Des procédures de fabrication et des mesures de biréfringence pour concevoir Ion Lanthanide magnétiquement sensibles phospholipides assemblées de chélation

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Summary

Des procédures de fabrication pour ion lanthanide hautement magnétiquement sensibles polymoléculaire assemblées de chélation sont présentés. La réponse magnétique est dictée par la taille de l’Assemblée, qui est adaptée par extrusion à travers des membranes nanopore. Assemblées alignability magnétique et changements structurels induits par la température sont surveillées par des mesures de la biréfringence, une technique gratuite à résonance magnétique nucléaire et de la diffusion des neutrons petit angle.

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Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

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Abstract

Bicelles sont des assemblages d’accordable disque polymoléculaire formés d’une grande variété de mélanges de lipides. Diverses applications études structurales de protéine de membrane par résonance magnétique nucléaire (RMN) aux développements nanotechnologiques, y compris la formation de gels optiquement actifs et magnétiquement commutables. Ces technologies nécessitent contrôle élevé de la taille de l’Assemblée, la réponse magnétique et la résistance thermique. Mélanges de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine (DMPC) et son ion lanthanide (Ln3 +) chélatant conjugué de phospholipides, 1, 2-dimyristoyl -sn- glycéro-3-phospho-éthanolamine-diéthylène triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), monter dans des assemblys fortement magnétiquement sensibles telles que le DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (rapport molaire 4:1:1) bicelles. Introduction de cholestérol (Chol-OH) et dérivés stéroïdiens dans la bicouche se traduit par un autre jeu d’assemblys offrant des propriétés physico-chimiques uniques. Pour une composition lipidique donnée, l’alignability magnétique est proportionnel à la taille de bicelle. La complexation de Ln3 + se traduit par des réponses magnétiques sans précédent en termes de grandeur et alignement de direction. L’effondrement de thermo réversible des structures disque-comme dans les vésicules en chauffant permet adaptation des dimensions assemblées par extrusion à travers des membranes filtrantes avec la taille des pores définis. Les bicelles magnétique réglable sont régénérées par refroidissement à 5 ° C, ce qui entraîne l’Assemblée dimensions définies par les précurseurs de la vésicule. Dans les présentes, cette procédure de fabrication est expliquée et l’alignability magnétique des assemblées est quantifié par des mesures de biréfringence sous champ magnétique 5,5 T. Le signal de la biréfringence, provenant de la bicouche phospholipidique, outre permet la surveillance des changements polymoléculaire dans la bicouche. Cette technique simple est complémentaire des expériences RMN qui sont couramment employées pour caractériser bicelles.

Introduction

Bicelles sont des assemblages de type disque polymoléculaire provenant de nombreux mélanges de lipides. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ils sont largement utilisés pour la caractérisation structurale des biomolécules de membrane par spectroscopie RMN. 6 , 7 Toutefois, les efforts récents visent à élargir le champ d’applications possibles. 5 , 8 , 9 le système de bicelle plus étudié est composé d’un mélange de 1, 2-dimyristoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine (DMPC), constituant la partie plane de l’Assemblée et 1, 2-dihexanoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine (DHPC) phospholipides qui couvre le bord. 1 , 2 , 3 la géométrie moléculaire des phospholipides composer la bicouche dicter l’architecture de la structure polymoléculaire auto-assemblés. 4 , 5 remplacement DHPC avec DMPE-DTPA génère systèmes hautement magnétiquement sensibles et accordables bicelle. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (rapport molaire 4:1:1) bicelles associé avec beaucoup plus d’ions paramagnétiques lanthanide (Ln3 +) sur la surface de la bicouche, ayant pour résultat une réponse magnétique accrue. 10 par ailleurs, en remplaçant les molécules solubles dans l’eau de DHPC avec DMPE-DTPA/Ln3 + permet la formation de bicelles résistant à la dilution. 11

L’alignability magnétique des polymoléculaire planes assemblées est dicté par leur énergie magnétique dans l’ensemble,

Equation 1(1)

où B est l’intensité du champ magnétique, Equation 2 la n magnétique constant, le nombre d’agrégation et Equation 3 l’anisotropie de la susceptibilité diamagnétique moléculaire des lipides composer la bicouche. Par conséquent, la réponse de DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles aux champs magnétiques est adaptée par leur taille (nombre total n) et le Δχ d’anisotropie moléculaire susceptibilité diamagnétique. Celle-ci est facilement obtenue en changeant la nature de la Ln chélatés3 +. 12 , 13 , 14 , 15 présentation cholestérol (Chol-OH) ou autres dérivés de stéroïdes dans la bicouche offre la possibilité de régler aussi bien le nombre total n et le Δχ de la susceptibilité magnétique des assemblées. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 pour une composition lipidique donnée, plus grandes assemblées contiennent plus de lipides pouvant contribuer à l’E-mag (plus gros agrégat nombre n), résultant en des espèces plus réglable. La taille de DMPC/DHPC bicelles, par exemple, est conventionnellement contrôlée grâce à l’optimisation de la concentration composition de ratio ou total des lipides. 20 , 21 , 22 même si cela est possible en DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, leur transformation thermo réversible de bicelle aux vésicules par chauffage offres ajouté des options de personnalisation. Les moyens mécaniques tels que l’extrusion à travers des filtres de membrane permet de façonner des vésicules. Les bicelles magnétique réglable sont régénérées après refroidissement à 5 ° C et leurs dimensions sont dictées par les précurseurs de la vésicule. 11 Herein, nous nous concentrons sur le potentiel des procédures de fabrication mécanique avec DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) sous forme de systèmes de référence. Le processus fonctionne par analogie lorsque vous travaillez avec autres Ln3 + que Tm3 +. Le large éventail des possibilités offertes par ces techniques sont mises en évidence dans la Figure 1 et largement discutées ailleurs. 23

