Fertigung-Verfahren und Doppelbrechung Messungen für die Gestaltung von magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Phospholipid-Baugruppen

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Summary

Fertigung-Verfahren für stark magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Polymolecular Baugruppen werden vorgestellt. Die magnetische Antwort richtet sich nach der Montage Größe, die durch Extrusion durch Nanopore Membranen zugeschnitten ist. Die Assemblys magnetische Alignability und temperaturbedingte strukturelle Veränderungen werden durch Doppelbrechung Messungen, eine kostenlose Technik, NMR- und kleinen Winkel Neutronenstreuung überwacht.

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Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

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Abstract

Bicelles sind abstimmbaren scheibenartigen Polymolecular Baugruppen gebildet aus einer Vielzahl von Lipid-Mischungen. Anwendungen reichen von Membran-Protein strukturelle Studien durch Kernspinresonanz (NMR), nanotechnologischen Entwicklungen einschließlich der Bildung von optisch aktiven und magnetisch umschaltbar Gele. Solche Technologien erfordern hohe Kontrolle der Montage Größe, magnetische Resonanz und thermischen Widerstand. Mischungen von 1,2-Dimyristoyl -sn- Glycero-3-Phosphocholin (DMPC) und seine Lanthanoid-Ionen (Ln3 +) chelatisierenden Phospholipid-Konjugat, 1,2-Dimyristoyl -sn- Glycero-3-Phospho-Ethanolamin-Diethylenglykol Triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), in stark magnetisch reagieren Baugruppen wie DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + montieren (molares Verhältnis 4:1:1) Bicelles. Einführung von Cholesterin (Chol-OH) und Steroid-Derivate in der Bilayer führt zu einem anderen Satz von Assemblys bietet einzigartige physikalisch-chemischen Eigenschaften. Für eine gegebene Lipidzusammensetzung ist die magnetische Alignability proportional zur Bicelle Größe. Die Komplexierung von Ln3 + führt zu noch nie da gewesenen magnetische Antworten in Bezug auf Größe und Ausrichtung Richtung. Die Thermo-Reversible reduzieren der scheibenartigen Strukturen in Vesikeln beim Erhitzen können Anpassung die Assemblys Dimensionen durch Extrusion durch Membranfilter mit definierten Porengrößen. Die magnetisch anreihbar Bicelles werden regeneriert, durch kühlen auf 5 ° C, wodurch Einbaumaße durch die Vesikel Vorläufer definiert. Hierin, dieses Fertigung-Verfahren erläutert und die magnetische Alignability der Baugruppen wird durch Doppelbrechung Messungen unter 5,5 T Magnetfeld quantifiziert. Die Doppelbrechung Signal, aus dem Phospholipid Bilayer ermöglicht weitere Überwachung der Polymolecular Veränderungen in der Bilayer. Diese einfache Technik ist komplementär zur NMR-Experimente, die häufig eingesetzt werden, um Bicelles zu charakterisieren.

Introduction

Bicelles sind scheibenartige Polymolecular Baugruppen aus zahlreiche Lipid-Mischungen gewonnen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 sie sind für die strukturelle Charakterisierung von Membran Biomoleküle durch NMR-Spektroskopie verbreitet. 6 , 7 jüngste Bemühungen sollen jedoch das Feld der Anwendungsmöglichkeiten zu erweitern. 5 , 8 , 9 das am meisten untersuchte Bicelle System besteht aus einer Mischung von 1,2-Dimyristoyl -sn- Glycero-3-Phosphocholin (DMPC), die planar Bestandteil der Versammlung und 1,2-Dihexanoyl -sn- Glycero-3-Phosphocholin (DHCP) Phospholipid über den Rand. 1 , 2 , 3 die molekulare Geometrie der Phospholipide, die Komposition der Bilayer bestimmen die Architektur der selbstgebaute Polymolecular Struktur. 4 , 5 Ersatz DHCP mit DMPE-DTPA erzeugt sehr magnetisch reagieren und einstellbaren Bicelle Systeme. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Bicelles assoziieren mit vielen mehr paramagnetischen Lanthanoid-Ionen (Ln3 +) auf der Bilayer Oberfläche, wodurch eine verbesserte magnetische Antwort. 10 im übrigen ersetzt die wasserlösliche DHCP-Moleküle mit DMPE-DTPA/Ln3 + ermöglicht die Bildung von Verdünnung-resistente Bicelles. 11

Die magnetische Alignability planare Polymolecular Baugruppen wird durch ihre insgesamt magnetische Energie diktiert,

Equation 1(1)

wo B die magnetische Feldstärke ist, Equation 2 die magnetische Konstante, n die Aggregation Anzahl und Equation 3 der molekularen diamagnetische Suszeptibilität Anisotropie der Lipide der Bilayer zu komponieren. Daher ist die Reaktion der DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + Bicelles auf magnetische Felder durch ihre Größe (aggregierte Zahl n) und der molekularen diamagnetische Suszeptibilität Anisotropie Δχ zugeschnitten. Letzteres wird leicht durch Änderung der Art der Chelat Ln3 +erreicht. 12 , 13 , 14 , 15 Introducing Cholesterin (Chol-OH) oder anderen Steroid Derivate in der Bilayer bietet die Möglichkeit des Tunings die aggregierte Anzahl n und der magnetischen Suszeptibilität Δχ der Baugruppen. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 für einen gegebenen Lipidzusammensetzung enthalten größere Baugruppen mehr Lipide in der Lage, einen Beitrag zur E-Mag (größer aggregierte Zahl n), was zu mehr Einlaufkästen Arten. Die Größe der DMPC/DHCP Bicelles ist z. B. konventionell durch Optimierung der kompositorischen Lipidkonzentration Verhältnis oder insgesamt gesteuert. 20 , 21 , 22 auch wenn dies in DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + Bicelles möglich ist, ihre Thermo-Reversible Umwandlung von Bicelle zu Bläschen auf Heizung Angebote Schneiderei Optionen hinzugefügt. Mechanische bedeutet wie Extrusion durch Membranfilter ermöglicht die Gestaltung der Vesikel. Die magnetisch anreihbar Bicelles werden beim Abkühlen auf 5 ° C regeneriert und ihre Dimensionen sind aus der Vesikel-Vorstufen diktiert. 11 Herein, wir konzentrieren uns auf das Potenzial der mechanischen Fertigung Verfahren mit DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) als Bezugssysteme. Der Prozess funktioniert analog bei der Arbeit mit anderen Ln3 + als Tm3 +. Die breite Palette von Möglichkeiten, die diese Techniken sind in Abbildung 1 hervorgehoben und an anderer Stelle ausführlich erläutert. 23

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht über die möglichen Herstellung Verfahren. Die studierten magnetisch Einlaufkästen Ln3 + Komplexbildner Polymolecular Baugruppen bestehen aus entweder DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5). Die trockenen Lipid-Film wird mit einem 50 mM-Phosphat-Puffer auf einen pH-Wert von 7,4 hydratisiert und die gesamten Lipidkonzentration beträgt 15 mM. Eine effektive Hydratation der Lipid-Film erfordert entweder Einfrieren Auftauen Zyklen (FT) oder Heizen und kühlen Zyklen (H & C). H & C Zyklen sind notwendig, Proben nach dem letzten Einfrieren Auftauen Schritt regenerieren oder regenerieren Proben über einen längeren Zeitraum hinweg eingefroren aufbewahrt, wenn sie ohne weitere Extrusion verwendet werden sollen. Diese Schritte werden von Isabettini Et al.ausgiebig diskutiert. 23 maximal anreihbar Polymolecular Baugruppen werden erreicht, liefern verschiedene Montage-Architekturen basierend auf der Lipidzusammensetzung. Die Bicelle Größe und magnetische Alignability ist abstimmbaren durch Extrusion (Ext) durch Nanopore Membranfilter. Dargestellten Ausrichtung Faktoren Af wurden berechnet aus 2D kleiner Winkel Neutron (SANS) Streubildern einer DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Probe extrudiert über 800, 400, 200 oder 100 nm Poren. SANS Messungen sind ergänzende Mittel zur Quantifizierung der Bicelle Ausrichtung, die im Detail hier nicht abgedeckt werden. 11 , 16 die A-f reicht von-1 (parallele Neutronenstreuung oder senkrechte Ausrichtung des Bicelles in Bezug auf die Richtung des Magnetfeldes) bis 0 für isotrope Lichtstreuung.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Die Struktur des Bicelles wurde durch eine Vielzahl von Charakterisierung Techniken ausgiebig untersucht. 13 die Ausrichtung des Bicelles, einem Magnetfeld ausgesetzt wurde quantifiziert, entweder mithilfe NMR-Spektroskopie oder kleinen Winkel Neutron Streuexperimente (SANS). 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 sind jedoch die Verschiebung und Verbreiterung der NMR Spitzen Auftritt im Beisein von Ln3 + gravierende Einschränkungen der Methode. 15 , 26 , 27 , 28 obwohl SANS Experimente nicht leiden diese Einschränkung, alternative und mehr zugängliche Techniken sind wünschenswert für routinemäßige Quantifizierung von magnetisch induzierte Ausrichtung von Baugruppen in Lösung. Doppelbrechung Messungen sind eine vergleichsweise einfache und praktikable Alternative. Analog zeigen NMR-Experimente, Doppelbrechung Messungen wertvolle Informationen über Lipid Umgestaltungen und Lipid-Phasen in der Bilayer auftreten. Darüber hinaus sind geometrische Transformationen, die in der Polymolecular-Versammlung mit wechselnden Umweltbedingungen wie Temperatur überwacht. 11 , 12 , 13 , 16 magnetisch induzierte Doppelbrechung Δn′ wurde verwendet, um verschiedene Arten von Phospholipid-Systeme zu studieren. 13 , 29 , 30 Doppelbrechung Messungen auf der Grundlage der Phasenmodulation Technik in einem Magnetfeld ist eine praktikable Methode, um Ausrichtung des Bicelles zu erkennen. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 die Möglichkeit der Untersuchung von Bicelles mit Doppelbrechung in hohen Magnetfeldern bis zu 35 T zeigte auch von M. Liebi Et al. 13

Wenn polarisiertes Licht ein anisotropen Materials tritt, wird es in einer ordentlichen und außerordentlichen Welle gebrochen. 11 die zwei Wellen haben unterschiedliche Geschwindigkeiten und werden durch eine Verzögerung δ in Phase verschoben. Der Grad der Behinderung δ gemessen und in eine Doppelbrechung Signal umgewandelt Equation 5 , den Grad der Anisotropie in der materiellen mit zu quantifizieren

Equation 6(2)

wo λ ist die Wellenlänge des Lasers und d ist die Dicke der Probe. Phospholipide sind optisch anisotropen und ihre optische Achse deckt sich mit ihren langen molekularen Achsen parallel zu den Kohlenwasserstoff-Schwänzen. 11 , 12 keine Retardierung wird gemessen, wenn die Phospholipide in Lösung nach dem Zufallsprinzip orientiert sind. Retardierung wird gemessen, wenn Phospholipide parallel zueinander ausgerichtet sind. Der magnetisch induzierte Doppelbrechung Equation 5 haben einen positiven oder negativen Vorzeichen abhängig von der Orientierung der Moleküle in das magnetische Feld; siehe Abbildung 2. Phospholipide, die parallel zur x-Achse ausgerichtet führt zu einer negativen Equation 5 , während die ausgerichteten entlang der z-Achse zur Folge haben einer positives Equation 5 . Keine Doppelbrechung wird beobachtet, wenn die optische Achse mit der Richtung der Lichtausbreitung fällt, wie die Phospholipid Parallel zur y-Achse ausgerichtet.

Figure 2
Abbildung 2: Ausrichtung der Phospholipide und der entsprechenden Zeichen der magnetisch induzierte Doppelbrechung Equation 12 . Das Zeichen des gemessenen Equation 12 richtet sich nach der Ausrichtung des Phospholipid im Magnetfeld. Gestrichelte Linien zeigen die optische Achse des Moleküls. Das Licht ist um 45° polarisiert und breitet sich in y-Richtung. Das Magnetfeld B befindet sich in Z-Richtung. Diese Zahl wurde von M. Liebi geändert. 11 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Im Falle einer isotropen kolloidale Suspension von Bicelles wird die Ausrichtung durch die Anordnung der Phospholipide in der Bilayer induzierte Nullung Retardierung δ verloren gehen. Die Bicelles müssen auch ausrichten, um die optisch aktive Phospholipide in ihre Bilayer, verursacht eine Verzögerung δ von polarisiertem Licht orientieren. Infolgedessen ist die Doppelbrechung sensible Werkzeug, das magnetische Alignability Polymolecular Baugruppen zu quantifizieren. Bicelles ausgerichtet senkrecht zum Magnetfeld ergibt eine Positive Equation 5 , während die parallel ausgerichtet eine Negative erbringt Equation 5 . Das Schild hängt von der Ausrichtung des Setups und kann mit einer Referenzprobe überprüft werden.

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Protocol

1. Herstellung Verfahren für DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) und DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Polymolecular Baugruppen

  1. Erste Vorbereitungen
    1. Waschen der Gläser durch Spülen einmal mit Ethanol stabilisiert Chloroform (> 99 % Chloroform) und mit Druckluft trocknen.
    2. 2 unterschiedliche 10 mg/mL Stammlösungen der DMPC und DMPE-DTPA in Ethanol-stabilisiertes Chloroform zu produzieren (> 99 % Chloroform), eine 10 mM-Stammlösung von Chol-OH in Ethanol-stabilisiertes Chloroform (> 99 % Chloroform) und einer 10 mM Vorratslösung TmCl3 in Methanol.
    3. Bereiten Sie ein 50 mM Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4 durch Mischen 0,121 g Natrium Dihydrogen Phosphat Dihydrat und 0,599 g wasserfreies di-Natrium Wasserstoff Phosphat in 100 mL Reinstwasser H2O.
  2. Vorbereitung der trockenen Lipid-film
    1. Wiegen Sie die benötigten Mengen an amphiphilen (DMPC, DMPE-DTPA und optional Chol-OH) und Ln3 + Stammlösungen in separaten 3 mL Glas Snap-Tassen mit einer Spritze 2,5 mL Glas.
      1. Für ein 3 mL Probenvolumen von DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1, insgesamt Lipidkonzentration 15 mm), in 3,6435 g der DMPC Vorratslösung, 1,4731 g DMPE-DTPA-Stammlösung und 0,7126 g der Vorratslösung TmCl3 wiegen.
      2. Für ein 3 mL Probenvolumen von DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5, total Lipidkonzentration 15 mm) in 2,9148 g der Vorratslösung DMPC, 1,4731 g DMPE-DTPA-Stammlösung, 1,0749 g der Chol-OH-Stammlösung und 0,7126 g wiegen die TmCl3 -Stammlösung.
        Achtung: Chloroform und Methanol sind giftig und flüchtige bei Raumtemperatur. Arbeiten unter einer Abzugshaube und umgehend mit der Massenmessungen fortfahren.
    2. Übertragen Sie die Inhalte des Snap-Cups bis 25 mL Runde untere Kolben. Spülen Sie jede Snap-Tasse in die Rundboden-Flasche mit ca. 2,5 mL des entsprechenden Lösungsmittels.
    3. Entfernen Sie das Lösungsmittel im Vakuum in einem Drehverdampfer bei 40 ° C. Festlegen der Ausgangsdruck, 30 000 Pa bis der Großteil der Lösungsmittel entfernt. Reduzieren Sie den Druck bis 100 Pa und trocknen die Probe unter Drehung für ein Minimum von 2 h. erhalten einen einheitliche trocken Lipid-Film auf die Glaswände des Kolbens.
    4. Legen Sie die trockenen Lipid-Film für 1 Minute unter einen stetigen Strom von Argon zu vermeiden Lipidoxidation in Luft und speichern die Probe in der Tiefkühltruhe vor Rehydratation.
  3. Hydratation der trockenen Lipid-film
    1. Fügen Sie 3 mL Phosphatpuffer in den Rundboden-Kolben, eine total Lipidkonzentration von 15 mM zu erreichen.
    2. Führen Sie ein Einfrieren Auftauen (FT) Zyklus durch Eintauchen des Kolbens unter Drehung in flüssigem Stickstoff bis es gefroren ist gründlich (der Flüssigstickstoff hält Sieden), dann Hitze zurück bis zu 60 ° C indem man die Probe für 5 min in ein Wasserbad, wirbeln die Küvette kontinuierlich zu den Schmelzprozess zu unterstützen. Gelten 30 s vortexen vor jeder Gefrierzyklus bei die Probe flüssig ist zugunsten die Hydratation der Lipid-Film.
      Hinweis: Keine Lipid-Film sollte an den Kolben Wänden sichtbar sein, nachdem die zweite Einfrieren Auftauen Zyklus.
    3. Wiederholen Sie 1.3.2 zu insgesamt fünf Mal. Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe zu vermeiden unnötige Verdunstung des Phosphatpuffer, wenn die Probe heiß ist. Das Protokoll kann angehalten werden, wenn die Probe gefroren ist.
    4. Fahren Sie mit zwei Heizen und kühlen (H & C) Zyklen zu stabilisieren die Probe aus der letzten eisigen Schritt oder halten bis zu zwei Monate lang gefroren. Erhitzen Sie die Probe auf 40 oder 60 ° C für DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5), bzw. vor Abkühlung auf 5 ° C 1 ° C/Min., pflegen die Probe 5 min bei der maximalen und minimalen Temperaturen des Zyklus.
    5. Nun, entweder bestimmen die Doppelbrechung Signal der Probe in einem äußeren Magnetfeld (Schritt 2) oder weitere Extrudieren die Probe die Bicelle Dimensionen und magnetische Alignability (Schritt 1.4) anpassen.
      Hinweis: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Proben sind hauptsächlich bestehend aus Bicelles mit einer mittleren hydrodynamischen Durchmesser DH 70 nm eine Anzahlverteilung ergab gewonnenen dynamische Lichtstreuung (DLS) Messungen bei 5 ° C. Diese Proben enthalten auch größere Polymolecular Baugruppen mit einer mittleren DH 500 nm eine Intensitätsverteilung ergab. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Proben sind höchst Polydisperse mit typischen Intensitätsverteilungen enthüllt eine mittlere DH 700 nm, während die Anzahl Verteilungen eine Bevölkerung zeigen von kleineren dominiert Bicelles in der Größenordnung von 200 nm. Weitere detaillierte Größenverteilung und Cryo Transmission Electron Microscopy Bilder dieser Proben wurden von Isabettini Et Al. berichtet 23
  4. Extrusion von Polymolecular Baugruppen.
    1. Montieren Sie den Extruder, wie in Abbildung 3dargestellt. Verwenden Sie Handschuhe und Pinzette mit Kieselsäure Rohre für Handhabung zu schützen. Befeuchten Sie das Filterpapier (5) mit ein paar Tropfen des Puffers, um eine optimale Platzierung der Membranfilter (6) zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass das Papier keine Falten hat, nach dem Platzieren der o-Ring (7) an der Spitze.
      Hinweis: Im Extrusionsverfahren wurde getestet auf Membranfilter (6) mit einem Porendurchmesser von 800, 400, 200 und 100 nm; siehe Abbildung 7.
    2. Legen Sie das Wasserbad auf 40 ° C für DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Proben oder 60 ° C für DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Proben um die Bildung von extrudierbaren Vesikeln zu garantieren.
    3. Verbinden Sie den Extruder mit einer unter Druck stehenden Stickstoff-Flasche mit einem Hochdruck-PVC-Rohr (> 4 MPa) mit Serto-Adapter ausgestattet und extrudieren Sie das flüssige Material durch die Membran. 1 MPa Druck ist in der Regel erforderlich für Extrusion durch Membranfilter (6) mit einem Porendurchmesser von 200 nm und höher. 1,5 bis 2,5 MPa sind erforderlich für die kleineren Membranfilter (6) mit einem Porendurchmesser von 100 nm.
      Hinweis: Ändern die Membranfilter, wenn ungewöhnlich hohe Drücke (> 2,5 MPa) sind erforderlich, um die Probe Extrudieren (Dies ist das erste Zeichen einer Verstopfung).
    4. Öffnen Sie die Abdeckung (10) und legen Sie die Probe mit einer 2 mL-Glas-Pipette. Dann schließen Sie die Abdeckung (10) und öffnen Sie das Druckventil (12) halten Sie das Probenröhrchen Outlet (2). Schließen Sie das Druckventil (12) nach der Extrusion-Zyklus abgeschlossen ist, entlüften und weiter mit dem nächsten Zyklus.
      Hinweis: Lassen Sie die Probe nicht im Kontakt zu lange mit dem heißen doppelwandigen Behälter (8), übermäßige Probenverlust durch Verdunstung zu vermeiden.
30-60 s ist genug Zeit für eine 3 mL Probe im Extruder equilibrate vor dem Öffnen des Druckventil (12).
  • Fahren Sie mit 10 Extrusion Zyklen für einen bestimmten Membran Pore Dimension wie in Abbildung 3dargestellt. Die meisten Bicelle Systeme werden extrudiert 10mal durch Membranen mit einem Porendurchmesser von 200 und einem anderen 10mal durch Membranen mit einem Porendurchmesser von 100 nm, Probe Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
  • Jetzt bestimmen Sie die Doppelbrechung Signal der Probe in einem äußeren Magnetfeld (Schritt 2).
  • Figure 3
    Abbildung 3: Labor-Extruder für Bicelle und telson Vorbereitungen verwendet. Der Extruder setzt sich aus den unteren bis: Mount (1), (2) Probe Raum mit Kunststoff Auslaufrohr 2,4 mm (Innendurchmesser) und o-Ring (3) und (4) große und kleine stabilisierende Mesh (5) Filterpapier, (6) Membranfilter, (7) o-Ring (8) doppelwandigen Behälter sammeln (9. ) top-Cover mit Einlauf und Druck Verbindung, (10) Abdeckung, (11) Schmetterling Schrauben (12) Druckventil. Eine Skizze des montierten Extruders wird von der rechten Seite angezeigt. Stickstoff (N2) erfolgt über einen Druckbehälter und doppelwandige Behälter (9) mit einem Wasserbad zur Temperaturregelung verbunden ist. Die Probe wird 10 Extrusion Zyklen für jede gegebene Membran Filter Porendurchmesser (Beispielpfad in blau dargestellt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    (2) Doppelbrechung Messungen der DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) und DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Polymolecular Baugruppen.

    1. Bauen Sie und verbinden Sie die Doppelbrechung Setup wie in Abbildung 4 dargestellt und versorgen Sie die entsprechenden elektronischen Elemente mit Strom. Stellen Sie nicht die PEM, die Probe und den zweiten Polarisator in der Laser-Pfad in diesem Stadium. Zu vermeiden, erkennen von zurückgestreute Laserlicht durch reflektierende Oberflächen, zum Beispiel Aluminium Spiegelhalter mit schwarzem Papier abdecken.
    2. Passen Sie die Spiegel um die Laserstärke am Detektor, vertreten durch die Intensität des Gleichstroms zu maximieren Equation 7 aus dem Tiefpassfilter in Abbildung 4 bgewonnen.
      Achtung: Tragen Sie geeigneten Augenschutz, wenn die Spiegel einstellen und mit einem Laser-Sicherheit-Trainer zu konsultieren Sie, wenn Laser zum ersten Mal bearbeiten.
    3. Biegen Sie die erste gekreuzten linearen Polarisator (gepflegt senkrecht zu den einfallenden Laserstrahls) zur Maximierung der Equation 7 .

    Figure 4
    Abbildung 4: Schematische Darstellung der Doppelbrechung Setup und Anschlüsse für die optischen Signale. A) einen supraleitenden Elektromagneten liefert ein 5,5 T Magnetfeld. Das Licht von einem Diodenlaser bei 635 nm ist von zwei gekreuzten Polarisatoren polarisiert. Spannungsoptische Modulator PEM-90 arbeitet mit 50 KHz mit einer Amplitude0 von 2,405 rad und platziert zwischen zwei Polarisatoren. Die Probe liegt in den Magneten zwischen PEM und den zweiten Polarisator. Non-polarisierende Spiegel lenkt das Licht durch die verschiedenen Elemente und schließlich von einem Photodetektor erfasst wird. Die erste und zweite harmonische Equation 10 und Equation 11 des AC-Signals werden überwacht, erlaubt die Berechnung der Doppelbrechung Signal geben Informationen über die magnetische Alignability des Ln3 + chelatisierenden Polymolecular Baugruppen. Die Probe-Küvette ist mit einem externen Wasserbad zur Temperaturregelung (blau) verbunden. Die Temperatur der Probe wird mit einem Temperaturfühler (rot) überwacht. B) das Signal von der Photo-Detektor wird eine zweite Bestellung Sallen-Key Tiefpass-Filter (24 V AC Stromversorgung) mit einer Trennfrequenz von 360 Hz durch ein ±12 VDC Tunnelschnur Stromversorgungskabel (3) zugeführt. Der Tiefpassfilter Auszüge der Gleichanteil Equation 7 und liefert sie an die PC-Schnittstelle (4) über ein Ω Kabel BNC 50. Das Signal aus dem Photo-Detektor ist auf die zwei Lock-in Verstärker geliefert (das Extrahieren der ersten und zweiten harmonisches Equation 10 und Equation 11 ) durch ein BNC 50 Ω Kabel (1) & (2). Die harmonischen Intensitäten werden durch eine Phase-Sensitive-Erkennung erkannt. Infolgedessen wird das PEM-Signal als Referenzsignal der Lock-in-Verstärker (1f-Ausgabe von PEM in der ersten Lock-in-Verstärker und 2f-Ausgabe in der zweiten, verbunden mit BNC 50 Ω Kabel) verwendet. Die Ausgangssignale werden auf die PC-Interface-Einheit durch BNC 50 Ω Kabel geliefert. Analoge Erwerb Einheiten GFP-AI-110 und GFP-CB-1 digitalisieren das Signal, das über eine RS 232-Kabel für die Überwachung an den Computer übertragen wird. Temperaturfühler Typ K ist auch an die PC-Schnittstelle angeschlossen wo analoge Erwerb Einheiten GFP-CB-3 und GFP-TC-120 das Signal digitalisieren vor der Übertragung auf den Computer über eine RS 232-Kabel für die Überwachung. (C) Bild des schematischen Setups in B. Kernelemente vorgestellt werden identifiziert, mit entsprechenden Zahlen von 1 bis 4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    1. Ort der zweiten gekreuzten linearen Polarisator senkrecht zu den einfallenden Laserstrahls, wie in Abbildung 4Adargestellt. Minimierung der Equation 7 durch den zweiten Polarisator in einem 90°-Winkel die erste festlegen.
    2. Ort der spannungsoptische Modulator (PEM) bei 0° zwischen zwei gekreuzten lineare Polarisatoren und senkrecht zu den einfallenden Laserstrahls wie in Abbildung 4Adargestellt. Passen Sie PEM auf eine Frequenz von 50 kHz und Amplitude A0, 2,405 rad an, wie in Abbildung 5Agezeigt. Der Gleichanteil wird dadurch unabhängig von Doppelbrechung und steigert die Equation 7 .
      Hinweis: Die optische Achse des PEM kann abgestimmt werden, um ein paar Grad konstant zu halten Equation 7 in Luft vor der Messung einer Probe.
    3. Warten Sie 1 Stunde nach dem Einschalten der Laser- und elektronische Geräte, das Signal zu stabilisieren.
    Das Signal ist stabil, sobald der Auto-Ausstieg der Lock-in Verstärker konstant bleibt.
  • Legen Sie die Probe in einem temperaturgeregelten Quarz Küvette mit einer Weglänge von 10 mm und verbinden Sie es mit einer externen Wasserbad anfänglich bei 5 ° C.
  • Platzieren Sie ein 0,5 mm dicken Typ K Thermoelement (Temperaturfühler) direkt in der Probe zur Überwachung der Temperatur der Probe. Stellen Sie sicher, dass die Sonde mit dem Laserlicht nicht stört, indem man ein Weißbuch in der Laser-Pfad (nach der Küvette) und auf der Suche nach Schatten durch die Sonde verursacht.
    Hinweis: Es ist ein 2-3 ° C Unterschied zwischen der Aufnahme der Temperatur des Wasserbades und die Temperatur der Probe.
  • Platzieren Sie die Küvette in die Bohrung des Magneten, wie in Abbildung 4Adargestellt. Das Laserlicht breitet sich horizontal durch die Probe, durch nicht polarisierenden Spiegel abgelenkt und von einem Photodetektor erkannt.
    Hinweis: Der Laser richtet sich nach unten, durch die Probe und sichern Sie den gleichen Pfad um Faraday Effekte (z. B. die Drehung der Polarisationsebene des Lichtes durch das Magnetfeld verursacht, wenn hinunter abgebrochen wird, bei seiner Rückkehr in die entgegengesetzte Richtung) zu berücksichtigen.
  • Wenden Sie einen stetigen Luftstrom der komprimierten Luft bei Raumtemperatur und 10000 Pa auf die Küvette zur Vermeidung von Kondensation des Wassers auf die Zellwände, die reduzieren die Intensität des Signals und Lärm zu erhöhen. Dies ist besonders wichtig bei der Messung bei 5 ° C.
  • Erkennen der erste und zweite harmonischen Equation 10 und Equation 11 des AC-Signals mit zwei Lock-in Verstärker. Auto phase Lock-in Verstärker durch Drücken der Taste (2) in Abbildung 5 b gezeigt und die Empfindlichkeit einstellen, wie in Abbildung 5 b (1) gezeigt. Stellen Sie sicher, dass es nicht mehr als vier rote Balken auf die Verstärker wie in Abbildung 5 b (3) gezeigt, dass Signal Überlastung zu vermeiden. Notieren Sie sich die Beschäftigten Empfindlichkeit für beide Lock-in-Verstärker in das Programm Tesla_Magnet_Const_V092 , wie in Abbildung 5 (8) dargestellt. Das Programm ist als ergänzende Information zur Verfügung gestellt.
  • Rampe das Magnetfeld bis 5,5 T durch die Lieferung von Strom an den Magneten durch das Programm Tesla_Magnet_Const_V092 , wie in Abbildung 5 (5) dargestellt.
  • Erhalten der Doppelbrechung Equation 5 Gleichung 2, wo die Retardierung wird berechnet mit
    Equation 13(3)
    wo Equation 14 und Equation 15 sind Bessel Funktionen der ersten Art, mit Equation 16 und Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 plot die Retardierung im Programm Tesla_Magnet_Const_V092, wie in Abbildung 5 (4) dargestellt.
    Hinweis: Die Verzögerung vom Programm sollte nicht, die Doppelbrechung Signal zu berechnen, wenn zwei Lock-in Verstärker nicht mit der gleichen Empfindlichkeit arbeiten verwendet werden (siehe Punkt 2.12). Die protokollierten harmonischen Intensitäten Equation 10 und Equation 11 durch die Empfindlichkeit der Lock-in Verstärker zu den korrekten Abmessungen multipliziert werden müssen. Darüber hinaus muss die Doppelbrechung Signal gemessen unter einem Magnetfeld normalisiert werden durch Subtraktion der mittlere Doppelbrechung Signals erhalten bei 0 T.
  • Überwachen Sie die Probe Doppelbrechung Signal auf konstante oder Änderung der Temperatur (1 ° C/min) durch die Regulierung der Temperatur des Wasserbades verbunden, die Küvette in Abbildung 4dargestellt.
  • Melden Sie sich die experimentellen Daten durch Ausfüllen der experimentellen Beschreibung in Abbildung 5 (8), bietet einen Dateinamen (9) und drücken der Taste "START Log" (10).
  • Figure 5
    Abbildung 5: Illustrationen der Erwerbstätigen Einstellungen und Programm Screenshots. A) PEM-Einstellungen: Retardierung 2,405 rad, Wellenlänge 635 nm, Frequenz 50 Hz. White Kreise zeigen welche Einstellungen aktiviert werden (USR = benutzerdefinierte Retardierung, LOC = lokaler Betriebsart). B) Lock-in Verstärker-Einstellungen. Die Empfindlichkeit (1) muss vor jeder Messung Bedarf Schritt 2.11 gewählt werden. Es sollte nicht mehr als vier rote Balken auf dem Display (3) um eine Signal-Überlastung zu vermeiden. Eine Überlastung tritt auf, wenn die rote led (1) einschaltet, so dass eine Messung unmöglich. Drücken Sie die Taste Auto Phase (2) vor jeder Messung. C) Screenshots des Programms Tesla_Magnet_Const_V092 als ergänzende Information zur Verfügung gestellt. Das Programm ermöglicht die Kontrolle des magnetischen Feldes und Aufzeichnung der alles, was die Signalausgänge als Funktion der Zeit. Die magnetische Feldstärke und Probentemperatur sind in (1) dargestellt. Die erste und zweite harmonische Equation 10 und Equation 11 des AC-Signals durch die zwei Lock-in Verstärker gemessen werden (2) dargestellt. Die Intensität des Gleichstroms Equation 7 (3) aufgetragen ist. Die Retardierung berechnet wie in Schritt 2.13 beschrieben und dargestellt (4). Die magnetische Feldstärke ist in (5) festgelegt. Die direkte Messung der Temperatur aufgezeichnet durch das Thermoelement Typ K (6) präsentiert und die Ausgangssignale (Equation 23 und Equation 22 ) (7). Zusätzliche Probeninformationen kann in (8) wie die Beschäftigten Empfindlichkeit der Verstärker, Beispielnamen, etc. eingefügt werden. Die Daten können protokolliert und in eine txt-Datei gemäß (9) exportiert werden. Starten und stoppen der Datenerfassung mit der Taste "START Log" (10). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Representative Results

    Die Doppelbrechung Signal eines nicht-extrudierte DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Probe wurde unter 5,5 T Magnetfeld überwacht, während eine Erwärmung und Abkühlung Zyklus von 5 bis 40 ° C und zurück mit einer Rate von 1 ° C/min (Abbildung 6). Die Doppelbrechung Ergebnisse bestätigten hohen magnetischen Achsen bei 5 ° C mit einem Wert von 1,5 x 10-5, doppelt so stark wie bei den gemeldeten extrudierten Systemen. 6 , 7 , 23 die Nullstellen der Doppelbrechung Signal über die T-m der DMPC bei 24 ° C wurde durch die Bildung von nicht anreihbar Bläschen verursacht. Das Erscheinungsbild der Bewegung der ungeordneten Flüssigphase ausgelöst großen Umstellungen in den Polymolecular-Versammlungen. Diese Umstellungen sind Thermo-reversibel. Einlaufkästen Arten wurden beim Abkühlen unter Tm regeneriert und die Doppelbrechung Signal folgte dem gleichen Trend wie beim Erhitzen. Die ausgeprägte Gipfel um herum Tm markieren den Ersatz der Einlaufkästen Assemblys nicht anreihbar Vesikel. 23 die langsame Kinetik der molekularen Umlagerungen in Bezug auf die angewandte Wärme- und Kälteerzeugung Rate von 1 ° C/min erklären, warum die Gipfel waren nicht überlappen. Stattdessen begann beide Gipfel Tm der DMPC, darauf hindeutet, dass Bilayer Lipide ein gewisses Maß an Ordnung zugunsten die Bildung von Einlaufkästen Arten haben müssen.

    Figure 6
    Abbildung 6: Doppelbrechung Signal als Funktion der Temperatur für einen nicht-extrudierte DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Probe auf (rot) Heizen und kühlen (blau) 1 ° C/Min. Die Probe wurde folgendermaßen Protokoll 1, 1.3.5 vorbereitet. Die Doppelbrechung Messungen wurden durchgeführt, nach dem Protokoll-Schritt 2. Stärke des Magnetfeldes wurde bis 5,5 T hochgefahren und die Probe wurde bei 5 °, erreichen eine Doppelbrechung Signal von 1,5 x 10-5 bevor Sie mit dem Wärme- und Kältesektor Zyklus beibehalten. Die Doppelbrechung Signal stirbt bei Temperaturen über 35 ° C, wo keine Ausrichtung, wie die Probe beobachtet wurde, bestand ausschließlich aus Vesikel. Beim Abkühlen der Bicelles wurden aufbereitet und eine endgültige Doppelbrechung Signal von 7,2 x 10-6 gelang bei 5,5 T und 5 ° C. Die magnetische Feldstärke auf 0 T hochgefahren war und blieb der Probenmaterials bei 5 ° C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Eine DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Probe wurde hydratisiert, Anschluss an die Heizung und Kühlung Verfahren in Schritt 1.3.4 und anschließend 10-Mal bei 60 ° C durch Membranfilter verschiedener Porengrößen extrudiert, siehe Punkt 1.4. Bei 60 ° C versammelt die Lipid-Mischung in Vesikeln, die durch den Extrusionsvorgang geprägt sind. 16 , 35 , 36 , 37 nach Abschluss der Extrusion, die Bicelles wurden durch Abkühlen auf 5 ° C regeneriert und der hydrodynamische Durchmesser DH wurde gemessen, indem DLS. Die magnetische Alignability der Bicelles war bei 5 ° C durch computing A-f mit SANS bei 8 T und der Doppelbrechung Messsignal bei 5,5 T ausgewertet; siehe Abbildung 7. Die Doppelbrechung Signal erhielt durch Rampen Bereich bis 5,5 T und zurück auf 0 T, wie in Abbildung 7Agezeigt. Der Peak-Doppelbrechung ereignete sich um 5,5 T wo war der höchste Grad der Ausrichtung nach Gleichung 1 erwartet. Die hydrodynamische Durchmesser DH die Bicelles verringerte sich auf 220, 190, 106 und 91 nm von aufeinander folgenden Extrusionen durch Membranen mit Porengrößen von 800, 400, 200 und 100 nm bzw.. Die entsprechende Abnahme der magnetischen Ausrichtung wurde bestätigt durch die abnehmende Doppelbrechung Signal und der Rückgang der absoluten einf Null in Abbildung 7 bnähert. Die Ergebnisse bestätigten die Möglichkeit der Steuerung von Bicelle Größe und magnetische Ausrichtung durch Anpassung der Vesikel durch Extrusion bei 60 ° C und Abkühlung wieder auf 5 ° C.

    Figure 7
    Abbildung 7: Magnetische Ausrichtung einer DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Probe durch Membranfilter der Pore Abmessungen extrudiert. (A) Doppelbrechung Signal Δn′ als Funktion der magnetischen Feldstärke B wenn oben und unten für die Probe durch 800 nm Poren extrudiert Rampen. Der Peak-Doppelbrechung wurde auf 5,5 T gemäß Gleichung 1 erreicht. Dieser maximale Doppelbrechung Wert wird berichtet B). Derselben Probe wurde durch 400 nm Poren extrudiert. Die magnetische Ausrichtung wurde ausgewertet, indem beide Doppelbrechung Messungen (schwarze Quadrate) bei 5,5 T (analog, was für den vorherigen Schritt der Extrusion in A getan wurde) und Berechnung der Ausrichtung Faktoren einf (rote Kreise) bei 8 T, in Abhängigkeit von aufgetragen der hydrodynamische Durchmesser DH erzielten DLS. Die magnetische Ausrichtung wurde analog an derselben Probe durch 200 nm Poren und ein letztes Mal nach dem Extrudieren durch 100 nm Poren extrudiert bewertet. Alle Messungen wurden bei 5 ° C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Discussion

    Eine detaillierte Darstellung der wie Doppelbrechung Messungen in Kombination mit SANS verwendet wurden Experimente um zu bewerten Methoden zur Erzeugung von sehr magnetisch reagieren Ln3 + chelatisierenden Phospholipide Baugruppen ist in Isabettini Et al. 23 die vorgeschlagene Herstellung Protokolle gelten auch für Baugruppen bestehend aus der längeren DPPC und BPUK-DTPA Phospholipide oder für solche, die chemisch veränderter Steroid Derivate in ihren Bilayer. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 die einzige Voraussetzung ist, dass die Stichprobe ausreichend hohe Temperaturen erhitzt wird Schritte 1.3.2, 1.3.3 und 1.3.4 1.4.2. Die Temperaturen dürfen die Bilayer Lipide eine ungeordnete Flüssigphase, Grat optimale Hydratation der trockenen Lipid Film oder Probe Regeneration eingeben. DPPC/BPUK-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Baugruppen, müssen zum Beispiel über die Übergangstemperatur Phase des DPPC bei 42 ° C erhitzt werden, während die analoge DMPC basierendes System über 24 ° c erhitzt werden muss Eine ausreichend hohe Temperatur ist auch notwendig, die Bildung von extrudierbaren Vesikeln, die auftritt, wenn die Lipid-Bilayer in einem ungeordneten Zustand in Schritt 1.4 ist zu gewährleisten. Die Einfrieren Auftauen Zyklen im Schritt 1.3.2 können vollständig durch H ersetzt & C Zyklen. 23 aber die Probe braucht mehr Zeit, um voll-Lipid-Film mit diesem Verfahren Hydrat und muss verwirbelt 20 min bei 5 ° C und 2 min bei 60 ° C. Zusätzliche H & C Zyklen werden Elemente des trockenen Lipid-Film auf die Glaswände des Kolbens noch eingehalten.

    Die Tm3 + Komplexbildner Bicelles präsentiert in diesem Protokoll richten Sie senkrecht zur Magnetfeld-Richtung. Diese Ausrichtung Richtung stammt aus der großen positiven magnetischen Suszeptibilität von Tm3 +. 11 , 14 andere Lanthanoid-Ionen wie Dy3 + und Yb3 + können auch angewendet werden. 11 , 13 , 19 verschiedene Magnetische Anisotropie des Ln3 + bietet zusätzliche Möglichkeiten zur Anpassung der magnetischen Ausrichtung von der Bicelles. Zum Beispiel erhöht Dy3 + per se negative magnetische Suszeptibilität von der Bilayer Phospholipide, wodurch ein hohes Maß an Ausrichtung der Bicelles parallel zur Richtung magnetischen Feldes. 13 diese Änderung in Achsrichtung wird erkannt durch eine Änderung im Zeichen der Doppelbrechung Signal und die Ausrichtung Faktoren berechnet von anisotropen 2D SANS Mustern. Es ist wichtig zu beachten, dass die magnetische Suszeptibilität nicht ausschließlich durch die chemische Natur des Ln3 + , sondern durch die Chelat Geometrie des Ln3 +bestimmt ist-Phospholipid-Komplex. 19 , 38 der magnetischen Suszeptibilität kann entwickelt werden, durch die Synthese von verschiedenen Ln3 + chelatisierenden Phospholipid-Headgroups, die magnetische Antwort die resultierenden Assemblys zu definieren. 38

    Jede Probe unterscheidet sich optisch abhängig von der Art der konstituierenden Lipide beschäftigt. Überwachung der Probe Trübung als Funktion der Temperatur ist eine ergänzende Methode, Temperatur-induzierten Strukturwandel in den Versammlungen zu bewerten. Obwohl diese Messungen in der Regel in Ermangelung eines Magnetfeldes in einem Spektrophotometer durchgeführt werden, überwachen die Intensität des Lasers Gleichstrom Equation 7 mit dem hier vorgeschlagenen Setup bietet die gleiche Informationen in Anwesenheit eines Magnetfeldes Feld. 11 , 16 der DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Proben sind in der Regel weniger trübe als ihre Chol-OH enthaltenden DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Kollegen bei 5 ° C. Proben, die ähnlich wie Wasser bei 5 ° C sind in der Regel nicht anreihbar in einem magnetischen Feld. Bei Raumtemperatur, beide Proben Blick transparent weil der DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Proben sind in einer Übergangsphase zwischen Bicelles und Bläschen und großen konzentrischen Löcher erscheinen im DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Bicelles. 11 , 16 , 23 der Übergangszustand des Bicelles zu Vesikeln in DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) geht auch einher mit einem Anstieg der Viskosität der Probe bei Raumtemperatur. Diese temperaturabhängige Veränderung der Trübung macht es schwierig, die richtige Empfindlichkeit im Schritt 2.11 Wahl. Wenn die Empfindlichkeit auf eine trübe Probe bei 5 ° C zu hoch eingestellt ist, kann die transparentere Natur der Probe beim Erhitzen eine Überlastung der Verstärker führen. Darüber hinaus sehr trübe Proben erhöht erheblich den Lärm Signalverhältnis und möglicherweise nicht geeignet für Doppelbrechung Messungen. Das Licht des Lasers muss die Probe durchlaufen, um erkannt zu werden können.

    Non-extrudierte Proben sind immer mehr trübe und haben die Tendenz zu Aggregat auf kurzfristige Lagerung im Kühlschrank. Dennoch die magnetisch reagieren Proben sind leicht mit einem H regeneriert & C-Zyklus. Non-extrudierte Proben können auch gespeichert werden, im gefrorenen Zustand und leicht regeneriert durch H & C Zyklen. Extrudierte Proben sind im Kühlschrank aufbewahrt und innerhalb einer Woche nach der Probenvorbereitung häufig gemessen. Keine Studien berichten über die längere Lagerung von extrudierten Arten entweder eine Flüssigkeit oder in gefrorenem Zustand. Daher kann die Größenverteilung der Assemblys erhalten von Extrusion über längerer Lagerung garantiert werden.

    Analog gibt es für jedes Bicelle System diese magnetisch Einlaufkästen planaren Baugruppen nur in einem definierten Bereich der Lipidzusammensetzung und Konzentration. Änderung der Lipid-Verhältnisse führt verschiedene Montage-Architekturen, einschließlich der Bildung von Micellen, Bändern und Vesikeln. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 die Phosphat-Puffer-Konzentration und pH-Wert im Schritt 1.1.3 spielt eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung der Bicelles und ihre magnetische Resonanz. Der Puffer definiert die physikalisch-chemischen Wechselwirkungen für die hydrophilen Umgebung Polymolecular Baugruppen. Geringere Puffer Konzentrationen führen verschiedene Montage-Architekturen, während höhere Konzentrationen Probe Aggregation und Niederschlag durch ein Screening der anfallenden Gebühren verursachen.Unter sauren Bedingungen mit pH-Werten zwischen 3 und 4 sind die Carbonsäure Moieties dient als Liganden in der DMPE-DTPA/Ln3 + Komplex protonierten. Dies führt zur Zerstörung der magnetisch reagieren Polymolecular Baugruppen, durch Aggregation und Niederschlag in der Probe beobachtet. Die magnetisch reagieren Ln3 + Polymolecular Baugruppen haben einen angemessenen Widerstand gegenüber einfacheren pH-Werte. Jedoch DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Bicelles erwiesen sich in Mizellen bei pH-Werten von 12,9 aufteilen. 11 die Proben darf niemals Leitungswasser oder andere Salze ausgesetzt werden. Andere Ionen wird stören die Ln3 + chelatisierenden Prozess oder Aggregation von Baugruppen durch Ladung Screening führen. Für SANS Messungen, die Puffer vorbereitet wie in Schritt 1.1.3 D2O anstelle von hochreinen H2O. Hinweis beschrieben, dass der Zählerstand pH 7.0 (entsprechend einem pD-Wert von 7,4) werden.

    Die strukturelle Transformationen auftreten in Polymolecular Baugruppen unterliegen einer Heizung und Kühlung Zyklus sind Thermo-reversibel. Daher sollte das gleiche wie das letzte Doppelbrechung Signal bei 5 ° C vor dem Temperatur-Zyklus. 11 , 16 wenn die Doppelbrechung Signal nach dem Zyklus höher ist, wurde die Probe nicht richtig im Schritt 1.3.4 regeneriert. Dies geschieht häufig in Proben für einen längeren Zeitraum gespeichert. Eine niedrigere Doppelbrechung Signal nach der Temperatur Zyklus, wie in Abbildung 6 zeigt ein Problem in der Versuchsanordnung. Am häufigsten wurde der Laser Lichtweg durch Streuung zurück oder ein anderes Objekt gestört. Besonders problematisch ist dies mit den Temperaturfühler direkt in der Probe eingefügt (siehe Schritt 2,8) sollten die darüber nicht mit den direkten Pfad des Laserlichts Eingreifen platziert werden. Ein gestörter Lichtweg verursacht einen Rückgang der Equation 7 , einem lauten Signal und/oder abnorme Gipfeln in der Doppelbrechung Temperaturkurven. Zum Beispiel wurde der Gipfel auf der Heizung bei ca. 35 ° C in Abbildung 6 durch Expansion der Wasserkühlung Rohre in den direkten Weg des Laserlichts verursacht. Die Doppelbrechung Signal möglicherweise nicht vertrauenswürdigen von diesem Punkt an. Obwohl die allgemeine Form der abkühlenden Kurve normal war, wurde das niedrigere Doppelbrechung Signal erhalten bei 5 ° C durch die Störungen verursacht.

    Die Doppelbrechung Werte aus nach diesem Protokoll sind nicht absolut und werden verwendet, um Proben untereinander zu vergleichen. Für den Vergleich mit Literatur Werte ist eine Kalibrierung mit einem Referenzsystem erforderlich. Z. B. die Zeichen für die gemessene Verzögerung hängt von der Ausrichtung des Aufbaus und können mit Toluol, hat eine Cotton-Mouton-konstante von 3,27 × 10−9 T−2überprüft werden. 39 , 40

    Die Doppelbrechung Signal aus Veränderungen in der Probe magnetische Ausrichtung kann aus dem Signal verursacht durch molekulare Umlagerungen in der Bilayer entkoppelt werden. Ausrichtung Faktoren berechnet aus anisotropen 2D SANS Muster unter ein magnetisches Feld sind nur durch die Masse Ausrichtung der Polymolecular Baugruppen beeinflusst. Die beiden Methoden ergänzen und Entkopplung der Beiträge zur Doppelbrechung Signal zu ermöglichen. Das vorgeschlagene Doppelbrechung Setup konnte durch die Spaltung des Laserstrahls ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von Proben mit und ohne Belastung durch das äußere Magnetfeld perfektioniert werden. Die Doppelbrechung Ergebnisse für die Probe im Magnetfeld könnte durch das Signal für die Probe bei 0 T, effektiv für den Hintergrund Buchhaltung erhalten normalisiert werden.

    Doppelbrechung Messungen sind nicht beschränkt auf die magnetische Ausrichtung des Bicelles zu quantifizieren. Zahlreiche weiche Materialien erzeugen eine Doppelbrechung Signal durch Bestellung von ihrer internen Struktur. Die vorgeschlagene Einrichtung ermöglicht es, um die Doppelbrechung solcher Materialien als Funktion der Temperatur mit oder ohne ein äußeres Magnetfeld zu überwachen. Anthracen Organogel Fasern, wurmartigen Micellen unter Durchfluss, nanokristalliner Cellulose und Amyloid-Fe3O4 Fibrillen sind ein paar Beispiele dessen Doppelbrechung Verhalten mit dem vorgeschlagenen Setup erfolgreich bewertet wurde. 29 , 30 , 32 , 41

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    Disclosures

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Acknowledgments

    Die Autoren erkennen des Schweizer Nationalfonds zur Finanzierung der SMhardBi (Projekt Nr. 200021_150088/1). Die SANS-Experimente wurden an der Schweizer Spallation Neutronenquelle SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Schweiz durchgeführt. Die Autoren danken Dr. Joachim Kohlbrecher für seine Führung mit den SANS-Experimenten. Die Doppelbrechung Messaufbau unter hohen Magnetfeldern inspiriert aus der bestehenden Einrichtung im Hochfeld-magnetische Labor HFML, Nijmegen, Niederlande. Wir danken Jan Corsano, Bruno Pfister für seine Hilfe bei der Entwicklung der Elektronik der Doppelbrechung Setup und Daniel Kiechl für den Bau der Frameworks erlaubt feine und einfache Ausrichtung des Lasers und Dr. Bernhard Koller für laufende technische Unterstützung.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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