Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation des Lipopeptides N-terminal pour la détermination de structure par spectrométrie de masse

Immunology and Infection

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Summary

L’enrichissement des lipoprotéines bactériennes à l’aide d’une phase de surfactant non ionique, méthode de partitionnement est décrite pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou d’autres applications. D’autres mesures sont détaillées pour préparer des N-terminal lipopeptides tryptique pour la caractérisation structurale par spectrométrie de masse.

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Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (135), e56842, doi:10.3791/56842 (2018).

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Abstract

Les lipoprotéines sont des constituants importants de l’enveloppe de la cellule bactérienne et puissants activateurs de la réponse immunitaire innée chez la mammifères. Malgré leur importance à la fois la physiologie cellulaire et immunologie, il reste encore beaucoup à découvrir sur les lipoprotéines nouveaux formulaires, comment ils sont synthétisés et l’effet des différentes formes sur l’immunité de l’hôte. Pour permettre des études approfondies sur les lipoprotéines, ce protocole décrit une méthode pour l’enrichissement de lipoprotéines bactériennes et préparation de N-terminal lipopeptides tryptique pour la détermination de structure par laser assistée par matrice desorption ionisation-temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS). Poursuivant sur une phase de Triton X-114 établie partitionnement méthode pour extraction de lipoprotéines et l’enrichissement de la membrane de la cellule bactérienne, le protocole prévoit des mesures supplémentaires pour éliminer les contaminants non-lipoprotéines, augmentant le rendement de la lipoprotéine et pureté. Étant donné que les lipoprotéines sont couramment utilisés dans les essais de récepteurs Toll-like (TLR), il est essentiel d’abord caractériser la structure de N-terminal par MALDI-TOF Mme Herein, on présente une méthode pour isoler des peptides hydrophobes concentrés enrichis en N-terminal lipopeptides adaptés à l’analyse directe par MALDI-TOF MS/MS. lipoprotéines qui ont été séparés par électrophorèse Sodium dodécyl Sulfate Poly-Acrylamide (SDS-PAGE) sont transférées à une membrane de nitrocellulose, digérés in situ avec la trypsine, séquentiellement lavé pour enlever des peptides tryptiques polaires et finalement élué avec du chloroforme-méthanol. Lorsqu’il est couplé avec MS des peptides trypsinisés plus polaires de solutions de lavage, cette méthode fournit la capacité à identifier la lipoprotéine et caractériser son extrémité N-terminale dans une expérience simple. Formation d’un adduit sodium intentionnelle peut également être utilisée comme un outil pour promouvoir plusieurs spectres de fragmentation structurellement informative. En fin de compte, enrichissement des lipoprotéines et détermination de leurs structures de N-terminal permettra des études plus approfondies sur cette classe omniprésente des protéines bactériennes.

Introduction

Lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par une conservée cystéine des lipides modifiés de N-terminal qui ancre le domaine protéine globulaire à la surface de la membrane cellulaire. Ils sont universellement distribués chez les bactéries, qui constituent 2 à 5 % de tous les gènes cellulaires au sein d’un génome typique1. Assemblée de complexes protéiques et dans le maintien de cellules enveloppe intégrité structurale2, lipoprotéines jouent un rôle crucial dans une grande variété de processus cellulaires, notamment l’absorption des éléments nutritifs, transduction du signal. Chez les bactéries pathogènes, lipoprotéines servent de facteurs de virulence3,4. Lors d’une infection, reconnaissance des lipopeptides N-terminale de récepteur Toll-like (TLR) 2 incite à une réaction immunitaire innée pour éliminer les pathogènes envahisseurs. Selon l’état de l’acylation N-terminale, lipoprotéines sont généralement reconnus par le remplaçant TLR2 hétérodimérique complexes. TLR2-TLR1 reconnaît N-acylés lipopeptides, tandis que TLR2-TLR6 lie lipopeptide libre α-aminé termini. Une fois lié, les voies de signalisation convergent pour induire la sécrétion de proinflammatory cytokines3,4.

On pensait auparavant que lipoprotéines de bactéries Gram-positives ont été diacylated et ceux des bactéries à Gram négatif triacylated, différant par l’absence ou la présence d’un acide gras amidé sur le résidu de cystéine N-terminale conservé. Cette hypothèse a été soutenue par l’absence de séquences orthologues dans les génomes de Lnt, la transférase de N-acyl-Gram négatif qui forme triacylated lipoprotéines5Gram positifs. Cependant, des études récentes ont révélé triacylation lipoprotéine dans Firmicutes Gram positif que manque lnt, ainsi que trois structures de lipoprotéines N-terminal roman, appelés la peptidyl, lyso et N -acétyl formes6,7 ,,8. Ces résultats soulèvent des questions sur les formulaires de lipoprotéine d’encore-à-être-découvert possible, aux côtés des questions fondamentales sur comment ces nouvelles lipoprotéines sont faites et quel but physiologique ou avantage répandre des diverses formes. En outre, ils démontrent clairement l’incapacité actuelle de la génomique pour prédire la structure de lipoprotéines. En effet, nous avons récemment identifié une nouvelle classe de transférase de N-acyl-lipoprotéine, appelé Lit, Enterococcus faecalis et Bacillus cereus qui rend lyso-formulaire lipoprotéines9. Ceci indique la nécessité de vérifier expérimentalement la structure de lipoprotéines, qui peut s’avérer difficile en raison de leur nature extrêmement hydrophobe et limitée des méthodes permettant de caractériser leur structure moléculaire.

Pour faciliter les études sur l’induction de la réponse immunitaire de l’hôte, ainsi que la détermination structurale N-terminal de lipoprotéine, nous avons adapté plusieurs protocoles décrits précédemment afin de purifier les lipoprotéines bactériennes et préparer le tryptique N-terminal lipopeptides pour analyse par MALDI-TOF MS6,10,11,12. Les lipoprotéines sont enrichis en utilisant une phase de X-114 Triton (désormais dénommé surfactant ou TX-114) établie partitionnement méthode, avec optimisation pour enlever les contaminants non-lipoprotéines et augmenter le rendement de la lipoprotéine. Ces lipoprotéines sont appropriés pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou pour davantage de purification par SDS-PAGE. Pour MALDI-TOF MS, transfert des lipoprotéines de membrane de nitrocellulose fournit un échafaudage pour efficace in situ la digestion trypsique, lavage et élution subséquente de la surface de la membrane, ce qui entraîne très purifiée lipopeptides N-terminale. Nitrocellulose a été établi pour faciliter la manipulation des échantillons et améliorer la couverture de séquence pour les peptides fortement hydrophobes de l’intégrale de membrane protéines13,14, ainsi que les lipoprotéines9,10 . La méthode a l’avantage supplémentaire de fractionnement des peptides basées sur la polarité, afin que des solutions de lavage intermédiaire peuvent être analysées pour l’identification de protéines de haute confiance en même temps que la détermination de structure N-terminale dans une expérience simple . Ce protocole unique sodium intentionnelle caractéristiques la formation d’adduits à promouvoir la fragilisation d’ion parent vers dehydroalanyl ions pendant MS/MS, aidant à affectation structurelle de l’état d’acylation - N. L’extrémité N-terminale est deux la fonctionnalité plus variable et clée liée à la reconnaissance TLR des lipoprotéines. Pris ensemble, ce protocole a permis des études intensives et reproductibles sur les lipoprotéines, les différentes étapes de purification et de la détermination de structure par MALDI-TOF MS facilement adapté selon l’objectif global de l’expérience.

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Protocol

1. la croissance et la lyse des cellules

  1. Se développent bactéries dans 15 mL de bouillon de trypticase soja (TSB) ou multimédias semblables à la fin de la phase exponentielle (OD600 de 1,0 à 1,5). Récolter les cellules par centrifugation, laver une fois avec une solution saline tampon Tris/EDTA (TBSE) et poursuivre avec le protocole ou geler jusqu'à l’utilisation.
    NOTE : TBSE : 20 mM Tris-hydrochloride (HCl), pH 8,0, le chlorure de sodium (NaCl), 130 mM et 5 mM d’acide tétraacétique (EDTA)). Modification et expression de lipoprotéines peuvent être influencés par des conditions de croissance (p. ex. l’acidité, salinité, milieux de culture) et la phase de croissance15. La croissance des cellules peut évoluer comme vous le souhaitez, mais 15 mL de cellules est recommandé pour une préparation unique de lipoprotéines comme la biomasse excédentaire peut diminuer le rendement des lipoprotéines. Une préparation de 15 mL donne généralement assez échantillon pour un chargement optimal de ~ 2 à 4 voies sur un gel mini standard de SDS-PAGE.
  2. Remettre en suspension les cellules en 800 μL TBSE avec fluorure de sulfonyle de benzyle 1 mM (PMSF) et le lysozyme de 0,5 mg/mL. Transvaser la solution dans un tube de microcentrifuge fileté 2,0 mL avec bouchon à vis et le joint torique et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
    NOTE : Certaines espèces ne sont pas sensibles à la lyse par la lysozyme. Une enzyme lytique appropriée devrait être substituée afin d’aider à la lyse.
  3. Ajouter des perles de zircone/silice 0,1 mm ~ 800 μL dans le tube et perturber les cellules par agitation à vitesse maximale (7 000 tr/min) sur un homogénéisateur pour 5 cycles de 30 s chacune, avec 2 min de repos sur la glace entre chaque cycle.
  4. Échantillon de centrifuger à 3000 g pendant 5 min à 4 ° C (pour granuler perles et ininterrompu de cellules). Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 2,0 mL et rester sur la glace.
  5. Ajouter 200 μl TBSE au culot restant et revenir à l’homogénéisateur pour un cycle supplémentaire. Centrifuger (voir ci-dessus) et combiner le surnageant avec le surnageant précédent (devrait être le volume total de la 800-1000 μL).

2. enrichissement des lipoprotéines par séparation de phases TX-114

  1. Compléter le surnageant avec TX-114 agent tensio-actif à une concentration finale de 2 % (vol/vol) en ajoutant un volume égal de 4 % (vol/vol) le surfactant dans TBSE glacée et incuber sur glace pendant 1 heure, mélanger par inversion chaque ~ 15 min.
    Remarque : Lorsqu’on les refroidit, le surnageant et le surfactant sera miscibles.
  2. Transférer le tube dans un bain-marie à 37 ° C et laisser incuber pendant 10 min induire la phase de séparation. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 10 min à température ambiante pour maintenir l’espacement bi-phasique.
  3. Doucement Pipetter au large de la phase aqueuse supérieure et le jeter. Ajouter TBSE glacé à la phase inférieure de surfactant pour remplir le tube à son volume initial et renverser pour mélanger. Incuber sur glace pendant 10 min.
  4. Transférer le tube dans un bain-marie à 37 ° C et incuber pendant 10 min induire la séparation des phases, puis centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à température ambiante.
  5. Répétez les étapes 2,3-2,4 fois plus pour un total de 3 séparations. La phase aqueuse supérieure de retirer et jeter.
  6. Enlever la pastille de protéines précipités formé au cours de l’extraction (visible au fond du tube), en ajoutant 1 volume de TBSE glacé à la phase de surfactant. Centrifuger à 4 ° C à 16 000 x g pendant 2 min granuler les protéines insolubles.
    NOTE : Échantillon doit rester une seule phase. En cas de séparation de phase, re-chill échantillon et centrifuger à nouveau. Le culot est généralement composé de contaminants non-lipoprotéines, mais peut être conservé pour une analyse ultérieure.
  7. Transférer immédiatement le surnageant dans un tube de frais microtubes de 2,0 mL contenant 1250 μL d’acétone 100 %. Pipette de haut en bas soigneusement laver l’échantillon de la pointe, car il sera visqueuse. Mélanger par retournement et incuber une nuit à-20 ° C à précipiter les protéines.
  8. Centrifuger l’échantillon à 16 000 x g pendant 20 min à température ambiante pour granuler des lipoprotéines avec attention à l’orientation du tube. Lipoprotéines formera un film mince, blanc le long de la paroi extérieure du tube.
  9. Pellet de laver deux fois avec l’acétone à 100 %. Décanter l’acétone et laisser l’échantillon à l’air sec.
  10. Ajouter 20-40 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ou une norme Laemmli SDS-PAGE échantillon tampon16 et soigneusement resuspendre par pipetage verticalement contre le mur avec les lipoprotéines précipités. Raclez les parois de l’éprouvette avec l’embout de la pipette pour déloger des lipoprotéines.
    Remarque : Les lipoprotéines seront dissoudront pas dans un tampon Tris, mais plutôt forment une suspension.
    1. Stocker des lipoprotéines à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. SDS-PAGE, Electroblotting et coloration avec Ponceau S

  1. Lipoprotéines séparés par SDS-PAGE à l’aide de méthodes standard16.
    NOTE : Le pourcentage d’acrylamide gel appropriée variera selon son utilisation prévue et de la taille des lipoprotéines. Ici, E. faecalis lipoprotéines ont été séparés sur un 10 % gel de Tris-glycine, alors qu’un gel de Tris-tricine 16,5 % a été utilisé pour la lipoprotéine d’e. coli plus petite Lpp17.
  2. Transférer les lipoprotéines à une membrane de nitrocellulose transfert en utilisant une procédure standard electroblotting.
    Remarque : Un transfert semi-sec à l’aide de Bjerrum Schafer-Nielsen tampon plus 0,1 % SDS s’est déroulée à 25 V, 1.3 mA pour 15 min18. Alternativement, membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) pourrait être utilisé, mais comme il est plus hydrophobe que la nitrocellulose, elle pourrait diminuer efficace d’élution des lipopeptides hydrophobe de la membrane aux étapes ultérieures.
  3. Transférer la membrane de nitrocellulose dans un récipient et le couvercle avec la solution de Ponceau S (0,2 % (p/v) : Ponceau S dans l’acide acétique à 5 %). Rocher doucement pendant 5 min ou jusqu'à ce que les bandes rouge-rose sont visibles.
  4. Décanter la solution de Ponceau S et Rincez soigneusement la membrane de nitrocellulose avec dH2O pour supprimer excès stain.
    NOTE : Les bandes colorées Ponceau vont décolorer rapidement. Si les bandes disparaissent, répétez le processus de coloration.
  5. Avec une lame de rasoir propre, exciser la bande désirée et transférez dans un tube de microcentrifuge. Laver trois fois avec 1 mL de dH2O à décolorer entièrement la bande.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Stocker la section excisée recouverte d’eau à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
  6. La section de transfert sur une surface propre et avec une lame de rasoir propre, dés la bande de nitrocellulose en petits morceaux d’environ 1 mm x 1 mm. collecter les morceaux dans un tube à microcentrifugation 0,5 mL hypoprotidique liaison.
  7. Laver les morceaux deux fois avec 0,5 mL de fraîchement préparés 50 mM de bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3), pH 7,8 en eau de qualité de chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

4. tryptique Digestion, Lipopeptide Extraction de la Membrane de Nitrocellulose, déposition sur cible MALDI et Acquisition de données

  1. Remettre en suspension les morceaux de nitrocellulose dans 20 μL d’une solution de 20 μg/mL de trypsine dans 50 mM NH4HCO3pH 7,8 en eau de qualité HPLC. Vortex pour mélanger, puis tourner brièvement pour s’assurer que toutes les pièces sont entièrement couverts par la solution de trypsine. Couvrir le couvercle du tube à l’aide de film de paraffine pour éviter l’évaporation et incuber digérer pendant une nuit à 37 ° C.
  2. Rotation de l’échantillon à 16 000 x g pendant 30 s et retirer le liquide de pipetage.
    NOTE : Cette commande supprime les peptides hydrophiles trypsinisés pouvant être examinés plus tard par MALDI-TOF MS pour l’identification des protéines.
  3. Ajouter 50 μL de 0,5 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans l’eau de qualité HPLC. Vortex pour mélanger, puis faites tourner l’échantillon brièvement pour s’assurer que toutes les pièces sont couverts par la solution. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Retirer le liquide de pipetage.
    Mise en garde : TFA est nocif par inhalation. Manipuler avec précaution et utiliser dans la hotte de laboratoire chimique. Éviter tout contact avec la peau.
  4. Répétez l’étape 4.3 avec 50 μL de 10 % d’acétonitrile dans l’eau de qualité HPLC.
    Mise en garde : L’acétonitrile est nocif par inhalation. Manipuler avec précaution et utiliser dans la hotte de laboratoire chimique. Éviter tout contact avec la peau.
  5. Répétez l’étape 4.3 avec 50 μL de 20 % d’acétonitrile dans l’eau de qualité HPLC.
    Remarque : Cette commande supprime toute peptides modérément hydrophobes faiblement liées à la nitrocellulose.
  6. Éluer les lipopeptides étroitement liée, ajouter 15 μl de matrice (ACSSD) acide α-cyano-4-hydroxycinnamique 10 mg/mL fraîchement dissoute dans du chloroforme-méthanol (2:1, v/v) et incuber pendant 10 min à température ambiante avec agitation intermittente.
    1. On peut aussi ajouter 15 μL de chloroforme-méthanol pour éluer les lipopeptides et matrice se mêlent à une date ultérieure. Autres matrices, tels que l’acide 2, 5-dihydroxybenzoïque (DHB), doivent être testés comme solutions de rechange de CHCA si on obtient des résultats insatisfaisants pour une composition particulière lipopeptide.
      Mise en garde : Tant chloroforme / méthanol sont nocifs par inhalation. Manipuler avec précaution et utiliser dans la hotte de laboratoire chimique. Éviter tout contact avec la peau.
    2. Facultatif : Sodium de promouvoir la formation d’adduits, compléter la solution de CHCA dans le chloroforme-méthanol avec du bicarbonate de sodium aqueux (NaHCO3) à une concentration finale de 1 mM.
  7. Faire tourner l’échantillon brièvement. Avec une pipette, transvaser avec soin le liquide dans un nouveau tube de microcentrifuge de liaison faible en protéines. Cette solution contient l’essentiel de la lipopeptides N-terminale.
    Remarque : La nitrocellulose peut partiellement ou totalement se dissolvent dans la solution de chloroforme-méthanol. Cela n’affectera pas négativement les résultats de MS et peut être utilisé comme une méthode alternative d’accroître le rendement de lipopeptides. Membrane de PVDF se dissoudront pas de la même manière.
  8. Déposer 1 μL des lipopeptides éluée avec CHCA sur une cible MALDI en acier polie.
    Remarque : Le chloroforme-méthanol s’évaporera rapidement, laissant derrière eux cristallisé CHCA et lipopeptides. Une option seconde 1 μL aliquote peut être déposé sur le même endroit pour augmenter la concentration de l’échantillon. Chloroforme-méthanol peut se propager significativement après la déposition sur la cible et à ce titre, il faut pour éviter le mélange d’échantillon sur la cible. Il est recommandé de déposer et de tirer plusieurs spots de chaque échantillon.
  9. Procéder immédiatement à la spectrométrie de masse. Balayer tous les domaines de la tache pour lipopeptide signal, surtout si l’endroit contient deux couches d’échantillon, car la deuxième couche peut pousser les lipopeptides au bord extérieur de la tache.
    NOTE : Intensité du laser départ recommandée est 25 %, mais il peut être nécessaire d’augmenter l’intensité pour acquérir le signal et la somme de plusieurs spectres (analyses de 20 ou plus) pour atteindre le rapport signal-bruit proportionné. Ici, les spectres ont été acquis sur un instrument de MALDI-TOF-TOF (voir la Table des matières) en utilisant une méthode de l’instrument configuré en usine pour la détection d’ions positifs de réflecteur sur la plage de m/z 700-3500. L’appareil a été étalonné avec un mélange de peptide trypsique de l’albumine sérique bovine (BSA).

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Representative Results

Une représentation schématique du protocole est fournie à la Figure 1. La fraction enrichie en lipoprotéines extraite de Enterococcus faecalis ATCC 19433 par TX-114 est illustrée à la Figure 2. À titre de comparaison, le marquage chromosomique de la fraction des protéines précipitées est aussi indiquée. Protéines de cette fraction ont été confirmés par MALDI-MS pour être très abondantes contaminent les protéines autres que des lipoprotéines (tableau 1). Les spectres de masse à la Figure 3 démontrent le profil d’ion peptide trypsique de la lipoprotéine d’e. faecalis PnrA qui se produit avec des lavages ultérieurs du PnrA nitrocellulose lié avec des solvants de polarité (PIC cessions visées dans les de plus en plus Tableau 2). La figure 4 montre le N-terminale caractérisation structurale du PnrA tel que déterminé par MALDI-TOF-MS/MS, révélant le diagnostic N- acylés dehydroalanyl pics en accord avec la forme de lyso-lipoprotéine. La figure 5 illustre l’effet du sodium la formation sur la fragmentation, d’adduits avec l’ion parent sodiated préférentiellement fragmentant en faveur de la N- acylés dehydroalanyl ion.

Figure 1
Figure 1 : schéma du protocole. Les lipoprotéines sont enrichis par la séparation de phases TX-114 et peuvent être utilisés directement, le plus souvent lors d’essais de TLR ou purifiés pour la détermination de structure par SDS-PAGE. Les lipoprotéines sont transférés à la nitrocellulose, digérés par la trypsine, lavée par étapes et la résultante lipopeptides élué avec du chloroforme-méthanol pour l’analyse structurale par MALDI-MS. Les solutions de lavage de la trypsine et de la nitrocellulose peuvent être sauvegardées pour l’identification des protéines et l’analyse SM. w / : ; TFA : l’acide trifluoroacétique ; ACN : acétonitrile ; CHCA : α-cyano-4-hydroxycinnamique ; OPT : facultatif ; MALDI : désorption-ionisation laser assistée par matrice ; MS : spectrométrie de masse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Profil du TX-114 enrichi en protéines d’e. faecalis. Un gel de Tris-glycine SDS-PAGE 10 % colorées au bleu de Coomassie bleu (A) et la membrane de nitrocellulose correspondant teintés avec Ponceau S (B) révèlent un baguage différentes mires entre la fraction des protéines précipitées (« PPT ») et purifiés lipoprotéines (« LP »). Les bandes colorées au bleu de Coomassie indiquées ont été excisées et identifiés comme non-lipoprotéines par MALDI-MS des peptides tryptiques (voir tableau 1). PnrA a été identifié et analysé par le protocole décrit ci-après. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : les changements de profil et l’abondance de Ion avec polarité de nitrocellulose laver solutions. (A) la fraction de la trypsine montre plusieurs fragments de peptide interne correspondant à la lipoprotéine d’e. faecalis que PNRA a indiqué à la Figure 2. Le 10 % (B) et 20 % d’acétonitrile (C) laver fractions Voir la changements d’intensité de signal et une diminution du nombre global des sommets individuels. (D) la fraction d’élution finale est hautement enrichie avec les lipopeptides N-terminal à m /z 997, signalé par un astérisque (*). Intensité de chaque spectre est normalisée à (A) pour la comparaison de l’intensité du signal. Masses de pics et de séquences attribuées sont répertoriés dans le tableau 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Bande ID de la protéine N° d’adhésion Poids moléculaire (HNE). Comte de peptide
1 facteur d’élongation Tu GB | EOL37301.1 | 43 387 15
2 Peroxydase du NADH GB | EOL34572.1 | 49 520 9
3 pyruvate déshydrogénase E1component, sous-unité alpha GB | EOL34709.1 | 41 358 12
4 composant de pyruvate déshydrogénase E1, bêta sous-unité GB | EOL34710.1 | 35 373 19
5 Protéine ribosomale 30 s S2 GB | EOL33066.1 | 29 444 16
6 Protéine ribosomale 30 s S3 GB | EOL37312.1 | 24 355 14

Tableau 1 : les protéines précipitées sont contaminants non-lipoprotéines. Les protéines ont été identifiées par digestion trypsique et MALDI-MS à l’aide de la norme en gel de protocoles de digestion19 et sont répertoriés de haut en bas dans le même ordre qu’ils apparaissent sur le gel de Coomassie dans la Figure 2. Chaque protéine a été identifié avec un intervalle de confiance (IC) supérieur à 95 %.

Nombre maximal Masse théorique Position de protéine N ° des Sites de coupe interrompues Séquence peptidique
1 631.3409 170-176 0 GVADAAK
2 675.4035 316-321 1 TKEAVK
3 826.4093 163-169 0 FQAGFEK
4 893.4839 121-128 0 NVVSATFR
5 943.5359 240-247 0 VWVIGVDR
6 1040.5047 188-197 0 YAASFADPAK
7 1200.6331 273-284 0 GVGTAVQDIANR
8 1316.6997 290-301 0 FPGGEHLVYGLK
9 1385.7827 83-94 0 FNTIFGIGYLLK
10 1432.743 149-162 0 VGFVGGEEGVVIDR
11 1568.7802 259-272 1 DGKEDNFTLTSTLK
12 1672.8289 240-254 1 VWVIGVDRDQDADGK
13 1707.8184 129-145 0 DNEAAYLAGVAAANETK
14 1724.8027 35-49 0 SFNQSSWEGLQAWGK
15 1797.9228 257-272 2 TKDGKEDNFTLTSTLK
16 1872.9854 285-301 1 ALEDKFPGGEHLVYGLK
17 1945.9613 230-247 1 DLNESGSGDKVWVIGVDR
18 2240.1345 149-169 1 VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK
19 2675.2543 230-254 2 DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK

Tableau 2 : observe les masses et les peptides tryptiques correspondantes. In silico de digestion trypsique du PnrA E. faecalis (GenBank : EOL37280.1) a été effectuée à l’aide de PeptideMass20,21, permettant jusqu'à deux manqué coupe des sites. Les masses théoriques des pics observés sur les spectres à la Figure 3 sont répertoriés, ainsi que les séquences peptidiques correspondantes.

Figure 4
Figure 4 : MALDI-TOF MS de la lipoprotéine d’e. faecalis PnrA. (A) spectre MS Parent de la m /région de z 997 correspondant à la lipopeptide N-terminal du PnrA E. faecalis . (B) MS/MS du pic lipopeptide révèle que c’est la forme de lyso, avec le diagnostic N- acylés dehydroalanyl peptide fragment ion pic signalé par un astérisque (*). La structure élucidée est indiquée (C). Ce chiffre a été modifié par une précédente publication9. R.I. : intensité relative s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : formation d’un adduit Sodium favorise la fragmentation ion parent vers ions lipopeptide dehydroalanyl. (A) les spectres de MALDI-TOF du peptide lipoprotéine Lpp N-terminal e. coli sans (traces de turquoise) et avec (traces bleus) l’ajout de bicarbonate de sodium. Ajout de bicarbonate de sodium à la fraction d’élution finale provoque une augmentation de 22 Da de la masse calculée de le lipopeptide parent. En comparaison avec le spectre MS/MS de l’ion protonée (B), le spectre MS/MS de l’ion correspondant de sodiated (C) montre importante fragmentation préférentielle vers le N-acyl-dehydroalanyl ion par neutre élimination de la fraction diacylthioglyceryl, signalée par un astérisque (*). La structure du peptide trypsique parent triacylated Lpp N-terminal (D) et le N-acyl-dehydroalanyl ion de fragment peptidique (E) sont représentés. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication9. R.I. : intensité relative s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole ci-après décrit deux étapes distinctes de caractérisation des lipoprotéines : enrichissement de TX-114 phase de détermination de partitionnement et structurale par MALDI-TOF MS. Pendant l’essorage TX-114, centrifugation supplémentaire supprime les protéines contaminantes qui précipitent au cours de ce processus, suivi par la précipitation de l’acétone à céder des lipoprotéines hautement enrichis. En limitant l’échelle de chaque préparation à une valeur de 15 mL de cellules, plusieurs échantillons peuvent être facilement traitées en parallèle et si vous le souhaitez, regroupées à la fin du protocole.

Pour l’analyse structurale par MS, transfert des lipoprotéines à la nitrocellulose facilite la digestion trypsique, lavage et élution ultérieure de la membrane. Dans nos mains, cette approche s’est avéré pour être préférable d’extraction induite par le détergent de gel de polyacrylamide traditionnels bouchons, car les lipoprotéines sont associées à la surface de la membrane de nitrocellulose et pas entourés de polyacrylamide. Association des lipoprotéines avec la surface de nitrocellulose empêche également en grande partie le problème commun de l’adsorption non spécifique aux surfaces de conteneur de peptides de hydrophobes. Élution progressive des pièces nitrocellulose supprime plusieurs peptides tryptiques hydrophiles, internes qui peuvent être analysés par MALDI-TOF MS pour atteindre les affectations de confiance élevée protéines d’identification, alors que l’étape d’élution finale rendements reproductible lipopeptides concentrés dans un petit volume qui est en grande partie exempt de sels interférentes et ion supprimant les contaminants.

Analyse par SM réussie d’une lipoprotéine est sous réserve de son abondance, et à ce titre, les bandes plus sombres de la membrane de Ponceau S colorés sont susceptibles de donner les meilleurs résultats. Cependant, il est possible que plusieurs lipoprotéines peuvent migrer dans une seule bande pendant la séparation de PAGE, ce qui complique les spectres qui en résulte. Par conséquent, il est fortement recommandé d’abord identifier la protéine en masse de peptide prise d’empreintes digitales (PMF), qui peut être accompli en recueillant les spectres MS sur la fraction totale de la trypsine ou de chaque fraction de lavage de l’acétonitrile et saisit les pics qui en résulte dans un logiciel comme mascotte22. Une fois la séquence protéique a été déterminée, calculer la masse de la tryptique lipopeptide N-terminal significativement aide à choisir quel ion à fragmenter par SM/SM.

Hétérogénéité d’échantillon supplémentaire peut résulter de différentes longueurs de chaînes acyl sur les lipoprotéines au sein d’une population et leurs modifications N-terminal, les deux selon la source bactéries6. Alors que la variation de longueur de chaîne rend pour les clusters de pic sur les spectres de parent, caractérisées par 14 Da incréments correspondant aux groupes méthylènes (- CH2-), il peut diviser le signal global de lipopeptides et diminuer la sensibilité. Il est également probable que les formes différentes lipoprotéines influencent l’enrichissement et la fragmentation, si nous avons identifié avec succès triacylated, diacylated et lipoprotéines de lyso-formulaire en utilisant le protocole décrit. De même, les diverses fractions de peptide des lipoprotéines ajoutent un autre niveau de complexité aux analyses, quelle que soit leur structure N-terminal, comme une composition très hydrophile acide aminé peut empêcher lipopeptide partitionnement dans la phase organique chloroforme à l’aide d’autres méthodes d’extraction8. Transfert de la lipoprotéine à la nitrocellulose aiderait à étudier ces lipopeptides, comme toutes les fractions de l’élution peuvent être analysées dans cette méthode.

Puisant dans la littérature concernant les triacylglycérols et phospholipides23, sodium intentionnelle de la formation d’adduits peuvent servir à promouvoir une fragmentation plus informative via la formation de la (N-acyle)-dehydroalanyl ion de peptide. Ces ions caractéristiques sont essentiels à l’affectation de structure, étant donné que l’état de l’acylation de l’extrémité N-terminale est isolé les substitutions d’acyle sur la portion de glycéryle. Formation d’un adduit sodium fournit une option de rechange commode en soufre oxydation par le peroxyde d’hydrogène, qui s’est avéré également promouvoir N-acyl-dehydroalanyl peptide fragmentation6,8. Bien que les adduits de sodium peut voir l’une suppression globale du signal ion parent, l’augmentation spécifique de fragmentation vers dehydroalanyl ions compense intensité ion parent diminuée. Il peut être intéressant à explorer d’autres matrices et fragmentation des adduits afin d’obtenir les spectres plus informatifs.

Ce protocole améliore la traditionnelle phase de TX-114 partitionnement procédé d’enrichissement de lipoprotéines, tandis que le transfert des lipoprotéines PAGE séparée d’une membrane de nitrocellulose facilite la digestion trypsique et élution de lipopeptides. Analyse de MALDI-TOF MS sur les fractions tryptiques ou lavage totales permet l’identification de protéines en tandem avec détermination de structure N-terminal par SM/SM dans une expérience simple. Sodium en option adduit formation faits saillants des différences à la lipopeptide aminée en favorisant la fragmentation ion plus informative. La capacité de systématiquement lipoprotéines de purifier et caractériser leurs extrémités N-terminales permettra des études approfondies sur des lipoprotéines comment de nouveaux formulaires sont établis, leur rôle physiologique au sein de l’enveloppe de la cellule bactérienne, et comment elles sont détectées par le système immunitaire chez les mammifères système.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Recherche dans le laboratoire de Meredith a été financée par des fonds de démarrage fournis par le Collège Eberly de la Science (Pennsylvania State University). Nous remercions le Dr Tatiana Laremore d’expertise technique et l’accès à l’équipement à la Penn State protéomique et spectrométrie de masse Core Facility, University Park, PA, où ont été effectuées des analyses par spectrométrie de masse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
0.01 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 110791012
Acetic acid EMD AX0073-9
Acetone EMD AX0116-6
Acetonitrile EMD AX0142-6
Ammonium bicarbonate Fluka Analytical 09830
BioTrace NT Nitrocellulose PALL Life Sciences 66485
Bovine serum albumin (BSA) digest standard Protea PS-204-1
Chloroform Acros Organics 423550025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP118
HPLC Grade water EMD WX0008-1
Lysozyme Fisher Scientific BP535-1
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) Amresco 0754
Pierce trypsin protease Thermo Scientific 90057
Ponceau S Acros Organics 161470100
Protein LoBind Tube 0.5mL Eppendorf 022431064
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 792519
Sodium chloride Macron Fine Chemicals 7581-06
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich 299537
Tris-hydrochloride (HCl) Fisher Scientific BP152
Triton X-114 Sigma-Aldrich 93422
Tryptic soy broth (TSB) BD 211822
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) Sigma-Aldrich C8982
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MagNALyser Roche
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad
MALDI-TOF target Bruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF Bruker Daltonics Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser

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References

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