Figure 1
Figure 1 : aperçu schématique des procédures de fabrication possible. Étudiés par magnétisme réglable Ln3 + chélateur polymoléculaire assemblées sont composées de deux DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5). Le film lipidique sec est hydraté avec une mémoire tampon au phosphate 50 mM à un pH de 7,4 et la concentration de lipides totaux est de 15 mM. Une hydratation efficace du film lipidique nécessite soit gel dégel cycles (FT) ou chauffage et refroidissement des cycles (H & C). H & C cycles sont nécessaires pour régénérer les échantillons après le dernier gel dégel étape, ou pour régénérer les échantillons congelés pendant une période prolongée de temps s’ils doivent être utilisés sans davantage d’extrusion. Ces étapes sont longuement débattus par Isabettini et al. 23 polymoléculaire au maximum réglable assemblées soient atteints, livrant des architectures assembly différent basés sur la composition des lipides. La taille de bicelle et alignability magnétique est accordable par extrusion (Ext) à travers des filtres de membrane nanopore. L’alignement présenté facteurs Af ont été calculées de 2D petit angle neutron scattering (San) modèles d’un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) échantillon extrudé à travers soit 800, 400, 200 ou 100 nm pores. SANS mesures sont un moyen complémentaire de quantifier l’alignement de bicelle qui ne sera pas couvert plus en détail ci-après. 11 , 16 A laf varie entre -1 (diffusion de neutrons parallèle ou perpendiculaire alignement de le bicelles à l’égard de la direction du champ magnétique) et 0 pour la diffusion isotrope.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La structure de bicelles a été étudiée par un large éventail de techniques de caractérisation. 13 l’alignement de bicelles exposés à un champ magnétique a été quantifiée à l’aide de la spectroscopie RMN ou expériences de diffusion (San) de neutrons petit angle. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 Toutefois, le déplacement et l’élargissement des pics NMR qui se produisent en présence de Ln3 + sont la méthode de sérieuses limites. 15 , 26 , 27 , 28 bien que SANS expériences ne souffrent pas de cette limitation, alternative et des techniques plus accessibles sont souhaitables pour la quantification systématique de l’alignement magnétique induit des assemblys dans la solution. Les mesures de biréfringence sont une alternative viable et relativement simple. Par analogie à des expériences RMN, mesures de biréfringence révèlent des renseignements précieux sur les réarrangements de lipides et de phases lipidiques qui se produisent dans la bicouche. En outre, les transformations géométriques qui se produisent dans l’assembly polymoléculaire avec l’évolution des conditions environnementales comme la température sont contrôlées. 11 , 12 , 13 , 16 Δn′ de biréfringence induite par magnétisme a été utilisé pour étudier les différents types de systèmes de phospholipides. 13 , 29 , 30 mesures de biréfringence basées sur la technique de modulation de phase dans un champ magnétique est une méthode viable pour détecter l’orientation de bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 la possibilité d’enquêter sur les bicelles avec la biréfringence dans des champs magnétiques élevés jusqu'à 35 T a aussi été démontrée par Laura M. et al. 13

Lorsque la lumière polarisée entre dans un matériau anisotrope, il va être réfracté dans une vague ordinaire et extraordinaire. 11 les deux ondes ont des vitesses différentes et sont décalés en phase par un retard δ. Le degré de retard δ est mesuré et converti en un signal de biréfringence Equation 5 pour quantifier le degré d’anisotropie dans la matière à l’aide

Equation 6(2)

où λ est la longueur d’onde du laser et d est l’épaisseur de l’échantillon. Les phospholipides sont optiquement anisotropes et leur axe optique coïncide avec leurs haches longtemps moléculaires, parallèles à la queue d’hydrocarbure. 11 , 12 aucun retard n’est mesuré si les phospholipides sont orientées au hasard dans la solution. Un retard est mesuré lorsque les phospholipides sont alignés parallèlement les uns aux autres. La biréfringence magnétique induite Equation 5 peut avoir un signe positif ou négatif selon l’orientation des molécules dans le champ magnétique ; Voir la Figure 2. Phospholipides alignés parallèlement à l’axe des abscisses donnera lieu à un négatif Equation 5 , même si ces alignés le long de l’axe z positif Equation 5 . Aucun biréfringence n’est observée lorsque l’axe optique coïncide avec la direction de propagation de lumière comme le phospholipide s’aligne parallèlement à l’axe y.

Figure 2
Figure 2 : Alignement des phospholipides et signe correspondant de la biréfringence magnétique induite Equation 12 . Le signe des Equation 12 dépend de l’orientation des phospholipides dans le champ magnétique. Les lignes pointillées indiquent l’axe optique de la molécule. La lumière est polarisée à 45° et se propage dans la direction y. Le champ magnétique B est dans la direction z. Ce chiffre a été modifié par M. Laura. 11 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans le cas d’une suspension colloïdale isotrope de bicelles, l’orientation induite par l’arrangement des phospholipides dans la bicouche sera perdue, remise à zéro de l’arriération δ. Le bicelles doit également aligner afin d’orienter les phospholipides optiquement actifs dans leurs bicouches, provoquant un retard δ de la lumière polarisée. En conséquence, la biréfringence est un outil sensible pour quantifier l’alignability magnétique des assemblées polymoléculaire. Bicelles alignés perpendiculairement au champ magnétique permettra d’obtenir un positif Equation 5 , tandis que ceux alignés parallèlement donnera un négatif Equation 5 . Le signe dépend de l’alignement de l’installation et peut être vérifié auprès d’un échantillon de référence.

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Protocol

1. procédure fabrication de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) et DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) polymoléculaire assemblées

  1. Préparations préliminaires
    1. Laver toute la verrerie en rinçant une fois avec de l’éthanol stabilisé chloroforme (> 99 % chloroforme) et sécher à l’air comprimé.
    2. Produire 2 solutions mères distinctes de 10 mg/mL de DMPC et DMPE-DTPA dans le chloroforme éthanol-stabilisé (> chloroforme de 99 %), une solution 10 mM de Chol-OH dans du chloroforme éthanol-stabilisé (> chloroforme de 99 %) et une solution de TmCl3 à 10 mM méthanol.
    3. Préparer un tampon de phosphate 50 mM à un pH de 7.4 en mélangeant 0,121 g de sodium dihydrate de phosphate monopotassique et 0,599 g de di-sodium anhydre hydrogénophosphate dans 100 mL d’ultrapure H2O.
  2. Préparation du film lipidique sec
    1. Peser les quantités nécessaires d’amphiphiles (DMPC DMPE-DTPA et éventuellement Chol-OH) et Ln3 + stocks solutions en clin d’oeil-tasses en verre séparée 3 mL avec une seringue de verre de 2,5 mL.
      1. Pour un volume d’échantillon de 3 mL de DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (rapport molaire 4:1:1, concentration de lipides totaux de 15 mM), peser en 3,6435 g de la solution mère de DMPC, 1,4731 g de la solution mère de DMPE-DTPA et 0,7126 g de la solution mère de TmCl3 .
      2. Pour un volume d’échantillon de 3 mL de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5, concentration de lipides totaux de 15 mM), pèsent en 2,9148 g de la solution mère de DMPC, 1,4731 g de la solution mère de DMPE-DTPA, 1,0749 g de solution mère de Chol-OH et 0,7126 g de la solution3 TmCl.
        ATTENTION : Chloroforme / méthanol sont toxiques et volatils à la température ambiante. Travailler sous une hotte aspirante et rapidement aller de l’avant avec les mesures de masse.
    2. Transférer le contenu des coupes-clin d’oeil à un 25 mL ballon à fond rond. Rincer chaque snap-tasse dans le ballon à fond rond avec environ 2,5 mL du solvant correspondant.
    3. Éliminer le solvant sous vide dans un évaporateur rotatif à 40 ° C. Réglez la pression initiale à 30 000 Pa jusqu'à ce que la majeure partie du solvant est supprimé. Réduire la pression à 100 Pa et sécher l’échantillon en vertu de la rotation pour un minimum de 2 h. obtiennent un film uniforme sec lipidiques sur les parois de verre du flacon.
    4. Placez le film lipidique sec pendant une minute sous un flux régulier d’argon pour éviter l’oxydation des lipides dans l’air et conserver l’échantillon dans le congélateur avant de réhydratation.
  3. Hydratation du film lipidique sec
    1. Ajouter les 3 mL de tampon phosphate au ballon pour atteindre une concentration de lipides totaux de 15 mM.
    2. Effectuer un cycle de gel-dégel (FT) en plongeant la fiole sous rotation dans l’azote liquide jusqu'à ce qu’il est complètement gelé (les butées d’azote liquide bouillant), puis chauffer jusqu'à 60 ° C en arrière en plaçant l’échantillon pendant 5 min dans un bain d’eau, agitant en permanence et du ballon le processus de fusion de l’aide. Appliquer 30 s de vortex avant chaque cycle de congélation lorsque l’échantillon est liquide à l’aide de l’hydratation du film lipidique.
      Remarque : Aucun film lipidique ne doit être visible sur les murs de la fiole après le deuxième gel dégel cycle.
    3. 1.3.2 le répète cinq fois au total. Refermer le flacon avec un bouchon pour éviter l’évaporation inutile du tampon phosphate lorsque l’échantillon est chaud. Le protocole peut être suspendu lorsque l’échantillon est congelé.
    4. Procéder à deux de chauffage et de refroidissement (H & C) cycles pour stabiliser l’échantillon qui sort de la dernière étape de congélation, ou garder congelé pendant deux mois. Chauffer l’échantillon à 40 ou 60 ° C pour DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5), respectivement, avant refroidissement à 5 ° C à 1 ° C/min. maintenir l’échantillon 5 min au maximum et minimum températures du cycle.
    5. Maintenant, soit déterminer le signal de la biréfringence de l’échantillon dans un champ magnétique externe (étape 2) ou encore extraire l’échantillon afin d’adapter les dimensions de bicelle et magnétique alignability (étape 1.4).
      Remarque : DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) échantillons sont composées principalement de bicelles avec un diamètre moyen hydrodynamique DH de 70 nm telle que révélée par une distribution numéro obtenu à partir des mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) à 5 ° C. Ces échantillons contiennent aussi de grandes assemblées de polymoléculaire avec une moyenne DH de 500 nm, telle que révélée par une répartition de l’intensité. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) échantillons sont hautement polydispersés en taille avec des distributions d’intensité typique révélant une moyenne DH de 700 nm, tandis que les distributions numéros révèlent une population dominée par petites bicelles dans la gamme de taille de 200 nm. Les distributions de taille plus détaillées et cryo images de microscopie électronique de transmission de ces échantillons ont été rapportés par Isabettini et al. 23
  4. Extrusion des assemblées polymoléculaire.
    1. Assembler l’extrudeuse tel qu’illustré à la Figure 3. Utiliser des gants et pincettes avec protection des tubes de silice pour la manutention. Mouiller le filtre en papier (5) avec quelques gouttes de tampon pour permettre un positionnement optimal de la membrane filtrante (6). Assurez-vous que le papier n’a aucun pli après avoir placé le joint torique (7) sur le dessus.
      Remarque : Le processus d’extrusion a été testé sur membranes filtrantes (6) avec un diamètre de pore de 800, 400, 200 et 100 nm ; Voir la Figure 7.
    2. Mettre au bain-marie à 40 ° C pendant DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) échantillons ou 60 ° C pour les échantillons de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) afin de garantir la formation de vésicules extrudable.
    3. Connecter l’extrudeuse à une bouteille d’azote sous pression à l’aide d’un tube de PVC haute pression (> 4 MPa) équipés d’adaptateurs serto et extraire le matériau liquid à travers la membrane. 1 MPa de pression est habituellement exigé pour l’extrusion à travers des filtres de membrane (6) de diamètre de pore de 200 nm et ci-dessus. 1,5 à 2,5 MPa sont tenus pour les plus petites membranes filtrantes (6) avec un diamètre de pore de 100 nm.
      Remarque : Changer le filtre à membrane si anormalement hautes pressions (> 2,5 MPa) sont nécessaires pour extraire l’échantillon (c’est le premier signe de colmatage).
    4. Ouvrez le couvercle (10) et insérez l’échantillon à l’aide d’une pipette de verre de 2 mL. Ensuite, fermez le couvercle (10) et ouvrir la soupape de pression (12) tout en tenant le tube de sortie de l’échantillon (2). Fermer la valve de pression (12) à la fin du cycle de l’extrusion, évent et continuer avec le prochain cycle.
      Remarque : Ne pas laisser l’échantillon en contact trop longtemps avec le navire chemisé chaud (8) pour éviter la perte excessive d’échantillon par évaporation.
30-60 s est assez de temps pour un échantillon de 3 mL de s’équilibrer dans l’extrudeuse avant d’ouvrir la valve de pression (12).
  • Passez à 10 cycles d’extrusion pour une dimension de pores membranaires donné tel qu’illustré à la Figure 3. La plupart des systèmes bicelle est extrudée 10 fois à travers des membranes de diamètre de pore de 200 et un autre 10 fois à travers des membranes de diamètre de pore de 100 nm, garantir la comparabilité de l’échantillon.
  • Maintenant, déterminez le signal de la biréfringence de l’échantillon dans un champ magnétique externe (étape 2).
  • Figure 3
    Figure 3 : extrudeuse de laboratoire utilisé pour les préparations de bicelle et vésicule. L’extrudeuse est Assemblée à partir du bas vers le haut : Mont (1), (2) échantillon collectant l’espace avec un tube de sortie en plastique de 2,4 mm (diamètre intérieur) et joint torique (3) et (4) grandes et petites mailles stabilisante, (5) filtre en papier, filtres à membranes (6), joint torique (7) (8) chemisé pour bateau, (9. ) haut de la page couverture avec connexion d’entrée et de pression, soupape de pression (12) (10) de la couverture, vis papillon (11). Une esquisse de l’extrudeuse assemblé est illustrée de la droite côté. L’azote gazeux (N2) est alimenté par un réservoir sous pression et le navire chemisé (9) est connecté à un bain d’eau pour contrôler la température. L’échantillon est soumis à 10 cycles d’extrusion pour n’importe quel diamètre de pore de filtre de membrane donnée (trajectoire en bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    2. mesures biréfringence de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) et DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) polymoléculaire assemblées.

    1. Construire et raccorder l’installation de biréfringence telle que présentée dans la Figure 4 et alimenter les éléments électroniques respectifs. Ne placez pas le PEM, l’échantillon et le second polariseur dans le chemin d’accès de laser à ce stade. Éviter la détection de la lumière de laser dos diffusée en recouvrant les surfaces réfléchissantes, par exemple en aluminium supports de miroir, avec papier noir.
    2. Régler les miroirs afin de maximiser l’intensité du laser dans le détecteur, qui est représenté par l’intensité du courant continu Equation 7 provenant du filtre passe-bas dans la Figure 4 b.
      ATTENTION : Porter une protection oculaire appropriée lorsque vous ajustez les miroirs et de consulter avec un instructeur de sécurité laser si la manipulation des lasers pour la première fois.
    3. Tournez le premier polariseur linéaire croisé (maintenu perpendiculaire au faisceau laser incident) afin de maximiser le Equation 7 .

    Figure 4
    Figure 4 : représentation schématique de l’installation de la biréfringence et les connexions pour les signaux optiques. A) un électro-aimant supraconducteur fournit un champ de magnétique 5,5 T. La lumière émise par une diode laser 635 nm est polarisée par deux polariseurs croisés. Un modulateur de photoélasticité PEM-90 fonctionne à 50 KHz avec une amplitude0 de rad 2,405 et placé entre les deux polariseurs. L’exemple se trouve dans l’aimant entre le PEM et le second polariseur. Miroirs non polarisant guider la lumière à travers les différents éléments et est finalement détectée par un photodétecteur. La première et la deuxième harmonique Equation 10 et Equation 11 du signal AC sont surveillés, permettant le calcul du signal biréfringence donnant des informations sur l’alignability magnétique de la Ln3 + polymoléculaire assemblées de chélation. La cupule de l’échantillon est connectée à un bain d’eau externe pour contrôle de la température (en bleu). La température de l’échantillon est contrôlée avec une sonde de température (rouge). B) le signal du détecteur photo est alimenté en deuxième filtre passe-bas ordre Sallen-Key (24 alimentation V AC) avec une fréquence de coupure de 360 Hz à travers un câble braded d’alimentation ±12 VDC (3). Le filtre passe-bas extrait la composante DC Equation 7 et il fournit à l’interface PC (4) par un câble BNC 50 en Ω. Le signal du détecteur photo est livré aux deux verrous amplificateurs (qui extrait la première et la deuxième harmonique Equation 10 et Equation 11 ) par un câble Ω BNC 50 (1) & (2). Les intensités harmoniques sont détectées par un sensible à la phase de détection. Par conséquent, le signal PEM est utilisé comme signal de référence pour les amplificateurs de lock-in (1f-sortie de la PEM dans le premier amplificateur à verrouillage et 2f-sorties dans la seconde, avec BNC 50 Ω câbles raccordés). Les signaux de sortie sont envoyées à l’unité d’interface PC par des câbles BNC 50 Ω. Unités d’acquisition analogique cFP-AI-110 et cFP-CB-1 numériser le signal qui est transmis à l’ordinateur via un câble RS 232 pour la surveillance. La sonde de température de type K est également reliée à l’unité d’interface PC où les unités d’acquisition analogique cFP-CB-3 et cFP-TC-120 numériser le signal avant de transférer à l’ordinateur via un câble RS 232 pour la surveillance. C) photo de l’installation schéma présentée dans B. principaux éléments sont identifiés avec les numéros de 1 à 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    1. Placez le deuxième polariseur linéaire croisé perpendiculaire au faisceau laser incident, tel qu’illustré dans la Figure 4 a. Réduire au minimum la Equation 7 en définissant le deuxième polariseur à un angle de 90° par rapport à la première.
    2. Place le modulateur de photoélasticité (PEM) à 0° entre les deux polariseurs linéaires croisées et perpendiculaire au faisceau laser incident tel qu’illustré dans la Figure 4 a. Ajuster le PEM à une fréquence de 50 kHz et d’amplitude A0 à 2,405 rad comme illustré à la Figure 5 a. Ce qui rend le composant DC indépendant de biréfringence et stimule le Equation 7 .
      Remarque : L’axe optique de la PEM peut être à l’écoute de quelques degrés pour maintenir une constante Equation 7 dans l’air avant de mesurer n’importe quel échantillon.
    3. Attendre 1 h après avoir allumé le laser et les équipements électroniques pour stabiliser le signal.
    Le signal est stable une fois que l’auto-abandon progressif de l’amplificateur de lock-in reste constante.
  • Placer l’échantillon dans une cuvette de quartz à température contrôlée avec une longueur de chemin d’accès de 10 mm et connectez-le à un bain d’eau externe initialement fixé à 5 ° C.
  • Placez un thermocouple de type épais K de 0,5 mm (sonde de température) directement dans l’échantillon pour surveiller la température de l’échantillon. Vérifier que la sonde n’interfère pas avec la lumière laser en plaçant un livre blanc dans le chemin de laser (après la cupule) et à la recherche d’ombre causée par la sonde.
    Remarque : Il y a une différence de 2-3 ° C entre l’enregistrement de la température de l’eau du bain et de la température de l’échantillon.
  • Placer la cuve dans l’alésage de l’aimant, comme illustré à la Figure 4 a. La lumière laser se propage horizontalement à travers l’échantillon, est déviée par les miroirs non polarisant et détectée par un photodétecteur.
    Remarque : Le laser est dirigé vers le bas, par le biais de l’échantillon et de sauvegarder le même chemin pour tenir compte des effets de Faraday (c'est-à-dire la rotation de l’avion de polarisation de la lumière causée par le champ magnétique lorsque descendant est annulée lors de son retour dans le sens inverse).
  • Appliquer un flux constant d’air comprimé à température ambiante et 10000 Pa sur la cuvette pour éviter la condensation d’eau sur les parois cellulaires, ce qui réduirait l’intensité du signal et augmenter le bruit. Ceci est particulièrement important lors de la mesure à 5 ° C.
  • Détecter la première et la deuxième harmonique Equation 10 et Equation 11 du signal AC avec deux amplificateurs de lock-in. Auto les amplificateurs de verrouillage de phase en appuyant sur la touche (2) illustré à la Figure 5 b et ajuster la sensibilité comme le montre la Figure 5 b (1). Assurez-vous qu’il n’y a pas plus de quatre barres rouges sur les amplificateurs comme illustré à la Figure 5 b (3) pour éviter la surcharge du signal. Notez la sensibilité indépendant pour deux amplificateurs de blocage dans le programme Tesla_Magnet_Const_V092 comme illustré dans la Figure 5 (8). Le programme est fourni à titre d’information complémentaire.
  • Rampe du champ magnétique jusqu'à 5,5 T en fournissant le courant à l’aimant à travers le programme Tesla_Magnet_Const_V092 , comme illustré à la Figure 5 (5).
  • Obtenir la biréfringence Equation 5 utilisant l’équation 2, où le retard est calculé avec
    Equation 13(3)
    Equation 14 et Equation 15 sont des fonctions de Bessel de première espèce, avec Equation 16 et Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 tracer le retard dans le programme Tesla_Magnet_Const_V092, comme illustré à la Figure 5 (4).
    NOTE : Le retard prévu par le programme ne doit pas être utilisé pour calculer le signal de la biréfringence, si les deux amplificateurs de blocage ne fonctionnent pas à la même sensibilité (Voir l’étape 2.12). Les intensités harmoniques connectées Equation 10 et Equation 11 doivent être multipliées par la sensibilité des amplificateurs de blocage pour obtenir les bonnes dimensions. En outre, le signal de biréfringence mesuré dans un champ magnétique doit être normalisé en soustrayant le signal de biréfringence moyen obtenu à 0 T.
  • Surveiller le signal de biréfringence de l’échantillon à une constante ou changement de température (1 ° C/min) de régulation de la température de l’eau du bain reliée à la cuvette, illustrée à la Figure 4.
  • Connecter les données expérimentales en remplissant la description expérimentale dans la Figure 5 (8), en fournissant un nom de fichier (9) et en appuyant sur le bouton « START log » (10).
  • Figure 5
    Figure 5 : Illustrations des paramètres indépendants et des captures d’écran du programme. A) paramètres de PEM : un retard 2,405 rad, longueur d’onde de 635 nm, fréquence 50 Hz. White cercles indiquent quels paramètres à activer (USR = retard définies par l’utilisateur, LOC = mode d’opération local). B) Lock-in réglages de l’amplificateur. La sensibilité (1) doit être sélectionné avant chaque mesure conformément à l’étape 2.11. Il faudrait pas plus de quatre barres rouges sur l’écran (3) pour éviter une surcharge du signal. Une surcharge se produit lorsque le voyant (1) rouge s’allume, la mesure impossible. Appuyez sur la touche de phase d’auto (2) avant chaque mesure. C) captures d’écran du programme Tesla_Magnet_Const_V092 à titre de renseignement complémentaire. Le programme permet le contrôle du champ magnétique et l’enregistrement de toutes les sorties de la signalisation en fonction du temps. L’intensité du champ magnétique et la température de l’échantillon sont restituées en (1). La première et la deuxième harmonique Equation 10 et Equation 11 du signal AC mesuré par les deux amplificateurs de blocage sont restituées en (2). L’intensité du courant continu Equation 7 est tracée en (3). Le retard est calculé comme indiqué au point 2.13 et tracé dans (4). L’intensité du champ magnétique se trouve dans (5). La mesure directe de la température enregistrée par le thermocouple de Type K est présentée en (6) et les signaux de sortie (Equation 23 et Equation 22 ) (7). Exemples supplémentaires d’informations peuvent être insérées (8) telles que la sensibilité indépendant des amplificateurs, nom de l’échantillon, etc.. Les données peuvent être exploitées et exportées vers un fichier .txt fourni (9). Démarrer et arrêter la collecte de données avec la touche « START log » (10). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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    Representative Results

    Le signal de la biréfringence d’un non extrudé DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) échantillon a été suivie sous champ magnétique 5,5 T pendant un chauffage et de refroidissement cycle de 5 à 40 ° C et à une vitesse de 1 ° C/min (Figure 6). Les résultats de la biréfringence ont confirmé des alignements magnétiques élevés à 5 ° C avec une valeur de 1,5 x de 10-5, deux fois aussi forte en ce qui concerne les systèmes extrudés signalés. 6 , 7 , 23 la remise à zéro du signal biréfringence au-dessus des Tm de DMPC à 24 ° C a été causé par la formation de vésicules non-réglable. L’apparition du mouvement de la phase liquide désordonnée a déclenché des réarrangements majeurs dans les assemblées polymoléculaire. Ces transpositions sont thermo réversible. Réglable espèces ont été régénérées après refroidissement en dessous de Tm et le signal de la biréfringence a suivi la même tendance que le chauffage. Les pics distincts qui se produisent autour de Tm marquent le remplacement des assemblées réglable par des vésicules non-réglable. 23 la cinétique lente de ces réarrangements moléculaires en ce qui concerne le chauffage appliqué et le refroidissement de 1 ° C/min expliquer pourquoi les pics n’étaient pas chevauchement. Au lieu de cela, les deux pics a commencé au Tm de DMPC, suggérant que les lipides bicouche doivent avoir un certain degré d’afin de favoriser la formation d’espèces réglable.

    Figure 6
    Figure 6 : Signal de biréfringence en fonction de la température pour un non extrudé DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) l’échantillon sur (rouge) de chauffage et de refroidissement (bleu) à 1 ° C/min. L’échantillon a été préparé suivant les étapes du protocole 1 à 1.3.5. Les mesures de biréfringence ont été menées après l’étape du protocole 2. L’intensité du champ magnétique était inclinée jusqu'à 5,5 T et l’échantillon a été maintenu à 5 °, parvenir à un signal de biréfringence de 1.5 x 10-5 avant de procéder au cycle de chauffage et de climatisation. La biréfringence signal flatlines à des températures supérieures à 35 ° C où aucun alignement a été observé que l’échantillon était composé uniquement de vésicules. Lors du refroidissement, les bicelles ont été régénérées et un signal de biréfringence final de 7,2 x 10-6 a été obtenu à 5,5 T et 5 ° C. L’intensité du champ magnétique était inclinée vers le bas pour 0 T et l’échantillon a été maintenu à 5 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Un échantillon de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) a été hydratée après le chauffage et refroidissement de procédure à l’étape 1.3.4 et par la suite expulsé 10 fois à 60 ° C à travers des filtres de membrane de pores de différentes tailles, reportez-vous à l’étape 1.4. À 60 ° C, le mélange de lipides assemble dans des vésicules, qui sont influencées par le procédé d’extrusion. 16 , 35 , 36 , 37 à l’issue de l’extrusion, les bicelles ont été régénérées par refroidissement à 5 ° C et l’hydrodynamique diamètre DH a été mesuré par DLS. Le magnétique alignability de la bicelles a été évaluée à 5 ° C en calculant l’Af avec SANS à 8 T et en mesurant le signal de la biréfringence à 5,5 T ; Voir la Figure 7. Le signal de la biréfringence a été obtenu par la montée en puissance du champ jusqu'à 5,5 T et vers le bas à 0 T tel qu’illustré à la Figure 7 a. La biréfringence maximum a eu lieu à 5,5 T où il était attendu le plus haut degré de l’alignement de l’équation 1. Le diamètre hydrodynamique DH de la bicelles a été réduit à 220, 190, 106 et 91 nm par des extrusions successives par le biais de la taille des pores des membranes de 800, 400, 200 et 100 nm respectivement. La diminution correspondante dans l’alignement magnétique a été confirmée par le signal de biréfringence décroissante et la réduction en valeur absolue unf , comme il s’approchait de zéro en Figure 7 b. Les résultats ont confirmé la possibilité de contrôler la taille de bicelle et alignement magnétique à travers la confection des vésicules par extrusion à 60 ° C et le refroidissement à 5 ° C.

    Figure 7
    Figure 7 : Alignement magnétique d’un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) échantillon extrudé à travers des membranes filtrantes de différentes dimensions de pore. A) Δn′ de signal de biréfringence en fonction de l’intensité du champ magnétique B lors du lancement en haut et en bas pour l’échantillon extrudé à travers 800 nm pores. La biréfringence maximum a été atteint à 5,5 T conformément à l’équation 1. Cette valeur maximale de la biréfringence est rapportée dans B). Le même échantillon a été expulsé à travers 400 nm pores. L’alignement magnétique a été évaluée par les deux mesures de la biréfringence (carrés noirs) à 5,5 T (par analogie à ce qui a été fait pour l’étape précédente d’extrusion dans A) et de calcul des facteurs d’alignement unf (cercles rouges) à 8 T tracées en fonction de la diamètre hydrodynamique DH obtenue par DLS. L’alignement magnétique a été évalué par analogie sur le même échantillon extrudé à travers 200 nm pores et une dernière fois après extrusion à travers 100 nm pores. Toutes les mesures ont été effectuées à 5 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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    Discussion

    Un compte rendu détaillé de comment biréfringence mesures ont été utilisées en combinaison avec SANS expériences pour évaluer des méthodes pour la génération hautement magnétiquement sensibles Ln3 + chélateurs phospholipides ensembles est en Isabettini et al. 23 les protocoles de fabrication proposées sont également applicables pour les assemblys composés des phospholipides DPPC et DPPE-DTPA plus longtemps ou pour ceux contenant des dérivés de stéroïdes chimiquement modifiées dans leur bicouche. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 la seule condition étant que l’échantillon est chauffé à une température suffisamment élevée dans les étapes 1.3.2 et 1.3.3, 1.3.4 1.4.2. Les températures doivent permettre les lipides de la bicouche entrer dans une phase liquide désordonnée, garantissant une hydratation optimale de la régénération de film ou de l’échantillon sec lipidique. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) assemblées, par exemple, doivent être chauffés au-dessus de la température de transition de phase de la DPPC à 42 ° C, tandis que le système DMPC analogue doit être chauffé au-dessus de 24 ° C. Une température suffisamment élevée est également nécessaire pour garantir la formation de vésicules extrudable survenant lors de la bicouche lipidique est dans un État désordonné à l’étape 1.4. Les cycles de gel-dégel à l’étape 1.3.2 peuvent être entièrement remplacés par H & C cycles. 23 Toutefois, l’échantillon nécessite plus de temps pour hydrater pleinement le film lipidique avec cette procédure et doit être mixés 20 min quand à 5 ° C et 2 min à 60 ° C. H supplémentaire & C cycles sont réalisées si les éléments du film lipidique sec sont encore observées sur les parois de verre du flacon.

    Les Tm3 + chélateurs bicelles présentés dans le présent protocole aligner perpendiculairement à la direction du champ magnétique. Cette direction d’alignement est originaire la grande susceptibilité magnétique positive de Tm3 +. 11 , 14 autres ions lanthanides comme Dy3 + et Yb3 + peuvent également être appliquées. 11 , 13 , 19 l’anisotropie magnétique différente de la Ln3 + offre un moyen supplémentaire d’adaptation l’alignement magnétique de la bicelles. Par exemple, Dy3 + augmente la susceptibilité magnétique intrinsèque négative des phospholipides bicouche, ayant pour résultat un degré élevé d’alignement de le bicelles parallèle à la direction du champ magnétique. 13 cette nouvelle orientation de l’alignement est détectée par un changement de signe de fois le signal de la biréfringence et les facteurs d’alignement calculés à partir d’anisotrope 2D SANS motifs. Il est important de noter que la susceptibilité magnétique n’est pas uniquement dictée par la nature chimique de la Ln3 + , mais par la géométrie chélate de la Ln3 +-phospholipides complexes. 19 , 38 la susceptibilité magnétique peut être conçue en synthétisant différentes Ln3 + chélateurs polaires phospholipides, définissant la réponse magnétique des assemblées qui en résulte. 38

    Chaque échantillon est optiquement différent selon la nature des lipides constitutifs employées. Surveillance de la turbidité de l’échantillon en fonction de la température est une méthode complémentaire pour évaluer les transformations structurelles induites par la température dans les assemblys. Bien que ces mesures sont généralement effectuées en l’absence d’un champ magnétique dans un spectrophotomètre, suivi de l’intensité du courant continu laser Equation 7 avec l’installation proposée dans la présente offre les mêmes informations en présence magnétique champ. 11 , 16 le DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) les échantillons sont généralement moins troubles que leurs Chol-OH contenant DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) homologues à 5 ° C. Les échantillons qui ressemble à l’eau à 5 ° C ne sont généralement pas réglable dans un champ magnétique. At room température, les deux échantillons regard transparent car le DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) les échantillons sont dans une phase de transition entre les bicelles et les vésicules séminales et grands trous concentriques apparaissent dans le DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 l’état de transition de bicelles aux vésicules DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) est également accompagné d’une augmentation de la viscosité de l’échantillon à la température ambiante. Ce changement dépend de la température de la turbidité est difficile choisir la bonne sensibilité à l’étape 2.11. Si la sensibilité est réglée trop haut sur un échantillon de trouble à 5 ° C, la nature plus transparente de l’échantillon sur le chauffage peut causer une surcharge des amplificateurs. En outre, les échantillons très turbides augmenteront considérablement le bruit ratio signal et peuvent ne pas convenir pour la mesure de la biréfringence. La lumière laser doit être en mesure d’aller à travers l’échantillon afin d’être détecté.

    Échantillons non extrudé sont toujours plus turbides et ont tendance à s’agréger après stockage à court terme dans le réfrigérateur. Néanmoins, les échantillons magnétiquement sensibles sont facilement régénérées avec un H & cycle C. Échantillons non extrudé peuvent également être stockés à l’état congelé et aisément régénéré par H & C cycles. Extrudé échantillons sont conservés dans le réfrigérateur et mesure généralement en une semaine après la préparation de l’échantillon. Aucun rapport d’études sur la conservation prolongée des espèces extrudés dans un liquide ou un état congelé. Par conséquent, la distribution de taille des assemblys issus d’extrusion ne peut être garantie sur un stockage prolongé.

    Par analogie à n’importe quel système de bicelle, ces assemblys planaires magnétique réglable n’existent que dans une plage définie de composition lipidique et de la concentration. Altérant les ratios lipides se traduira par des architectures assembly différent, y compris la formation de micelles, des rubans et des vésicules. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 la concentration du tampon phosphate et le pH à l’étape 1.1.3 joue un rôle crucial dans l’élaboration de la bicelles et leur réponse magnétique. Le tampon définit les interactions physico-chimiques qui régissent le milieu hydrophile entourant les assemblées polymoléculaire. Des concentrations plus faibles de tampon entraîner architectures assembly différent, tandis que des concentrations plus élevées provoquent l’agrégation de l’échantillon et la précipitation en raison d’un dépistage des frais excédentaires.Dans des conditions acides avec des valeurs de pH entre 3 et 4, les portions d’acide carboxylique agissant comme ligands dans le GMEP-DTPA/Ln3 + complexes sont protonés. Cela se traduit par la destruction des assemblées polymoléculaire magnétiquement sensibles, agrégation et précipitation dans l’échantillon observé. Les magnétiquement sensibles Ln3 + polymoléculaire assemblées ont une résistance raisonnable vers des valeurs de pH plus basiques. Cependant, DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) bicelles se sont révélés se divisent en micelles à un pH de 12,9. 11 les échantillons ne doivent jamais être exposés à l’eau du robinet ou d’autres sels. N’importe quel autre ion va déranger la Ln3 + processus de chélation ou provoquer l’agrégation des assemblées en raison de l’examen préalable en accusation. Pour SANS mesures, le tampon est préparé comme indiqué au point 1.1.3 en D2O au lieu d’ultrapure H2O. Note que le relevé de compteur pH sera 7.0 (correspondant à une valeur de pD de 7.4).

    Les transformations structurelles qui se produisent dans les assemblys polymoléculaire soumis à un chauffage et de refroidissement de cycle sont thermo réversible. Par conséquent, le signal de biréfringence final à 5 ° C devrait être identique avant le cycle de température. 11 , 16 si le signal de la biréfringence est plus élevé après le cycle, l’échantillon a été pas correctement régénéré dans l’étape 1.3.4. Cela se produit couramment dans les échantillons stockés pendant une période prolongée de temps. Un signal de biréfringence inférieur après que le cycle de température observée à la Figure 6 indique un problème dans le montage expérimental. Le plus souvent, le trajet de la lumière laser a été troublé par retour de diffusion ou un autre objet. C’est particulièrement problématique avec la sonde de température insérée directement dans l’échantillon (voir étape 2.8) qui doit être placé à n’interfère ne pas avec le chemin d’accès direct de la lumière laser. Un parcours lumineux perturbée provoque une chute dans la Equation 7 , un signal bruyant, et/ou anormales pics dans les courbes de température biréfringence. Par exemple, le pic se trouvant sur le chauffage à environ 35 ° C dans la Figure 6 a été causé par une expansion des tubes eau de refroidissement dans la trajectoire directe de la lumière laser. Le signal de la biréfringence ne peut pas faire confiance a partir que. Bien que la forme générale de la courbe de refroidissement était normale, le signal de biréfringence inférieur à 5 ° C a été causé par l’interférence.

    Les valeurs de biréfringence obtenues suite à ce protocole ne sont pas absolus et sont utilisées pour comparer les échantillons entre eux. Pour fins de comparaison avec la littérature, un étalonnage avec un système de référence est requis. Par exemple, le signe de l’arriération mesurée dépend de l’alignement de la mise en place et peut être contrôlé avec toluène, qui a une constante de coton-Mouton de 3,27 × 10−9 T−2. 39 , 40

    Le signal de biréfringence provenant de changements dans l’alignement magnétique de l’échantillon peut être dissociée de la signal causé par des réarrangements moléculaires dans la bicouche. Facteurs d’alignement calculé à partir d’anisotrope 2D SANS patrons obtenus sous un champ magnétique sont seulement influencées par l’alignement de la majeure partie des assemblées polymoléculaire. Les deux méthodes sont complémentaires et permettent de découplage des contributions pour le signal de la biréfringence. L’installation de biréfringence proposée pourrait être parfaite en divisant le faisceau laser, permettant la surveillance simultanée des échantillons avec et sans exposition au champ magnétique externe. Les résultats de biréfringence obtenus pour l’échantillon dans le champ magnétique peuvent être normalisées par le signal obtenu pour l’échantillon à 0 T, comptabilité efficacement pour le fond.

    Mesure de la biréfringence ne se limitent pas à quantifier l’alignement magnétique de bicelles. Nombreux soft-matériaux génèrent un signal de biréfringence en raison de l’ordre de leur structure interne. La configuration proposée permet de surveiller la biréfringence de ces matériaux en fonction de la température avec ou sans un champ magnétique externe. Les fibres d’organogel anthracène, vermiformes micelles sous flux, nanocellulose et des fibrilles amyloïdes-Fe3O4 sont quelques exemples dont le comportement biréfringence a été évalué avec succès avec la configuration proposée. 29 , 30 , 32 , 41

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    Disclosures

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Acknowledgments

    Les auteurs reconnaissent la Swiss National Science Foundation pour financement SMhardBi (numéro de projet 200021_150088/1). SANS expériences ont été effectuées à la source de neutrons de spallation Suisse SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Suisse. Les auteurs remercient chaleureusement le Dr. Joachim Kohlbrecher pour ses conseils avec les expériences SANS. L’installation de mesure de la biréfringence sous des champs magnétiques élevés a été inspirée de la configuration existante au haut champ magnétique laboratoire HFML, Nijmegen, Pays-Bas. Nous remercions Bruno Pfister pour son aide dans le développement de l’électronique de l’installation de la biréfringence, Jan Corsano et Daniel Kiechl pour construire les cadres permettant un alignement fin et facile du laser et Dr. Bernhard Koller pour soutien technique continu.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

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