İmalat işlemleri ve Birefringence ölçümler manyetik olarak duyarlı Lanthanide iyon şelat Fosfolipid Derlemeler tasarlama

Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

İmalat işlemleri polymolecular derlemeler şelat manyetik olarak son derece duyarlı lanthanide iyon için sunulmaktadır. Manyetik yanıt ekstrüzyon nanopore membranlar yoluyla tarafından hazırlanmıştır derleme boyutu tarafından belirlenir. Derlemeler manyetik alignability ve yapısal değişiklikler sıcaklık kaynaklı birefringence ölçümleri, Nükleer manyetik rezonans ve küçük açı nötron saçılma için ücretsiz bir teknik tarafından izlenir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bicelles lipid karışımları çok sayıda oluşmuş akort disk benzeri polymolecular derlemeler vardır. Uygulamalar nanoteknolojik gelişmeler optik aktif ve manyetik olarak değiştirilebilir jelleri oluşumu da dahil olmak üzere membran proteini yapısal çalışmalar Nükleer manyetik rezonans (NMR) arasında değişir. Bu tür teknolojiler derleme boyutu, manyetik yanıt ve termal direnci yüksek kontrol gerektirir. Karışımları 1,2-dimyristoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DMPC) ve onun lanthanide iyon Fosfolipid eşlenik, 1,2 şelat (Ln3 +)-dimyristoyl -sn- glycero-3-fosfo-etanolamin-diethylene triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), manyetik olarak son derece duyarlı derlemeler gibi DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + içine monte (molar oranı 4:1:1) bicelles. Kolesterol (CHOI-OH) ve başka bir küme benzersiz FİZİKO-kimyasal özellikleri sunan birleştirmeler bilayer sonuçlarında steroid türevleri giriş. Verilen lipid kompozisyon için manyetik alignability bicelle boyutuyla orantılıdır. Ln3 + complexation büyüklüğü ve hizalama yönü açısından görülmemiş manyetik yanıt sonuçlanır. Disk benzeri yapıları termo-tersinir çöküşü içine veziküller Isıtma üzerine derlemeler boyutları ekstrüzyon tarafından tanımlanmış gözenek boyutları ile membran filtreleri ile terzilik sağlar. Manyetik olarak alignable bicelles 5 ° C, vezikül öncüleri tarafından tanımlanan derleme boyutları sonuçlanan soğutma tarafından yeniden oluşturulur. Burada, bu üretim yordamı açıkladı ve tüm derlemeler manyetik alignability birefringence ölçümleri 5,5 T manyetik alan altında tarafından sayılabilir. Fosfolipid bilayer kaynaklanan birefringence sinyal daha da bilayer içinde meydana gelen polymolecular değişiklikleri izleme sağlar. Bu basit tekniği yaygın olarak bicelles karakterize etmek için istihdam edilmektedir NMR deneyler için tamamlayıcı.

Introduction

Bicelles çok sayıda lipid karışımlar elde edilen disk benzeri polymolecular derlemeler vardır. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 onlar membran biomolecules yapısal karakterizasyonu için NMR spektroskopisi tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. 6 , 7 ancak, son çabaları olası uygulama alanın genişletin hedefliyoruz. 5 , 8 , 9 en çok çalışılan bicelle sistem 1,2 karışımından oluşmaktadır-dimyristoyl -sn- glycero-3-derleme ve 1,2 düzlemsel kısmını phosphocholine (DMPC),-dihexanoyl -sn- glycero-3-phosphocholine (DHPC) Fosfolipid kenarına kapsayan. 1 , 2 , 3 bilayer dikte kendi kendine monte polymolecular yapısı mimari beste fosfolipitler moleküler geometri. 4 , 5 yerine DHPC DMPE-DTPA ile manyetik olarak son derece duyarlı ve ayarlanabilir bicelle sistemleri oluşturur. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar oranı 4:1:1) bicelles ilişkilendirmek çoğu ile daha fazla paramagnetic lanthanide iyonları (Ln3 +) bilayer'ın yüzeyinde, gelişmiş bir manyetik tepkisine yol. 10 Ayrıca, suda çözünen DHPC molekülleri DMPE-DTPA/Ln3 + sağlar ile seyreltme dayanıklı bicelles oluşumunu değiştirme. 11

Düzlemsel polymolecular derlemeler manyetik alignability genel olarak manyetik enerji tarafından dikte edilir,

Equation 1(1)

B manyetik alan şiddeti, olduğu yerde Equation 2 manyetik sabit, n toplama numarası ve Equation 3 bilayer beste lipidler moleküler diamagnetic duyarlılık anizotropi. Bu nedenle, DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles yanıt manyetik alanlar için onların boyutu (Toplam sayı n) ve moleküler diamagnetic duyarlılık anizotropi Δχ tarafından hazırlanmıştır. İkinci kolayca Şelatatlı Ln3 +doğası değiştirerek elde edilir. 12 , 13 , 14 , 15 Introducing kolesterol (CHOI-OH) veya bilayer steroid diğer türevleri toplama n sayısına ve manyetik duyarlılık Δχ kurulumları ayarlama imkanı sunuyor. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 verilen lipid kompozisyon için daha alignable türler kaynaklanan daha fazla lipidler Emag için (daha büyük toplama n sayısına), katkıda bulunmak ve yetenekli büyük derlemeler içerir. DMPC/DHPC bicelles, boyutunu örneğin, geleneksel çıktısından lipid oranı veya toplam konsantrasyonu optimizasyon ile kontrol edilir. 20 , 21 , 22 bu DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles mümkün olsa da, bicelle veziküller Teklifler Isıtma üzerine onların termo-tersinir dönüşüm terzilik seçenekleri eklendi. Veziküller şekillendirme membran filtreleri ile ekstrüzyon sağlar gibi mekanik anlamına gelir. Manyetik olarak alignable bicelles 5 ° C-soğutma üzerine yeniden oluşturulur ve boyutlarıyla vezikül öncüleri dikte. 11 işbu, mekanik imalat işlemleri ile DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + potansiyelini ele (molar oranı 4:1:1) veya DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) referans sistemleri olarak. Süreç siparişlerimiz ile diğer Ln3 + daha Tm3 +çalışırken işler. Bu teknikler tarafından sunulan olanaklar geniş şekil 1 ' de vurgulanır ve kapsamlı bir şekilde başka bir yerde tartışıldı. 23

Figure 1
Şekil 1: olası üretim prosedürleri şematik bakış. Okudu manyetik alignable Ln3 + şelat polymolecular derlemeler her iki DMPC/DMPE-DTPA/Tm-3 + in oluşmaktadır (molar oranı 4:1:1) veya DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5). Kuru lipit filmin 7,4 pH değeri, bir 50 mM fosfat tampon ile sulu ve toplam lipid konsantrasyon 15 mM. Etkili bir nemlendirme lipit filmin de donma çözülme döngüsü (FT) veya Isıtma ve soğutma çevrimleri gerektirir (H & C). H & C döngüleri örnekleri son donma adım çözdürme sonra yeniden veya eğer onlar daha fazla ekstrüzyon kullanılmak üzere uzun bir süre içinde donmuş muhafaza örnekleri yeniden oluşturmak için gerekli. Aşağıdaki adımları Isabettini ve arktarafından kapsamlı bir şekilde ele alınmıştır. 23 sonuna kadar alignable polymolecular derlemeler, lipid kompozisyona göre farklı derleme mimarileri teslim elde edilir. Bicelle boyutu ve manyetik alignability nanopore membran filtreleri ile ekstrüzyon (Ext) tarafından ayarlanabilir. Sunulan hizalama etkenler Af 2D küçük açı nötron saçılma (San) desenleri 800, 400, 200 veya 100 kalıptan çekilmiş DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) örneği üzerinden hesaplanan nm gözenekleri. Ölçümler daha ayrıntılı olarak burada kapsamında olmayan bicelle hizalama miktarının, tamamlayıcı bir anlamı vardır. 11 , 16 izotropik saçılma için 0 -1 (paralel nötron saçılma veya manyetik alan yönü ile ilgili olarak bicelles dikey hizalamasını) arasında Af değişen.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bicelles yapısını karakterizasyonu teknikleri geniş bir dizi tarafından kapsamlı bir şekilde okudu. 13 bicelles bir manyetik alana maruz hizalamasını NMR spektroskopisi veya küçük açı nötron saçılma (San) deneyler kullanarak sayısal. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 ancak, shift ve Ln3 + varlığında meydana gelen NMR doruklarına genişletmektedir yöntemine ciddi sınırlamalar vardır. 15 , 26 , 27 , 28 rağmen SANS deneyler bu sınırlama, alternatif ve olmaz daha erişilebilir teknikleri çözüm derlemelerde manyetik olarak indüklenen hizalamasını rutin miktar için arzu edilir. Birefringence ölçümleri uygun ve nispeten basit bir alternatiftir. Mahsum NMR deneyleri için birefringence ölçümleri lipid düzenlemeler ve lipid aşamaları bilayer içinde meydana gelen değerli bilgileri ortaya koyuyor. Ayrıca, geometrik dönüştürmeleri sıcaklık gibi çevre koşulları değişen polymolecular derleme içinde meydana gelen izlenir. 11 , 12 , 13 , 16 manyetik olarak indüklenen birefringence Δn′ Fosfolipid sistemleri çeşitli çalışma kullanılmaya başlanmıştır. 13 , 29 , 30 birefringence ölçümleri bir manyetik alan içinde faz modülasyon tekniği dayalı bicelles yönünü bulmak için uygun bir yöntem var. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 bicelles birefringence yüksek manyetik alanlarda en fazla 35 T ile soruşturma imkanı da M. Liebi vd tarafından sunuldu 13

Bir Anizotropik malzeme polarize ışığın girdiği zaman, olağan ve olağanüstü bir dalga kırılan. 11 iki dalgalar farklı hızları var ve aşamasında retardasyon δ tarafından kaydırılır. Geriliği δ derecesini ölçülen ve bir birefringence sinyale dönüştürülür Equation 5 malzeme kullanarak anizotropi derecesini ölçmek için

Equation 6(2)

Burada λ dalga boyu lazer ve d numune kalınlığı olmasıdır. Fosfolipitler optik Anizotropik ve onların optik eksen hidrokarbon kuyrukları paralel onların uzun moleküler eksenli denk geliyor. 11 , 12 fosfolipitler rastgele çözüm odaklı Eğer hiçbir retardasyon ölçülür. Fosfolipitler birbirine paralel hizalandığında retardasyon ölçülür. Manyetik olarak indüklenen birefringence Equation 5 bir pozitif veya negatif işaret molekülleri yönünü bağlı olarak manyetik alanına; olabilir bkz: Şekil 2. Paralel x ekseni için hizalı fosfolipitler olumsuz bir neden olacaktır Equation 5 , bu hizalanmış z ekseni boyunca olumlu bir sonuç ise Equation 5 . Hiçbir birefringence Fosfolipid paralel y ekseni olarak hizalar gibi optik eksen ışık yayma yönü ile ne zaman denk görülmektedir.

Figure 2
Resim 2: Uyum fosfolipitler ve karşılık gelen manyetik olarak indüklenen birefringence iz Equation 12 . Ölçülen iz Equation 12 manyetik alandaki Fosfolipid yönünü bağlıdır. Optik eksen molekülün kesik çizgilerle gösterilir. Işık 45 ° polarize ve y yönde yayar. Manyetik alan B z yönünde olur. Bu rakam M. Liebi değiştirildi. 11 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bir izotropik kolloidal süspansiyon bicelles söz konusu olduğunda, bilayer fosfolipitler düzenlenmesi tarafından indüklenen yönlendirme, retardasyon δ sıfırlanması kaybolacaktır. Bicelles aynı zamanda bir zeka özrü δ polarize ışığın neden onların bilayers optik etkin fosfolipitler yönlendirmek amacıyla hizalamanız gerekir. Sonuç olarak, birefringence polymolecular derlemeler manyetik alignability ölçmek için önemli bir araçtır. Bicelles hizalanmış dikey manyetik alan olarak olumlu bir verecek Equation 5 , bu paralel uyumlu bir negatif verecektir iken Equation 5 . İşareti belgili tanımlık tertibat Hizalama'bağlıdır ve örneği ile kontrol edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. üretim yordamı için DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 4:1:1) ve DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) polymolecular derlemeler

  1. Ön hazırlıklar
    1. Yıkama yıkama tarafından tüm Züccaciye Mağazaları bir kez etanol ile stabilize kloroform (> % 99 kloroform) ve sıkıştırılmış hava ile kuru.
    2. 2 ayrı 10 mg/mL stok çözümlerinde DMPC ve DMPE-DTPA etanol stabilize kloroform üretmek (> % 99 kloroform), bir 10 mM hisse senedi çözümde Choi-Oh etanol stabilize kloroform (> % 99 kloroform) ve TmCl3 ' te 10 mM stok çözeltisi metanol.
    3. 7.4 pH değeri, bir 50 mM fosfat tampon 0.121 g sodyum dihydrogen fosfat dihydrate ve 0.599 g susuz di-Sodyum hidrojen fosfat ultrasaf H2o 100 ml karıştırarak hazırlayın
  2. Kuru lipit filmin hazırlanması
    1. Amphiphiles (DMPC, DMPE-DTPA ve isteğe bağlı olarak Choi-OH) ve Ln3 + stok çözümleri gerekli miktarda ayrı 3 mL cam ek-bardak içinde 2.5 mL cam şırıngayla tartın.
      1. DMPC/DMPE-DTPA 3 mL örnek hacmi için / Tm3 + (molar oranı 4:1:1, toplam lipid konsantrasyon 15 mm), DMPC hisse senedi çözüm, 1.4731 g DMPE-DTPA hisse senedi çözüm ve TmCl3 hisse senedi çözüm 0.7126 g 3.6435 g ağırlığında.
      2. DMPC hisse senedi çözüm 2.9148 g, 1.4731 g DMPE-DTPA hisse senedi çözüm, Choi-OH hisse senedi çözüm 1.0749 g ve 0.7126 g için bir 3 mL numune hacmi DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5, 15 mM toplam lipid konsantrasyonu) tartmak TmCl3 hisse senedi çözüm.
        Dikkat: Kloroform ve metanol toksik ve oda sıcaklığında uçucu vardır. Bir duman başlık altında çalışması ve derhal kitle ölçümleri ile devam edin.
    2. Ek-bardak içeriği 25 mL yuvarlak alt şişesi aktarmak. Yaklaşık 2.5 mL karşılık gelen solvent ile yuvarlak alt şişesi içine her ek-fincan yıkayın.
    3. Solvent vakum altında 40 ° C'de döner Buharlaştırıcı kaldırmak 30 000 için ilk basınç ayarlı çözücü çoğunu kaldırılıncaya kadar Pa. Baskıyı azaltmak için 100 Pa ve kuru örnek dönüş için en az 2 h altında elde şişeye cam duvarları tek tip kuru lipid filmde.
    4. Kuru lipit filmin bir havada lipid oksidasyonu önlemek ve rehydration önce dondurucuda örnek depolamak için argon akışı altında 1 dakika yerleştirin.
  3. Hidrasyon kuru lipit filmin
    1. Fosfat tampon 3 mL 15 mM toplam lipid konsantrasyon ulaşmak için yuvarlak alt şişe ekleyin.
    2. Bu iyice (kaynar sıvı azot durur) dondurulmuş, daha sonra ısı kadar şişeye dönüş sıvı azot altında dalan tarafından bir donma-çözülme (FT) döngüsü yürütmek için balonun sürekli dönen bir su banyosunda 5 min için örnek koyarak 60 ° C'ye kadar geri eritme işlemi yardım. 30 uygulamak vortexing örnek ne zaman lipit filmin hidrasyon yardım etmek için sıvı dondurma her döngüsü önce s.
      Not: ikinci donma sonra çözülme döngüsü lipid film yok şişesi duvarlarında görünür olmalıdır.
    3. 1.3.2 toplam beş kez tekrarlayın. Şişeye örnek sıcak olduğunda fosfat tampon gereksiz buharlaşma önlemek için bir kap ile kapatın. Örnek donmuş zaman protokol duraklatılmış.
    4. İki Isıtma ve soğutma için devam (H & C) döngüsü son dondurucu adım dışarı geliyor örnek stabilize veya iki aya kadar donmuş tutmak için. Örnek 40-60 ° C için DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + ısı (molar oranı 4:1:1) veya DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5), sırasıyla, 1 ° C/dk. 5 ° C'de soğutma önce korumak örnek, maksimum ve minimum 5 dk sıcaklıklar döngüsü.
    5. Şimdi, ya da harici bir manyetik alan (Adım 2) örnekte birefringence sinyal belirlemek veya daha fazla örnek bicelle boyutları ve manyetik alignability (Adım 1.4) terzi bükün.
      Not: DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 4:1:1) örnekleri esas olarak 70 ortalama hidrodinamik Çapı DH ile bicelles, oluşan bir numara dağıtım tarafından ortaya nm elde edilen dinamik ışık saçılma (DL) ölçümleri 5 ° C'de üzerinden Bu örnekler aynı zamanda bir ortalama DH 500 ile daha büyük polymolecular derlemeler içerir bir yoğunluk dağıtım tarafından ortaya nm. DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) olduğu son derece polydisperse boyutu 700 ortalama DH açığa tipik yoğunluk dağıtımları ile sayı dağıtımları daha küçük hakim bir nüfus ortaya iken nm, bicelles boyutu aralığı 200 nm. Daha ayrıntılı boyutu dağılımları ve cryo transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri bu örneklerin Isabettini vd tarafından bildirilmiştir 23
  4. Ekstrüzyon polymolecular derlemeler.
    1. Ekstruder şekil 3' te gösterilen topla. Eldiven ve cımbız silis tüpler işleme için koruma ile kullanın. Filtre kağıdı (5) (6) membran filtre en iyi bir yerleşim için izin vermek için arabellek birkaç damla ile ıslak. O-ring (7) üzerine koyduktan sonra hiçbir kıvrımlar kağıt olduğundan emin olun.
      Not: Ekstrüzyon işleminin membran filtreleri (6) 100, 200, 400 ve 800 gözenek çapı ile test edildi nm; bkz. Şekil 7.
    2. İçin DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + 40 ° c su banyosu ayarla (molar oranı 4:1:1) numune veya 60 ° C extrudable veziküller oluşumu güvence altına almak DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) örnekleri için.
    3. Yüksek basınçlı PVC boru kullanarak bir basınçlı azot biberondan Ekstruder bağlanmak (> 4 MPa) serto adaptörler ile donatılmış ve sıvı malzeme membran ile yükselt. 1 MPa basınç genellikle 200 membran filtreleri (6) gözenek çapı ile ekstrüzyon için gerekli nm ve üstü. 1,5-2,5 MPa ile 100 gözenek çapı daha küçük membran filtreleri (6) için gereklidir nm.
      Not: membran filtre normal olmayan bir şekilde değiştirmek yüksek basınç (> 2.5 MPa) (Bu tıkanma ilk işareti) örnek yükseltme için gereklidir.
    4. (10) kapağını açın ve 2 mL cam pipet kullanarak örnek ekleyin. Sonra (10) kapağını kapatın ve örnek çıkış tüp (2) tutarak basınç valfi (12) açın. Ekstrüzyon döngüsü tamamlandıktan sonra basınç valfi (12) kapatmak, delik ve sonraki döngüsü ile devam etmek.
      Not: örnek buharlaşma tarafından aşırı örnek kaybını önlemek için çok uzun süre sıcak ceketli gemi (8) ile temas halinde bırakmayın.
30-60 s Ekstruder içinde basınç valfi (12) açmadan önce equilibrate 3 mL örnek yeterli zamanı.
  • Şekil 3' te gösterilen belirli membran gözenek boyutu için 10 ekstrüzyon döngüsü devam edin. Çoğu bicelle sistemleri gözenek çapı 100 ile 200 ve başka bir 10 kat membran aracılığıyla gözenek çaplı membranlar yoluyla 10 kez çekilmiş nm, örnek karşılaştırılabilir güvence altına alınması.
  • Şimdi, birefringence sinyal bir dış manyetik alan (Adım 2) örnek olarak belirleyin.
  • Figure 3
    Şekil 3: bicelle ve vezikül hazırlıkları için kullanılan Laboratuvar Ekstruder. Ekstruder aşağıdan yukarıya monte edilir: (1) aparatı, (2) örnek alan bir 2.4 mm (iç çap) plastik çıkış tüp ve o-ring, (3) ve (4) büyük ve küçük teskin mesh (5) filtre kağıdı, (6) membran filtreleri, o-ring (7), (8) ceketli gemi ile toplama (9. ) üst kapak giriş ve basınç bağlantısı, (10) kapak, (11) kelebek vida, (12) basınç valfi ile. Birleştirilmiş ekstruder bir kroki ve sağ-el-tarafında gösterilir. Azot gazı (N2) bir basınç teknesi tarafından sağlanır ve ceketli gemi (9) sıcaklık kontrolü için bir su banyosu bağlı. Örnek 10 ekstrüzyon döngüleri için herhangi bir verilen membran filtre gözenek çapı (mavi renkle gösterilen örnek yol) geçer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    2. DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + birefringence ölçümleri (molar oranı 4:1:1) ve DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) polymolecular derlemeler.

    1. Oluşturmak ve birefringence ayarı olarak sunulan Şekil 4 bağlanmak ve ilgili elektronik elemanları için güç kaynağı. PEM, örnek ve ikinci polarize lazer yolundaki bu aşamada koymayın. Yansıtıcı yüzeyler, örneğin alüminyum ayna sahipleri, siyah kağıt kapsayan tarafından geri dağınık lazer ışık algılama kaçının.
    2. Doğru akım yoğunluğu tarafından temsil edilir dedektörü, lazer yoğunlukta en üst düzeye çıkarmak için aynaları ayarlayın Equation 7 4B rakamdüşük geçiş filtrede elde.
      Dikkat: aynalar ayarlarken uygun göz koruma giymek ve bir lazer Emanet öğretim üyesi ile ilk kez lazerler manipüle danışın.
    3. En üst düzeye çıkarmak için ilk çapraz doğrusal polarize (olay lazer ışını tutulan dik) açmak Equation 7 .

    Figure 4
    Şekil 4: birefringence kurulum ve optik sinyalleri bağlantılarında şematik gösterimi. A) süper iletken bir elektromıknatıs 5,5 T manyetik alan sağlar. Diode lazer 635, ışıktan nm tarafından iki çapraz polarize polarize. Photoelastic modülatör PEM-90 50 KHz bir genlik ile bir0 2.405 rad çalışır ve arasında iki polarize yerleştirilir. Örnek mıknatıs PEM ve ikinci polarize arasında yer almaktadır. Aynalar sigara polarize ışık farklı elemanları aracılığıyla rehberlik ve nihayet bir fotoğraf Dedektör tarafından algılanır. Birinci ve ikinci harmonik Equation 10 ve Equation 11 polymolecular derlemeler şelat Ln3 + manyetik alignability hakkında bilgi veren birefringence sinyal hesaplanması izin AC sinyal olarak izlenir. Örnek küvet sıcaklık kontrolü (mavi) için bir dış su banyosu bağlıdır. Örnek sıcaklığı ile bir sıcaklık probu (kırmızı) izlenir. B) fotoğraf Dedektör sinyal bir ikinci sipariş Sallen-Key düşük geçiş filtresi (24 V AC güç kaynağı) ±12 V DC güç kaynağı braded kablo (3) aracılığıyla kesme frekans 360 Hz ile içine beslenir. Alçak geçiren Filtre DC bileşen ayıklar Equation 7 ve PC-arabirimi (4) BNC 50 Ω kablo aracılığıyla teslim eder. Fotoğraf Dedektör sinyal iki kilit-in amplifikatörler için teslim edilir (birinci ve ikinci harmonik ayıklamak Equation 10 ve Equation 11 ) BNC 50 Ω kablo (1) aracılığıyla & (2). Harmonik yoğunluklarda faz duyarlı algılama tarafından algılanır. Sonuç olarak, PEM sinyal (1f-PEM içine ilk kilit-in amplifikatör ve ikinci, 2f-çıkış çıkışını bağlı BNC ile 50 Ω kabloları) kilit-in amplifikatörler işaretimi başvuru olarak kullanılır. Çıkış sinyalleri PC arayüz birimi BNC 50 Ω kablolar aracılığıyla teslim edilir. Analog edinme birimleri cFP-AI-110 ve cFP-CB-1 izlemek için RS 232 kablo aracılığıyla bilgisayara transfer edilir sinyal digitalize. Türü K sıcaklık probu da nerede izlemek için RS 232 kablo aracılığıyla bilgisayara aktarmadan önce sinyal analog edinme birimleri cFP-CB-3 ve cFP-TC-120 digitalize PC arayüz birimi bağlıdır. C) B. anahtar öğeleri sunulan şematik Kur resmini karşılık gelen 1 ile 4 numaraları ile tanımlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    1. İkinci Çapraz doğrusal polarize olay lazer ışını, dikey şekil 4Aiçinde gösterildiği gibi yerleştirin. En aza indirmek Equation 7 ile ilgili ilk 90 ° açıyla ikinci polarize ayarlayarak.
    2. İki çapraz lineer polarize ve dikey şekil 4Aiçinde gösterildiği gibi olay lazer ışını olarak 0 ° photoelastic modülatör (PEM) bir yer. PEM bir frekansa 50 kHz ve genlik A0 2.405 rad için şekil 5A' gösterildiği gibi ayarlayın. Bu DC bileşeni birefringence ve artırır bağımsız yapar Equation 7 .
      Not: PEM optik eksen bir sabit tutmak için bir kaç derece ayarlı Equation 7 herhangi bir örnek ölçme önce havada.
    3. 1s için lazer ve sinyal dengelemek için elektronik ekipman açtıktan sonra bekleyin.
    Auto-kilit-in amplifikatörler, aşamalı sabit kalır sonra sinyal durumu iyi.
  • Örnek yolu uzunluğu 10 mm ile bir sıcaklık kontrollü kuvars küvet yerleştirin ve başlangıçta 5 ° C'de küme bir dış su banyosu bağlayın
  • 0,5 mm kalın türü K ısıl (sıcaklık probu) örnek örnek sıcaklık izlemek için doğrudan yerleştirin. Sonda bir beyaz kağıt lazer yolunda (sonra küvet) yerleştirerek ve yoklama ile neden gölgeler için bakarak lazer ışığı ile karışmaz doğrulayın.
    Not: Su banyosu sıcaklık kaydı ve örnek sıcaklığı arasında 2-3 ° C fark yoktur.
  • Küvet mıknatıs, delik içinde şekil 4Aiçinde gösterildiği gibi yerleştirin. Lazer ışık yatay olarak örnek yayar, Sigara polarize aynalar tarafından bükülmesi ve fotoğraf Dedektör tarafından tespit.
    Not: Lazer aşağı örneği üzerinden ve aynı yolu geri yukarı Faraday etkileri (yani aşağı gidiş geri ters yönde geldiğiniz zaman iptal edildiğinde manyetik alanı tarafından neden ışığın polarizasyon uçak rotasyon) için hesap için yönlendirilir.
  • Sabit hava akışı basınçlı hava oda sıcaklığında ve 10000 uygulama Pa küvet üzerinde yoğunlaşma su hücre duvarları, sinyalin yoğunluğunu azaltmak ve gürültü artışı önlemek için. 5 ° C'de ölçerken önem kazanır
  • Birinci ve ikinci harmonik tespit Equation 10 ve Equation 11 kilit-in iki yükselteçler ile AC sinyal. Otomatik şekil 5B içinde gösterilen (2) düğmesine basarak kilit-in amplifikatörler faz ve hassasiyetini şekil 5B içinde (1) gösterildiği gibi ayarlayın. Sinyal aşırı yükleme önlemek için şekil 5B içinde (3) gösterildiği gibi amplifikatörler dörtten fazla kırmızı çubuklar olmadığından emin olun. Her iki kilit-in amplifikatörler Tesla_Magnet_Const_V092 programında için istihdam duyarlılık aşağı şekil 5C içinde (8) gösterildiği gibi dikkat edin. Program tamamlayıcı bilgiler sağlanmaktadır.
  • Manyetik alan 5,5 T kadar şekil 5C içinde (5) gösterildiği gibi Tesla_Magnet_Const_V092 programı aracılığıyla mıknatıs için geçerli sağlayarak rampa.
  • Birefringence elde Equation 5 denklem 2, nerede geriliği ile hesaplanır kullanarak
    Equation 13(3)
    nerede Equation 14 ve Equation 15 ile birinci türden Bessel fonksiyonları vardır Equation 16 ve Equation 17 . 11 , 13 , 18 , 33 , 34 şekil 5C içinde (4) gösterildiği gibi Tesla_Magnet_Const_V092, programda retardasyon arsa.
    Not: program tarafından sağlanan retardasyon iki kilit-in amplifikatörler aynı hassasiyeti çalışmıyorsanız birefringence sinyal hesaplamak için kullanılmamalıdır (bkz. Adım 2.12). Günlüğe kaydedilen harmonik yoğunluklarını Equation 10 ve Equation 11 doğru boyutlarını almak için kilitli amplifikatörler duyarlılık tarafından çarpılan gerek. Ayrıca, bir mıknatıs alanı altında ölçülen birefringence sinyal 0 T. elde edilen ortalama birefringence sinyal çıkararak normalleştirilmiş gerekir
  • Örnek'in birefringence sinyal sabit ya da şekil 4' te gösterilen küvet bağlı su banyosu sıcaklığını düzenleyen tarafından sıcaklık (1 ° C/dak) değiştirme izlemek.
  • Bir dosya adı (9) sağlayan ve "START kütük" düğme (10) tuşuna basarak deneysel veriler şekil 5C (8), deneysel açıklama doldurarak oturum.
  • Figure 5
    Şekil 5: programın ekran görüntüleri ve istihdam ayarlar illüstrasyonlar. A) PEM ayarları: retardasyon 2.405 rad, dalga boyu 635 nm, frekansı 50 Hz. beyaz daireler belirtmek aktif olması için hangi ayarları (USR kullanıcı tanımlı retardasyon, LOC = çalışma yerel modu =). B) kilit amplifikatör ayarları. Hassasiyet (1) 2.11. adımda gerekli her ölçüyü önce seçilmesi gerekiyor. Bir sinyal aşırı yükleme önlemek için ekranda (3) dörtten fazla kırmızı çubuklar olmamalıdır. Aşırı yüklenme (1) led kırmızı açar, bir ölçüm imkansız hale oluşur. Her ölçüm önce otomatik faz düğmesi (2) tuşuna basın. C) ekran programı ek bilgiler Tesla_Magnet_Const_V092 . Program denetim manyetik alan ve kayıt tüm sinyal bir fonksiyonu olarak çıktılar sağlar. Manyetik alan şiddeti ve numune sıcaklığı (1) çizilir. Birinci ve ikinci harmonik Equation 10 ve Equation 11 göre gibi iki kilit amplifikatörler ölçülen AC sinyal (2) çizilir. Doğru akım yoğunluğu Equation 7 (3) çizilir. Geriliği 2,13 adımda anlatıldığı gibi hesaplanır ve (4) çizilen. Manyetik alan şiddeti (5) ayarlanır. Tip K ısıl tarafından kaydedilen sıcaklık doğrudan ölçümü (6 adet) sunulan ve çıkış sinyalleri (Equation 23 ve Equation 22 ) (7). Ek örnek bilgiler (8) istihdam duyarlılığını amplifikatörler, örnek adı, vb gibi eklenebilir. Verileri günlüğe ve (9) sağlanan bir .txt dosyası ihraç. Başlatma ve durdurma "START kütük" düğme (10) ile veri toplama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Bir sigara kalıptan çekilmiş DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + birefringence sinyal (molar oranı 4:1:1) örnek bir Isıtma ve soğutma döngüsü 5 ila 40 ° C ve 1 ° C/dk (şekil 6) oranında geri sırasında 5,5 T manyetik alan altında izlenir. Birefringence sonuçları 5 ° c değeri yüksek manyetik hizalamaları 1.5 x 10-5, iki kat daha güçlü bildirilen ekstrüzyon sistemleri gelince doğruladı. 6 , 7 , 23 birefringence sinyal Tm DMPC 24 ° c üzerinde sıfırlanması alignable sigara vezikül oluşumu ile neden oldu. Sıvı düzensiz faz hareket görünümünü önemli düzenlemeler polymolecular meclislere tetikledi. Bu düzenlemeler termo-tersinir. Alignable türler Tm soğutma üzerine yeniden ve birefringence sinyal Isıtma gibi üzerinde aynı trend izledi. Tm meydana gelen farklı zirveleri alignable derlemeler değiştirme tarafından alignable veziküller işaretleyin. 23 ile ilgili uygulamalı Isıtma ve soğutma hızı 1 ° C/dk moleküler düzenlemeler yavaş Kinetik açıklamak neden tepeleri değil örtüşen. Bunun yerine, her iki doruklarına Tm DMPC, bilayer lipidler alignable türlerin oluşumu lehine sipariş belirli bir ölçüde olmalıdır düşündüren başladı.

    Figure 6
    Şekil 6: Birefringence işaretimi sıcaklık fonksiyonu olarak bir sigara kalıptan çekilmiş DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 4:1:1) (kırmızı) Isıtma ve soğutma (mavi) 1 ° C/dak üzerine örnek Örnek 1-1.3.5 Protokolü adımları izleyerek hazırlanmıştır. Birefringence ölçümler Protokolü adım 2 takip yapılmıştır. Manyetik alan şiddeti 5.5 T kadar hızlandırıldığını ve örnek 5 °, 1.5 x 10-5 Isıtma ve soğutma döngüsü için devam etmeden önce bir birefringence sinyal elde devam edildi. Birefringence sinyal nedir nerede yok hizalama örnek olarak gözlendi 35 ° C üzerindeki sıcaklıklarda yalnızca veziküller ile oluşmaktadır. Soğutma, üzerine bicelles yeniden ve bir final birefringence sinyal 7.2 10-6 x 5,5 T ve 5 ° c elde edildi Manyetik alan şiddeti 0 T aşağı hızlandırıldığını ve örnek 5 ° C'de devam edildi Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) örnek Isıtma takip sulu ve yordam soğutma 1.3.4 adım've daha sonra 10 kez 60 ° C'de farklı gözenek boyutları membran filtreler aracılığıyla kalıptan çekilmiş, bkz: adım 1.4. 60 ° C'de lipid karışımı ekstrüzyon işlemi tarafından şekillenir veziküller monte edilerek üretilir. 16 , 35 , 36 , 37 ekstrüzyon tamamladıktan sonra bicelles 5 ° C-soğutma tarafından yeniden ve hidrodinamik Çapı DH DLS tarafından ölçüldü. Bicelles manyetik alignability 5 ° C'de SANS ile Af T saat 8'de bilgisayar ve birefringence sinyal 5.5 T ölçme değerlendirilmiştir; bkz. Şekil 7. Birefringence sinyal şekil 7Aiçinde gösterildiği gibi alan geri aşağı 0 T ve 5,5 T kadar ramping tarafından elde edildi. En yüksek birefringence hizalama en üst düzeyde denklem 1 göre nerede bekleniyordu 5.5 T oluştu. Bicelles hidrodinamik Çapı DH 220, 190, 106 ve 91 düşürüldü nm tarafından gözenek boyutları ile membranlar yoluyla art arda ekstrüzyon 800, 400, 200 ve 100 nm anılan sıraya göre. Manyetik hizalama karşılık gelen azalma oldu sıfır içinde şekil 7Byaklaşırken birf azalan birefringence sinyal ve mutlak azalma tarafından onaylandı. Sonuçları bicelle biçimi ve Ekstrüzyon 60 ° C'de tarafından veziküller terzilik ve geri 5 ° C'ye soğutma manyetik hizalama kontrol etme imkanı doğruladı

    Figure 7
    Şekil 7: Çeşitli gözenek boyutları membran filtreler aracılığıyla kalıptan çekilmiş bir DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) örnek manyetik hizalaması. A) Birefringence sinyal Δn′ manyetik alan şiddeti ile 800 nm gözenekleri kalıptan çekilmiş örnek için aşağı ve yukarı ramping zaman B bir fonksiyonu olarak. En yüksek birefringence, 5.5 T denklem 1 uyarınca ulaşıldı. Bu maksimal birefringence değer bildirilen B). Aynı örnek 400 nm gözenekleri kalıptan çekilmiş. Manyetik hizalama hizalama faktörlerin birf (kırmızı daireler) 8 T çizilen bir fonksiyonu olarak hesaplama ve her iki birefringence ölçülerde (siyah kareler) (mahsum a önceki ekstrüzyon adım için yapılanları) 5,5 T tarafından değerlendirilmiştir hidrodinamik Çapı DH DLS. tarafından elde. Manyetik hizalama mahsum 200 nm gözenekleri ve 100 nm gözenekler yükseltme sonra son bir kez kalıptan çekilmiş aynı örnek üzerinde incelendi. Tüm ölçümler 5 ° C'de gerçekleştirilmiştir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Derlemeler olduğunu Isabettini vd. fosfolipitler şelat manyetik olarak son derece duyarlı Ln3 + oluşturmak için yöntemleri değerlendirmek için nasıl birefringence ölçümleri SANS ile birlikte kullanılan ayrıntılı hesabını deneyler 23 önerilen imalat protokolleri de daha uzun DPPC ve DPPE-DTPA fosfolipitler oluşan derlemeler için veya onların bilayer kimyasal mühendislik steroid türevleri içerenler için geçerlidir. 11 , 12 , 17 , 18 , 19 örnek için yeterince yüksek sıcaklıklarda ısıtılır o varlık tek gereksinim 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 ve 1.4.2 adımları. Sıcaklıklar bilayer lipidler sıvı bir düzensiz aşamasında, Kuru lipid film ya da örnek rejenerasyon en uygun hidrasyon guarantying girmek izin vermesi gerekir. DPPC/DPPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 4:1:1) derlemeler, örneğin, benzer DMPC tabanlı sistem 24 ° c üzerinde ısıtmalı olmalıdır süre DPPC faz geçiş sıcaklığı 42 ° C'de yukarıda ısıtmalı olabilir gerek Yeterince yüksek bir sıcaklık da extrudable veziküller lipid bilayer adım 1.4 düzensiz bir durumda olduğunda meydana gelen oluşumu garanti etmek gereklidir. 1.3.2. adımda donma-çözülme çevrimleri tamamen H tarafından değiştirilebilir & C döngüleri. 23 ancak, örnek tam lipit filmin bu yordamla hidrat için daha fazla zamana ihtiyacı ve vortexed 20 dk 5 ° C ile 60 ° C'de zaman 2 dk zaman olmalıdır Ek H & C döngüleri olup üstlenmiş kuru lipit filmin unsurları hala şişeye cam duvarları üzerinde izlenmektedir.

    Bu protokol için sunulan Tm3 + şelat bicelles manyetik alan yönüne dik hizalayın. Bu hizalama yönü büyük pozitif manyetik duyarlılık Tm3 +kaynaklanır. 11 , 14 Dy3 + ve Yb3 + gibi diğer lanthanide iyonları da uygulanabilir. 11 , 13 , 19 farklı manyetik anizotropi Ln3 + bicelles manyetik hizalamasını terzilik ek bir yol sunar. Örneğin, Dy3 + bicelles manyetik alan yönüne paralel hizalamasını yüksek derecede sonuçlanan bilayer fosfolipitler, özünde negatif manyetik duyarlılık geliştirir. 13 bu değişikliği uyum yönde değişiklik birefringence sinyal ve Anizotropik 2D hesaplanan hizalama faktörler işareti ile tespit desenleri SANS. Manyetik duyarlılık yalnızca kimyasal doğası Ln3 + ama Ln3 +chelate geometri tarafından dikte edilir değil olduğunu unutmamak önemlidir-Fosfolipid karmaşık. 19 , 38 manyetik duyarlılık Fosfolipid headgroups, elde edilen derlemeler manyetik yanıt tanımlama şelat farklı Ln3 + sentezleme tarafından tasarlanmış. 38

    Her örnek optik istihdam oluşturan lipidler niteliğine bağlı olarak farklıdır. Örnek'ın bulanıklık sıcaklık fonksiyonu olarak izleme sıcaklık kaynaklı yapısal dönüşümleri derlemeleri içinde değerlendirmek için tamamlayıcı bir yöntemdir. Her ne kadar bu ölçümler genellikle bir manyetik alan içinde bir Spektrofotometre yokluğunda yürütülmektedir, lazer'ın doğru akım yoğunluğu izleme Equation 7 burada önerilen kurulumu ile aynı bilgileri bir manyetik huzurunda sunar Alan. 11 , 16 DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 4:1:1) genellikle daha az bulanık Choi-OH içeren DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 16:4:5:5) meslektaşlarına 5 ° C'de olduğu Su 5 ° C'de benzeyen örnekler genellikle bir manyetik alan alignable değildir. At Oda sıcaklığı, her iki örnekleri göz şeffaf çünkü DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 4:1:1) bicelles ve veziküller arasında bir geçiş aşamasında olduğu ve büyük konsantrik delik görünür DMPC/Choi-OH/DMPE-DTPA/Tm içinde3 + (molar oranı 16:4:5:5) bicelles. 11 , 16 , 23 bicelles veziküller içinde DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + için geçiş durumu (molar oranı 4:1:1) da örnek'ın viskozite oda sıcaklığında bir artış ile eşlik eder. Bu sıcaklık bağımlı değişikliği bulanıklık, doğru duyarlılık 2.11. adımda seçtiğiniz güçleştirir. Işık hassasiyeti çok yüksek bir bulanık örneği 5 ° C'de ayarlanıyorsa, örnek Isıtma üzerinde daha şeffaf doğası amplifikatörler aşırı neden olabilir. Ayrıca, son derece bulanık örnekleri gürültü sinyal oranı önemli ölçüde artacak ve birefringence ölçümleri için uygun olmayabilir. Lazer ışık algılanması için örnek gitmek gerekir.

    Sigara kalıptan çekilmiş olduğu her zaman daha fazla bulanık ve eğilim üzerine kısa süreli depolama buzdolabında toplanacak. Yine de, manyetik olarak duyarlı örnekleri kolayca bir H ile yeniden & C döngüsü. Örnekleri sigara kalıptan çekilmiş Ayrıca depolanması donmuş durumda ve kolayca H tarafından yeniden & C döngüleri. Yükseltilmiş örnekleri buzdolabında muhafaza ve yaygın bir örnek'ın hazırlık takip hafta içinde ölçülür. Bir sıvı veya donmuş bir devlet haddelenmiş türlerin uzun süreli depolama çalışmaları rapor yok. Bu nedenle, ekstrüzyon elde edilen derlemeler boyutu dağılımı üzerinde uzun süreli depolama garanti edilemez.

    Mahsum herhangi bir bicelle sistemi, manyetik olarak alignable bu düzlemsel derlemeler sadece lipit bileşimi ve konsantrasyon tanımlanmış bir Aralık vardır. Lipid oranı değiştirme micelles, kurdeleler ve veziküller oluşumu da dahil olmak üzere farklı derleme mimarilerde neden olur. 5 , 11 , 16 , 18 , 20 fosfat tampon konsantrasyon ve pH 1.1.3. adımda bicelles ve onların manyetik yanıt şekillenmesinde önemli bir rol oynar. Arabellek polymolecular derlemeler çevreleyen hidrofilik çevre yöneten FİZİKO-kimyasal etkileşimler tanımlar. Daha yüksek konsantrasyonlarda örnek toplama ve yağış nedeniyle bir aşırı şarj tarama neden iken düşük arabellek konsantrasyonlarda farklı derleme mimarilerde neden.Asidik pH değerleri 3 ve 4 arasında olan, ligandlar DMPE-DTPA/Ln3 + olarak karmaşık hizmet karboksilik asit moieties protonated koşullardadır. Bu toplama ve yağış örnek tarafından gözlenen manyetik olarak duyarlı polymolecular derlemeler imha olur. Manyetik olarak duyarlı Ln3 + polymolecular birleştirmeler daha temel pH değerleri doğru makul bir direnci vardır. Ancak, DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar oranı 4:1:1) bicelles micelles 12,9 pH değerlerini de içine ayırmak için gösterildi. 11 örnekleri asla musluk suyu veya diğer tuzları maruz gerekir. Herhangi bir diğer iyon işlem şelat Ln3 + rahatsız veya toplama kurulumları ücretsiz tarama nedeniyle neden. Ölçümler, arabellek adımda 1.1.3 D2O ultrasaf H2O. Not pH metre okuma (7,4 pD değerine karşılık gelen) 7.0 olacaktır yerine açıklandığı gibi için hazır.

    Polymolecular derlemeler bir Isıtma tabi içinde meydana gelen ve soğutma döngüsü yapısal dönüşümleri termo-tersinir. Bu nedenle, son birefringence sinyal 5 ° c sıcaklık döngüsü önce olmalıdır. 11 , 16 birefringence sinyal döngüsü sonra yüksekse, örnek düzgün 1.3.4 adımda yeniden değil. Bu yaygın olarak uzun bir süre için depolanan örneklerinde oluşur. Sıcaklık döngüsü sonra şekil 6 ' gibi daha düşük bir birefringence sinyal deneysel Kurulumu'ndaki bir sorun olduğunu gösterir. En sık, lazer ışık yolunu geri saçılma veya başka bir nesne tarafından rahatsız oldu. Bu örnek doğrudan eklenen sıcaklık probu ile özellikle sorunlu (bkz. Adım 2.8) hangi yerleştirilmesi ile lazer ışık yolunu doğrudan karışmaması için. Rahatsız bir ışık yolu bir sonbaharda neden olur Equation 7 , gürültülü bir sinyal ve/veya anormal birefringence-sıcaklık eğrileri Peaks'e. Örneğin, şekil 6 yaklaşık 35 ° c Isıtma üzerinde meydana gelen en yüksek lazer ışık doğrudan yolu içine gereksinimi tüplerinin genişleme neden oldu. Birefringence sinyal o noktadan itibaren güvenilir olmayabilir. Soğutma eğrinin genel şekli normal olmasına rağmen 5 ° C'de elde edilen alt birefringence Sinyal parazit tarafından neden oldu.

    Bu protokol sonrası elde edilen birefringence değerler mutlak değildir ve kendi aralarında örnekleri karşılaştırmak için kullanılır. Edebiyat değerleri ile karşılaştırma için bir kalibrasyon referans sistemi ile gereklidir. Örneğin, ölçülen zeka belirtisi set-up Hizalama'bağlıdır ve 3,27 × 10−9 T−2bir pamuk-Mouton sabiti olan toluen ile kontrol edilebilir. 39 , 40

    Değişiklikler örnek'ın manyetik uyum içinde kaynaklanan birefringence sinyal bilayer moleküler düzenlemeler nedeniyle sinyalinden gelen decoupled. Hizalama faktörler Anizotropik 2D SANS hesaplanan desenler bir manyetik alan altında elde sadece polymolecular derlemeler toplu hizalama tarafından etkilenmiştir. İki yöntem tamamlayıcı ve birefringence sinyal için katkıların ayırımı izin. Önerilen birefringence Kur örnekleri ve dış manyetik alana maruz olmayan eş zamanlı izlenmesi için izin lazer ışını bölerek mükemmel olabilir. Manyetik alan örnek için elde edilen birefringence sonuçları at 0 T, etkili bir şekilde arka planı için muhasebe örneği için elde edilen sinyal normalleştirilmiş.

    Birefringence ölçümleri bicelles manyetik hizalamasını miktarının için sınırlı değildir. Çok sayıda yumuşak malzeme sipariş kendi iç yapısı nedeniyle bir birefringence sinyal oluşturmak. Sıcaklık veya harici bir manyetik alan olmadan bir fonksiyonu olarak bu tür malzemelerin birefringence izlemek için önerilen kurulum sağlar. Anthracene organogel lifleri, akış, nanocrystalline selüloz ve amiloid-Fe3O4 liflerinde altında wormlike micelles olan birefringence davranış ile önerilen kurulum başarıyla değerlendirildi birkaç örnektir. 29 , 30 , 32 , 41

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Acknowledgments

    Yazarlar SMhardBi (proje numarası 200021_150088/1) finansmanı için İsviçre Ulusal Bilim Vakfı kabul etmiş oluyorsunuz. İsviçre spallation nötron kaynağı Hoşlandığımı, Paul Scherrer Instute, Villigen, İsviçre SANS deneyler yapıldı. Yazarlar sıcak Dr. Joachim Kohlbrecher SANS deneyleri ile onun rehberlik için teşekkür ederiz. Birefringence ölçüm Kur yüksek manyetik alanlar'ın altında yüksek-alan manyetik Laboratuvarı HFML, Nijmegen, Hollanda varolan kurulumundan ilham kaynağı oldu. Bruno Pfister birefringence Kur elektronik gelişmekte olan onun yardım için Jan Corsano ve Daniel iyi ve facile hizalama lazer izin çerçeveler oluşturmak için Kiechl ve Dr. Bernhard Koller devam eden teknik destek için teşekkür ederiz.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Avanti Polar Lipids 850345P >99%
    1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) Avanti Polar Lipids 790535P >99%
    Thulium(III) chloride Sigma-Aldrich 439649 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Dysprosium(III) chloride Sigma-Aldrich 325546 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Ytterbium(III) chloride Sigma-Aldrich 439614 anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
    Chloroform Sigma-Aldrich 319988 contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
    Methanol Sigma-Aldrich 34860 ≥99.9%
    Cholesterol Amresco 433 Ultra pure grade
    D2O ARMAR chemicals 1410 99.8 atom % D
    Ultrapure water Millipore Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
    electronic pH meter Metrohm 17440010
    Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter VWR 515-2028
    Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter VWR 515-2029
    Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter VWR 515-2030
    Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter VWR 515-2032
    Whatmann Filter paper VWR 230600
    25 ml round bottom flask VWR 201-1352 14/23 NS
    3 ml glass snap-cup VWR 548-0554 ND18, 18x30mm
    2.5 ml glass syringe Hamilton
    Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merk 1.06342 Salt used to make phosphate buffer
    di-Sodium hydrogen phosphate Merk 1.06586 Salt used to make phosphate buffer
    Liquid Nitrogen Carbagas -
    Pressurized Nitrogen gas Carbagas - 200 bar bottle
    Lipid Extruder 10 ml Lipex - Fully equipped with thermobarrel
    High-pressure PVC tube GR NETUM - must resist more than 4 MPa
    Serto adaptors Sertot -
    Nitrile gloves VWR -
    2 ml glass pipettes VWR 612-1702 230 mm long
    Diode Laser Newport LPM635-25C
    DSP Dual Phase Lock-in Amplifier SRS SR830
    Photodiode Detector Silonex Inc. SLSD-71N5 5mm2, Silicon, photo-conductive
    5.5 T Cryogenic Magnetic Cryogenic/Oerlikon AG - 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
    Second order low pass filter home-built - Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
    Photoelastic modulator Hinds instruments PEM-90
    Glan-Thompson Calcite Polarizer Newport 10GT04 25.4mm diameter
    Quartz sample cuvette Hellma 165-10-40 temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
    Temperature probe Thermocontrol - Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
    Non-polarizing mirrors Newport 50326-1002 25.4mm
    RS 232 cables National Instruments 189284-02 For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
    BNC 50 Ω cable and connectors National Instruments 763389-01
    cFP-AI-110 National Instruments 777318-110 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-CB-1 National Instruments 778618-01 Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
    cFP-CB-3 National Instruments 778618-03 Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
    cFP-TC-120 National Instruments 777318-120 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
    cFP-1804 National Instruments 779490-01 Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
    LabView 2010 National Instruments -
    Industrial power supply Traco Power TCL 060-124 100-240V AC
    Waterbath Julabo FP40-HE refrigerated/Heating Circulator

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sanders, C. R., Hare, B. J., Howard, K. P., Prestegard, J. H. Magnetically-oriented phospholipid micelles as a tool for the study of membrane-associated molecules. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 26, 421-444 (1994).
    2. Glover, K. J., et al. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 81, (4), 2163-2171 (2001).
    3. Katsaras, J. H. T. A., Pencer, J., Nieh, M. -P. "Bicellar" lipid mixtures as used in biochemical and biophysical studies. Naturwissenschaften. 92, (8), 355-366 (2005).
    4. Sanders, C. R., Prosser, R. S. Bicelles: a model membrane system for all seasons? Structure. 6, (10), 1227-1234 (1998).
    5. Dürr, U. H. N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: birth and coming of age of lipid bicelles. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 69, 1-22 (2013).
    6. Dürr, U. H. N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem. Rev. 112, 6054-6074 (2012).
    7. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lepidic bicelle method. J. Vis. Exp. (59), (2012).
    8. Barbosa-Barros, L., et al. Bicelles: lipid nanostructured platforms with potential dermal applications. Small. 6, 807-818 (2012).
    9. Lin, L., et al. Hybrid bicelles as a pH-sensitive nanocarrier for hydrophobic drug delivery. RSC Adv. 6, 79811-79821 (2016).
    10. Beck, P., et al. Novel type of bicellar disks from a mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed lanthanides. Langmuir. 26, (8), 5382-5387 (2010).
    11. Liebi, M. Tailored phospholipid bicelles to generate magnetically switchable material. ETH Zürich. Switzerland. PhD Thesis n° 21048, ISBN 978-3-905609-55-4 (2013).
    12. Liebi, M., et al. Magnetically enhanced bicelles delivering switchable anisotropy in optical gels. ACS. Appl. Mater. Interfaces. 6, (2), 1100-1105 (2014).
    13. Liebi, M., et al. Alignment of bicelles studied with high-field magnetic birefringence and small-angle neutron scattering measurements. Langmuir. 29, 3467-3473 (2013).
    14. Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys J. 74, 2405-2418 (1998).
    15. Prosser, R. S., Bryant, H., Bryant, R. G., Vold, R. R. Lanthanide chelates as bilayer alignment tools in NMR studies of membrane-associated peptides. J. Magn. Reson. 141, 256-260 (1999).
    16. Liebi, M., Kohlbrecher, J., Ishikawa, T., Fischer, P., Walde, P., Windhab, E. J. Cholesterol increases the magnetic aligning of bicellar disks from an aqueous mixture of DMPC and DMPE-DTPA with complexed thulium ions. Langmuir. 28, (29), 10905-10915 (2012).
    17. Liebi, M., et al. Cholesterol-diethylenetriaminepentaacetate complexed with thulium ions integrated into bicelles to increase their magnetic alignability. J. Phys. Chem. B. 117, (47), 14743-14748 (2013).
    18. Isabettini, S., et al. Tailoring bicelle morphology and thermal stability with lanthanide-chelating cholesterol conjugates. Langmuir. 32, 9005-9014 (2016).
    19. Isabettini, S., et al. Mastering the magnetic susceptibility of magnetically responsive bicelles with 3β-Amino-5-Cholestene and complexed lanthanide ions. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 10820-10824 (2017).
    20. De Angelis, A. A., Opella, S. J. Bicelle samples for solid-state NMR of membrane proteins. Nat. Protoc. 2, (10), 2332-2338 (2007).
    21. Son, W. S., et al. "Q-Titration" of long-chain and short-chain lipids differentiates between structured and mobile residues of membrane proteins studied in bicelles by solution NMR spectroscopy. J. Magn. Reson. 214, 111-118 (2012).
    22. Avanti Polar Lipids Inc. Bicelle Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/bicelle-preparation (2017).
    23. Isabettini, S., et al. Methods for Generating Highly Magnetically Responsive Lanthanide-Chelating Phospholipid Polymolecular Assemblies. Langmuir. 33, 6363-6371 (2017).
    24. Nieh, M. -P., Glinka, C. J., Krueger, S., Prosser, R. S., Katsaras, J. SANS study on the effect of lanthanide ions and charged lipids on the morphology of phospholipid mixtures. Biophysical Journal. 82, (5), 2487-2498 (2002).
    25. Watts, A., Spooner, P. J. R. Phospholipid phase transitions as revealed by NMR. Chem. Phys. Lip. 57, 195-211 (1991).
    26. Bleaney, B. Nuclear magnetic-resonance shifts in solution due to lanthanide ions. J. Magn. Reson. 8, 91-100 (1972).
    27. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Solid-state NMR studies of magnetically aligned phospholipid membranes: taming lanthanides for membrane protein studies. Biochem. Cell Biol. 76, 443-451 (1998).
    28. Prosser, R. S., Volkov, V. B., Shiyanovskaya, I. V. Novel chelate-induced magnetic alignment of biological membranes. Biophys. J. 75, 2163-2169 (1998).
    29. Shklyarevskiy, I. O., et al. Magnetic alignment of self-assembled anthracene organogel fibers. Langmuir. 21, 2108-2112 (2005).
    30. Christianen, P. C. M., Shklyarevskiy, I. O., Boamfa, M. I., Maan, J. C. Alignment of molecular materials in high magnetic fields. Physica B: Condens. Matter. 346, 255-261 (2004).
    31. Maret, G., Dransfeld, K. Biomolecules and polymers in high steady magnetic fields. Top. App. Phys. 57, 143-204 (1985).
    32. Gielen, J. C., Shklyarevskiy, I. O., Schenning, A. P. H. J., Christianen, P. C. M., Maan, J. C. Using magnetic birefringence to determine the molecular arrangement of supramolecular nanostructures. Sci. Tech. Adv. Mater. 10, (1), 014601 (2009).
    33. Shklyarevskiy, I. O. Deformation and ordering of molecular assemblies in high magnetic fields. Nijmegen University. The Netherlands. PhD Thesis, ISBN 90-9018956-4 (2005).
    34. Fuller, G. G. Optical rheometry of complex fluids. Oxford University Press. NY. (1995).
    35. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
    36. Avanti Polar Lipids Inc. Liposome Preparation. Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation (2017).
    37. Avanti Polar Lipids Inc. Preparing Large, Unilamellar Vesicles by Extrusion (LUVET). Available from: https://avantilipids.com/tech-support/liposome-preparation/luvet (2017).
    38. Isabettini, S., et al. Molecular engineering of lanthanide ion chelating phospholipids generating assemblies with a switched magnetic susceptibility. Phys. Chem. Chem. Phys. 19, 20991-21002 (2017).
    39. Battaglia, M. R., Ritchie, G. L. D. Molecular magnetic anisotropies from the Cotton-Mouton effect. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2. 73, (2), 209-221 (1977).
    40. Sprunt, S., Nounesis, G., Litster, J. D., Ratna, B., Shashidhar, R. High-field magnetic birefringence study of the phase behavior of concentrated solutions of phospholipid tubules. Phys. Rev. E. 48, (1), 328-339 (1993).
    41. Zhao, J., et al. Continuous paranematic ordering of rigid and semiflexible amyloid-Fe3O4 hybrid fibrils in an external magnetic field. Biomacromolecules. 17, (8), 2555-2561 (2016).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics