Fabrication förfaranden och Dubbelbrytning mätningar för att utforma magnetiskt responsiv Lanthanide Ion kelaterande fosfolipid församlingar

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fabrication förfaranden för starkt magnetiskt responsiv lanthanide ion kelaterande polymolecular församlingar presenteras. Den magnetiska Svaren styrs av storleken på församlingen, som är anpassad av extrudering genom nanopore membran. Församlingarna magnetiska alignability och temperatur-inducerad strukturella förändringar övervakas av Dubbelbrytning mätningar, en gratis teknik att kärnmagnetisk resonans och liten vinkel neutronspridning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bicelles finns avstämbara disk-liknande polymolecular församlingar bildades ur ett stort utbud av lipid blandningar. Program varierar från membran protein strukturella studier av kärnmagnetisk resonans (NMR) till nanotekniska utvecklingen inklusive bildandet av optiskt aktiv och magnetiskt omkopplingsbar geler. Sådan teknik kräver hög kontroll av församlingens storlek, magnetiska svar och termisk resistans. Blandningar av 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC) och dess lanthanide ion (Ln3 +) kelaterande fosfolipid konjugat, 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phospho-etanolamin-dietylenglykol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), montera in starkt magnetiskt lyhörd sammansättningar såsom DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar förhållandet 4:1:1) bicelles. Införandet av kolesterol (Chol-OH) och steroid derivat i lipidens resultat i en annan uppsättning församlingar erbjuder unika fysikalisk-kemiska egenskaper. För en given lipid sammansättning är den magnetiska alignability proportionell mot storleken på bicelle. Komplexering av Ln3 + resulterar i oöverträffad magnetiska Svaren när det gäller både omfattning och anpassning riktning. Thermo-reversibla kollapsen av disk-liknande strukturer i blåsor vid uppvärmning kan skräddarsy de församlingarna dimensioner av extrudering genom membranfilter med definierade porstorlek. De magnetiskt justeringsbar bicelles regenereras genom nedkylning till 5 ° C, vilket resulterar i församlingen dimensioner definieras av vesikler prekursorer. Häri, proceduren fabrication förklaras och den magnetiska alignability för församlingar kvantifieras i Dubbelbrytning mätningar under ett 5,5 T magnetfält. Dubbelbrytning signalen, med ursprung från den fosfolipid lipidens, möjliggör ytterligare övervakning av polymolecular förändringar som sker i lipidens. Denna enkla teknik är ett komplement till NMR-experimenten som är vanligen anställda att karaktärisera bicelles.

Introduction

Bicelles finns disk-liknande polymolecular församlingar erhållits från talrika lipid blandningar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 de används för strukturella karakterisering av membran biomolekyler av NMR spektroskopi. 6 , 7 dock senaste insatser syftar till att utöka området för möjliga tillämpningar. 5 , 8 , 9 det mest studerade bicelle-systemet består av en blandning av 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC), som utgör den plana delen av församlingen och 1,2-dihexanoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DHPC) fosfolipid som täcker kanten. 1 , 2 , 3 de fosfolipider som komponera lipidens molekylär geometri diktera arkitekturen av strukturen själv monterade polymolecular. 4 , 5 ersätter DHPC med DMPE-DTPA genererar mycket magnetiskt lyhörd och avstämbara bicelle system. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar förhållandet 4:1:1) bicelles associera med många fler paramagnetiska lanthanide joner (Ln3 +) på den lipidens yta, vilket resulterar i en förbättrad magnetisk svar. 10 dessutom ersätta de vattenlösliga DHPC-molekylerna med DMPE-DTPA/Ln3 + möjliggör bildandet av utspädning-resistent bicelles. 11

Den magnetiska alignability planar polymolecular sammansättningar styrs av deras övergripande magnetisk energi,

Equation 1(1)

där B är den magnetiska fältstyrkan, Equation 2 den magnetiska konstant, n antalet aggregering och Equation 3 den molekylära diamagnetic känslighet anisotropin de lipider som komponera lipidens. Därför är DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles svar på magnetiska fält anpassad efter deras storlek (sammanlagda antal n) och den molekylära diamagnetic känslighet anisotropi Δχ. Den senare är lätt uppnås genom att ändra arten av den kelaterade Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 Introducing kolesterol (Chol-OH) eller andra steroid derivat i lipidens erbjuder möjligheten att trimma både den sammanlagda antal n och den magnetiska känslighet Δχ för församlingar. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 för en given lipid sammansättning, större sammansättningar innehåller mer lipider kan bidra till Emag (större sammanlagda antal n), vilket resulterar i mer justeringsbar arter. Storleken på DMPC/DHPC bicelles, till exempel styrs konventionellt genom optimering av komponera lipid baserat eller total koncentration. 20 , 21 , 22 även om detta är möjligt i DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, deras thermo-reversibla omvandlingen från bicelle till blåsor vid värme erbjuder La skräddarsy alternativ. Mekaniskt förfarande såsom extrudering genom membranfilter tillåter formning av blåsor. De magnetiskt justeringsbar bicelles regenereras vid nedkylning till 5 ° C och deras dimensioner dikteras från vesikler prekursorer. 11 häri, fokuserar vi på potentialen för mekanisk tillverkning förfaranden med DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) som referenssystem. Processen fungerar analogt när du arbetar med andra Ln3 + än Tm3 +. Det breda utbudet av möjligheter som erbjuds av dessa tekniker är markerat i figur 1 och utförligt diskuterat någon annanstans. 23

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över förfaranden som möjliga fabrication. De studera magnetiskt justeringsbar Ln3 + kelaterande polymolecular församlingarna består av antingen DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5). Torra lipid filmen är återfuktad med en 50 mM fosfatbuffert vid ett pH-värde på 7,4 och den totala lipid-koncentrationen är 15 mM. En effektiv återfuktning av lipid filmen kräver antingen frysa upptining cykler (FT) eller uppvärmning och nedkylning cykler (H & C). H & C cykler är nödvändigt att regenerera prover efter den sista frysning upptining steg eller att regenerera proverna förvaras frysta över en längre tid om de ska användas utan ytterligare extrudering. Här diskuteras utförligt av Isabettini et al. 23 maximally justeringsbar polymolecular församlingar uppnås, att leverera olika församlingen arkitekturer utifrån lipid sammansättning. Bicelle storlek och magnetiska alignability är avstämbara genom strängsprutning (Ext) genom nanopore membranfilter. Den presenterade justering faktorer Af beräknades från 2D liten vinkel neutron scattering (SANS) mönster av ett DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) prov extruderade genom antingen 800, 400, 200 eller 100 nm porer. Är ett kompletterande sätt att kvantifiera bicelle justering som inte täcks mer i detalj häri SANS mätningar. 11 , 16 Af varierar från -1 (parallella neutronspridning eller vinkelrät anpassning av bicelles med avseende på magnetfält riktning) till 0 för isotropiskt spridning.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Strukturera av bicelles har studerats av ett brett utbud av tekniker för karakterisering. 13 anpassningen av bicelles som exponeras för ett magnetfält har kvantifierats med hjälp av NMR spektroskopi eller liten vinkel neutron scattering (SANS) experiment. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 men skiftet och breddning av NMR topparna förekommer i närvaro av Ln3 + är allvarliga begränsningar till metoden. 15 , 26 , 27 , 28 även om SANS experiment lider inte av denna begränsning, alternativa och mer tillgängliga tekniker är önskvärt för rutinmässig kvantifiering av Magnetiskt inducerad justering av församlingarna i lösning. Dubbelbrytning mätningar är en livskraftig och jämförelsevis enkla alternativ. Analogt till NMR-experimenten avslöja Dubbelbrytning mätningar värdefull information om lipid rearrangements och lipid faser som förekommer i lipidens. Dessutom övervakas geometriska omformningar som förekommer i den polymolecular församlingen med förändrade miljöförhållanden som temperatur. 11 , 12 , 13 , 16 Magnetiskt inducerad Dubbelbrytning Δn′ har använts för att studera olika typer av fosfolipid system. 13 , 29 , 30 Dubbelbrytning mätningar baserat på en fas modulationsteknik i ett magnetfält är en livskraftig metod att upptäcka läggning av bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 möjligheten att undersöka bicelles med Dubbelbrytning i höga magnetfält upp till 35 T också framgick av M. Liebi o.a. 13

När polariserat ljus träder en anisotropa material, kommer det att vara bryts i en löpande våg. 11 de två vågorna har olika hastigheter och skiftas i fas av en utvecklingsstörning δ. Graden av utvecklingsstörning δ mäts och omvandlas till en Dubbelbrytning signal Equation 5 att kvantifiera graden av anisotropi i material med

Equation 6(2)

där λ är våglängden av laser och d är tjockleken på provet. Fosfolipider är optiskt anisotropic och deras optiska axeln sammanfaller med deras långa molekylär yxor, parallella kolväte svansar. 11 , 12 ingen retardation mäts om fosfolipider är slumpmässigt orienterade i lösning. Retardation mäts när fosfolipider är justerade parallellt till varandra. Magnetiskt inducerad dubbelbrytningen Equation 5 kan ha ett positivt eller negativt tecken beroende på orienteringen av molekylerna i det magnetiska fältet; Se figur 2. Fosfolipider justerade parallellt till x-axeln kommer att resultera i en negativ Equation 5 , medan de arrangera i rak linje längs z-axeln resulterar i en positiv Equation 5 . Ingen Dubbelbrytning observeras när den optiska axeln sammanfaller med riktningen av ljusa förökningen som fosfolipid justerar parallellt med y-axeln.

Figure 2
Figur 2: Anpassningen av fosfolipider och motsvarande tecken på Magnetiskt inducerad dubbelbrytningen Equation 12 . Tecknet för den uppmätta Equation 12 beror på orienteringen för fosfolipid i magnetfältet. Streckade visar linjer den optiska axeln av molekylen. Ljuset är polariserat på 45° och propagerar i y riktning. Magnetfältet B är i z riktning. Denna siffra har ändrats från M. Liebi. 11 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

När det gäller en isotrop kolloidal suspension av bicelles förloras orientering inducerad av ordningen av fosfolipider i lipidens, nollställning av utvecklingsstörning δ. Bicelles måste också anpassa för att orientera de optiskt aktiva fosfolipider i deras lipidmonolager, orsakar en utvecklingsstörning δ av polariserat ljus. Dubbelbrytning är följaktligen ett känsliga verktyg att kvantifiera den magnetiska alignability polymolecular församlingar. Bicelles arrangera i rak linje vinkelrätt mot magnetfältet kommer att ge en positiv Equation 5 , medan de justerade parallellt kommer att ge en negativ Equation 5 . Tecken beror på anpassning av installationen och kan kontrolleras med ett referensprov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tillverkning förfarandet för DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) och DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) polymolecular församlingar

  1. Preliminära preparat
    1. Tvätta allt glas genom att spola en gång med etanol stabiliserad kloroform (> 99% kloroform) och torrt med tryckluft.
    2. Producera 2 distinkta 10 mg/mL stamlösningar av DMPC och DMPE-DTPA i etanol-stabiliserad kloroform (> 99% kloroform), 10 mM stamlösning Chol-Oh i etanol-stabiliserad kloroform (> 99% kloroform) och en 10 mM stamlösning TmCl3 i metanol.
    3. Förbered en 50 mM fosfatbuffert vid ett pH-värde på 7,4 genom att blanda 0.121 g natriumdivätefosfatdihydrat och 0.599 g vattenfri di-natrium väte fosfat i 100 mL ultrarena H2O.
  2. Beredning av torra lipid filmen
    1. Väga de krävda mängderna av amphiphiles (DMPC, DMPE-DTPA och eventuellt Chol-OH) och Ln3 + lager lösningar i separata 3 mL glas snapin-koppar med en 2,5 mL glasspruta.
      1. För en volym 3 mL prov av DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1, totalt lipid koncentration av 15 mM), väga i 3.6435 g DMPC stamlösning, 1.4731 g DMPE-DTPA stamlösning och 0.7126 g TmCl3 stamlösning.
      2. För ett 3 mL provvolymen av DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5, totala lipid koncentration av 15 mM), väga in 2.9148 g DMPC stamlösning, 1.4731 g DMPE-DTPA stamlösning, 1.0749 g av Chol-OH stamlösning och 0.7126 g TmCl3 stamlösning.
        FÖRSIKTIGHET: Kloroform och metanol är giftiga och flyktiga vid rumstemperatur. Arbeta under ett dragskåp och omedelbart gå vidare med massa mätningar.
    2. Överför innehållet i snapin-kopparna till en 25 mL rund botten kolven. Spola varje snapin-cup i rund botten kolven med cirka 2,5 mL motsvarande lösningsmedlet.
    3. Ta bort lösningsmedlet under vakuum i rotationsindunstare vid 40 ° C. Ställ in inledande trycket till 30 000 Pa tills de flesta av lösningsmedlet avlägsnas. Minska trycket till 100 Pa och torr provet under rotation för ett minimum av 2 h. få en enhetlig torr lipid film på glasväggarna i kolven.
    4. Placera filmen torr lipid 1 minut under en stadig ström av argon att undvika lipid oxidation i luft och förvara provet i frysen före rehydrering.
  3. Återfuktning av torr lipid filmen
    1. Tillsätt de 3 mL fosfatbuffert till rund botten kolven till en total lipid koncentration på 15 mM.
    2. Utföra en freeze-upptining (FT) cykel av störta kolven under rotation i flytande kväve tills det fryses grundligt (flytande kväve stoppen kokande), och sedan värma tillbaka upp till 60 ° C genom att placera provet under 5 minuter i ett vattenbad, virvlande kolven kontinuerligt stöd smältprocessen. Applicera 30 s av omskakas innan varje frysning cykel när provet är flytande stöd hydratisering av lipid filmen.
      Obs: Ingen lipid film ska vara synliga på kolvens väggar efter andra frysa upptining cykel.
    3. Upprepa 1.3.2 totalt fem gånger. Tillslut kolven med en mössa att undvika onödig avdunstning av fosfatbuffert när provet är varm. Protokollet kan pausas när provet är frusen.
    4. Gå vidare till två värme och kyla (H & C) cykler att stabilisera provet kommer ur det sista frysning steget, eller hålla frysta i upp till två månader. Värm provet med 40 eller 60 ° C för DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5), respektive före kylning till 5 ° C vid 1 ° C i minst bibehålla provet 5 min vid de högsta och lägsta temperaturer på cykeln.
    5. Nu, antingen fastställa Dubbelbrytning signalen av provet i ett yttre magnetfält (steg 2) eller ytterligare pressa provet för att skräddarsy bicelle dimensioner och magnetiska alignability (steg 1.4).
      Obs: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) prover huvudsakligen består av bicelles med en genomsnittlig hydrodynamiska diameter DH 70 nm som framkommit vid ett antal distribution erhålls av dynamiska ljusspridning (DLS) mätningar vid 5 ° C. Dessa prover också innehålla större polymolecular församlingar med en genomsnittlig DH 500 nm som framkommit vid en intensitet fördelning. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) prover är mycket polydisperse i storlek med typiska intensitet distributioner avslöjar en genomsnittlig DH 700 nm, medan antalet fördelningarna avslöjar en befolkning som domineras av mindre bicelles i storleksintervallet 200 nm. Mer detaljerad storlek distributioner och cryo överföring elektronmikroskopi bilder av dessa prover har rapporterats av Isabettini et al. 23
  4. Extrudering av polymolecular sammansättningarna.
    1. Sätt ihop extrudern som visas i figur 3. Använd handskar och pincett med skydda kiseldioxid rör för hantering. Våt pappersfiltret (5) med några droppar av buffert som möjliggör en optimal placering av membranfiltret (6). Kontrollera att papperet har inga veck efter att placera o-ringen (7) på toppen.
      Obs: Extruderingsprocessen testades på membranfilter (6) med pordiameter 800, 400, 200 och 100 nm. Se figur 7.
    2. Ställ i vattenbad till 40 ° C för DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) prover eller 60 ° C för DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) prover att garantera bildandet av extrudable blåsor.
    3. Anslut extrudern till en trycksatt kväve flaska använder en högtrycks PVC-rör (> 4 MPa) utrustad med serto adaptrar och pressa det flytande materialet genom membranet. 1 MPa tryck krävs vanligtvis för extrudering genom membranfilter (6) med pordiameter 200 nm och ovan. 1,5-2,5 MPa krävs för de mindre membranfilter (6) med pordiameter 100 nm.
      Obs: Ändra membranfiltret om onormalt höga tryck (> 2,5 MPa) krävs att extrudera provet (detta är ett första tecken på igensättning).
    4. Öppna luckan (10) och infoga provet med pipett 2 mL glas. Sedan Stäng luckan (10) och öppna ventilen (12) medan du håller provet outlet röret (2). Stänga av ventil (12) efter extrudering cykeln är klar, ventilera och fortsätta med nästa cykel.
      Obs: Lämna inte provet i kontakt alltför länge med heta mantlade fartyget (8) att undvika överdriven provet förluster genom avdunstning.
30-60 s är tillräckligt med tid för ett 3 mL prov temperera i extrudern innan du öppnar ventilen (12).
  • Gå vidare till 10 extrudering cykler för en viss aluminiummembran pore dimension som visas i figur 3. De flesta av de bicelle systemen är extruderad 10 gånger genom membran med pordiameter 200 och en annan 10 gånger genom membran med pordiameter 100 nm, garanterar prov jämförbarhet.
  • Nu, bestämma Dubbelbrytning signalen av provet i ett yttre magnetfält (steg 2).
  • Figure 3
    Figur 3: laboratorium extruder används för bicelle och vesikler förberedelser. Extrudern monteras nedifrån och upp: (1) Montera, (2) provet samla utrymme med en 2,4 mm (inre diameter) plast outlet tube och o-ring (3) och (4) stora och små stabiliserande mesh, (5) filtrerpapper, (6) membranfilter, (7) o-ring (8) mantlade fartyg, (9. ) topplock med inlopp och trycket anslutning, (10) lock, (11) fjäril skruvar (12) ventil. En skiss av monterade extrudern visas i högra sida. Kvävgas (N2) tillhandahålls av ett tryckkärl och mantlade fartyget (9) är ansluten till ett vattenbad för temperaturkontroll. Provet genomgår 10 extrudering cykler för någon viss aluminiummembran filter pordiameter (prov sökvägen visas i blått). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    2. Dubbelbrytning mätningar av DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) och DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) polymolecular församlingar.

    1. Bygga och ansluta den Dubbelbrytning setup som presenteras i figur 4 och strömförsörjning för respektive elektroniska element. Placera inte PEM, urvalet och andra polarisationsfiltret i sökvägen laser i detta skede. Undvika att upptäcka bakåtspritt laserljus genom att täcka reflekterande ytor, till exempel aluminium spegel hållare, med svart papper.
    2. Justera speglarna för att maximera laser intensitet på detektorn, som representeras av intensiteten av riktaströmmen Equation 7 erhålls från lågpass filtret i diagram 4B.
      FÖRSIKTIGHET: Använd lämpligt ögonskydd när du justerar speglarna och rådgöra med en laser säkerhet instruktör om att manipulera lasrar för första gången.
    3. Vända den första korsade linjär polarisatorn (underhållna vinkelrätt mot de infallande laserstrålen) för att maximera den Equation 7 .

    Figure 4
    Figur 4: Schematisk framställning av Dubbelbrytning installation och anslutningar för optiska signaler. A) en supraledande elektromagnet levererar ett 5,5 T magnetfält. Ljuset från en diodlaser på 635 nm är polariserat av två korsade polarisatorer. En photoelastic modulator PEM-90 fungerar på 50 KHz med en amplitud0 av 2.405 rad och placeras mellan de två polarisationsfilter. Provet ligger i magneten mellan PEM och andra polarisationsfiltret. Icke-polarisera speglar guide ljuset genom de olika delarna och slutligen påvisas genom en fotodetektor. Den första och andra harmoniskt Equation 10 och Equation 11 av AC signal övervakas, medger beräkning av Dubbelbrytning signalen ger information om den magnetiska alignability Ln3 + kelat polymolecular församlingar. Det provet kyvetten är ansluten till en extern vattenbad för temperaturkontroll (blå). Temperaturen i provet övervakas med en temperatursond (röd). B) signalen från fotodetektor matas in i en andra beställning Sallen-Key lågpassfilter (24 V AC strömförsörjning) med en avskärmningsfrekvens 360 Hz genom en ±12 V DC braded Strömförsörjningskabel (3). Lågpassfilter extrakt komponenten DC Equation 7 och levererar den till PC-gränssnittet (4) via en BNC 50 Ω kabel. Signalen från fotodetektor levereras till de två inlåsning förstärkarna (som extrahera den första och andra harmoniskt Equation 10 och Equation 11 ) via en BNC 50 Ω kabel (1) & (2). De harmoniska stödnivåerna upptäcks av en fas-känslig detektion. Följaktligen används PEM signalen som referenssignal för inlåsning förstärkarna (1f-produktion av PEM in första låsa in förstärkaren och 2f-utgång till andra, ansluten med BNC 50 Ω kablar). Utgångssignalerna levereras till PC-interface enheten via BNC 50 Ω kablar. Analog förvärv enheter GFP-AI-110 och GFP-CB-1 digitalisera signalen som överförs till datorn via ett RS 232-kabel för övervakning. Typ K temperatur sonden är också ansluten till PC-interface enheten där analog förvärv enheter GFP-CB-3 och GFP-TC-120 digitalisera signalen innan den överförs till datorn via ett RS 232-kabel för övervakning. (C) bild av den schematiska setup presenteras i B. Key element identifieras med motsvarande nummer från 1 till 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    1. Placera den andra korsade linjär polarisatorn vinkelrätt mot de infallande laserstrålen, som visas i figur 4A. Minimera den Equation 7 genom att ange andra polarisationsfiltret i 90° vinkel med avseende på först.
    2. Plats photoelastic modulatorn (PEM) vid 0° mellan två korsade linjär polarizers och vinkelrätt mot de infallande laserstrålen som visas i figur 4A. Justera PEM till en frekvens av 50 kHz och amplitud A0 till 2.405 rad som visas i figur 5A. Detta gör del-Anseendedcen oberoende av Dubbelbrytning och ökar den Equation 7 .
      Obs: Den optiska axeln av PEM kan stämmas av några grader för att bibehålla en konstant Equation 7 i luften innan du mäter något urval.
    3. Vänta 1 h efter att vrida på laser och elektronisk utrustning att stabilisera signalen.
    Signalen är stabil när auto-utfasningen av inlåsning förstärkarna förblir konstant.
  • Placera provet i en kontrollerad temperatur kvarts kyvetten med en sökväg-längd av 10 mm och Anslut den till en extern vattenbad inställt på 5 ° C.
  • Placera en 0,5 mm tjock typ K termoelement (temperatursond) direkt i provet att övervaka temperaturen på provet. Verifiera att sonden inte stör laserljuset genom att placera en vitbok i sökvägen laser (efter kyvetten) och letar skuggor orsakade av sonden.
    Obs: Det finns en 2-3 ° C skillnad mellan temperatur inspelning av vattenbad och temperaturen i provet.
  • Placera kyvetten i borrhålen i magneten, som visas i figur 4A. Laserljuset är sprids horisontellt genom provet, avlänkas av icke-polarisera speglar och upptäcks av en fotodetektor.
    Obs: Lasern är riktad nedåt, genom provet och tillbaka samma väg till konto för Faraday effekter (dvs rotation planet polarisering av ljus orsakas av magnetfältet när går ner avbryts när du kommer tillbaka i motsatt riktning).
  • Tillämpa ett stadigt flöde av tryckluft vid rumstemperatur och 10000 Pa på kyvetten att undvika kondensering av vatten på cellväggar, vilket skulle minska intensiteten i signalen och bullret ökar. Detta är särskilt viktigt vid mätning vid 5 ° C.
  • Upptäcka den första och andra harmoniskt Equation 10 och Equation 11 av AC signalen med två lås-i förstärkare. Auto fas inlåsning förstärkarna genom att trycka på knappen (2) visas i figur 5B och justera känsligheten som visas i figur 5B (1). Kontrollera att det inte finns fler än fyra röda staplar på förstärkarna som visas i figur 5B (3) att undvika signal överbelastning. Anteckna den sysselsatta känsligheten för både låsning förstärkare i programmet Tesla_Magnet_Const_V092 som visas i figur 5 c (8). Programmet ges som kompletterande information.
  • Ramp magnetfältet upp till 5,5 T genom att leverera ström till magneten via programmet Tesla_Magnet_Const_V092 som visas i figur 5 c (5).
  • Erhålla dubbelbrytningen Equation 5 med hjälp av ekvation 2, där utvecklingsstörning beräknas med
    Equation 13(3)
    där Equation 14 och Equation 15 är Bessel-funktionerna av den första sorten, med Equation 16 och Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 Rita utvecklingsstörning i programmet Tesla_Magnet_Const_V092, som visas i figur 5 c (4).
    Obs: Den utvecklingsstörning som tillhandahålls av programmet bör inte användas för att beräkna Dubbelbrytning signalen om de två inlåsning förstärkarna inte är verksamma på samma känslighet (se punkt 2.12). Harmonisk loggade Ljusstyrkorna Equation 10 och Equation 11 har multipliceras känsligheten för inlåsning förstärkarna att få rätt dimensioner. Dessutom måste Dubbelbrytning signalen mäts under ett magnet-fält normaliseras genom att subtrahera den genomsnittliga Dubbelbrytning signal erhålls vid 0 T.
  • Övervaka provets Dubbelbrytning signal vid konstant eller ändra temperatur (1 ° C/min) genom att reglera temperaturen i vattenbadet ansluten till den kyvetten som visas i figur 4.
  • Logga in experimentella data genom att fylla i experimentella beskrivningen i figur 5 c (8), som tillhandahåller ett filnamn i (9) och trycka på knappen ”START log” (10).
  • Figure 5
    Figur 5: illustrationer sysselsatta inställningar och program skärmdumpar. A) PEM inställningar: utvecklingsstörning 2.405 rad, våglängd 635 nm, frekvens 50 Hz. White cirklar indikerar vilka inställningar ska aktiveras (USR = användardefinierad retardation, LOC = lokala driftläge). B) låsa in förstärkaren inställningar. Känslighet (1) måste väljas före varje mätning som krävs i steg 2.11. Det bör inte vara mer än fyra röda staplarna på displayen (3) för att undvika en signal överbelastning. En överbelastning uppstår när den röda led i (1) tänds, omöjliggör en mätning. Tryck på auto fas (2) före varje mätning. C) skärmdumpar av programmet Tesla_Magnet_Const_V092 som kompletterande information. Programmet möjliggör kontroll av magnetfältet och inspelning av alla signalen utgångar som funktion av tiden. Den magnetisk fältstyrka och provtemperaturen ritas i (1). Den första och andra harmoniskt Equation 10 och Equation 11 av AC signalen mäts av två inlåsning förstärkarna är ritade i (2). Intensiteten av riktaströmmen Equation 7 ritas i (3). Utvecklingsstörning beräknas enligt steg 2.13 och ritade i (4). Den magnetiska fältstyrkan ligger i (5). Direkt mätning av temperaturen registreras av det typ K termoelementet presenteras i (6) och utsignaler (Equation 23 och Equation 22 ) i (7). Ytterligare prov informationen kan infogas i (8) såsom anställd känsligheten av förstärkare, prov namn, etc. Data kan loggas och exporteras till en txt-fil i (9). Starta och stoppa dataförvärvet med knappen ”START log” (10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Dubbelbrytning signalera av en icke-extruderade DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) prov övervakades under ett 5,5 T magnetfält under en uppvärmning och kylning cykel från 5 till 40 ° C och tillbaka med en hastighet på 1 ° C/min (figur 6). Dubbelbrytning visade hög magnetisk linjeföring vid 5 ° C med ett värde av 1,5 x 10-5, dubbelt så starkt när det gäller rapporterade extruderad systemen. 6 , 7 , 23 den nollställning av Dubbelbrytning signalen ovan Tm av DMPC vid 24 ° C orsakades av bildandet av icke-justeringsbar blåsor. Rörelse utseendet på störda vätskefasen utlöste stora omflyttningar i polymolecular församlingar. Dessa rearrangements är thermo-reversibla. Justeringsbar arter regenererades vid kylning under Tm och Dubbelbrytning signalen följt samma trend som på värme. De distinkta toppar inträffar runt Tm Markera ersättning av justeringsbar församlingarna genom icke-justeringsbar blåsor. 23 den långsam kineticsen av de molekylära rearrangements avseende tillämpad uppvärmning och kylning hastighet på 1 ° C/min förklara varför topparna inte överlappande. I stället började båda toppar vid Tm av DMPC, vilket tyder på att lipidens lipider måste ha en viss grad av ordning att gynna bildandet av justeringsbar arter.

    Figure 6
    Figur 6: Dubbelbrytning signal som en funktion av temperaturen för en icke-extruderade DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) prov på värme (röd) och kyla (blå) på 1 ° C/min. Provet var beredd följa protokollstegen 1 till 1.3.5. Dubbelbrytning mätningarna genomfördes efter protokollet steg 2. Den magnetiska fältstyrkan var ramped upp till 5,5 T och provet bibehölls vid 5 °, uppnå en Dubbelbrytning signal 1,5 x 10-5 innan du fortsätter till cykelns värme- och kylsystem. De Dubbelbrytning signal farten vid temperaturer över 35 ° C där ingen justering observerades som provet bestod enbart av blåsor. Vid kyla, bicelles regenererades och en slutlig Dubbelbrytning signal på 7,2 x 10-6 uppnåddes vid 5,5 T och 5 ° C. Den magnetiska fältstyrkan var ramped ner till 0 T och provet bibehölls vid 5 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    En DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) provet var släckt efter uppvärmning och kylning förfarandet i steg 1.3.4 och därefter extruderas 10 gånger på 60 ° C genom membranfilter med olika porstorlek, se steg 1.4. 60 ° c monterar lipid blandningen till blåsor, som formas av extruderingsprocessen. 16 , 35 , 36 , 37 efter avslutad extrudering, bicelles regenererades genom nedkylning till 5 ° C och hydrodynamiska diametern DH mättes genom DLS. Den magnetiska alignability av bicelles utvärderades vid 5 ° C av computing i Af med SANS på 8 T och genom att mäta Dubbelbrytning signalen på 5,5 T; Se figur 7. Dubbelbrytning signalen erhölls genom rampning fältet upp till 5,5 T och tillbaka ner till 0 T som visas i figur 7A. Topp dubbelbrytningen inträffade på 5,5 T där den högsta graden av anpassning förväntades enligt ekvation 1. Hydrodynamiska diameter DH bicelles reducerades till 220, 190, 106 och 91 nm genom successiva profiler genom membran med en porstorlek av 800, 400, 200 och 100 nm respektive. Motsvarande magnetiska justering minskade bekräftas av minskande Dubbelbrytning signalen och en minskning i absoluta enf när den närmade sig noll i figur 7B. Resultaten bekräftade möjligheten att kontrollera bicelle storlek och magnetiska justering genom sömnad av blåsor av extrudering vid 60 ° C och kyla tillbaka till 5 ° C.

    Figure 7
    Figur 7: Magnetiska anpassningen av ett DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) prov extruderade genom membranfilter med olika pore dimensioner. (A) Dubbelbrytning signal Δn′ som en funktion av den magnetiska fältstyrkan B när ramp upp och ner för provet extruderade genom 800 nm porer. Topp dubbelbrytningen nåddes på 5,5 T enligt ekvation 1. Detta maximal Dubbelbrytning värde rapporteras i B). Samma prov var pressad genom 400 nm porer. Magnetiska justeringen utvärderades genom båda Dubbelbrytning mätningarna (svarta fyrkanter) på 5,5 T (analogt till vad som gjordes för föregående extrudering steg i A) och uträkningen av justering faktorer enf (röda cirklar) på 8 T ritas som en funktion av den hydrodynamiska diameter DH erhålls genom DLS. Magnetiska justeringen utvärderades analogt på samma prov extruderade genom 200 nm porer, och en sista gång efter strängpressning genom 100 nm porer. Alla mätningar utfördes vid 5 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    En detaljerad redogörelse för hur Dubbelbrytning mätningar användes i kombination med SANS experiment för att utvärdera metoder för att generera mycket magnetiskt lyhörd Ln3 + kelat fosfolipider sammansättningar är i Isabettini et al. 23 de föreslagna fabrication protokoll gäller också för aggregat som består av de längre DPPC och DPPE-DTPA fosfolipider eller för dem som innehåller kemiskt modifierade steroid derivat i deras lipidens. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 det enda kravet är att provet upphettas till tillräckligt höga temperaturer i steg 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 och 1.4.2. Temperaturerna måste tillåta lipidens lipider ange flytande oordnade fas, sätt optimal återfuktning av torr lipid film eller prov regeneration. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) församlingar, till exempel behöver värmas över fas övergångstemperaturen av DPPC vid 42 ° C, medan det analoga DMPC-baserat systemet måste upphettas över 24 ° C. Tillräckligt hög temperatur är också nödvändigt att garantera bildandet av extrudable blåsor som uppstår när den lipid lipidens är i ett oordnat tillstånd i steg 1.4. Freeze-upptining cykler i steg 1.3.2 ersättas fullt ut av H & C cykler. 23 men provet behöver mer tid att fullt återfukta lipid filmen med den här proceduren och måste vara vortexed 20 min vid 5 ° C och 2 min vid 60 ° C. Ytterligare H & C cykler är företa sig om delar av torr lipid filmen observeras fortfarande på glasväggarna i kolven.

    De Tm3 + kelaterande bicelles presenteras i detta protokoll justera vinkelrätt mot magnetfältet riktning. Denna anpassning riktning härstammar från stor positiv magnetisk känslighet av Tm3 +. 11 , 14 andra lanthanide joner såsom Dy3 + och Yb3 + kan också tillämpas. 11 , 13 , 19 de olika magnetisk anisotropin Ln3 + erbjuder ytterligare sätt att skräddarsy magnetiska anpassningen av bicelles. Exempelvis förbättrar Dy3 + egensäkra negativa magnetiska känslighet av lipidens fosfolipider, vilket resulterar i en hög grad av anpassning av bicelles parallellt med magnetfältet riktning. 13 denna förändring i anpassning riktning upptäcks av en förändring i tecken på både Dubbelbrytning signalen och justering faktorer beräknas från Anisotrop 2D SANS mönster. Det är viktigt att notera att den magnetiska känsligheten inte är enbart dikteras av kemiska beskaffenhet de Ln3 + utan av de Ln3 +kelat geometri-phospholipid complex. 19 , 38 den magnetiska känsligheten kan vara konstruerad av syntetisera olika Ln3 + kelat fosfolipid headgroups, definiera de resulterande församlingarna magnetiska svar. 38

    Varje prov är optiskt olika beroende på arten av de som utgör lipider som anställd. Övervakning av provets grumlighet som en funktion av temperaturen är en kompletterande metod för att utvärdera temperatur-inducerad strukturomvandlingar i församlingar. Även om dessa mätningar genomförs oftast i avsaknad av ett magnetfält i en spektrofotometer, övervakning intensiteten av laserns likström Equation 7 med setup föreslås häri erbjuder samma information i närvaro av en magnetisk fältet. 11 , 16 the DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) prover är vanligtvis mindre grumligt än sina Chol-OH innehållande DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) motsvarigheter vid 5 ° C. Prover som liknar vatten vid 5 ° C är i allmänhet inte justeringsbar i ett magnetfält. Vid rumstemperatur, båda prover utseende transparent eftersom den DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) prover i en övergångsfas mellan bicelles och blåsor och stora koncentriska hål visas i DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 övergången tillståndet för bicelles till blåsor i DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) åtföljs med en ökning av provets viskositet vid rumstemperatur. Denna temperatur-anhörigen förändring i grumlighet gör det svårt att välja rätt känslighet i steg 2.11. Om känsligheten justeras för högt på en grumlig prov vid 5 ° C, kan mer transparent arten av provet på värme orsaka en överbelastning av förstärkarna. Dessutom mycket grumliga prover kommer att avsevärt öka bullret som signal baserat och kanske inte är lämplig för Dubbelbrytning mätningar. Laserljuset måste kunna gå igenom provet för att upptäckas.

    Icke-extruderad prover är alltid mer grumligt och har en tendens till samlade vid kort sikt förvaring i kylen. Dock de magnetiskt lyhörd proverna lätt regenereras med en H & C cykel. Icke-extruderad prover kan också förvaras i fruset tillstånd och lätt regenereras genom H & C cykler. Extruderad proverna förvaras i kylen och ofta mätt i en vecka efter den provberedning. Inga studier rapport om långvarig lagring av extruderad arter i en vätska eller en fryst tillstånd. Därför kan storleksfördelningen av de församlingar som erhållits från extrudering inte garanteras under långvarig lagring.

    Analogt till bicelle system finns dessa magnetiskt justeringsbar planar församlingar bara i ett definierat område av lipid sammansättning och koncentration. Att ändra lipid nyckeltalen kommer att resultera i olika församlingen arkitekturer, inklusive bildandet av miceller, band och blåsor. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 fosfat buffert koncentrationen och pH i steg 1.1.3 spelar en avgörande roll i att forma bicelles och deras magnetiska svar. Bufferten definierar de fysikalisk-kemiska interaktioner ECB hydrofila miljön kring polymolecular sammansättningarna. Lägre buffert koncentrationer resultera i olika församlingen arkitekturer, medan högre koncentrationer orsaka prov aggregering och nederbörd på grund av en överskjutande kostnad screening.Under sura förhållanden med pH-värden mellan 3 och 4 är en karboxylsyra beståndsdelarna tjänstgör som ligander inom DMPE-DTPA/Ln3 + komplexa protonerade. Detta resulterar i förstörelsen av de magnetiskt responsiv polymolecular församlingar, observeras av aggregation och nederbörd i provet. De magnetiskt lyhörd Ln3 + polymolecular församlingarna har en rimlig beständighet mot mer grundläggande pH-värden. Dock DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) bicelles visades att bryta upp i miceller vid pH värden på 12,9. 11 proverna får aldrig utsättas för vatten eller andra salter. Några andra ion kommer störa de Ln3 + kelat processen eller resultera i aggregering av församlingarna på grund av kostnad screening. För SANS mätningar, är bufferten beredd enligt steg 1.1.3 i D2O istället för ultrarena H2O. Observera att pH mätaravläsning kommer vara 7.0 (som motsvarar ett pD-värde på 7,4).

    De strukturella förändringar som förekommer i polymolecular aggregat omfattas av en uppvärmning och kylning cykel är thermo-reversibla. Den slutliga Dubbelbrytning signalen vid 5 ° C bör därför samma som innan temperatur cykeln. 11 , 16 om Dubbelbrytning signalen är högre efter cykeln, provet var inte ordentligt regenereras i steg 1.3.4. Detta inträffar vanligen i prover lagras under en längre tid. En lägre Dubbelbrytning signal efter temperaturen cykel som observerats i figur 6 visar ett problem i den experimentella setup. Vanligast, stördes laser ljusstrålen av tillbaka spridning eller ett annat objekt. Detta är särskilt problematiskt med temperatursond infogas direkt i provet (se steg 2,8) som ska placeras att inte störa laserljuset direkt väg. En störd ljusbanan orsakar en minskning av den Equation 7 , en högljudd signal och/eller onormala toppar i Dubbelbrytning-temperatur kurvorna. Till exempel orsakades toppen som inträffar på värme vid ca 35 ° C i figur 6 av expansion av water-cooling rören in direkt på laserljuset. Dubbelbrytning signalen kan inte vara betrodd från den punkten och framåt. Även om den allmänna formen av kyla kurvan var normala, orsakades lägre Dubbelbrytning signalen erhålls vid 5 ° C av störningen.

    De Dubbelbrytning värden som erhålls från efter detta protokoll är inte absoluta och används för att jämföra prover sinsemellan. För jämförelse med värden för litteratur krävs en kalibrering med ett referenssystem. Till exempel tecknet av den uppmätta utvecklingsstörning beror på anpassning av set-up och kan kontrolleras med toluen, som har en bomull-Mouton konstant av 3.27 × 10−9 T−2. 39 , 40

    Dubbelbrytning signalen med ursprung från förändringar i provets magnetiska justering kan frikopplas från den signal som orsakas av molekylär omflyttningar i lipidens. Justering faktorer beräknas från Anisotrop 2D SANS mönster som erhållits enligt ett magnetfält påverkas endast av bulk anpassningen av polymolecular sammansättningarna. De två metoderna kompletterar varandra och tillåta frikoppling av bidragen till Dubbelbrytning signalen. Den föreslagna Dubbelbrytning setup kunde bli fullkomnade genom att dela upp laserstrålen, vilket möjliggör samtidig övervakning av prover med och utan exponering för externa magnetfält. Dubbelbrytning resultaten för provet i magnetfältet kan normaliseras av den signal som erhålls för provet vid 0 T, effektivt redovisning för bakgrunden.

    Dubbelbrytning mätningar är inte begränsade till kvantifiera magnetiska anpassningen av bicelles. Många mjuka-material genererar en Dubbelbrytning signal på grund av beställning av deras interna struktur. Föreslagna inställningen tillåter för att övervaka dubbelbrytningen av sådant material som funktion av temperatur med eller utan ett externt magnetiskt fält. Antracen organogel fibrer, wormlike miceller under flöde, nanokristallin cellulosa och amyloid-Fe3O4 fibriller är några exempel vars Dubbelbrytning beteende utvärderades framgångsrikt med föreslagna setup. 29 , 30 , 32 , 41

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna har något att avslöja.

    Acknowledgments

    Författarna erkänner schweiziska National Science Foundation för att finansiera SMhardBi (projekt nummer 200021_150088/1). SANS experimenten utfördes vid den schweiziska spallation neutronkällan SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Schweiz. Författarna tacka vill varmt Dr Joachim Kohlbrecher för hans vägledning med SANS experimenten. Dubbelbrytning mätning inställningar under höga magnetfält inspirerades från den befintliga konfigurationen på hög-fält magnetiska laboratorium HFML, Nijmegen, Nederländerna. Vi tackar Bruno Pfister för hans hjälp att utveckla elektronik Dubbelbrytning setup, Jan Corsano och Daniel Kiechl för att konstruera de ramar som möjliggör fina och lättköpt justering av laser och Dr. Bernhard Koller för löpande teknisk support.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics