Fabricage Procedures en dubbele breking metingen voor het ontwerpen van magnetisch responsieve Lanthanide Ion chelaat fosfolipide Assemblies

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fabricage procedures voor zeer magnetisch responsieve lanthanide ion chelaat polymolecular assembly's worden gepresenteerd. De magnetische reactie wordt bepaald door de grootte van de vergadering, die is afgestemd door extrusie via nanopore membranen. De assemblages magnetische alignability en temperatuur-geïnduceerde structurele veranderingen worden gecontroleerd door de dubbele breking metingen, een gratis techniek om nucleaire magnetische resonantie en kleine hoek neutronen verstrooiing.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bicelles zijn afstembare schijf-achtige polymolecular assembly's gevormd uit een grote verscheidenheid van lipide mengsels. Toepassingen variëren van membraan eiwit structurele studies door nucleaire magnetische resonantie (NMR) tot nanotechnologische ontwikkelingen, met inbegrip van de vorming van optisch actieve en magnetisch schakelbare gels. Dergelijke technologieën vereisen hoge controle van de grootte van de vergadering, de magnetische reactie en de warmteweerstand. Mengsels van 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfocholine (DMPC) en haar lanthanide-ion (Ln3 +) chelaat fosfolipide conjugaat, 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phospho-ethanolamine-diethyleenglycol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), assembleren in zeer magnetisch responsieve assemblages zoals DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molaire verhouding 4:1:1) bicelles. Invoering van cholesterol (Chol-OH) en steroïde derivaten in de dubbelgelaagde resultaten in een andere set van assembly's bieden unieke fysisch-chemische eigenschappen. Voor een bepaald lipide-samenstelling is de magnetische alignability evenredig aan de grootte van de bicelle. De kleurverandering van Ln3 + resulteert in ongekende magnetische reacties in termen van zowel de omvang als de uitlijning richting. De thermo-omkeerbare ineenstorting van de schijf-achtige structuren in blaasjes op verwarming kunt afstemming van de vergaderingen afmetingen door extrusie via membraanfilters met gedefinieerde porie maten. Het magnetisch alignable bicelles worden geregenereerd door afkoeling tot 5 ° C, wat resulteert in vergadering afmetingen gedefinieerd door het blaasje precursoren. Hierin, deze procedure fabricage wordt uitgelegd en de magnetische alignability van de assembly's wordt gekwantificeerd door dubbele breking metingen onder een 5.5 T magnetisch veld. Het signaal van de dubbele breking, afkomstig uit de fosfolipide dubbelgelaagde, verder kan polymolecular veranderingen in de dubbelgelaagde. Deze eenvoudige techniek is complementair aan NMR experimenten die algemeen werkzaam zijn te karakteriseren van bicelles.

Introduction

Bicelles zijn polymolecular schijf-achtige assemblages verkregen uit talrijke lipide-mengsels. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 zijn ze veel gebruikt voor de structurele karakterisering van membraan biomoleculen door NMR spectroscopie. 6 , 7 echter, recente inspanningen willen uitbreiden op het gebied van mogelijke toepassingen. 5 , 8 , 9 de meest bestudeerde bicelle systeem bestaat uit een mengsel van 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfocholine (DMPC), die deel uitmaken van het vlakke deel van de vergadering en 1,2-dihexanoyl -sn- glycero-3-fosfocholine (DHPC) Fosfolipide die betrekking hebben op de rand. 1 , 2 , 3 de moleculaire geometrie van de fosfolipiden componeren het dubbelgelaagde dicteren de architectuur van de structuur van zelf geassembleerde polymolecular. 4 , 5 ter vervanging van DHPC met DMPE-DTPA genereert zeer magnetisch responsieve en afstembare bicelle systemen. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molaire verhouding 4:1:1) bicelles koppelen met veel meer paramagnetisch lanthanide ionen (Ln3 +) op van de dubbelgelaagde oppervlak, wat resulteert in een verbeterde magnetische reactie. 10 voorts, ter vervanging van de in water oplosbare DHPC moleculen met DMPE-DTPA/Ln3 + maakt de vorming van verdunning-resistente bicelles. 11

De magnetische alignability van vlakke polymolecular assembly's wordt gedicteerd door hun algemeen magnetische energie,

Equation 1(1)

Indien B de magnetische veldsterkte is, Equation 2 de magnetische constant, n het nummer van de aggregatie en Equation 3 de anisotropie van de moleculaire diamagnetisch gevoeligheid van het samenstellen van de dubbelgelaagde lipiden. Daarom is de reactie van DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles op magnetische velden op maat door hun grootte (totale getal n) en de moleculaire diamagnetisch gevoeligheid anisotropie Δχ. De laatste wordt gemakkelijk bereikt door het veranderen van de aard van de chelaat Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 Introducing cholesterol (Chol-OH) of andere steroïde derivaten in de dubbelgelaagde biedt de mogelijkheid van tuning van zowel de statistische getal n en de Δχ van de magnetische gevoeligheid van de vergaderingen. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 voor de samenstelling van een bepaald lipide, grotere assemblages bevatten meer lipiden die kunnen bijdragen aan de E-mag (grotere statistische getal n), wat resulteert in meer alignable soorten. De grootte van DMPC/DHPC bicelles, bijvoorbeeld, wordt conventioneel gecontroleerd door optimalisatie van het componeren vetgehalte voor verhouding of totaal. 20 , 21 , 22 maar dit mogelijk in DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles is, hun thermo-omkeerbare transformatie van bicelle naar blaasjes op verwarming aanbiedingen toegevoegd spastische opties. Mechanische betekent zoals extrusie via membraanfilters kunt vormgeven van de blaasjes. Het magnetisch alignable bicelles op koeling tot 5 ° C worden geregenereerd en hun afmetingen van het vesikel precursors worden gedicteerd. 11 Herein, richten we ons op het potentieel van mechanische fabricage procedures met DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) of DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) als referentiesystemen. Het proces werkt naar analogie bij het werken met andere Ln3 + dan Tm3 +. Het brede scala van mogelijkheden die worden geboden door deze technieken zijn gemarkeerd in Figuur 1 en elders uitvoerig besproken. 23

Figure 1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de mogelijke fabricage procedures. De bestudeerde magnetisch alignable Ln3 + chelaatvormers polymolecular assembly's zijn samengesteld uit beide DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) of DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5). De droge lipide-film is met een 50 mM fosfaatbuffer op een pH van 7,4 gehydrateerd en het totale vetgehalte is 15 mM. Een effectieve hydratatie van de lipide-film vereist bevriezen of ontdooien cycli (FT) of verwarming en koeling cycli (H & C). H & C cycli zijn nodig om te regenereren monsters na de laatste vorst ontdooien stap, of te regenereren monsters bevroren gehouden over een langere periode van tijd als ze moeten worden gebruikt zonder verdere extrusie. Deze stappen worden uitvoerig besproken door Isabettini et al. 23 maximaal alignable polymolecular assemblages resultaat wordt bereikt, het leveren van de vergadering van de verschillende platforms gebaseerd op de samenstelling van lipide. De grootte van de bicelle en de magnetische alignability is afstembare door extrusie (Ext) via nanopore membraanfilters. De gepresenteerde uitlijning factoren Af werden berekend op basis van 2D kleine hoek neutronen verstrooiing (SANS) patronen van een DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) monster geëxtrudeerd via 800, 400, 200 of 100 nm poriën. SANS metingen zijn een complementaire middelen van het kwantificeren van de uitlijning van de bicelle die niet aan bod komt in meer detail hierin. 11 , 16 de Af varieert van -1 (parallelle neutronen verstrooiing of loodrecht uitlijning van de bicelles met betrekking tot de richting van het magnetisch veld) op 0 voor isotrope verstrooiing.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De structuur van bicelles is uitgebreid bestudeerd door een breed scala van karakterisering technieken. 13 de uitlijning van de bicelles blootgesteld aan een magnetisch veld heeft gekwantificeerd met behulp van NMR-spectroscopie of kleine hoek neutronen verstrooiing (SANS) experimenten. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 de verschuiving en de verbreding van de pieken van de NMR voordoet in aanwezigheid van Ln3 + zijn echter ernstige beperkingen aan de methode. 15 , 26 , 27 , 28 hoewel SANS experimenten lijden niet onder deze beperking, alternatieve en toegankelijker technieken zijn wenselijk voor routinematige kwantificering van magnetisch geïnduceerde uitlijning van assemblages in oplossing. Dubbele breking metingen zijn een levensvatbare en relatief eenvoudig alternatief. Analoog aan NMR experimenten onthullen dubbele breking metingen waardevolle informatie over lipide herschikkingen en lipide fasen die zich voordoen in de dubbelgelaagde. Bovendien, meetkundige transformaties die zich voordoen in de vergadering van de polymolecular met veranderlijke omgevingsomstandigheden zoals temperatuur worden gecontroleerd. 11 , 12 , 13 , 16 magnetisch geïnduceerde dubbele breking Δn′ is gebruikt voor het bestuderen van verschillende soorten fosfolipide systemen. 13 , 29 , 30 dubbele breking metingen gebaseerd op de techniek van de fase modulatie in een magnetisch veld is een haalbare methode om de oriëntatie van bicelles detecteren. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 de mogelijkheid onderzoeken van bicelles met dubbele breking in hoge magnetische velden tot 35 T werd ook aangetoond door M. Liebi et al. 13

Als gepolariseerd licht een anisotrope materiaal binnenkomt, zal het worden gebroken in een gewone en buitengewone golf. 11 de twee golven hebben verschillende snelheden en in fase door een δ retardatie worden verschoven. De mate van vertraging δ wordt gemeten en omgezet in een dubbele breking signaal Equation 5 te kwantificeren van de mate van anisotropie in het materiaal met

Equation 6(2)

waar is λ de golflengte van de laser en d de dikte van het monster. Fosfolipiden zijn optisch anisotrope en hun optische as samenvalt met hun lange moleculaire assen, parallel aan de staarten van koolwaterstof. 11 , 12 geen vertraging wordt gemeten als de fosfolipiden willekeurig in oplossing georiënteerde zijn. Vertraging wordt gemeten als fosfolipiden, parallel met elkaar worden uitgelijnd. Het magnetisch geïnduceerde dubbele breking Equation 5 kan hebben een positief of negatief teken afhankelijk van de oriëntatie van de moleculen in het magnetisch veld; Zie Figuur 2. Fosfolipiden parallel uitgelijnd met de x-as zal resulteren in een negatieve Equation 5 , terwijl die uitgelijnd langs de z-as in een positieve resulteren Equation 5 . Geen dubbele breking is waargenomen wanneer de optische as samenvalt met de richting van licht propagatie zoals de fosfolipide uitgelijnd evenwijdig aan de y-as.

Figure 2
Figuur 2: Aanpassing van de fosfolipiden en het bijbehorende teken van het magnetisch geïnduceerde dubbele breking Equation 12 . Het teken van de gemeten Equation 12 is afhankelijk van de oriëntatie van de fosfolipide in het magnetisch veld. Onderbroken lijnen geven de optische as van het molecuul. Het licht is gepolariseerd op 45° en zich voortplant in de y-richting. Het magnetisch veld B is in de z-richting. Dit cijfer is gewijzigd van M. Liebi. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In het geval van een isotroop colloïdale suspensie van bicelles zullen de oriëntatie geïnduceerd door de rangschikking van de fosfolipiden in de dubbelgelaagde verloren gaan, de retardatie δ zeroing. De bicelles moet ook uitlijnen om te oriënteren de optisch actieve fosfolipiden in hun bilayers, waardoor een retardatie δ van de gepolariseerd licht. Dubbele breking is derhalve een gevoelig instrument te kwantificeren van de magnetische alignability van de polymolecular-assembly's. Bicelles uitgelijnd loodrecht op het magnetisch veld resulteert in een positieve Equation 5 , terwijl die parallel uitgelijnd in een negatieve resulteert Equation 5 . Het bord hangt af van de uitlijning van de setup en kan worden gecontroleerd met een referentiemonster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabricage procedure voor DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) polymolecular samenstellen

  1. Voorlopige preparaten
    1. Wassen alle het glaswerk door te spoelen eenmaal met ethanol gestabiliseerd chloroform (> 99% chloroform) en droog met perslucht.
    2. Produceren van 2 verschillende 10 mg/mL voorraadoplossingen van DMPC en DMPE-DTPA in ethanol-gestabiliseerde chloroform (> 99% chloroform), een 10 mM stamoplossing van Chol-OH in ethanol-gestabiliseerde chloroform (> 99% chloroform) en een stamoplossing van 10 mM voor TmCl3 in methanol.
    3. Bereid een 50 mM fosfaatbuffer op een pH van 7,4 door het mengen van 0.121 g natrium Natriumdiwaterstoffosfaat fosfaat (dihydraat) p.a. en 0.599 g watervrij di-natrium waterstof fosfaat in 100 mL ultrazuiver H2O.
  2. Voorbereiding van de droge lipide-film
    1. Weeg de vereiste hoeveelheden amfifielen (DMPC, DMPE-DTPA en optioneel Chol-OH) en Ln3 + voorraadoplossingen in aparte 3 mL glas module-cups met een 2,5 mL glas spuit.
      1. Voor een 3 mL monstervolume van DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1, totale vetgehalte van 15 mM), wegen in 3.6435 g van de stockoplossing van DMPC, 1.4731 g van de DMPE-DTPA stockoplossing en 0.7126 g van de stockoplossing van de3 TmCl.
      2. Voor een 3 mL monstervolume van DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5, totale vetgehalte van 15 mM), weeg 2.9148 g van de stockoplossing van DMPC, 1.4731 g van de DMPE-DTPA stockoplossing, 1.0749 g van de stockoplossing Chol-OH en 0.7126 g de3 stockoplossing van TmCl.
        Let op: Chloroform en methanol zijn giftig en vluchtige bij kamertemperatuur. Werken in een zuurkast en snel verder met de massa-metingen.
    2. De inhoud van de module-cups overbrengen in een 25 mL ronde onderkant kolf. Spoel elke module-cup in de kolf met ronde bodem met ongeveer 2,5 mL van het overeenkomstige oplosmiddel.
    3. Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm in een rotatieverdamper bij 40 ° C. Instellen van de eerste druk tot 30.000 Pa totdat het grootste deel van het oplosmiddel wordt verwijderd. De druk verminderen tot 100 Pa en droog het monster onder rotatie voor een minimum van 2 h. verkrijgen een uniforme droge lipide-film over de glazen wanden van de kolf.
    4. Plaats de droge lipide-film gedurende 1 minuut onder een gestage stroom van argon te voorkomen van lipide oxidatie in de lucht en slaan het monster in de vriezer vóór rehydratie.
  3. Hydratatie van de droge lipide-film
    1. Voeg de 3 mL fosfaatbuffer toe aan de kolf met ronde bodem te bereiken van een totale vetgehalte van 15 mM.
    2. Verrichten van een bevriezen-ontdooien (FT) cyclus door het kelderen van de erlenmeyer onder rotatie in vloeibare stikstof tot het grondig (vloeibare stikstof stopt het koken) is bevroren, dan warmte terug tot 60 ° C door het plaatsen van het monster gedurende 5 minuten in een waterbad, zwenken van de kolf continu steun het smeltproces. Toepassing van de 30 s van vortexing vóór elke bevriezing cyclus wanneer het monster vloeibare is op de steun van de hydratatie van de lipide-film.
      Opmerking: Geen lipide-film moet worden weergegeven op de wanden van de kolf na de tweede bevriezen dooiende cyclus.
    3. Herhaal 1.3.2 in totaal vijf keer. Sluit de kolf of fles met een cap te vermijden geen onnodige verdamping van de fosfaatbuffer wanneer het monster heet. Het protocol kan worden onderbroken wanneer de steekproef is bevroren.
    4. Gaat u verder met twee verwarming en koeling (H & C) cycli stabiliseren van het monster uit de laatste bevriezing stap of bevroren voor maximaal twee maanden. Het verwarmen van het monster, tot 40 of 60 ° C voor DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) of DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5), respectievelijk, voordat u gaat koelen tot 5 ° C op 1 ° C/min. handhaven het monster 5 min op het maximum en minimum temperaturen van de cyclus.
    5. Nu, of het signaal van de dubbele breking van het monster in een extern magnetisch veld (stap 2) bepalen of verdere extruderen het monster om te stemmen op de afmetingen van de bicelle en de magnetische alignability (stap 1.4).
      Opmerking: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) monsters bestaan voornamelijk uit bicelles met een hydrodynamische middendiameter DH van 70 nm zoals geopenbaard door een aantal verdeling verkregen Dynamische lichtverstrooiing (DLS) metingen bij 5 ° C. Deze monsters bevatten ook grotere polymolecular samenstellingen met een gemiddelde DH van 500 nm zoals geopenbaard door een verdeling van de intensiteit. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) monsters zijn zeer polydisperse in grootte met de typische intensiteit distributies onthullen een gemiddelde DH van 700 nm, terwijl het aantal distributies een populatie gedomineerd onthullen door kleinere bicelles in het bereik van de grootte van 200 nm. Meer gedetailleerde grootte distributies en cryo Transmissie Electronenmicroscopie beelden van deze monsters zijn gemeld door Isabettini et al. 23
  4. Extrusie van de polymolecular-assembly's.
    1. Bouw de extruder zoals afgebeeld in Figuur 3. Handschoenen en pincet gebruiken met de bescherming van silica buizen voor behandeling. Natte het koffiefilter (5) met een paar druppels van de buffer toe voor een optimale plaatsing van de membraanfilter (6). Zorg ervoor dat het papier heeft geen plooien na het plaatsen van de o-ring (7) op de top.
      Opmerking: Het extrusieproces werd getest op membraanfilters (6) met een diameter van de porie van 800, 400, 200 en 100 nm; Zie Figuur 7.
    2. Instellen van het waterbad tot 40 ° C voor DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) monsters of 60 ° C voor DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) monsters te garanderen van de vorming van extrudeerbare blaasjes.
    3. De extruder verbinden met een hydrofoor stikstof fles met behulp van een hogedruk PVC-buis (> 4 MPa) uitgerust met serto adapters en extruderen van het vloeibare materiaal door het membraan. 1 MPa druk is meestal vereist voor extrusie via membraanfilters (6) met een porie-diameter van 200 nm en hoger. 1,5 tot 2,5 MPa zijn vereist voor de kleinere membraanfilters (6) met een diameter van de porie van 100 nm.
      Opmerking: Wijzig de membraanfilter als abnormaal hoge druk (> 2.5 MPa) zijn nodig om de diepte van het monster (dit is het eerste teken van verstopping).
    4. Open het klepje (10) en voeg het monster met behulp van een precisiepipet 2 mL glas. Vervolgens sluit de klep (10) en open de klep van de druk (12) terwijl het monsterbuisje stopcontact (2). Sluit de klep van de druk (12) na de extrusie-cyclus is voltooid, vent en gaat u verder met de volgende cyclus.
      Opmerking: Laat niet het monster in contact te lang met het hete dubbelwandige vaartuig (8) om te voorkomen dat buitensporige monster verlies door verdamping.
30-60-s is genoeg tijd voor een 3 mL monster te equilibreer in de extruder voor het openen van de klep van de druk (12).
  • Ga naar 10 extrusie cycli voor een bepaalde membraan porie dimensie zoals afgebeeld in Figuur 3. De meeste bicelle systemen zijn 10 keer geëxtrudeerd door membranen met een diameter van de porie van 200 en een ander 10 keer door membranen met een diameter van de porie van 100 nm, monster vergelijkbaarheid te garanderen.
  • Nu, bepalen het signaal van de dubbele breking van het monster in een extern magnetisch veld (stap 2).
  • Figure 3
    Figuur 3: laboratorium extruder gebruikt voor bicelle en vesikel preparaten. De extruder is samengesteld uit de bodem omhoog: (1) mount, (2) het verzamelen van ruimte met een 2.4 mm (binnendiameter) kunststof uitlaat buis en o-ring, (3) en (4) grote en kleine stabiliserende mesh, (5) filtreerpapier (6) de membraanfilters, o-ring (7), (8) dubbelwandige schepen, monster (9. ) top cover met inlaat en druk aansluiting, (10) cover, (11) vlinder schroeven, (12) druk ventiel. Een schets van de geassembleerde extruder wordt weergegeven van de rechts-rechter-zijde. De stikstofgas (N2) wordt geleverd door een drukvat en de dubbelwandige vaartuig (9) is aangesloten op een waterbad voor temperatuurregeling. Het monster ondergaat 10 extrusie cycli voor elk Filterdiameter porie gegeven membraan (monster pad getoond in blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    2. dubbele breking metingen van DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) polymolecular samenstellen.

    1. Bouwen en aansluiten van de dubbele breking setup als weergegeven in Figuur 4 en spanning aan de respectieve elektronische elementen leveren. Plaats niet de PEM, het monster en de tweede polarisator op het pad van de laser in dit stadium. Vermijd opsporen van laser back-verstrooid licht bedekken lichtweerkaatsende oppervlakken, bijvoorbeeld aluminium spiegel houders, met zwart papier.
    2. Aanpassen van de spiegels om te maximaliseren van de intensiteit van de laser op de detector, die wordt vertegenwoordigd door de intensiteit van de gelijkstroom Equation 7 verkregen van het low-pass filter in figuur 4B.
      Let op: Passende Oogbescherming dragen bij het aanpassen van de spiegels en overleg plegen met een laser veiligheid instructeur als manipuleren van lasers voor de eerste keer.
    3. Zet de eerste gekruiste lineaire polarisator (onderhouden loodrecht op de invallende laserstraal) om te maximaliseren de Equation 7 .

    Figure 4
    Figuur 4: schematische weergave van de dubbele breking setup en aansluitingen voor de optische signalen. A) een supergeleidende elektromagneet levert een 5.5 T magnetisch veld. Het licht van een diodelaser op 635 nm is gepolariseerd door twee gekruiste polarisatoren. Een fotoelasto modulator PEM-90 werkt op 50 KHz met een amplitude van een0 van 2.405 rad en tussen de twee polarisatoren geplaatst. Het monster ligt in de magneet tussen de PEM en de tweede polarisator. Non-polariserende spiegels begeleiden van het licht door de verschillende elementen en tenslotte wordt gedetecteerd door een foto-detector. De eerste en tweede-harmonische Equation 10 en Equation 11 van het AC-signaal worden gecontroleerd, waardoor de berekening van het signaal van de dubbele breking geven informatie over de magnetische alignability voor de Ln3 + chelaat polymolecular assembly's. De monster cuvette is verbonden met een extern waterbad voor temperatuurregeling (blauw). De temperatuur van het monster wordt gecontroleerd met een temperatuursonde (rood). B) het signaal van de foto detector wordt ingevoerd in een tweede bestelling Sallen-Key low-pass filter (24 V AC voeding) met een grensfrequentie van 360 Hz via een ±12 V DC power supply braded kabel (3). Het low-pass filter haalt het onderdeel DC Equation 7 en levert het aan de PC-interface (4) via een BNC 50 Ω kabel. Het signaal van de foto detector wordt geleverd aan de twee versterkers van lock-in (die de eerste en tweede-harmonische uittreksel Equation 10 en Equation 11 ) via een BNC 50 Ω kabel (1) & (2). De harmonische intensiteiten worden gedetecteerd door een fase-gevoelige detectie. Bijgevolg wordt de PEM-signaal gebruikt als referentie signaal voor de lock-in versterkers (1f-output van de PEM in de eerste versterker lock-in en 2f-uitgang in de tweede, verbonden met BNC Kabels met 50 Ω). De uitgangssignalen worden geleverd aan de eenheid van de PC-interface via BNC 50 Ω kabels. Analoge acquisitie eenheden GVB-AI-110 en GVB-CB-1 digitaliseren het signaal dat wordt overgebracht naar de computer via een RS-232-kabel voor het toezicht. De temperatuurvoeler type K is ook verbonden met de PC-interface-eenheid waar analoge acquisitie eenheden GVB-CB-3 en GVB-TC-120 het signaal digitaliseren voor het overdragen naar de computer via een RS-232-kabel voor het toezicht. C) foto van de schematische setup gepresenteerd in B. sleutelelementen zijn geïdentificeerd met overeenkomstige getallen van 1 tot 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    1. Plaats de tweede gekruiste lineaire polarisator loodrecht op de invallende laserstraal, zoals weergegeven in figuur 4A. Minimaliseer de Equation 7 door de vaststelling van de tweede polarisator op een hoek van 90° ten opzichte van de eerste.
    2. Plaats de fotoelasto modulator (PEM) bij 0° tussen de twee gekruiste lineaire polarisatoren en loodrecht op de invallende laserstraal zoals weergegeven in figuur 4A. Pas de PEM op een frequentie van 50 kHz en amplitude A0 tot 2.405 rad zoals weergegeven in figuur 5A. Dit maakt het onderdeel DC onafhankelijk van de dubbele breking en verhoogt de Equation 7 .
      Opmerking: De optische as van de PEM kan worden afgestemd door een paar graden te handhaven van een constante Equation 7 in de lucht voor het meten van een monster.
    3. 1 uur wachten na het aanzetten van de laser en elektronische apparatuur te stabiliseren van het signaal.
    Het signaal is stabiel, zodra de auto-fasering van de lock-in versterkers constant blijft.
  • Leg het monster in een temperatuur gecontroleerde kwarts Cuvet met een weglengte van 10 mm en het verbinden met een extern waterbad in eerste instantie ingesteld op 5 ° C.
  • Plaats een 0,5 mm dik type K-thermokoppel (temperatuurvoeler) rechtstreeks in de steekproef om de temperatuur van het monster te bewaken. Controleer of dat de sonde niet met het laserlicht interfereert door een Witboek in het pad van de laser (na de meetcel) te plaatsen en op zoek naar schaduwen veroorzaakt door de sonde.
    Opmerking: Er is een 2-3 ° C verschil tussen de opname van de temperatuur van het waterbad en de temperatuur van het monster.
  • Plaats de cuvette in de boring van de magneet, zoals weergegeven in figuur 4A. Het laserlicht wordt horizontaal wordt doorgegeven door middel van het monster afgebogen door niet-polariserende spiegels en gedetecteerd door een foto-detector.
    Opmerking: De laser is gericht naar beneden, door middel van het monster, en maak een back-up van hetzelfde pad ter verantwoording voor Faraday effecten (dat wil zeggen de draaihoek van het vliegtuig van de polarisatie van licht veroorzaakt door het magnetisch veld wanneer naar beneden wordt geannuleerd wanneer terug komen in de tegenovergestelde richting).
  • Toepassing van een constante luchtstroom van samengeperste lucht bij kamertemperatuur en 10000 Pa op de cuvette om condensatie van water op de celwand, die zou verminderen de intensiteit van het signaal en ruis te verhogen. Dit is vooral belangrijk bij het meten bij 5 ° C.
  • Detecteren van de eerste en tweede-harmonische Equation 10 en Equation 11 van het AC-signaal met twee lock-in versterkers. Auto fase de versterkers lock-in door op de knop (2) weergegeven in figuur 5B en de gevoeligheid zoals weergegeven in figuur 5B (1). Zorg ervoor dat er zich niet meer dan vier rode balken op de versterkers zoals weergegeven in figuur 5B (3) om te voorkomen dat overbelasting van het signaal. Toon waas naar de werknemer gevoeligheid voor beide versterkers lock-in in het programma Tesla_Magnet_Const_V092 zoals weergegeven in figuur 5C (8). Het programma wordt geleverd als aanvullende informatie.
  • Oprit het magnetisch veld tot 5.5 T door te leveren aan de magneet via het programma Tesla_Magnet_Const_V092 huidige zoals weergegeven in figuur 5C (5).
  • Verkrijgen van de dubbele breking Equation 5 met behulp van vergelijking 2, waar de vertraging wordt berekend met
    Equation 13(3)
    waar Equation 14 en Equation 15 zijn Bessel-functies van de eerste soort, met Equation 16 en Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 plot vertraging in het programma Tesla_Magnet_Const_V092, zoals getoond in figuur 5C (4).
    Opmerking: De retardatie geboden door het programma mag niet worden gebruikt voor de berekening van de dubbele breking signaal als de twee lock-in versterkers niet op dezelfde gevoeligheid werken (zie stap 2.12). De gelogde harmonische intensiteiten Equation 10 en Equation 11 moet worden vermenigvuldigd met de gevoeligheid van de versterkers lock-in om de juiste afmetingen. Bovendien, het signaal van de dubbele breking gemeten onder een magneet veld moet worden genormaliseerd door af te trekken van het signaal van de gemiddelde dubbele breking verkregen bij 0 T.
  • Controleren van het monster dubbele breking signaal bij constante of het wijzigen van de temperatuur (1 ° C/min) door het reguleren van de temperatuur van het waterbad aangesloten op de cuvette afgebeeld in Figuur 4.
  • Meld u de experimentele gegevens door het invullen in de experimentele beschrijving in figuur 5C (8), de naam van een bestand in (9), en druk op de knop 'START aanmelden' (10).
  • Figure 5
    Figuur 5: illustraties van de werknemer instellingen en programma screenshots. A) PEM instellingen: retardatie 2.405 rad, golflengte van 635 nm, frequentie 50 Hz. White cirkels aangeven welke instellingen u moet worden geactiveerd (USR = door gebruiker gedefinieerde retardatie, LOC = lokale bewerkingsmodus). B) Lock-in de instellingen van de versterker. De gevoeligheid (1) moet voor iedere meting zoals vereist in stap 2.11 worden geselecteerd. Er mag niet meer dan vier rode balken op het display (3) om te voorkomen dat een signaal overbelasting. Een overbelasting treedt op wanneer de rode leidde in (1) ingeschakeld, waardoor een meting onmogelijk. Druk op auto fase (2) vóór elke meting. C) Screenshots van het programma Tesla_Magnet_Const_V092 als aanvullende informatie verstrekt. Het programma staat controle van het magnetisch veld en opname van alle het signaal als functie van de tijd uitgangen. De magnetische veldsterkte en de temperatuur van het monster worden uitgezet in (1). De eerste en tweede-harmonische Equation 10 en Equation 11 van het signaal van de AC gemeten door de twee lock-in versterkers worden uitgezet in (2). De intensiteit van de gelijkstroom Equation 7 in (3) worden uitgezet. De achterstand is berekend zoals beschreven in stap 2.13 en die zijn uitgezet in (4). De magnetische veldsterkte is gevestigd in (5). De rechtstreekse meting van de temperatuur opgenomen door het thermokoppel Type K wordt gepresenteerd in (6) en de uitgangssignalen (Equation 23 en Equation 22 ) in (7). Extra voorbeelden kan worden ingevoegd in (8) zoals de werknemer gevoeligheid van de versterkers, monster naam, enz. De gegevens kunnen worden geregistreerd en geëxporteerd naar een txt-bestand waarin (9). Starten en stoppen van de data-acquisitie met de "START" logboekknoop (10). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Het signaal van de dubbele breking van een niet-geëxtrudeerde DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) monster werd gecontroleerd in het kader een 5.5 T magnetisch veld tijdens een verwarming en koeling van de cyclus van 5 tot 40 ° C en terug met een snelheid van 1 ° C/min (Figuur 6). De dubbele breking resultaten bevestigd hoge magnetische uitlijning bij 5 ° C met een waarde van 1,5 x 10-5, twee keer zo sterk wat betreft de gemelde geëxtrudeerde systemen. 6 , 7 , 23 de zeroing van het signaal van de dubbele breking boven de Tm van DMPC bij 24 ° C werd veroorzaakt door de vorming van niet-alignable blaasjes. Het uiterlijk van de beweging van de wanordelijke vloeistoffase leverde belangrijke herschikkingen in de polymolecular-assembly's. Deze herschikkingen zijn thermo-omkeerbaar. Alignable soorten werden opnieuw gegenereerd op koeling onder Tm en de dubbele breking signaal dezelfde trend gevolgd als bij verwarming. De verschillende toppen die zich voordoen rond Tm markeren de vervanging van de alignable-assembly's door niet-alignable blaasjes. 23 in de langzame kinetiek van de moleculaire herschikkingen met betrekking tot de toegepaste verwarming en koeling van de snelheid van 1 ° C/min wordt uitgelegd waarom de toppen waren niet overlappen. In plaats daarvan begonnen beide toppen op de T-m van DMPC, wat suggereert dat de dubbelgelaagde lipiden een zekere mate van orde om de gunst van de vorming van alignable soorten moeten hebben.

    Figure 6
    Figuur 6: Dubbele breking signaal als een functie van de temperatuur voor een niet-geëxtrudeerde DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) monster op (rood) Verwarming en koeling (blauw) op 1 ° C/min. Het monster werd opgesteld in vervolg op het protocol stappen 1 tot en met 1.3.5. De dubbele breking metingen werden uitgevoerd na het protocol van stap 2. De magnetische veldsterkte is ramped tot 5.5 T en het monster is gehandhaafd op 5 °, verwezenlijking van een signaal van de dubbele breking van 1.5 x 10-5 alvorens tot de warmte- en koelingsector cyclus. De dubbele breking signaal flatlines bij temperaturen boven de 35 ° C, waar geen uitlijning werd waargenomen als het monster was uitsluitend samengesteld uit de blaasjes. Bij afkoeling, de bicelles werden opnieuw gegenereerd een signaal van de definitieve dubbele breking van 7,2 x 10-6 werd verwezenlijkt en 5.5 T en 5 ° C. De magnetische veldsterkte is ramped tot 0 T en het monster werd gehandhaafd bij 5 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Een DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) monster was gehydrateerd na de verwarming en koeling van de procedure in stap 1.3.4 en later geëxtrudeerd 10 keer bij 60 ° C via membraanfilters van verschillende porie-grootte, zie stap 1.4. Bij 60 ° C assembleert het lipide-mengsel in blaasjes, die worden gevormd door het extrusieproces. 16 , 35 , 36 , 37 na het voltooien van het 3D-effect, de bicelles werden opnieuw gegenereerd door afkoeling tot 5 ° C en de hydrodynamische diameter DH werd gemeten door DLS. De magnetische alignability van de bicelles werd geëvalueerd op 5 ° C door het berekenen van de A-f met SANS op 8 T en door het meten van de dubbele breking signaal op 5.5 T; Zie Figuur 7. De dubbele breking signaal werd verkregen door het veld tot 5.5 T en terug naar 0 T speedramp zoals weergegeven in figuur 7A. De piek dubbele breking vond plaats in 5.5 T waar de hoogste mate van aanpassing werd verwacht volgens vergelijking 1. De hydrodynamische diameter DH van de bicelles werd teruggebracht tot 220, 190, 106 en 91 nm door opeenvolgende extrusies door membranen met porie-grootte van 800, 400, 200 en 100 nm respectievelijk. De bijbehorende daling in magnetische uitlijning werd bevestigd door het afnemende signaal van de dubbele breking en de afname van de absolute eenf als het naderde nul in figuur 7B. De resultaten bevestigen de mogelijkheid voor het beheren van de grootte van de bicelle en magnetische uitlijning door middel van afstemming van de blaasjes door extrusie bij 60 ° C en koelen terug naar 5 ° C.

    Figure 7
    Figuur 7: Magnetische uitlijning van een DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) monster geëxtrudeerd via membraanfilters van verschillende dimensies van de porie. A) dubbele breking signaal Δn′ als een functie van de magnetische veldsterkte B wanneer ramping omhoog en omlaag voor de steekproef geëxtrudeerd door 800 nm poriën. 5.5 T volgens vergelijking 1 werd de dubbele breking van piek bereikt. De waarde van deze maximale dubbele breking is gerapporteerd B). Hetzelfde monster was geëxtrudeerd door 400 nm poriën. De magnetische uitlijning werd beoordeeld door beide metingen van de dubbele breking (zwarte vierkantjes) op 5.5 T (naar analogie met wat werd gedaan voor de vorige stap van de extrusie in A) en berekening van de uitlijning factoren eenf (rode cirkels) op 8 T als functie van uitgezet de hydrodynamische diameter DH verkregen door DLS. De magnetische uitlijning werd geëvalueerd naar analogie op hetzelfde monster geëxtrudeerd via 200 nm poriën, en een laatste keer na extrusie door 100 nm poriën. Alle metingen werden uitgevoerd bij 5 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Een gedetailleerd overzicht van hoe de dubbele breking metingen werden gebruikt in combinatie met SANS experimenten voor de evaluatie van methoden voor het genereren van zeer magnetisch responsieve Ln3 + chelaat fosfolipiden assemblages is in Isabettini et al. 23 de voorgestelde fabricage-protocollen zijn ook van toepassing voor assembly's die zijn samengesteld uit de langere DPPC en DPPE-DTPA fosfolipiden of voor degenen met chemisch gemodificeerde steroïde derivaten in hun dubbelgelaagde. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 de enige vereiste is dat het monster wordt verwarmd tot een voldoende hoge temperatuur in stappen 1.3.2, 1.3.3 en 1.3.4 1.4.2. De temperatuur mag de dubbelgelaagde lipiden in te voeren van een wanordelijke gasfase, guarantying optimale hydratatie van de droge lipide film of monster regeneratie. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) samenstellen, bijvoorbeeld, moeten worden verwarmd boven de temperatuur van de fase-overgang van DPPC bij 42 ° C, terwijl de analoge DMPC-systeem moet worden verwarmd boven 24 ° C. Een voldoende hoge temperatuur is ook noodzakelijk om te garanderen van de vorming van extrudeerbare blaasjes die zich voordoen wanneer de lipide dubbelgelaagde in een ongeordende staat in stap 1.4. De cycli bevriezen-ontdooien in stap 1.3.2 volledig kunnen worden vervangen door H & C cycli. 23 maar het monster moet meer tijd om te hydrateren volledig de lipide-film met deze procedure en moet vortexed 20 min bij 5 ° C en 2 minuten bij 60 ° C. Extra H & C cycli worden uitgevoerd als elementen van de droge lipide-film nog steeds op de glazen wanden van de kolf waargenomen zijn.

    De Tm3 + chelaatvormers bicelles gepresenteerd in dit protocol uitlijnen loodrecht op de richting van het magnetisch veld. Deze uitlijning richting is afkomstig van de grote positieve magnetische gevoeligheid van Tm3 +. 11 , 14 andere lanthanide ionen zoals Dy3 + en Yb3 + kunnen ook worden toegepast. 11 , 13 , 19 de verschillende magnetische anisotropie van de Ln3 + biedt extra middelen voor het afstemmen van de magnetische uitlijning van de bicelles. Bijvoorbeeld, verhoogt Dy3 + de intrinsiek negatieve magnetische gevoeligheid van de dubbelgelaagde fosfolipiden, wat resulteert in een hoge mate van aanpassing van de bicelles die parallel aan de richting van het magnetisch veld. 13 deze verandering in richting van de uitlijning wordt ontdekt door een verandering in teken van zowel het signaal van de dubbele breking en de factoren van de uitlijning berekend op basis van anisotrope 2D SANS patronen. Het is belangrijk op te merken dat de magnetische gevoeligheid is niet uitsluitend bepaald door de chemische aard van de Ln3 + , maar door de chelate geometrie van de Ln3 +-fosfolipide complex. 19 , 38 de magnetische gevoeligheid kan worden ontworpen door de synthese van verschillende Ln3 + chelaat fosfolipide headgroups, definiëren de magnetische reactie van de resulterende vergaderingen. 38

    Elke sample is optisch verschillend afhankelijk van de aard van de samenstellende lipiden werkzaam. Controle van het monster turbiditeit als functie van de temperatuur is een complementaire methode om te evalueren van temperatuur-geïnduceerde structurele transformaties in de vergaderingen. Hoewel deze metingen worden meestal uitgevoerd bij gebrek aan een magneetveld in een spectrofotometer, toezicht op de intensiteit van de laser van gelijkstroom Equation 7 met de hierin voorgestelde setup biedt dezelfde informatie in het bijzijn van een magnetische veld. 11 , 16 de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) monsters zijn meestal minder troebeler dan hun Chol-OH met DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) tegenhangers bij 5 ° C. Monsters die lijkt op water bij 5 ° C zijn doorgaans niet alignable in een magnetisch veld. At kamertemperatuur, beide monsters blik transparant omdat de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) monsters zijn in een overgangsfase tussen bicelles en blaasjes en grote concentrische gaten verschijnen in de DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 de overgang staat van bicelles tot blaasjes in DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) gaat ook gepaard met een toename van de viscositeit van het monster bij kamertemperatuur. Deze temperatuur-afhankelijke wijziging in turbiditeit bemoeilijkt het kiezen van de juiste gevoeligheid in stap 2.11. Als de gevoeligheid is te hoog afgesteld op een troebel monster bij 5 ° C, kan de transparanter aard van het monster op verwarming een overbelasting van de versterkers. Bovendien zeer troebele monsters de ruis/signaal verhouding aanzienlijk zal toenemen en mogelijk niet geschikt voor dubbele breking metingen. Het laserlicht moet zitten kundig voor het monster doorlopen om te worden gedetecteerd.

    Non-geëxtrudeerd monsters zijn altijd meer troebel en hebben de neiging tot totaal op korte termijn opslag in de koelkast. Niettemin, de magnetisch responsieve monsters gemakkelijk worden geregenereerd met een H & C cyclus. Non-geëxtrudeerd monsters kunnen ook worden opgeslagen in de bevroren staat en gemakkelijk geregenereerd door H & C cycli. Geëxtrudeerde monsters worden bewaard in de koelkast en doorgaans gemeten in één week na de voorbereiding van het monster. Geen studies verslag uit over de langdurige opslag van geëxtrudeerde soorten in een vloeistof of in een bevroren toestand. Daarom worden niet de grootteverdeling van de vergaderingen verkregen extrusie over langdurige opslag gegarandeerd.

    Analoog aan een bicelle-systeem bestaan deze magnetisch alignable vlakke assemblages alleen in een gedefinieerd bereik van lipide samenstelling en concentratie. Wijzigen van de verhoudingen van de lipide zal resulteren in de vergadering van de verschillende platforms, met inbegrip van de vorming van micellen, linten en blaasjes. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 de fosfaat buffer concentratie en pH in stap 1.1.3 speelt een cruciale rol bij het vormgeven van de bicelles en hun magnetische reactie. De buffer definieert de fysisch-chemische interacties bestuur de hydrofiele omgeving van de polymolecular-assembly's. Concentraties die lager buffer resulteren in verschillende vergadering platforms, terwijl hogere concentraties leiden monster aggregatie en neerslag als gevolg van een overmaat gratis screening tot.Onder zure omstandigheden met pH-waarden tussen 3 en 4 zijn de carbonzuur wordt fungeren als ligand in de DMPE-DTPA/Ln3 + complexe geprotoneerd. Dit leidt tot de vernietiging van de magnetisch responsieve polymolecular verzamelingen, waargenomen door de aggregatie en neerslag in de steekproef. Het magnetisch responsieve Ln3 + polymolecular assembly's hebben een redelijke weerstand naar meer fundamentele pH-waarden. Echter, DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) bicelles bleken te breken in micellen op pH-waarden van 12,9. 11 de monsters moeten nooit worden blootgesteld aan leidingwater of andere zouten. Elke andere ion zal verstoren de Ln3 + chelaat proces of leiden tot samenvoeging van de vergaderingen als gevolg van gratis screening. SANS metingen, is de buffer voorbereid zoals beschreven in stap 1.1.3 in D2O in plaats van ultrazuiver H2O. opmerking dat de pH meter lezing 7.0 zullen (overeenkomend met de waarde van een pD voor 7.4).

    De structurele veranderingen die zich voordoen in de polymolecular-assembly's onderworpen aan een verwarming en koeling van de cyclus zijn thermo-omkeerbaar. Het signaal van de definitieve dubbele breking bij 5 ° C moet dus hetzelfde als vóór de temperatuur-cyclus. 11 , 16 als de dubbele breking signaal hoger na de cyclus is, het monster was niet correct opnieuw gegenereerd in stap 1.3.4. Dit gebeurt meestal in monsters opgeslagen voor een langere periode van tijd. Een lagere dubbele breking signaal nadat de temperatuur cyclus zoals aangegeven in Figuur 6 duidt op een probleem in de experimentele opzet. Meestal is de laser lichtpad werd verstoord door terug verstrooiing of een ander object. Dit is met name problematisch met de temperatuurvoeler ingevoegd direct in de steekproef (zie stap 2.8) die moeten worden geplaatst over het niet interfereert met het directe pad van het laserlicht. Een verstoorde lichtpad veroorzaakt een daling van de Equation 7 , een luidruchtige signaal en/of abnormale pieken in de dubbele breking-temperatuur-curven. Bijvoorbeeld, werd de piek op verwarming bij 35 ° C in Figuur 6 veroorzaakt door de expansie van de Waterkoeling buisjes in het directe pad van het laserlicht. Het signaal van de dubbele breking kan niet worden vertrouwd vanaf dat moment. Hoewel de algemene vorm van de curve van de koeling normaal was, werd de lagere dubbele breking signaal verkregen bij 5 ° C veroorzaakt door de interferentie.

    De waarden van de dubbele breking verkregen volgens dit protocol zijn niet absoluut en gewend bent monsters onderling vergelijken. Ter vergelijking met de waarden van de literatuur is een kalibratie met een referentiesysteem vereist. Bijvoorbeeld, het teken van de gemeten retardatie hangt af van de uitlijning van de opzet en kan worden gecontroleerd met tolueen, die een katoen-Mouton-constante van 3,27 × 109 T−2 heeft. 39 , 40

    Het signaal van de dubbele breking die afkomstig zijn van veranderingen in de magnetische uitlijning van het monster kan worden losgekoppeld van het signaal veroorzaakt door moleculaire herschikkingen in de dubbelgelaagde. Uitlijning factoren berekend op basis van anisotrope 2D SANS patronen verkregen onder een magnetisch veld alleen worden beïnvloed door de uitlijning van de bulk van de polymolecular-assembly's. De twee methoden zijn complementair en toestaan dat ontkoppeling van de bijdragen aan de dubbele breking signaal. De setup van de voorgestelde dubbele breking kan worden geperfectioneerd door splitsing van de laserstraal, zodat voor de gelijktijdige bewaking van monsters met en zonder blootstelling aan het externe magnetisch veld. De dubbele breking en resultaten voor het monster in het magnetisch veld kunnen worden genormaliseerd door het signaal verkregen voor het monster bij 0 T, effectief boekhouding voor de achtergrond.

    Dubbele breking metingen zijn niet beperkt tot het kwantificeren van de magnetische uitlijning van bicelles. Talrijke soft-materialen genereren een dubbele breking signaal als gevolg van hun interne structuur te bestellen. De voorgestelde setup stelt in staat om te controleren de dubbele breking van dergelijk materiaal als functie van de temperatuur met of zonder een extern magnetisch veld. Anthraceen organogel vezels, wormachtige micellen onder stroom, nanocrystalline cellulose en amyloid-Fe3O4 fibrillen zijn een paar voorbeelden, wier gedrag dubbele breking met succes werd geëvalueerd met de voorgestelde setup. 29 , 30 , 32 , 41

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs hebben niets te onthullen.

    Acknowledgments

    De auteurs erkennen de Zwitserse National Science Foundation voor de financiering van SMhardBi (project nummer 200021_150088/1). De SANS experimenten werden uitgevoerd bij de Zwitserse spallation neutron bron SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Zwitserland. Dr. Joachim Kohlbrecher danken de auteurs hartelijk voor zijn leiding met de SANS-experimenten. De dubbele breking meting setup onder hoge magneetvelden is geïnspireerd vanuit de bestaande installatie op het Hoogveld magnetische laboratorium HFML, Nijmegen, Nederland. Wij danken Bruno Pfister voor zijn hulp bij de ontwikkeling van de elektronica van de dubbele breking setup, Jan Corsano en Daniel Kiechl voor de bouw van de kaders mooi fijn en facile uitlijning van de laser en Dr. Bernhard Koller voor lopende technische ondersteuning.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics