्ध सेटअप के चित्र B. Key तत्वों में प्रस्तुत 1 से 4 तक इसी संख्या के साथ पहचाने जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    1. दूसरी घटना लेजर बीम को सीधा रेखीय ध्रुवर पार प्लेस, के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया है । पहले के संबंध में एक ९० ° कोण पर दूसरा ध्रुवीकरण की स्थापना करके को छोटा करें. Equation 7
    2. photoelastic मॉडुलन (PEM) 0 ° पर दोनों के बीच रैखिक ध्रुवीकरण पार और सीधा घटना लेजर बीम के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया. एक आवृत्ति के लिए PEM समायोजित करें ५० kHz और आयाम A0 करने के लिए २.४०५ रेड के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया है । यह DC घटक को birefringence से स्वतंत्र बनाता है और को बूस्ट करता है । Equation 7
      नोट: PEM के ऑप्टिकल अक्ष किसी भी नमूने को मापने से पहले हवा में एक निरंतर बनाए रखने के लिए कुछ डिग्री से देखते हो सकता है. Equation 7
    3. संकेत को स्थिर करने के लिए लेजर और इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों पर मोड़ के बाद 1 घंटे के लिए रुको ।
    संकेत स्थिर है एक बार ऑटो-चरणबद्ध में ताला एम्पलीफायरों लगातार रहता है.
  • 10 मिमी की लंबाई एक पथ के साथ एक तापमान नियंत्रित क्वार्ट्ज cuvette में नमूना प्लेस और शुरू में 5 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक बाहरी पानी स्नान करने के लिए इसे कनेक्ट.
  • नमूना के तापमान पर नजर रखने के लिए सीधे नमूने में एक ०.५ mm मोटी प्रकार कश्मीर thermocouple (तापमान जांच) प्लेस । सत्यापित करें कि जांच लेजर पथ (cuvette के बाद) में एक सफेद कागज रखकर और जांच के कारण छाया के लिए खोज के द्वारा लेज़र लाइट के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
    नोट: पानी के स्नान और नमूना के तापमान के तापमान रिकॉर्डिंग के बीच एक 2-3 डिग्री सेल्सियस अंतर है ।
  • चुंबक के बोर में cuvette प्लेस, के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया है । लेजर प्रकाश नमूने के माध्यम से क्षैतिज प्रचार, गैर ध्रुवीकरण दर्पण द्वारा ध्यान हटाने की है और एक फोटो डिटेक्टर द्वारा पता लगाया ।
    नोट: लेजर नीचे निर्देशित है, नमूना के माध्यम से, और वापस एक ही रास्ता फैराडे प्रभाव के लिए खाते के लिए (चुंबकीय क्षेत्र की वजह से प्रकाश की ध्रुवीकरण विमान के रोटेशन यानी जब नीचे जा रहा रद्द कर दिया है जब वापस बाहर आ रहा है विपरीत दिशा में) ।
  • कक्ष की दीवारों पर पानी के संघनित्र से बचने के लिए cuvette पर कमरे के तापमान और १०००० फिलीस्तीनी अथॉरिटी पर एक स्थिर हवा का प्रवाह लागू करें, जो संकेत की तीव्रता को कम करने और शोर में वृद्धि होगी । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब 5 डिग्री सेल्सियस पर मापने ।
  • दो लॉक-इन एम्पलीफायरों के साथ पहली और दूसरी हार्मोनिक और AC सिग्नल का पता लगाएँ । Equation 10 Equation 11 ऑटो चरण-एम्पलीफायरों में बटन का उपयोग करके (2) चित्रा 5B में दिखाया गया है और चित्रा 5B (1) में दिखाया गया के रूप में संवेदनशीलता को समायोजित. सुनिश्चित करें कि सिग्नल अधिभार से बचने के लिए आरेख 5B (3) में दर्शाए अनुसार एम्पलीफायरों पर चार से अधिक लाल पट्टियां नहीं हैं । चित्रा 5C (8) में दिखाए गए के रूप में प्रोग्राम Tesla_Magnet_Const_V092 में दोनों लॉक-इन एम्पलीफायरों के लिए नियोजित संवेदनशीलता नीचे ध्यान दें । कार्यक्रम अनुपूरक जानकारी के रूप में प्रदान की जाती है ।
  • चित्रा 5C (5) में दिखाया गया है के रूप में कार्यक्रम Tesla_Magnet_Const_V092 के माध्यम से चुंबक के लिए वर्तमान की आपूर्ति करके चुंबकीय क्षेत्र ५.५ टी करने के लिए रैंप.
  • birefringence का उपयोग कर समीकरण 2, जहां मंदता के साथ परिकलित है प्राप्त करें Equation 5
    Equation 133)
    जहां और पहले प्रकार के बिसेल फ़ंक्शंस हैं, और । Equation 14 Equation 15 Equation 16 Equation 17 11 , 13 , 18 , ३३ , ३४ चित्रा 5C (4) में दिखाया गया है, कार्यक्रम Tesla_Magnet_Const_V092में मंदता साजिश ।
    ध्यान दें: प्रोग्राम द्वारा प्रदान की गई मंदता birefringence संकेत की गणना करने के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए यदि दो लॉक-इन एम्पलीफायरों एक ही संवेदनशीलता पर काम नहीं कर रहे हैं (चरण २.१२ देखें) । लॉग हार्मोनिक तीव्रता और सही आयामों को प्राप्त करने के लिए लॉक-इन एम्पलीफायरों की संवेदनशीलता से गुणा किया जा करने के लिए है । Equation 10 Equation 11 इसके अलावा, birefringence एक चुंबक क्षेत्र के तहत मापा संकेत मतलब birefringence 0 टी में प्राप्त संकेत घटाया द्वारा सामान्यीकृत किया जाना चाहिए ।
  • चित्रा 4में दिखाया cuvette से जुड़े पानी स्नान के तापमान को विनियमित करके लगातार या बदलते तापमान (1 डिग्री सेल्सियस/) पर नमूना birefringence संकेत मॉनिटर.
  • चित्रा 5C (8) में प्रयोगात्मक विवरण में भरने के द्वारा प्रयोगात्मक डेटा लॉग इन करें, (9) में एक फ़ाइल नाम प्रदान करने, और "प्रारंभ लॉग" बटन (10) दबाने.
  • Figure 5
    चित्र 5: नियोजित सेटिंग्स और प्रोग्राम स्क्रीनशॉट का रेखांकन. क) PEM सेटिंग्स: मंदता २.४०५ रेड, तरंग दैर्ध्य ६३५ एनएम, आवृत्ति ५० हर्ट्ज. सफेद हलकों क्या सेटिंग्स सक्रिय किया जा करने के लिए संकेत मिलता है (USR = उपयोगकर्ता परिभाषित मंदता, नियंत्रण रेखा = ऑपरेशन के स्थानीय मोड) । ख) लॉक-इन एम्पलीफायर सेटिंग्स । संवेदनशीलता (1) चरण २.११ में आवश्यक के रूप में प्रत्येक माप से पहले चयनित किया जा करने के लिए है । एक संकेत अधिभार से बचने के लिए (3) प्रदर्शन पर चार से अधिक लाल सलाखों नहीं होना चाहिए । एक अधिभार होता है जब में लाल एलईडी (1) पर बदल जाता है, एक माप असंभव बना रही है । हर माप से पहले ऑटो चरण बटन (2) दबाएँ. ग) कार्यक्रम के स्क्रीनशॉट अनुपूरक जानकारी के रूप में प्रदान की Tesla_Magnet_Const_V092 । कार्यक्रम के चुंबकीय क्षेत्र और समय के एक समारोह के रूप में सभी संकेत outputs के रिकॉर्डिंग के नियंत्रण की अनुमति देता है । चुंबकीय क्षेत्र शक्ति और नमूना तापमान (1) में रची गई हैं । पहली और दूसरी हार्मोनिक और दो लॉक-इन एम्पलीफायरों द्वारा मापा एसी संकेत (2) में प्लॉट किए गए हैं. Equation 10 Equation 11 प्रत्यक्ष वर्तमान की तीव्रता (3) में प्लॉट की गई है । Equation 7 मंदता के रूप में चरण २.१३ में वर्णित की गणना और (4) में रची गई है । चुंबकीय क्षेत्र ताकत (5) में सेट है । प्रकार K thermocouple द्वारा दर्ज तापमान की प्रत्यक्ष माप (6) में प्रस्तुत किया गया है और उत्पादन संकेतों (और) में (7) ।Equation 23 Equation 22 अतिरिक्त नमूना जानकारी में सम्मिलित किया जा सकता है (8) ऐसे एम्पलीफायरों की कार्यरत संवेदनशीलता, नमूना नाम, आदि के रूप में. डेटा लॉग इन किया जा सकता है और में प्रदान की गई एक. txt फ़ाइल (9) के लिए निर्यात । प्रारंभ करें और "प्रारंभ लॉग" बटन (10) के साथ डेटा प्राप्ति रोकें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Representative Results

    birefringence संकेत एक गैर-बाहर निकाला DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) नमूना एक ५.५ टी के तहत निगरानी की गई थी 5 से ४० डिग्री सेल्सियस और वापस 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट (चित्रा 6) की दर से एक हीटिंग और शीतलक चक्र के दौरान चुंबकीय क्षेत्र । birefringence परिणाम १.५ x 10 के एक मूल्य के साथ 5 डिग्री सेल्सियस पर उच्च चुंबकीय संरेखण की पुष्टि की-5, दो बार के रूप में रिपोर्ट की जाती है सिस्टम के लिए मजबूत के रूप में । , 7 , 23 DMPC के टीएम के ऊपर birefringence संकेत के शूंय पर 24 डिग्री सेल्सियस गैर-संरेखित बुलबुले के गठन के कारण था । तरल परिक्रमा चरण के आंदोलन प्रकटन polymolecular सभाओं में प्रमुख पुनर्व्यवस्थाओं ट्रिगर । ये पुनर्व्यवस्थाएं थर्मामीटर-प्रतिवर्ती हैं । सीध प्रजातियों टीएम नीचे ठंडा करने पर पुनर्जीवित किया गया था और birefringence संकेत हीटिंग पर के रूप में एक ही प्रवृत्ति के बाद । अलग टीएम के आसपास होने वाली चोटियों गैर संरेखित बुलबुले के द्वारा संरेखण विधानसभाओं के प्रतिस्थापन निशान । 23 कैनेटीक्स के लागू ताप और शीतलन दर के संबंध में आणविक पुनर्व्यवस्थाओं की धीमी गति के बारे में 1 °/समझा क्यों चोटियों अतिव्यापी नहीं थे । इसके बजाय, दोनों चोटियों DMPC के टीएम में शुरू किया, सुझाव है कि bilayer लिपिड आदेश की एक निश्चित डिग्री के लिए संरेखित प्रजातियों के गठन एहसान होना चाहिए ।

    Figure 6
    चित्रा 6: एक गैर के लिए तापमान के एक समारोह के रूप में Birefringence संकेत-बाहर निकाला DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) नमूना पर हीटिंग (लाल) और शीतलन (नीला) पर 1 डिग्री सेल्सियस/ नमूना 1.3.5 करने के लिए प्रोटोकॉल चरण 1 के बाद तैयार किया गया था । birefringence माप प्रोटोकॉल चरण 2 के बाद आयोजित किए गए थे । चुंबकीय क्षेत्र ताकत ५.५ टी करने के लिए रैंप पर था और नमूना 5 डिग्री पर बनाए रखा गया था, हीटिंग और शीतलक चक्र के लिए आगे बढ़ने से पहले १.५ x 10-5 के एक birefringence संकेत प्राप्त करने । ३५ डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर birefringence संकेत flatlines जहां कोई संरेखण नमूना के रूप में मनाया गया था केवल बुलबुले से बना था । ठंडा करने पर, bicelles पुनर्जीवित किया गया और ७.२ x 10 के एक अंतिम birefringence संकेत-6 ५.५ टी और 5 डिग्री सेल्सियस पर हासिल किया गया था । चुंबकीय क्षेत्र ताकत 0 टी के लिए नीचे रैंप और नमूना 5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    A DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) नमूना कदम 1.3.4 में हीटिंग और शीतलन प्रक्रिया के बाद हाइड्रेटेड किया गया था और बाद में विभिन्न ताकना आकार की झिल्ली फिल्टर के माध्यम से ६० डिग्री सेल्सियस पर 10 बार बाहर निकाला, चरण १.४ देखें । ६० डिग्री सेल्सियस से कम, लिपिड मिश्रण बुलबुले में इक्ट्ठा होता है, जो बाहर निकालना प्रक्रिया के आकार के होते हैं । 16 , ३५ , ३६ , ३७ बाहर निकालना पूरा करने के बाद, bicelles 5 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा द्वारा पुनर्जीवित किया गया और hydrodynamic व्यास डीएच DLS द्वारा मापा गया था । bicelles की चुंबकीय संरेखण 5 ° c में मूल्यांकन किया गया था 8 टी पर बिना संस के साथ एकएफ और ५.५ टी पर birefringence संकेत को मापने के द्वारा; चित्र 7देखें । birefringence संकेत क्षेत्र रैंप ५.५ टी करने के लिए और वापस 0 टी करने के लिए नीचे के रूप में चित्रा 7Aमें दिखाया द्वारा प्राप्त किया गया था । चोटी birefringence ५.५ टी जहां संरेखण के उच्चतम डिग्री समीकरण 1 के अनुसार की उंमीद थी पर हुई । bicelles के hydrodynamic व्यास डीएच को क्रमशः ८००, ४००, २००, और १०० एनएम के आकार के साथ झिल्ली के माध्यम से २२०, १९०, १०६, और ९१ एनएम तक कम किया गया । इसी कमी चुंबकीय संरेखण में कम birefringence संकेत और निरपेक्ष एकएफ में कमी के रूप में यह आंकड़ा 7Bमें शूंय से संपर्क की पुष्टि की थी । परिणाम ६० डिग्री पर बाहर निकालना द्वारा बुलबुले के सिलाई के माध्यम से bicelle आकार और चुंबकीय संरेखण को नियंत्रित करने की संभावना की पुष्टि की और 5 डिग्री सेल्सियस के लिए वापस ठंडा ।

    Figure 7
    चित्रा 7: एक DMPC के चुंबकीय संरेखण/चौल-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) नमूना विभिंन ताकना आयामों की झिल्ली फिल्टर के माध्यम से बाहर निकाला । एक) Birefringence संकेत Δn ′ चुंबकीय क्षेत्र शक्ति बी के एक समारोह के रूप में जब ऊपर और नीचे ८०० एनएम pores के माध्यम से बाहर निकाला नमूना के लिए रैंप । समीकरण 1 के अनुसार पीक birefringence ५.५ टी में पहुंच गया था । यह अधिक से अधिक birefringence मान B) में बताया गया है. एक ही नमूना ४०० एनएम pores के माध्यम से बाहर निकाला गया था । चुंबकीय संरेखण ५.५ टी पर दोनों birefringence माप (काले चौकों) द्वारा मूल्यांकन किया गया था (एक में पिछले बाहर निकालना कदम के लिए क्या किया गया था करने के लिए analogously) और संरेखण कारकों की गणना द्वारा 8 टी में एक (लाल हलकों) के एक समारोह के रूप में साजिश रची hydrodynamic व्यास डीएच DLS द्वारा प्राप्त की चुंबकीय संरेखण एक ही नमूना २०० एनएम pores के माध्यम से बाहर निकाला पर analogously मूल्यांकन किया गया था, और एक आखिरी बार १०० एनएम के माध्यम से बाहर निकालना pores के बाद । सभी माप 5 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    कैसे birefringence माप के साथ संयोजन में प्रयोग किया गया के एक विस्तृत खाता उच्च चुंबकीय उत्तरदायी पैदा करने के लिए तरीकों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग Ln3 + chelating फॉस्फोलिपिड सभाओं Isabettini एट अल में है । 23 प्रस्तावित निर्माण प्रोटोकॉल भी अब DPPC और DPPE-DTPA फॉस्फोलिपिड या उनके bilayer में रासायनिक इंजीनियर स्टेरॉयड डेरिवेटिव वाले लोगों के लिए की रचना की विधानसभाओं के लिए लागू कर रहे हैं. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 केवल आवश्यकता जा रही है कि नमूना 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 और 1.4.2 चरणों में पर्याप्त रूप से उच्च तापमान के लिए गर्म है । तापमान bilayer लिपिड एक तरल परिक्रमा चरण में प्रवेश करने की अनुमति चाहिए, शुष्क लिपिड फिल्म या नमूना पुनर्जनन के इष्टतम जलयोजन guarantying । DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) विधानसभाओं, उदाहरण के लिए, ४२ डिग्री सेल्सियस पर DPPC के चरण संक्रमण तापमान से ऊपर गरम किया जा करने की आवश्यकता है, जबकि अनुरूप DMPC आधारित प्रणाली 24 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्म किया जाना चाहिए । एक पर्याप्त उच्च तापमान भी जब लिपिड bilayer चरण १.४ में एक परिक्रमा राज्य में होने वाली बाहर करने वाला बुलबुले के गठन की गारंटी करने के लिए आवश्यक है । कदम 1.3.2 में फ्रीज गल चक्र पूरी तरह से एच & #38; सी चक्र द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । 23 हालांकि, नमूना और अधिक समय की जरूरत है पूरी तरह से इस प्रक्रिया के साथ लिपिड फिल्म हाइड्रेट और 20 मिनट जब 5 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट में ६० डिग्री सेल्सियस पर जब भंवरित किया जाना चाहिए । अतिरिक्त ज & #38; ग चक्र अगर शुष्क लिपिड फिल्म के तत्वों अभी भी कुप्पी के शीशे की दीवारों पर मनाया जाता है ।

    Tm3 + chelating bicelles इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत चुंबकीय क्षेत्र की दिशा में सीधा संरेखित करें । इस संरेखण दिशा Tm3 +के बड़े सकारात्मक चुंबकीय संवेदनशीलता से उत्पन्न होती है । 11 , 14 अन्य lanthanide आयनों जैसे उपसंचालक3 + और Yb3 + भी लागू किया जा सकता है । 11 , 13 , 19 Ln के विभिंन चुंबकीय anisotropy3 + bicelles के चुंबकीय संरेखण सिलाई का अतिरिक्त साधन प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, उपसंचालक3 + bilayer फॉस्फोलिपिड के आंतरिक रूप से नकारात्मक चुंबकीय संवेदनशीलता को बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप bicelles के संरेखण का एक उच्च स्तर चुंबकीय क्षेत्र की दिशा में जाता है । 13 संरेखण दिशा में यह परिवर्तन दोनों birefringence संकेत और संरेखण अनिसोट्रोपिक 2d बिना पैटर्न से गणना कारकों के हस्ताक्षर में परिवर्तन से पता चला है । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चुंबकीय संवेदनशीलता केवल ln के रासायनिक प्रकृति द्वारा तय नहीं है3 + लेकिन ln3 +chelate ज्यामिति-फॉस्फोलिपिड परिसर । 19 , ३८ चुंबकीय संवेदनशीलता synthesizing विभिंन Ln3 + chelating फॉस्फोलिपिड headgroups, परिणामस्वरूप विधानसभाओं के चुंबकीय प्रतिक्रिया को परिभाषित द्वारा इंजीनियर हो सकता है । ३८

    हर नमूने ऑप्टिकली गठन लिपिड कार्यरत की प्रकृति के आधार पर अलग है । तापमान के एक समारोह के रूप में नमूना के मैलापन निगरानी विधानसभाओं में तापमान प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एक पूरक विधि है । हालांकि इन माप आम तौर पर एक spectrophotometer में एक चुंबकीय क्षेत्र के अभाव में आयोजित कर रहे हैं, सेटअप के साथ है लेजर प्रत्यक्ष वर्तमान की तीव्रता की निगरानी प्रस्तावित इस के साथ साथ एक चुंबकीय की उपस्थिति में एक ही जानकारी प्रदान करता है Equation 7 मैदान. 11 , 16 The DMPC/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) नमूने आमतौर पर कम पंकिल से उनके चौल-oh युक्त DMPC/चौल-oh/DMPE-DTPA/tm3 + (दाढ़ अनुपात 16:4:5:5) समकक्षों 5 डिग्री सेल्सियस पर । 5 डिग्री सेल्सियस पर पानी जैसी नमूने आम तौर पर एक चुंबकीय क्षेत्र में संरेखित नहीं हैं । कमरे के तापमान पर, दोनों नमूने पारदर्शी लग रही है क्योंकि DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) नमूने bicelles और बुलबुले के बीच एक संक्रमण चरण में है और बड़े गाढ़ा छेद DMPC/चौल-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + में दिखाई देते है (दाढ़ रेश्यो 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) में बुलबुले के लिए bicelles के संक्रमण राज्य भी कमरे के तापमान पर है नमूना चिपचिपापन में वृद्धि के साथ है । मैलापन में यह तापमान-निर्भर परिवर्तन २.११ कठिन चरण में सही संवेदनशीलता का चयन करता है । संवेदनशीलता बहुत अधिक एक पंकिल नमूना पर 5 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित किया जाता है, तो अधिक पारदर्शी प्रकृति के नमूने के हीटिंग पर एम्पलीफायरों के एक अधिभार के कारण हो सकता है. इसके अलावा, उच्च पंकिल नमूने काफी अनुपात संकेत करने के लिए शोर में वृद्धि होगी और birefringence माप के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. लेजर प्रकाश का पता लगाया जा करने के लिए नमूने के माध्यम से जाने के लिए सक्षम होना चाहिए ।

    गैर बाहर निकाला नमूनों हमेशा अधिक पंकिल है और फ्रिज में अल्पावधि भंडारण पर कुल करने की प्रवृत्ति है । फिर भी, चुंबकीय उत्तरदायी नमूने आसानी से एक ज & #38; सी चक्र के साथ पुनर्जीवित कर रहे हैं । गैर-बाहर नमूने भी जमे हुए राज्य में संग्रहीत किया जा सकता है और आसानी से ज & #38; C चक्र द्वारा पुनर्जीवित । बाहर निकाला नमूनों फ्रिज में रखा और सामांयतः नमूना तैयारी के बाद एक सप्ताह में मापा जाता है । या तो एक तरल या एक जमे हुए राज्य में निकाला प्रजातियों के लंबे समय तक भंडारण पर कोई अध्ययन रिपोर्ट । इसलिए, बाहर निकालना से प्राप्त असेंबली का आकार वितरण लंबे समय तक संग्रह पर गारंटी नहीं किया जा सकता है ।

    Analogously किसी भी bicelle प्रणाली के लिए, इन चुंबकीय संरेखित planar विधानसभाओं केवल लिपिड संरचना और एकाग्रता की एक परिभाषित रेंज में मौजूद हैं । लिपिड अनुपात में फेरबदल micelles, रिबन, और बुलबुले के गठन सहित विभिन्न विधानसभा आर्किटेक्चर, में परिणाम होगा । 5 , 11 , 16 , 18 , 20 फॉस्फेट बफर एकाग्रता और पीएच चरण 1.1.3 में bicelles और उनके चुंबकीय प्रतिक्रिया को आकार देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । बफर polymolecular विधानसभाओं आसपास के हाइड्रोफिलिक वातावरण को नियंत्रित फिजिको-रासायनिक बातचीत को परिभाषित करता है । कम बफर सांद्रता विभिन्न विधानसभा आर्किटेक्चर में परिणाम, whilst उच्च सांद्रता नमूना एकत्रीकरण और एक अतिरिक्त शुल्क स्क्रीनिंग के कारण वर्षा के कारण.3 और 4 के बीच पीएच मूल्यों के साथ अंलीय शर्तों के तहत, carboxylic एसिड DMPE में लाइगैंडों के रूप में सेवारत moieties-DTPA/Ln3 + परिसर protonated हैं । इस नमूने में एकत्रीकरण और वर्षा द्वारा मनाया चुंबकीय उत्तरदायी polymolecular विधानसभाओं के विनाश में परिणाम है । चुंबकीय उत्तरदायी Ln3 + polymolecular सभाओं अधिक बुनियादी पीएच मूल्यों की दिशा में एक उचित प्रतिरोध है । हालांकि, DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (दाढ़ अनुपात 4:1:1) bicelles १२.९ के पीएच मूल्यों पर micelles में तोड़ने के लिए दिखाए गए थे । 11 नमूने पानी या अन्य लवण का दोहन करने के लिए कभी नहीं उजागर किया जाना चाहिए । किसी भी अंय आयन Ln3 + chelating प्रक्रिया या आरोप स्क्रीनिंग के कारण विधानसभाओं के एकत्रीकरण में परिणाम परेशान करेंगे । बिना माप, बफर के रूप में चरण 1.1.3 में वर्णित के रूप में तैयार किया जाता है D2o के बजाय ultrapure H2o. ध्यान दें कि पीएच मीटर रीडिंग ७.० (७.४ के एक पीडी मूल्य के लिए इसी) हो जाएगा ।

    एक हीटिंग और शीतलक चक्र के अधीन polymolecular विधानसभाओं में होने वाली संरचनात्मक परिवर्तनों को थर्मामीटरों प्रतिवर्ती कर रहे हैं । इसलिए, 5 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम birefringence संकेत तापमान चक्र से पहले के रूप में एक ही होना चाहिए । 11 , 16 यदि चक्र के बाद birefringence संकेत अधिक है, तो चरण 1.3.4 में नमूना ठीक से जेनरेट नहीं किया गया । यह आमतौर पर समय की एक लंबी अवधि के लिए संग्रहीत नमूनों में होता है । एक कम birefringence संकेत के बाद तापमान चक्र के रूप में देखा चित्रा 6 प्रयोगात्मक सेटअप में एक समस्या को इंगित करता है । सबसे अधिक, लेजर प्रकाश पथ वापस बिखरने या किसी अंय वस्तु से परेशान था । यह तापमान जांच के साथ विशेष रूप से समस्याग्रस्त है नमूना में सीधे डाला (२.८ कदम देखें) जो लेजर प्रकाश के प्रत्यक्ष पथ के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के रूप में रखा जाना चाहिए । एक परेशान प्रकाश पथ में गिरावट का कारण बनता है, एक शोर संकेत, और/या birefringence-तापमान घटता में असामांय चोटियों । Equation 7 उदाहरण के लिए, 6 चित्रा में लगभग ३५ डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग पर होने वाली चोटी लेजर प्रकाश के सीधे रास्ते में पानी ठंडा ट्यूबों के विस्तार के कारण होता था । birefringence संकेत है कि बिंदु के बाद से विश्वास नहीं किया जा सकता है । हालांकि शीतलक वक्र के सामांय आकार सामांय था, कम birefringence 5 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त संकेत हस्तक्षेप के कारण था ।

    इस प्रोटोकॉल के बाद से प्राप्त birefringence मान निरपेक्ष नहीं है और स्वयं के बीच नमूनों की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है । साहित्य मूल्यों के साथ तुलना के लिए, एक अंशांकन के साथ एक संदर्भ प्रणाली की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, मापा मंदता के हस्ताक्षर सेट-अप के संरेखण पर निर्भर करता है और टोल्यूनि के साथ जाँच की जा सकती है, जो ३.२७ × 10− 9 T− 2की कपास-भेड़ स्थिरांक है । ३९ , ४०

    नमूना चुंबकीय संरेखण में परिवर्तन से उत्पंन birefringence संकेत bilayer में आणविक पुनर्व्यवस्थाओं की वजह से संकेत से जोड़ा जा सकता है । अनिसोट्रोपिक 2d संस एक चुंबकीय क्षेत्र के तहत प्राप्त पैटर्न से गणना संरेखण कारकों केवल polymolecular विधानसभाओं के थोक संरेखण से प्रभावित कर रहे हैं । दो तरीकों पूरक है और birefringence संकेत करने के लिए योगदान के युग्मन की अनुमति देते हैं । प्रस्तावित birefringence सेटअप लेजर बीम बंटवारे से सिद्ध किया जा सकता है, के साथ और बाहरी चुंबकीय क्षेत्र के लिए जोखिम के बिना नमूनों की एक साथ निगरानी के लिए अनुमति देता है । चुंबकीय क्षेत्र में नमूने के लिए प्राप्त birefringence परिणाम 0 टी पर नमूना के लिए प्राप्त संकेत द्वारा सामान्यीकृत किया जा सकता है, प्रभावी ढंग से पृष्ठभूमि के लिए लेखांकन.

    Birefringence मापन bicelles के चुंबकीय संरेखण को बढ़ाता तक सीमित नहीं हैं । कई नरम सामग्री अपने आंतरिक संरचना के आदेश के कारण एक birefringence संकेत उत्पंन करते हैं । प्रस्तावित सेटअप के साथ या एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र के बिना तापमान के एक समारोह के रूप में ऐसी सामग्री की birefringence पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है । Anthracene organogel फाइबर, प्रवाह के तहत झाकने micelles, nanocrystalline फाइबर और amyloid-Fe3हे4 तंतुओं कुछ उदाहरण है जिसका birefringence व्यवहार सफलतापूर्वक प्रस्तावित सेटअप के साथ मूल्यांकन किया गया है । 29 , 30 , ३२ , ४१

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    लेखक स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन SMhardBi वित्तपोषण के लिए स्वीकार करते है (परियोजना संख्या 200021_150088/ संस प्रयोगों स्विस spallation न्यूट्रॉन स्रोत SINQ, पॉल Scherrer Instute, Villigen, स्विट्जरलैंड में प्रदर्शन किया गया । लेखकों गर्मजोशी से संस प्रयोगों के साथ उनके मार्गदर्शन के लिए डॉ जोकिम Kohlbrecher धंयवाद । उच्च चुंबकीय क्षेत्रों के तहत birefringence माप सेटअप उच्च क्षेत्र चुंबकीय प्रयोगशाला HFML, निजमेगेन, नीदरलैंड में मौजूदा सेटअप से प्रेरित था । हम ब्रूनो Pfister birefringence सेटअप, जन Corsano और डैनियल Kiechl की इलेक्ट्रॉनिक्स ठीक है और लेजर के सतही संरेखण की अनुमति के निर्माण के लिए, और डॉ बर्नहार्ड Koller के लिए चल रहे तकनीकी सहायता के लिए के विकास में उनकी मदद के लिए धंयवाद ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

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    References

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