Fabrikation procedurer og dobbeltbrydning målinger til at designe magnetisk lydhør Lanthanide Ion chelaterende Phospholipid forsamlinger

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fabrikation procedurer for stærkt magnetisk lydhør lanthanide ion chelaterende polymolecular forsamlinger er præsenteret. Den magnetiske svar er dikteret af den forsamling størrelse, der er tilpasset ved ekstrudering gennem nanopore membraner. Forsamlinger magnetisk alignability og temperatur-inducerede strukturelle ændringer overvåges af dobbeltbrydning målinger, en gratis teknik til Kernemagnetisk resonans og small angle neutron scattering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bicelles er afstemmelige disk-lignende polymolecular forsamlinger dannet fra en lang række lipid blandinger. Applikationer spænder fra membran protein strukturelle undersøgelser af Kernemagnetisk resonans (NMR) til den nanoteknologiske udvikling herunder dannelsen af optisk aktiv og magnetisk switchable geler. Sådanne teknologier kræver høj kontrol af forsamling størrelse, magnetiske svar og termisk bestandighed. Blandinger af 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC) og dens lanthanide ion (Ln3 +) chelaterende phospholipid konjugat, 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phospho-ethanolamin-diethylenglycol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), samles til stærkt magnetisk lydhør forsamlinger såsom DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles. Indførelsen af kolesterol (Chol-OH) og steroid derivater i tolagede resultater i et andet sæt af assemblies tilbyder unikke fysisk-kemiske egenskaber. For en given lipid sammensætning er den magnetiske alignability proportional med bicelle størrelse. Kompleks af Ln3 + resulterer i hidtil uset magnetiske svar med hensyn til både omfang og justering retning. Thermo-Vendbar sammenbrud af de disk-lignende strukturer i blærer ved opvarmning giver mulighed for tilpasning af forsamlinger dimensioner ved ekstrudering gennem membranfiltre med definerede pore størrelser. Magnetisk alignable bicelles regenereres ved afkøling til 5 ° C, hvilket resulterer i assembly dimensioner defineres af vesikel prækursorer. Heri, denne fabrikation procedure er forklarede og den magnetiske alignability forsamlinger er kvantificeret ved dobbeltbrydning målinger under en 5,5 T magnetfelt. Dobbeltbrydning signal, stammer fra tolagede phospholipid yderligere giver mulighed for overvågning af polymolecular forandringer i tolagede. Denne enkle teknik er et supplement til NMR eksperimenter, der er almindeligt anvendt til at karakterisere bicelles.

Introduction

Bicelles er disk-lignende polymolecular forsamlinger hidrørende fra talrige lipid blandinger. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 de er meget udbredt til strukturel karakterisering af membran biomolekyler ved NMR spektroskopi. 6 , 7 imidlertid nylige indsats sigte at udvide feltet af mulige anvendelser. 5 , 8 , 9 den mest studerede bicelle-system består af en blanding af 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC), der udgør den plane del af forsamlingen, og 1,2-dihexanoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DHPC) Fosfolipid dækker kanten. 1 , 2 , 3 den molekylære geometri af fosfolipider komponere tolagede diktere arkitektur af selvsamlede polymolecular struktur. 4 , 5 udskiftning af DHPC med DMPE-DTPA genererer stærkt magnetisk responsiv og justerbar bicelle systemer. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles forbinder med mange flere Paramagnetiske lanthanide ioner (Ln3 +) på den tolagede overflade, hvilket resulterer i en forbedret magnetiske svar. 10 desuden erstatter de vandopløselige DHPC molekyler med DMPE-DTPA/Ln3 + muliggør dannelsen af fortynding-resistente bicelles. 11

Den magnetiske alignability af plane polymolecular forsamlinger er dikteret af deres samlede magnetiske energi,

Equation 1(1)

hvor B er magnetisk feltstyrke, Equation 2 den magnetiske konstant, n sammenlægning antallet og Equation 3 molekylære diamagnetic modtagelighed anisotropy af lipider komponere tolagede. Svar af DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles for magnetiske felter er derfor skræddersyet ved deres størrelse (samlet antal n) og molekylære diamagnetic modtagelighed anisotropy Δχ. Sidstnævnte er let opnås ved at ændre karakteren af den chelaterede Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 indførelse kolesterol (Chol-OH) eller andre steroid derivater i tolagede giver mulighed for tuning både den samlede tal n og magnetiske modtagelighed Δχ forsamlinger. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 for en given lipid sammensætning, større forsamlinger indeholder flere lipider i stand til at bidrage til Emag (større samlede tal n), hvilket resulterer i mere alignable arter. Størrelsen af DMPC/DHPC bicelles, for eksempel, er konventionelt kontrolleret gennem optimering af at komponere lipid forholdet eller total koncentration. 20 , 21 , 22 selv om dette er muligt i DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, deres thermo-reversibel transformation fra bicelle til vesikler på varme tilbud tilføjet indstillinger, skrædder. Mekanisk betyder såsom ekstrudering gennem membranfiltre giver mulighed for udformningen af vesikler. Magnetisk alignable bicelles regenereres ved afkøling til 5 ° C og deres dimensioner er dikteret fra vesikel prækursorer. 11 Herein, vi fokuserer på potentialet i mekanisk fabrikation procedurer med DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) som referencesystemer. Processen fungerer analogt når du arbejder med andre Ln3 + end Tm3 +. Den brede vifte af muligheder, som disse teknikker er fremhævet i figur 1 og flittigt diskuteret andetsteds. 23

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt over de mulige fabrikation procedurer. De studerede magnetisk alignable Ln3 + chelaterende polymolecular forsamlinger er sammensat af enten DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5). Tør lipid film er hydreret med en 50 mM fosfat buffer på en pH værdi på 7,4 og den samlede lipid koncentration er 15 mM. En effektiv hydrering af lipid film kræver enten fryse optøningen cyklusser (FT) eller opvarmning og afkøling cyklusser (H & C). H & C cyklusser er nødvendigt at regenerere prøver efter sidste fryse optøning trin eller regenerere prøver opbevares frosset over en længere periode, hvis de skal anvendes uden yderligere ekstrudering. Disse trin er udførligt drøftet af Isabettini mfl. 23 maksimalt alignable polymolecular forsamlinger er opnået, leverer forskellige forsamling arkitekturer baseret på lipid sammensætning. Bicelle størrelse og magnetiske alignability er afstemmelige ved ekstrudering (Ext) gennem nanopore membranfiltre. Præsenteres justering faktorer Af blev beregnet fra 2D small angle neutron scattering (SANS) mønstre af en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøve ekstruderet gennem enten 800, 400, 200 eller 100 nm porer. SANS målinger er et supplerende middel til at kvantificere bicelle justering, der ikke er dækket i detaljer heri. 11 , 16 the Af varierer fra -1 (parallel neutron spredning eller vinkelret justering af bicelles med hensyn til retningen magnetfelt) til 0 for isotropic spredning.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Strukturen af bicelles er blevet grundigt undersøgt af en bred vifte af karakterisering teknikker. 13 justeringen af bicelles udsat for et magnetfelt har opgjort ved hjælp af enten NMR spektroskopi eller small angle neutron scattering (SANS) eksperimenter. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 dog skiftet og udvidelse af NMR toppe opstår ved tilstedeværelse af Ln3 + er alvorlige begrænsninger til metoden. 15 , 26 , 27 , 28 skønt SANS eksperimenter lider ikke af denne begrænsning, alternative og mere tilgængelige teknikker er ønskeligt for rutinemæssig kvantificering af magnetisk induceret tilpasning af forsamlinger i løsning. Dobbeltbrydning målinger er en levedygtig og forholdsvis enkle alternativ. Analogt til NMR eksperimenter afsløre dobbeltbrydning målinger værdifulde oplysninger om lipid rearrangementer og lipid faser forekommer i tolagede. Derudover overvåges geometriske transformationer forekommer i polymolecular forsamlingen med skiftende miljøforhold som temperaturen. 11 , 12 , 13 , 16 magnetisk induceret dobbeltbrydning Δn′ har været brugt til at studere forskellige former for phospholipid systemer. 13 , 29 , 30 dobbeltbrydning målinger baseret på fase modulationsteknik i et magnetfelt er en levedygtig metode til at registrere retningen af bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 mulighed for at undersøge bicelles med dobbeltbrydning i høje magnetfelter op til 35 T også blev demonstreret gennem M. Liebi et al. 13

Når polariseret lys ind en anisotrope materiale, vil det være brydes i en ordinære og ekstraordinære bølge. 11 de to bølger har forskellige hastigheder og er flyttet i fase af en retardering δ. Grad af retardering δ er målt og omdannet til et flydende signal Equation 5 at kvantificere graden af anisotropy i den materielle hjælp

Equation 6(2)

hvor λ er bølgelængden af laser og d er tykkelsen af prøven. Fosfolipider er optisk anisotrope og deres optiske akse er sammenfaldende med deres lange molekylære akser, parallelt med kulbrinte haler. 11 , 12 ingen retardering måles hvis Fosfolipiderne er tilfældigt orienteret i løsning. Retardering er målt når fosfolipider er justeret parallelt med hinanden. Den magnetisk induceret dobbeltbrydning Equation 5 kan have en positiv eller negativ fortegn afhængigt af retningen af molekyler i det magnetiske felt; Se figur 2. Fosfolipider justeret parallelt til x-aksen vil resultere i en negativ Equation 5 , mens de justeret langs z-aksen resultere i en positiv Equation 5 . Ingen dobbeltbrydning er observeret, når den optiske akse falder sammen med ledelse af lys formering som phospholipid justerer parallel med y-aksen.

Figure 2
Figur 2: Justering af fosfolipider og tilsvarende tegn på den magnetisk induceret dobbeltbrydning Equation 12 . Tegnet af den målte Equation 12 afhænger af orientering af fosfolipid i magnetfeltet. Stiplede linjer angiver den optiske akse af molekylet. Lyset er polariseret på 45° og udbreder i y-retningen. Det magnetiske felt B er i z retning. Dette tal er blevet ændret fra M. Liebi. 11 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I tilfælde af en isotropic kolloid suspension af bicelles bliver orientering induceret af arrangement af fosfolipider i tolagede tabt, nulstilling retardering δ. Bicelles skal også justere for at orientere de optisk aktiv fosfolipider i deres dobbeltlag, forårsager en retardering δ af polariseret lys. Dobbeltbrydning er derfor en følsomme redskab til at kvantificere den magnetiske alignability polymolecular forsamlinger. Bicelles justeres vinkelret på det magnetiske felt vil give en positiv Equation 5 , mens de justeret parallelt vil give en negativ Equation 5 . Tegn afhænger af justeringen af opsætningen og kan kontrolleres med en kontrolprøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikation procedure for DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) og DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) polymolecular forsamlinger

  1. Foreløbige præparater
    1. Vask alle glasvarer ved gennemskylning engang med ethanol stabiliseret chloroform (> 99% chloroform) og tør med trykluft.
    2. Producere 2 særskilte 10 mg/mL stamopløsninger af DMPC og DMPE-DTPA i ethanol-stabiliseret chloroform (> 99% chloroform), et 10 mM stamopløsning af Chol-OH i ethanol-stabiliseret chloroform (> 99% chloroform) og en 10 mM stamopløsning af TmCl3 i methanol.
    3. Forberede en 50 mM fosfat buffer på en pH værdi på 7,4 ved at blande 0.121 g natrium dihydrogen fosfat dihydrat og 0.599 g vandfri di-natrium hydrogen fosfat i 100 mL i ultrarent H2O.
  2. Forberedelse af tørre lipid film
    1. Veje de nødvendige mængder af amphiphiles (DMPC, DMPE-DTPA, og eventuelt Chol-OH) og Ln3 + stamopløsninger i separate 3 mL glas snap-kopper med en 2,5 mL glas sprøjte.
      1. For en 3 mL prøve volumen af DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (molar forholdet 4:1:1, samlede lipid koncentration på 15 mM), vejer i 3.6435 g DMPC stamopløsning, 1.4731 g af DMPE-DTPA stamopløsningen og 0.7126 g TmCl3 stamopløsning.
      2. For en 3 mL prøve volumen af DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5, samlede lipid koncentration på 15 mM), veje i 2.9148 g DMPC stamopløsning, 1.4731 g DMPE-DTPA stamopløsning, 1.0749 g af Chol-OH stamopløsningen og 0.7126 g TmCl3 stamopløsning.
        Forsigtig: Chloroform og methanol er giftigt og flygtige ved stuetemperatur. Arbejde under et stinkskab og straks gå videre med de masse målinger.
    2. Overføre indholdet af snap-kopper til en 25 mL rund bund kolbe. Skyl hver snap-cup i rund bund kolben med omkring 2,5 mL af den tilsvarende opløsningsmiddel.
    3. Fjerne opløsningsmiddel under vakuum i en roterende fordamper ved 40 ° C. Sæt den første pres til mod 30.000 Pa indtil de fleste af opløsningsmidlet er fjernet. Reducere trykket til 100 Pa og tør prøve under rotation for et minimum af 2 h. opnår en ensartet tør lipid film på glasvægge i kolben.
    4. Placer tør lipid film i 1 minut under en jævn strøm af argon undgå lipid oxidation i luften og gemme prøven i fryseren inden rehydrering.
  3. Hydrering af tørre lipid film
    1. Tilføje fosfat buffer 3 mL rund bund kolben at nå frem til en total lipid koncentration af 15 mM.
    2. Udføre en fryse-optøning (FT) cyklus af kaster kolben under rotation i flydende kvælstof, indtil det er grundigt frosset (den flydende kvælstof stopper kogning), så varme tilbage op til 60 ° C ved at placere prøven i 5 min i et vandbad, hvirvlende kolben løbende til støtte den smeltende proces. Anvende 30 s af vortexing før hver indefrysning cyklus, når prøven er flydende til at støtte hydrering af lipid film.
      Bemærk: Ingen lipid film skal være synlige på kolben væggene efter andet fryse optøningen cyklus.
    3. Gentag 1.3.2 fem gange i alt. Kolben lukkes med en cap for at undgå unødvendige fordampning af fosfat buffer, når prøven er varmt. Protokollen kan afbrydes midlertidigt, når prøven er frosset.
    4. Gå videre til to opvarmning og afkøling (H & C) cykler at stabilisere prøven kommer ud af det sidste indefrysning skridt, eller holde frosset i op til to måneder. Opvarmes prøven til 40 eller 60 ° C for DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5), henholdsvis, før man køler til 5 ° C i 1 ° C/min. vedligehold prøve 5 min på maksimum og minimum temperaturer i cyklussen.
    5. Nu, enten bestemme dobbeltbrydning signal af prøven i et ydre magnetfelt (trin 2) eller yderligere presse prøven for at skræddersy bicelle dimensioner og magnetiske alignability (trin 1.4).
      Bemærk: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver er hovedsagelig består af bicelles med en gennemsnitlig hydrodynamiske diameter DH 70 nm som afsløret af et antal distribution fremstillet dynamisk lysspredning (DLS) målinger på 5 ° C. Disse prøver også indeholde større polymolecular samlinger med en gennemsnitlige DH 500 nm som afsløret ved en intensitet distribution. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøver er meget polydisperse i størrelse med typiske intensitet distributioner afslører en gennemsnitlig DH af 700 nm, mens de antal distributioner afslører en befolkning, der er domineret af mindre bicelles i den størrelse række 200 nm. Mere detaljerede størrelse distributioner og cryo transmissions Elektron Mikroskopi billeder af disse prøver er blevet rapporteret af Isabettini et al. 23
  4. Ekstrudering af polymolecular forsamlinger.
    1. Samle ekstruder, som vist i figur 3. Brug handsker og pincet med beskytte silica rør til håndtering. Våd filtrerpapir (5) med et par dråber af buffer til at give mulighed for en optimal placering af membranfilter (6). Kontroller, at papiret har ingen folder efter markedsføring o-ring (7) på toppen.
      Bemærk: Ekstruderingsprocessen blev testet på membranfiltre (6) med porestørrelse 800, 400, 200 og 100 nm; Se figur 7.
    2. Indstille et vandbad til 40 ° C til DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver eller 60 ° C for DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøver at garantere dannelsen af extrudable vesikler.
    3. Tilsluttes en trykisoleret kvælstof flaske ved hjælp af en højtryks PVC rør ekstruder (> 4 MPa) udstyret med serto adaptere og presse det flydende materiale gennem membranen. 1 MPa pres er normalt kræves for ekstrudering gennem membranfiltre (6) med porestørrelse på 200 nm og derover. 1,5-2,5 MPa er påkrævet for de mindre membranfiltre (6) med porestørrelse 100 nm.
      Bemærk: Ændre membranfiltret hvis unormalt høje belastninger (> 2,5 MPa) er forpligtet til at presse prøven (dette er det første tegn på tilstopning).
    4. Åbn dækslet (10) og indsætte eksemplet bruger en 2 mL glas pipette. Derefter lukke dækslet (10) og åbne trykventilen (12) mens du holder outlet prøveglas (2). Lukke trykventilen (12) efter ekstrudering cyklus er afsluttet, udluftning og fortsætte med den næste cyklus.
      Bemærk: Lad ikke prøven i kontakt for lang tid med den varme dobbeltvægget fartøj (8) at undgå overdreven prøve tab ved fordampning.
30-60 s er tilstrækkelig tid til en 3 mL prøve til Reagensglasset i ekstruder før åbning trykventilen (12).
  • Gå videre til 10 ekstrudering cyklusser for en given membran pore dimension som vist i figur 3. De fleste af bicelle systemer er ekstruderet 10 gange gennem membraner med porestørrelse 200 og en anden 10 gange gennem membraner med porestørrelse 100 nm, garantere prøve sammenlignelighed.
  • Nu, afgøre dobbeltbrydning signal af prøven i et ydre magnetfelt (trin 2).
  • Figure 3
    Figur 3: laboratorium ekstruder bruges til bicelle og vesikel præparater. Ekstruder er samlet fra bunden op: (1) mount, (2) prøven indsamling rum med en 2,4 mm (indvendig diameter) plast outlet rør og o-ring (3) og (4) små og store stabiliserende mesh, (5) filter papir, (6) membranfiltre, (7) o-ring, (8) dobbeltvægget fartøj, (9. ) top cover med indløb og pres forbindelse, (10) dækning, (11) sommerfugl skruer, (12) pres ventil. En skitse af den forsamlede ekstruder er vist af højre side. Nitrogen gas (N2) leveres af en trykbeholder og dobbeltvægget fartøjet (9) er sluttet til et vandbad til temperaturkontrol. Eksemplet gennemgår 10 ekstrudering cyklusser for enhver given membran filter pore diameter (prøve stien vist i blåt). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    2. dobbeltbrydning målinger af DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) og DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) polymolecular forsamlinger.

    1. Bygge og forbinde dobbeltbrydning setup som præsenteret i figur 4 og levere strøm til de respektive elektroniske elementer. Anbring ikke PEM, prøven og den anden polarizer i stien laser på dette stadium. Undgå afsløring tilbage-spredt laserlys ved at dække reflekterende overflader, for eksempel aluminium spejl indehavere, med sort papir.
    2. Justere spejle for at maksimere laser intensiteten på detektor, som er repræsenteret af intensiteten af jævnstrøm Equation 7 fremstillet af lavpasfilter i figur 4B.
      Forsigtig: Brug passende Øjenværn, når du justerer spejlene og rådføre sig med en laser sikkerhed instruktør hvis manipulere lasere for første gang.
    3. Drej den første krydsede lineær polarisator (vedligeholdt vinkelret hændelse laserstråle) for at maksimere den Equation 7 .

    Figure 4
    Figur 4: skematisk fremstilling af dobbeltbrydning setup og forbindelser til de optiske signaler. A) en superledende elektromagnet leverer en 5,5 T magnetfelt. Lyset fra en diodelaser på 635 nm er polariseret af to krydsede polarisatorer. En photoelastic modulator PEM-90 opererer på 50 KHz med en amplitude0 af 2.405 rad og placeret mellem de to polarisatorerne. Prøven ligger i magnet mellem PEM og den anden polarizer. Non-polariserende spejle guide lys gennem de forskellige elementer og endelig påvises ved en fotodetektor. Den første og den anden harmoniske Equation 10 og Equation 11 på AC signal bliver overvåget, tillader beregning af dobbeltbrydning signal at give oplysninger om den magnetiske alignability i Ln3 + chelaterende polymolecular forsamlinger. Prøven kuvette er tilsluttet en ekstern vandbad temperaturregulator (blå). Temperaturen i prøven er overvåget med en temperatur sonde (rød). B) signalet fra fotodetektor fødes ind i en anden rækkefølge Sall-Key lavpasfilter (24 V AC strømforsyning) med en grænsefrekvens på 360 Hz gennem en ±12 V DC power supply braded kabel (3). Lavpasfilter ekstrakter komponenten DC Equation 7 og leverer det til PC-grænseflade (4) gennem et BNC 50 Ω kabel. Signalet fra fotodetektor er leveret til de to lock-in forstærkere (som uddrag den første og den anden harmoniske Equation 10 og Equation 11 ) gennem et BNC 50 Ω kabel (1) & (2). De harmoniske intensiteter registreres af en fase-følsomme detektion. Derfor bruges PEM signal som reference signal til lock-in forstærkere (1f-produktion af PEM i den første lock-in forstærker og 2f-output til andet, forbundet med BNC 50 Ω kabler). Udgangssignalerne leveres til PC-interface enhed gennem BNC 50 Ω kabler. Analoge erhvervelse enheder FFP-AI-110 og den fælles fiskeripolitik-CB-1 digital signal, der er overført til computeren via en RS-232 kabel til overvågning. Type K temperatur sonde er også tilsluttet PC-interface enhed hvor analoge erhvervelse enheder FFP-CB-3 og den fælles fiskeripolitik-TC-120 digital signal før du overfører det til computeren via en RS-232 kabel til overvågning. C) billede af opsætningen skematisk præsenteret i B. nøgle elementer identificeres med tilsvarende tal fra 1 til 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    1. Sted den anden krydsende lineær polarisator vinkelret på de indfaldende laserstråle, som vist i figur 4A. Minimere den Equation 7 ved at sætte den anden polarisator på en 90° vinkel med hensyn til først.
    2. Sted photoelastic modulator (PEM) på 0° mellem de to krydsede lineær polarisatorer og vinkelret på de indfaldende laserstråle som vist i figur 4A. Justere PEM til en frekvens på 50 kHz og amplitude A0 til 2.405 rad, som vist i figur 5A. Dette gør komponenten DC uafhængigt af dobbeltbrydning og øger den Equation 7 .
      Bemærk: Den optiske akse af PEM kan indstilles et par grader til at opretholde en konstant Equation 7 i luften før måling af enhver prøve.
    3. Vente 1 time efter ombøjning oven på den laser og elektronisk udstyr til at stabilisere signalet.
    Signalet er stabil, når auto-udfasning af lock-in forstærkere forbliver konstant.
  • Prøven anbringes i en temperatur kontrolleret kvarts kuvette med en lysvej på 10 mm og tilsluttes en ekstern vandbad indstillet på 5 ° C.
  • Placer en 0,5 mm tyk type K termoelement (temperatur sonde) direkte i prøve at overvåge temperaturen i prøven. Kontroller, at sonden ikke blande sig med laserlys ved at placere en hvidbog i stien laser (efter kuvette) og leder efter skygger forårsaget af sonden.
    Bemærk: Der er en 2-3 ° C forskel mellem temperaturmåling af vandbadet og temperaturen i prøven.
  • Placer kuvette i boring af magnet, som vist i figur 4A. Laserlys er udbreder vandret gennem prøven, afledt af ikke-polariserende spejle og opdaget af en fotodetektor.
    Bemærk: Laser er rettet ned gennem prøven og tilbage af samme sti til regnskab for Faraday effekter (dvs. rotation af polarisering flyet af lys forårsaget af det magnetiske felt, når gå ned annulleres, når de kommer tilbage i den modsatte retning).
  • Anvende en konstant luftstrøm komprimeret luft ved stuetemperatur og 10000 Pa på kuvette at undgå kondensering af vand på cellevægge, hvilket ville reducere intensiteten af signalet og øge støj. Dette er især vigtigt, når der måles på 5 ° C.
  • Opdage den første og den anden harmoniske Equation 10 og Equation 11 på AC signal med to lock-in forstærkere. Auto fase lock-in-forstærkere ved at trykke på knappen (2) vist i figur 5B og justere følsomheden som vist i figur 5B (1). Sørg for der ikke er mere end fire røde søjler på forstærkere som vist i figur 5B (3) for at undgå signal overbelastning. Optegne den erhvervsdrivende følsomhed for både lock-in forstærkere i programmet Tesla_Magnet_Const_V092 , som vist i figur 5 c (8). Programmet tilbydes som supplerende information.
  • Rampe magnetfelt op til 5,5 T ved at levere strøm til magnet gennem programmet Tesla_Magnet_Const_V092 , som vist i figur 5 c (5).
  • Opnå dobbeltbrydning Equation 5 ved hjælp af ligningen 2, hvor retardering beregnes med
    Equation 13(3)
    hvor Equation 14 og Equation 15 er Bessel-funktionerne kun til den første slags, med Equation 16 og Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 plot retardering i programmet Tesla_Magnet_Const_V092, som vist i figur 5 c (4).
    Bemærk: Retardering leveres af programmet bør ikke bruges til at beregne dobbeltbrydning signal, hvis de to lock-in forstærkere ikke opererer på den samme følsomhed (Se trin 2.12). De logførte harmoniske intensiteter Equation 10 og Equation 11 skal multipliceres med følsomheden af lock-in forstærkere til at få de korrekte dimensioner. Derudover skal dobbeltbrydning signalet måles under en magnet felt være normaliseret ved at fratrække den gennemsnitlige dobbeltbrydning signal fremstillet på 0 T.
  • Overvåge den prøve dobbeltbrydning signal på konstant eller skiftende temperatur (1 ° C/min.) ved at regulere temperaturen i vandbadet tilsluttet kuvette vist i figur 4.
  • Log forsøgsdata ved at udfylde i den eksperimentelle beskrivelse i figur 5 c (8), at levere et filnavn i (9), og trykke på knappen "START log" (10).
  • Figure 5
    Figur 5: illustrationer af den erhvervsdrivende indstillinger og program screenshots. A) PEM indstillinger: retardering 2.405 rad, bølgelængde 635 nm, frekvens 50 Hz. White cirkler angiver hvilke indstillinger skal aktiveres (USR = bruger defineret retardering, LOC = lokale driftsform). B) Lock-in forstærker indstillinger. Følsomhed (1) der skal vælges før hver måling som krævet i trin 2.11. Der bør ikke være mere end fire røde søjler på displayet (3) for at undgå en signal overbelastning. En overbelastning opstår, når den røde led i (1) tændes, umuliggør en måling. Tryk på knappen auto fase (2) før hver måling. C) Screenshots af programmet Tesla_Magnet_Const_V092 leveres som supplerende information. Programmet giver mulighed for kontrol af magnetfeltet og optagelse af alle signalet output som funktion af tiden. Den magnetiske feltstyrke og prøve temperatur er afbildet i (1). Den første og den anden harmoniske Equation 10 og Equation 11 af AC signal målt ved de to lock-in forstærkere er afbildet i (2). Intensiteten af jævnstrøm Equation 7 er afbildet i (3). Retardering er beregnet som beskrevet i trin 2.13 og afbildet i (4). Den magnetiske feltstyrke er indstillet i (5). Direkte måling af temperaturen indspillet af Type K termoelement præsenteres i (6) og output signaler (Equation 23 og Equation 22 ) i (7). Yderligere oplysninger kan indsættes i (8) som erhvervsdrivende følsomheden af forstærkere, prøve navn mv. Dataene kan være logget og eksporteres til en .txt-fil i (9). Starte og stoppe dataopsamling med knappen "START log" (10). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Dobbeltbrydning signal om en ikke-ekstruderet DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) stikprøven blev overvåget under en 5,5 T magnetiske felt under en opvarmning og køling cyklus fra 5 til 40 ° C og tilbage med en hastighed på 1 ° C/min. (figur 6). Dobbeltbrydning bekræftede høj magnetisk alignments ved 5 ° C med en værdi af 1,5 x 10-5, dobbelt så stærke som for de rapporterede ekstruderede systemer. 6 , 7 , 23 nulstilling af dobbeltbrydning signal over Tm af DMPC på 24 ° C var forårsaget af dannelsen af ikke-alignable vesikler. Bevægelse udseendet af den uordnede væskefasen udløst store rearrangementer i polymolecular assemblies. Disse rearrangementer er thermo-reversible. Alignable arter blev regenereret ved afkøling under Tm og dobbeltbrydning signal fulgte samme udvikling som på varme. De forskellige toppe opstår omkring Tm mark udskiftning af de alignable forsamlinger af ikke-alignable vesikler. 23 de molekylære rearrangementer anvendt opvarmning og køling sats på 1 ° C/min. langsom forsvindingskinetik forklare hvorfor toppene ikke overlapper. I stedet startede begge toppe på Tm af DMPC, tyder på, at tolagede lipider skal have en vis grad af ordre til at favorisere dannelsen af alignable arter.

    Figure 6
    Figur 6: Dobbeltbrydning signal som funktion af temperatur for en ikke-ekstruderet DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøve ved opvarmning (rød) og afkøling (blå) på 1 ° C/min. Prøven blev udarbejdet efter protokollen trin 1 til 1.3.5. Dobbeltbrydning målinger blev gennemført efter protokollen trin 2. Den magnetiske feltstyrke var ramped op til 5,5 T og prøven blev opretholdt på 5 °, at opnå en dobbeltbrydning signal 1,5 x 10-5 , før du fortsætter til opvarmning og afkøling cyklus. Dobbeltbrydning signal flatlines ved temperaturer over 35 ° C hvor ingen justering blev observeret som stikprøven bestod udelukkende af vesikler. Efter afkøling, bicelles blev regenereret og et afsluttende dobbeltbrydning signal 7.2 x 10-6 blev opnået på 5,5 T og 5 ° C. Den magnetiske feltstyrke var ramped ned til 0 T og prøven blev opretholdt under 5 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    En DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) stikprøven blev hydreret efter opvarmning og køling procedure i trin 1.3.4 og efterfølgende ekstruderet 10 gange ved 60 ° C gennem membranfiltre af forskellige pore størrelser, se trin 1.4. Ved 60 ° C samler lipid blandingen i blærer, som er formet af ekstruderingsprocessen. 16 , 35 , 36 , 37 efter endt ekstrudering, bicelles blev regenereret ved afkøling til 5 ° C og den hydrodynamiske diameter DH blev målt af DLS. Den magnetiske alignability af bicelles blev evalueret ved 5 ° C, ved at beregne Af med SANS på 8 T og ved at måle dobbeltbrydning signal på 5,5 T; Se figur 7. Dobbeltbrydning signal er opnået ved ramping op til 5,5 T og tilbage til 0 T som vist i figur 7A. Peak dobbeltbrydning opstod på 5,5 T hvor den højeste grad af tilpasning blev forventet efter ligning 1. Den hydrodynamiske diameter DH af bicelles blev reduceret til 220, 190, 106 og 91 nm ved successive ekstruderinger gennem membraner med pore størrelser af 800, 400, 200 og 100 nm henholdsvis. Det tilsvarende fald i magnetiske justeringen blev bekræftet af den faldende dobbeltbrydning signal og reduktion i absolutte tal enf da det nærmede sig nul i figur 7B. Resultaterne bekræftede mulighed for at kontrollere bicelle størrelse og magnetiske tilpasning gennem tilpasning af blærer ved ekstrudering ved 60 ° C og køling tilbage til 5 ° C.

    Figure 7
    Figur 7: Magnetiske justering af en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) prøve ekstruderet gennem membranfiltre af forskellige pore dimensioner. A) dobbeltbrydning signal Δn′ som en funktion af den magnetiske feltstyrke B når ramping op og ned for prøven ekstruderet gennem 800 nm porer. Peak dobbeltbrydning nåede på 5,5 T efter ligningen 1. Denne maksimal dobbeltbrydning værdi er rapporteret i B). Samme prøve var ekstruderet gennem 400 nm porer. Den magnetiske justering blev evalueret ved begge dobbeltbrydning målinger (sorte firkanter) på 5,5 T (analogt til hvad der blev gjort for den forrige ekstrudering trin i A) og ved beregning af justering faktorer enf (røde cirkler) på 8 T afbildet som en funktion af den Hydrodynamisk diameter DH fremstillet af DLS. Den magnetiske justering blev evalueret analogt på samme prøve ekstruderet gennem 200 nm porer, og en sidste gang efter ekstrudering gennem 100 nm porer. Alle målinger blev udført under 5 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    En detaljeret redegørelse for hvordan dobbeltbrydning målinger blev brugt i kombination med SANS eksperimenter til at vurdere metoder til at generere meget magnetisk lydhør Ln3 + chelaterende fosfolipider forsamlinger er i Isabettini et al. 23 de foreslåede fabrikation protokoller er også gældende for assemblies, der består af de længere DPPC og DPPE-DTPA fosfolipider eller for dem, der indeholder kemisk manipuleret steroid derivater i deres tolagede. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 det eneste krav er, at prøven er opvarmet til tilstrækkeligt høje temperaturer i trin 1.3.2, 1.4.2, 1.3.3 og 1.3.4. Temperaturerne skal tillade tolagede lipider at indtaste en uorganiseret væskefasen, Vis optimal hydrering af tørre lipid film eller prøve regenerering. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) forsamlinger, for eksempel, behøver at blive opvarmet til over fase overgang temperatur DPPC på 42 ° C, mens den analoge DMPC-baseret system skal være opvarmet over 24 ° C. En tilstrækkelig høj temperatur er også nødvendige for at garantere dannelsen af extrudable blærer opstår når lipid tolagede er i en uorganiseret staten taktfast 1.4. Fryse-optøning cyklusser i trin 1.3.2 kan erstattes fuldt ud af H & C cyklusser. 23 men prøven har brug for mere tid til fuldt hydrat lipid film med denne procedure og skal være vortexed 20 min. Når på 5 ° C og 2 min. ved 60 ° C. Yderligere H & C cyklusser er gennemført hvis elementer af filmens tør lipid overholdes stadig på glasvægge i kolben.

    De Tm3 + chelaterende bicelles præsenteret i denne protokol justeres vinkelret magnetfelt. Denne justering retning stammer fra den store positive magnetiske modtagelighed af Tm3 +. 11 , 14 andre lanthanide ioner som Dy3 + og Yb3 + kan også anvendes. 11 , 13 , 19 de forskellige magnetisk anisotropy Ln3 + tilbyder yderligere midler til at skræddersy den magnetiske justering af bicelles. Eksempelvis styrker Dy3 + uløseligt negativ magnetisk modtagelighed af tolagede fosfolipider, hvilket resulterer i en høj grad af tilpasning af bicelles parallelt med magnetisk felt. 13 ændringen i tilpasning retning er opdaget af en ændring i tegn på både dobbeltbrydning signal og justering faktorer er beregnet ud fra anisotrope 2D SANS mønstre. Det er vigtigt at bemærke, at den magnetiske modtagelighed ikke udelukkende dikteret af den kemiske natur for Ln3 + , men af Chelat geometri Ln3 +-fosfolipid komplekse. 19 , 38 den magnetiske modtagelighed kan være manipuleret ved syntese af forskellige Ln3 + chelaterende phospholipid headgroups, definere de magnetiske svar af de resulterende forsamlinger. 38

    Hver prøve er optisk forskelligt afhængigt af arten af de udgør lipider ansat. Overvågning af prøven turbiditet som funktion af temperatur er en supplerende metode til at evaluere temperatur-inducerede strukturelle forandringer i forsamlingerne. Selv om disse målinger foregår som regel i mangel af et magnetisk felt i et spektrofotometer, overvågning intensiteten af laser jævnstrøm Equation 7 med opsætningen af foreslås heri tilbyder de samme oplysninger i overværelse af en magnetisk felt. 11 , 16 den DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver er normalt mindre grumset end deres Chol-OH indeholdende DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 16:4:5:5) kolleger under 5 ° C. Prøver der ligner vand ved 5 ° C er generelt ikke alignable i et magnetfelt. Ved stuetemperatur, begge prøver look gennemsigtig fordi DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) prøver er i en overgangsfase mellem bicelles og vesikler og store koncentriske huller vises i DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (kindtand forholdet 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 overgangstilstanden af bicelles til vesikler i DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) er også ledsaget af en forøgelse af den prøve viskositet ved stuetemperatur. Denne temperatur-afhængige ændring i turbiditet gør at vælge den rigtige følsomhed i trin 2.11 vanskeligt. Hvis følsomhed er justeret for højt på en grumset stikprøve på 5 ° C, kan mere gennemsigtig art prøve på opvarmning forårsage en overbelastning af forstærkere. Desuden meget grumset prøver øges betydeligt støj forholdet mellem signal og kan ikke være egnet til dobbeltbrydning målinger. Laserlys skal kunne gå igennem prøven for at blive opdaget.

    Non-ekstruderet prøver er altid mere grumset og har en tendens til aggregat ved kortvarig opbevaring i køleskabet. Ikke desto mindre magnetisk lydhør prøverne let regenereres med en H & C cyklus. Non-ekstruderet prøver kan også opbevares i frossen tilstand og let regenereres ved H & C cyklusser. Ekstruderet prøver opbevares i køleskabet og almindeligvis målt i en uge efter den prøveforberedelse. Ingen undersøgelser rapport for langvarig oplagring af ekstruderet arter i enten flydende eller frossen tilstand. Derfor kan ikke størrelse fordelingen af assemblies fremstillet af ekstrudering garanteres over længere tids opbevaring.

    Analogt til enhver bicelle system findes disse magnetisk alignable planar forsamlinger kun i et defineret område af lipid sammensætning og koncentration. At ændre lipid nøgletal vil resultere i forskellige forsamling arkitekturer, herunder dannelsen af micelles, bånd og vesikler. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 fosfat buffer koncentration og pH i trin 1.1.3 spiller en afgørende rolle i udformningen af bicelles og deres magnetiske svar. Bufferen, der definerer de fysisk-kemiske interaktioner for hydrofile miljøet omkring polymolecular forsamlingerne. Lavere buffer koncentrationer resultere i forskellige forsamling arkitekturer, mens højere koncentrationer forårsage prøve sammenlægning og nedbør på grund af en overskydende afgift screening.Under sure forhold med pH-værdier mellem 3 og 4 er en carboxylsyre fraspaltning tjener som ligander i DMPE-DTPA/Ln3 + komplekse protonated. Dette resulterer i ødelæggelse af magnetisk lydhør polymolecular forsamlinger, observeret af sammenlægning og nedbør i prøven. Magnetisk lydhør Ln3 + polymolecular forsamlinger har en rimelig modstand mod mere grundlæggende pH værdier. Dog DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar forholdet 4:1:1) bicelles blev vist til at bryde op i micelles ved pH værdier af 12,9. 11 prøverne må aldrig udsættes for vand fra hanen eller andre salte. Enhver anden ion vil forstyrre den Ln3 + chelaterende proces eller resultere i sammenlægning af forsamlinger på grund af afgift screening. For SANS målinger, er bufferen forberedt som beskrevet i trin 1.1.3 i D2O i stedet for ultrarent H2O. Bemærk at pH måleraflæsning bliver 7.0 (svarende til en pD værdi på 7,4).

    De strukturelle forandringer opstår i polymolecular assemblies underlagt en opvarmning og køling cyklus er thermo-reversible. Derfor, den endelige dobbeltbrydning signal ved 5 ° C bør være det samme som før temperatur cyklussen. 11 , 16 hvis dobbeltbrydning signal er højere efter cyklussen, prøven var ikke ordentligt regenereres i trin 1.3.4. Dette sker almindeligvis i prøver opbevares i en længere periode. En lavere dobbeltbrydning signal når temperatur cyklusen som observeret i figur 6 viser et problem i opsætningen af eksperimenterende. Mest almindeligt, var laser lys stien forstyrret af tilbage spredning eller et andet objekt. Dette er især problematisk med temperatursonden indsat direkte i prøven (Se trin 2.8) bør placeres som ikke forstyrrer den lede bane af laserlys. En forstyrret lys sti forårsager et fald i den Equation 7 , en larmende signal, og/eller unormale toppe i dobbeltbrydning-temperatur kurver. For eksempel, var peak forekommer på opvarmning på ca. 35 ° C i figur 6 forårsaget af udvidelse af vandkølet rørene ind den lede bane af laserlys. Dobbeltbrydning signal kan ikke have tillid til fra dette punkt og fremefter. Selv om den generelle form af afkøling kurven var normal, skyldtes den lavere dobbeltbrydning signal opnået ved 5 ° C indblanding.

    Dobbeltbrydning værdier fremkommet efter denne protokol er ikke absolut og bruges til at sammenligne prøver indbyrdes. Til sammenligning med litteratur værdier kræves en kalibrering med et referencesystem. For eksempel, tegnet af den målte retardering afhænger af justeringen af set-up og kan kontrolleres med toluen, som har en bomuld-Mouton konstant af 3,27 × 10−9 T−2. 39 , 40

    Dobbeltbrydning signal med oprindelse fra ændringer i prøvens magnetiske justering kan afkobles fra signalet forårsaget af molekylære rearrangementer i tolagede. Justering faktorer er beregnet ud fra anisotrope 2D SANS mønstre opnået under et magnetfelt er kun påvirket af bulk justeringen af polymolecular forsamlingerne. De to metoder er komplementære og tillade afkobling af bidragene til dobbeltbrydning signal. Opsætningen af foreslåede dobbeltbrydning kunne blive fuldkommengjort ved at opdele laserstråle, giver mulighed for samtidig overvågning af prøver med og uden udsættelse for det ydre magnetfelt. Dobbeltbrydning resultaterne for prøve i det magnetiske felt kunne være normaliseret af signalet fremstillet i stikprøven på 0 T, effektivt tegner sig for baggrunden.

    Dobbeltbrydning målinger er ikke begrænset til at kvantificere den magnetiske justering af bicelles. Mange soft-materialer generere en dobbeltbrydning signal på grund af bestilling af deres interne struktur. Den foreslåede konfiguration giver mulighed for at overvåge dobbeltbrydning af sådanne materialer som funktion af temperatur med eller uden et eksternt magnetfelt. Anthracen organogel fibre, wormlike micelles under flow, nanocrystalline cellulose og amyloid-Fe3O4 fibriller er et par eksempler hvis dobbeltbrydning adfærd var med held evalueret med den foreslåede setup. 29 , 30 , 32 , 41

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at oplyse.

    Acknowledgments

    Forfatterne anerkender den schweiziske National Science Foundation for finansiering SMhardBi (projekt nummer 200021_150088/1). SANS eksperimenter blev udført på den schweiziske spallation neutron kilde SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen i Schweiz. Forfatterne takke varmt Dr. Joachim Kohlbrecher til hans vejledning med SANS eksperimenter. Opsætningen dobbeltbrydning måling under høje magnetfelter var inspireret af den eksisterende opsætning ved høj-felt magnetiske laboratory HFML, Nijmegen, Nederlandene. Vi takke Bruno Pfister for hans hjælp i udvikle elektronik af opsætningen dobbeltbrydning, Jan Corsano og Daniel Kiechl til at konstruere rammer tillader fine og letkøbt justering af laser og Dr. Bernhard Koller til løbende tekniske support.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics