터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

Cancer Research

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Summary

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

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Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

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Abstract

그것은 관리와 암 환자에 대 한 특정 분자 표적된 약의 치료 전에 암에서 mutational 상태를 결정 하는 중요 한입니다. 임상 설정에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 유전자 테스트를 위한 널리 사용 됩니다. 그러나, FFPE DNA는 일반적으로 손상 되 고 포 르 말린으로 고정 과정 조각. 따라서, FFPE DNA는 때로는 낮은 품질 및 수량 DNA의 유전자 검사에 적합 하지. 여기 우리가 터치 인쇄물 세포학 (TIC), 암 세포에서 게놈 DNA를 현미경으로 관찰 될 수 있는 방법 제시. 셀 형태 및 암 세포 숫자는 TIC 견본을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 또한, TIC 샘플에서 게놈 DNA 추출 2 이내에 완료할 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 얻은 TIC DNA의 품질과 총 FFPE DNA 보다 높았다. 이 신속 하 고 간단한 방법 연구를 결과 보고에 대 한 처리 시간을 단축 하 고 유전자 검사 (예를 들어, 다음 세대 시퀀싱 분석, 디지털 PCR 및 양적 실시간 PCR)에 대 한 높은-품질 DNA를 수 있습니다.

Introduction

차세대 시퀀싱 기술 제공 하고있다 연구팀은 유전자 변형, Mendelian 질병, 유전 경향, 및 암 1,2,3 게놈 정보 분석에 중요 한 발전 . 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 및 국제 암 게놈 컨소시엄 (ICGC) 유전 변경 일반적인 암4의 여러 종류의 식별을 추구 했습니다. 수백 개의 필수 암 드라이버 유전자 성공적으로 확인 되었습니다, 그리고 이러한 분자의 일부 약물 개발1,,56타겟이 되고있다.

임상 설정에서 FFPE 표본 병 적인 진단과 분자 암 등 각종 질병에 대 한 테스트를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 포 르 말린으로 고정 과정 DNA-단백질 또는 DNA-DNA cross-linking과 DNA 파편을 유도. 따라서, FFPE DNA 샘플 적합 하지 않습니다 항상 유전자 분석에 대 한 낮은 질 및 양의 DNA7,,89. 또한, 고 기술 섹션을 정확 하 게 준비 해야 하는 FFPE 표본 준비를 몇 일 걸립니다. 따라서, 그것은 높은-품질 그대로 DNA를 얻기 위한 간단 하 고 빠른 방법을 개발 하는 것이 좋습니다.

세포학 병 적인 진단 위한 대체 방법입니다. Cytological 샘플 준비는 간단 하 게, 덜 FFPE 준비10에 비해 비싸고 더 빠른 접근 이다. TIC 기술 센 티 넬 림프절과 몇 년11,12자가 빠른 진단을 위해 유방암 환자에서 한계 조직에 수행 되었습니다. 그러나, TIC 표본에서 높은-품질 게놈 DNA를 추출할 수 있습니다 여부를 조사 하 고 후속 유전자 분석에 사용 되는 몇 가지 보고 있다. Cytological 표본은 일반적으로 물 들일 Papanicolaou (Pap) 또는 Giemsa 얼룩, 그리고 우리 이전 TIC 표본 (특히 Giemsa 얼룩이 샘플)에서 추출한 DNA의 품질과 양을 FFPE에서 얻은 샘플을 우수 하다는 것을 보고 조직13. Pap 얼룩과 비교, Giemsa 얼룩 장점이 덜 착 절차 요구에 있습니다. Pap 얼룩에 샘플 수정 되 고 스테인드, 후 그들은 해야 합니다 탑재할 종양 세포, 정상 세포를 현미경으로 염증 세포 등 샘플 내용을 구별을 위한 매체 (, Malinol)를 장착. Pap 견본 설치 단계 없이, 준비 하는 경우 거의 불가능 한 표본은 건조 하기 때문에 현미경으로 세포를 관찰 하는 것 아니다. 비교에서는, Giemsa 얼룩 말린된 상태에서 관찰 될 수 있다, 그러므로, 설치 단계 빠른 세포 평가 위해 필요 하지 않습니다. 서, 대 한 Giemsa 얼룩은 더 적당 한 건조 표본 필요 하기 때문 에입니다.

이 보고서에서 우리 TIC 표본을 Giemsa 얼룩과 준비에 대 한 간단 하 고 빠른 방법을 소개 하 고 TIC가 더 나은 FFPE 표본에 비해 DNA에 대 한 설명.

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Protocol

1. TIC 대비 빠른 현미경 평가 일반 유리를 사용 하 여 슬라이드

  1. 임상 병리학 조직 재료 사용할 수 있는 후 최대한 빨리 TIC 준비를 수행 합니다. TIC 표본 즉시 준비 수 없습니다, 경우 멸 균 거 즈 염 습으로 덮여 조직 자료를 유지 하 고 조직의 건조를 방지 하기 위해 냉장고에 보관.
  2. 5mm3 조직 소재 고체 종양 (예를 들어, 간, 폐, 그리고 유 방 조직) 등 수술이 나 내 시경으로 얻은 임상을 준비 합니다.
    1. 부드럽게 살 균-거 즈로 생리 식 염 수와 코팅 조직 닦 고 조직 표면에 혈액의 많은 경우, 혈액을 제거.
    2. 생 검 자료 등 현미경 표본에 대 한 멸 균 거 즈 생리 식 염 수에 담가 적신 샘플 계속.
  3. 잘라 정상적인 조직 트리밍 칼으로 손질 하 고 종양 질량 전부 표시 되지 않는 경우 종양 병 변의 표면 노출.
  4. 여러 번 gloved 손 가진 정상적인 유리 슬라이드에 절제 표본의 종양 표면 터치. 시각적으로 확인 하는 감동된 지역 일반 유리 슬라이드의 80% 이상 이다.
  5. 가볍게 폴 리 에틸렌 naphthalate (펜) 막 슬라이드에 대 한 일반 유리 슬라이드를 누르고 gloved 손을 가진 2-3 회를 부드럽게 문 지. 시각적으로 확인 하는 셀 펜 막 슬라이드에 일반 유리 슬라이드에서 전송 됩니다.
  6. 유리 및 실 온에서 5 분에 대 한 펜 막 슬라이드 건조.
  7. 직접 cytological 시험에 대 한 일반 유리 슬라이드를 얼룩. 5 s, 통 솔루션 유리 슬라이드와 Giemsa 얼룩 15에 대 한 솔루션을 다음 얼룩이 찍어 s.
  8. 평가 하 고 전체로 빠른 평가 위한 현미경 종양 내용과 cellularity 일반 유리 슬라이드에 화면. 종양 세포; 여러 기준에 따라 평가 핵 확대, 비정상적인 karyotype, 풍부한 chromatin, 셀의 부동 한 배급, 핵 구성 요소/세포질 구성 요소, 셀 크기 및 세포 극성의 비율.

2. 유전자 검사를 위한 펜 막 슬라이드 필름의 준비

  1. 샘플 종양 cellularity 경우 빠른 현미경 평가 (1.8), 단계에 의해 60% 이상의 DNA 추출에 대 한 펜 막 슬라이드의 종양 감동 영화 칼으로 잘라내어 gloved 손. pincette와 gloved 손 살 균 microcentrifuge 튜브 컷된 영화 전송.
  2. 종양 cellularity 낮은 (종양 내용의 60% 미만) 빠른 현미경 평가 (단계 1.8)에 의해 결정 되었다, 레이저 캡처 서 사용 하 고 종양 샘플을 얻을.
    1. 평가 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 종양 세포를 얼룩이 지기 Giemsa 수행 합니다.
    2. 적절 한 레이저 캡처 기정에 의해 PEM 막 슬라이드 필름을 잘라.
    3. pincette와 gloved 손 살 균 microcentrifuge 튜브 컷된 영화 전송.
    4. (프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기) DNA 추출까지 4 ° C에서 포함 하는 필름 microcentrifuge 튜브를 저장 합니다.

3. DNA 추출

  1. 제조업체의 지침에 따라 FFPE DNA 추출 키트를 사용 하 여 사소한 수정 TIC 또는 FFPE 조직 샘플에서 DNA 추출을 수행 합니다. 해당 키트는 FFPE DNA 추출 단계 수 있습니다.
  2. 180 µ L의 조직 세포의 용 해 버퍼를 추가 (pH = 8.3) 수동 200 µ L 피 펫과 영화 포함 된 microcentrifuge 관에. 5에 대 한 최대 속도 (약 2500 rpm)와 동 믹서와 vortexing에 의해 수동 20 µ L 피 펫과 혼합 성분 K의 20 µ L를 추가 s.
  3. 공기 인큐베이터와 56 ° C에서 샘플 밤새 품 어.
  4. 각각 1 h 10 분에 대 한 열 블록에 90 ° C에서 FFPE TIC 샘플을 품 어. 짧게 1500 x g 5에서 microcentrifuge 튜브 아래로 회전 미니 원심 분리기와 실 온에서 s.
  5. 5에 대 한 최대 속도에서 vortexing에 의해 철저 하 게 세포의 용 해 버퍼의 200 µ L 200 µ L 피 펫과 혼합 샘플에 추가 s.
  6. 200 µ L 피 펫과 에탄올 (96-100%)의 200 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합 vortexing 5에 대 한 최대 속도에 의해 짧게 s. 1500 x g 5에서 microcentrifuge 튜브 아래로 회전 미니 원심 분리기와 실 온에서 s.
  7. 조심 스럽게 전체 lysate 1000 µ L 피 펫 및 25 ° c.에 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기 회전 열을 전송
  8. 장갑 낀 손으로 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 스핀 열을 놓고 흐름 통해 플라스틱 처리 상자에 포함 된 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
  9. 워시 버퍼의 500 µ L 1000 µ L 피 펫 및 25 ° c.에 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기 회전 열에 추가
  10. 장갑 낀 손으로 깨끗 한 2 mL 컬렉션 튜브에 스핀 열을 놓고 흐름 통해 플라스틱 처리 상자에 포함 된 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
  11. 워시 버퍼의 500 µ L 1000 µ L 피 펫 및 25 ° c.에 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기 회전 열에 추가
  12. 플라스틱 처리 상자에 통해 흐름 포함 하는 컬렉션 튜브를 삭제 합니다. 장갑 낀 손으로 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 스핀 열을 놓고 막 건조 25 ° C에서 3 분 20000 x g에서 원심.
  13. Gloved 손 가진 DNA-낮은 바인딩 튜브에 스핀 열을 배치 합니다.
    1. 100 µ L 피 펫과 막의 중심을 차입 버퍼의 40-50 µ L를 추가 합니다.
    2. 5 분 및 25 ° c.에 1 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기에 대 한 실 온에서 품 어
    3. (프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기) 다음 단계까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.

4. 양적 실시간 PCR에 의해 DNA 품질의 추정

  1. 피 펫, 멸 균 microcentrifuge 튜브에 마스터 믹스를 다음과 같이 준비: 10 µ L 실시간 PCR 주인 혼합, 20의 1 µ L x 2의 RNase P 뇌관 프로브 믹스 x (amplicon 크기: 87 혈압), 그리고 살 균 nuclease 무료 물 8 µ L.
  2. 다음과 같이 한 살 균 microcentrifuge 튜브에 두 번째 마스터 믹스를 준비: 10 µ L 실시간 PCR 주인 혼합, 20의 1 µ L x 2의 RNase P 뇌관 프로브 믹스 x (amplicon 크기: 268 bp), 그리고 살 균 nuclease 무료 물 8 µ L.
  3. 5 포인트 표준 곡선에 대 한 인간의 제어 genomic DNA (키트에 제공 된)의 직렬 희석 4 번을 수행 하 고 절대 DNA 농도13를 결정 합니다.
  4. 20 µ L 피 펫과 광학 96-잘 반응 판의 별도 우물에 두 준비 마스터 믹스 (4.1 및 4.2 단계에서 준비)의 19 µ L를 추가 합니다.
  5. 2 µ L 피 펫 반응 혼합을 포함 하는 우물을 분리 하는 FFPE DNA 또는 TIC DNA의 1 µ L를 추가 합니다. 없는 템플릿 컨트롤에 대 한 반응 혼합을 포함 하는 별도 잘으로 nuclease 무료 물 1 µ L를 추가 합니다.
  6. 광학 접착제 필름 비 접착제 면을 보유 하 고 다시이 영화의 중심에서 백업 보호 껍질. 부드럽게 주걱 필름 끌어서 96 잘 접시 위에 영화 인감.
  7. 부드럽게 혼합 96 잘 접시 10 96 잘 접시 믹서를 사용 하 여 s 2000 rpm에서 실내 온도에. 잠시 실 온에서 3 분 1000 x g에서 격판덮개 원심
  8. 실시간 PCR 장비 및 삽입 96 잘 접시에 힘. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 20 95 ° C s 1 s 및 20 60 ° C s. 사용 "표준 곡선" 및 "고속 모드"에 대 한 95 ° C의 45 주기 다음
  9. DNA (상대 정량화;의 비율 DNA 파편을 평가 RQ) 긴 amplicon 획득 (268 bp) 짧은 amplicon에 (87 bp). RQ는 짧은 amplicon13의 긴 amplicon/는 평균 값의 평균 값입니다.

5. 다음 세대 시퀀싱 라이브러리 준비

  1. 제조업체의 지침에 따라 다음 세대 시퀀싱 시퀀싱 라이브러리를 준비 합니다.
  2. 샘플 당 살 균 microcentrifuge 관에서 다중 PCR 마스터 믹스를 다음과 같이 준비: 멀티플렉스 PCR 반응 솔루션, 뇌관 수영장, ≤6 µ L TIC 또는 FFPE DNA (1-100 ng), x 5의 4 µ L x 5의 4 µ L 20 µ L까지 물을 nuclease 무료 추가.
    1. PCR 튜브와 믹스를 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스 추가 부드럽게 튜브를 활용 하 여.
    2. 짧게 1500 x g 5에서 microcentrifuge 튜브 아래로 회전 미니 원심 분리기와 실 온에서 s.
  3. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 99 ° C의 20 주기 다음 2 분 동안 99 ° C 15 s 및 4 분 및 지주를 위한 60 ° C에 10 ° c.를 단계 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
    참고: 뇌관 쌍의 수에 따라 사이클의 수를 결정 합니다.
  4. PCR 튜브의 뚜껑 열고 2 µ L 피 펫으로 제한 효소의 2 µ L를 추가 합니다. PCR 튜브 두 드려서 부드럽게 PCR 튜브와 섞어 덮개를 닫습니다. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
  5. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 10 분, 10 분, 20 분 동안 60 ° C에 55 ° C 50 ° C 그리고 지주 단계 10 ° c. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
  6. 추가 어댑터 결 찰 마스터 믹스는 각 잘 포함 하는 피 펫과 소화 PCR amplicons 같습니다으로: 어댑터 결 찰 솔루션의 4 µ L, 바코드의 0.5 µ L, 어댑터의 0.5 µ L, 2 µ L nuclease 무료 물 및 DNA 리가의 2 µ L. 두 드려서 부드럽게 PCR 튜브와 섞어 덮개를 닫습니다. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 PCR 튜브 아래로 회전 실 온에서 s.
  7. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 30 분, 5 분, 5 분, 72 ° C 68 ° C 22 ° C 그리고 지주 단계 10 ° c.
  8. 제조업체의 지침에 따라 자석 구슬 시퀀싱 라이브러리를 정화.
  9. 1.5 mL DNA 낮은 바인딩 튜브에 어댑터 출혈 라이브러리 솔루션을 전송 합니다. 1세인트 정화에 대 한 DNA 낮은 바인딩 튜브에 자석 구슬의 45 µ L를 추가 합니다. 튜브를 두 드려서 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  10. 마그네틱 랙에 DNA-낮은 바인딩 튜브 장소 다음 솔루션은 분명 때까지 실 온에서 2 분 동안 품 어. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고 200 µ L 피 펫과 상쾌한 폐기.
  11. 200 µ L 피 펫과 갓된 70% 에탄올의 150 µ L를 추가한 다음는 튜브 사이드-투-사이드 씻어 구슬 자석의 이동. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고는 상쾌한 폐기.
  12. 두 번째 세척에 대 한 단계 5.11를 반복 합니다.
  13. 짧게 회전 튜브 미니 원심 분리기에서 1500 x g 5와 실 온에서 s. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 에탄올 방울 10 µ L 피 펫을 신중 하 게 삭제 합니다.
  14. 분산 구슬 자석 구슬 펠 릿을 포함 하는 DNA 낮은 바인딩 관으로 낮은 테의 50 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 2 분 동안 품 어.
  15. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 솔루션은 분명 때까지 2 분 동안 실 온에서 품 어.
  16. 새로운 DNA 낮은 바인딩 관으로 상쾌한의 50 µ L를 전송 하 고 2nd 정화에 대 한 100 µ L 피 펫과 자석 구슬의 75 µ L를 추가 합니다. 튜브를 두 드려서 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  17. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브 장소 다음 솔루션은 분명 때까지 실 온에서 2 분 동안 품 어. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고 200 µ L 피 펫과 상쾌한 폐기.
  18. 200 µ L 피 펫과 갓된 70% 에탄올의 150 µ L를 추가한 다음는 튜브 사이드-투-사이드 씻어 구슬 자석의 이동. 신중 하 게 자기 구슬을 방해 하지 않고는 상쾌한 폐기.
  19. 두 번째 세척에 대 한 5.18 단계를 반복 합니다.
  20. 짧게 5 1500 x g에서 미니 원심 분리기와 튜브 스핀 실 온에서 s. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 에탄올 방울 10 µ L 피 펫을 신중 하 게 삭제 합니다.
  21. 분산 구슬 자석 구슬 펠 릿을 포함 하는 DNA 낮은 바인딩 관으로 낮은 테의 50 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 2 분 동안 품 어.
  22. 마그네틱 랙에 DNA 낮은 바인딩 튜브를 놓고 솔루션은 분명 때까지 2 분 동안 실 온에서 품 어.
  23. 100 µ L 피 펫과 새로운 DNA 낮은 바인딩 관으로 순화 된 라이브러리를 포함 하는 상쾌한의 45 µ L를 전송 합니다.

6. 계량 양적 실시간 PCR에 의해 도서관 농도

  1. 제조업체의 지침13에 따라 각 도서관의 농도 결정 합니다.
    1. 다음과 같이 20-fold 희석 솔루션 준비: 믹스 2 µ L의 순화 된 라이브러리와 DNA 낮은 바인딩 튜브에서 nuclease 무료 물 38 µ L 2 µ L 및 100 µ L 피 펫.
    2. 7.3 단계까지-20 ° C에서 undiluted 라이브러리를 저장 합니다.
  2. 다음과 같이 200-fold 희석 솔루션 준비: 20-fold 희석된 순화 라이브러리 (단계 6.1에서에서 준비)의 5 µ L을 혼합 및 DNA 낮은 바인딩 튜브에서 nuclease 무료 물 45 µ L.
  3. 다음과 같이 2,000-fold 희석 솔루션 준비: 200-fold 희석된 순화 라이브러리 (6.2 단계에서 준비)의 5 µ L을 혼합 및 DNA 낮은 바인딩 튜브에서 nuclease 무료 물 45 µ L.
  4. 다음과 같이 반응 마스터 믹스를 준비: 믹스 마스터 믹스 솔루션 x 2의 10 µ L와 살 균 microcentrifuge 튜브에 뇌관-조사 분석 결과 솔루션 x 20의 1 µ L를 피펫으로 다음 튜브를 활용 하 여 섞는다. 광학 96-잘 반응의 우물에 반응 마스터 믹스의 11 µ L를 추가 합니다.
  5. 각 잘 10 µ L 피 펫을 2,000-fold 희석된 라이브러리의 9 µ L, 각 표준 컨트롤의 9 µ L 또는 nuclease 무료 물 9 µ L를 추가 합니다.
  6. 광학 접착제 필름 비 접착제 면을 보유 하 고 다시이 영화의 중심에서 백업 보호 껍질.
    1. 부드럽게 주걱 필름 끌어서 96 잘 접시 위에 영화 인감.
    2. 부드럽게 혼합 96 잘 접시 10 96 잘 접시 믹서를 사용 하 여 실 온에서 s.
    3. 잠시 실 온에서 3 분 1000 x g에서 격판덮개 원심
  7. 실시간 PCR 장비 및 삽입 96 잘 접시에 힘. 다음 프로토콜을 사용 하 여 PCR 반응 실행: 2 분, 20 95 ° C 50 ° C s, 95 ° C의 40 주기 1 s 및 20 60 ° C s. 사용 "표준 곡선" 및 "고속 모드"에 대 한 다음
  8. 2000 정량으로 정한 농도 곱하여 undiluted 라이브러리 농도 계산 합니다.

7. 다음 세대 시퀀싱

  1. 실행된 상태를 계획 하 고 소프트웨어 실행된 매개 변수를 설정 합니다.
    1. [계획 탭]을 클릭 하 고 [템플릿], 적절 한 실행된 방법 선택.
    2. 응용 프로그램 및 기술 유형을 선택 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    3. 선택 악기, 샘플 준비 키트 (옵션), 라이브러리 키트 형식, 템플릿 키트, 시퀀싱 키트, 보정 모드를 기본, 칩 유형, 컨트롤 시퀀스 (옵션), 그리고 바코드 집합 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    4. 플러그인을 선택 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    5. 프로젝트를 선택 하 고 [다음]을 클릭 합니다.
    6. 기본 참조 및 대상 영역의 침대 파일을 선택 합니다.
    7. 샘플 이름 입력, 바코드를 선택 하 고 [실행 계획]을 클릭 합니다.
  2. 서식 파일 준비를 수행 하 고 제조업체의 지침에 따라 자동된 악기에 로드 칩. 시 약 카트리지 사용 하기 전에 45 분 동안 실 온에서 녹여
  3. Undiluted 라이브러리 라이브러리 농도 단계 6.8에서에서 계산에 따르면 nuclease 무료 물으로 희석 하 고 20 오후 라이브러리.
    1. 시퀀싱 및 저장소 얼음에 풀링된 라이브러리를 준비 합니다.
    2. 샘플 튜브의 아래쪽에는 풀링된 도서관 100 µ L 피 펫 25 µ L를 추가 합니다. 48 h 이내 풀링된 라이브러리를 사용 합니다.
  4. 전원을 켜고 자동된 악기의 덮개를 엽니다.
    1. 시퀀싱 칩, 칩 어댑터, 농축 카트리지, 카트리지 팁, PCR 플레이트, PCR 프레임 물개, 복구 튜브, 솔루션 카트리지, 및 시 약 카트리지 자동된 악기의 적절 한 위치에 놓습니다.
    2. 터치 [설치 실행]과 [단계적] 화면에.
    3. 덮개를 닫고 [확인 시작] 화면에 터치.
    4. 갑판 후 스캔 프로세스, 화면에서 [다음]을 터치 합니다.
    5. 표시 내용 (키트 유형, 칩 유형, 칩 ID, 샘플 ID 계획)를 확인 하 고, 시간 설정 화면에서 [확인]을 터치.
  5. 칩 로드를 마치고:
    1. 화면에서 [다음]을 터치 하 고 덮개를 엽니다.
    2. 장갑 낀 손으로 칩 어댑터에서 시퀀싱 칩을 언로드.
    3. 칩 칩 컨테이너에 배치 parafilm와 저장소 시퀀싱 반응까지 4 ° C에서 랩.
    4. 장갑 낀 손으로 자동된 악기의 적절 한 위치에서 농축 카트리지, PCR 플레이트, PCR 프레임 물개, 복구 튜브, 솔루션 카트리지, 및 시 약 카트리지를 제거.
    5. 장갑 낀 손으로 자동된 악기의 폐기물 팁 위치에 빈 팁 카트리지를 전송 합니다.
    6. [다음]을 터치 하 고 커버를 닫습니다.
    7. [시작]을 터치 하 고 4 분에 대 한 자외선에 의해 자동된 악기를 청소.
  6. 나트륨 chlorite 태블릿 초순과 0.22 μ m 필터 흐름 필터 장치 필터 솔루션의 1000 mL에 용 해.
    1. 전원 시퀀싱 악기에.
    2. [클린] 터치 및 시퀀싱 악기의 화면에서 [다음].
    3. 250 mL 필터 소독 나트륨 아 염소 산 염 해결책의 및 초순 이후 250 mL와 시퀀싱 악기 청소.
  7. [초기화]를 터치 하 고 화면에 적절 한 시퀀싱 키트를 선택 합니다.
    1. 장갑 낀 손으로 적절 한 위치에 회색 화주를 설치 합니다.
    2. 세척 솔루션 (키트에 제공), pH 조정 솔루션 (100 m m 수산화 나트륨의 350 µ L을 포함 하는)와 (키트에 제공) pH 표준 솔루션 시퀀싱 악기를 초기화 합니다.
  8. 100 µ L 피 펫을 50 mL 튜브 (키트에 제공 된)에서 (키트에 제공 되는) dATP, dGTP, dCTP, dTTP 뉴클레오티드의 20 µ L를 추가 합니다.
    1. 장갑 낀 손으로 적절 한 위치에 회색 화주를 설치 합니다.
    2. 50 mL 튜브 및 나사 시퀀싱 악기에 로드 합니다.
    3. 초기화 단계는 약 25 분 소요를 시작 하는 화면에서 [다음]을 터치 합니다.
  9. 초기화 단계를 완료:
    1. 화면에서 [실행]을 터치 하 고 적절 한 라이브러리 준비 악기를 선택 합니다.
    2. 칩의 2 차원 바코드를 스캔.
    3. 적절 한 위치에 시퀀싱 칩을 삽입 합니다.
    4. 칩 클램프 및 악기 문을 닫습니다.
    5. [칩 확인], [다음], 및 시퀀싱 실행 시작 화면에서 [확인].
  10. 시퀀싱 반응 후 데이터를 전송 하 고 시퀀싱 서버13,17에 파이프라인 데이터 분석을 수행 합니다.

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Representative Results

그림 1 에서 DNA 추출 TIC 표본을 준비 전체 프로세스를 보여 줍니다. 특히, 절차 TIC 샘플에서 게놈 DNA를만 2 일 걸립니다. 우리는 슬라이드 처리 하기 전에 종양 스토리지의 어떤 효과 평가합니다. 우리는 조직 표본을 즉시 슬라이드에 감동 했다 그리고 염 분 moistened 살 균-거 즈에 1 h (그림 2)에 대 한 조직을 유지 했다 종양 세포를 유리 슬라이드에 연결 된 발견. 그러나, 조직 실 온에서 보관 했다 때 종양 세포 했다 잘 연결 되지 슬라이드에. 준비 슬라이드 3 개월간 4 ° C에서 저장 될 수 있었다. 따라서, 그것은 건조 표본 수 있도록 중요 하지 않습니다.

우리는 우리의 방법의 유틸리티를 검사 하 고 표본 FFPE를 사용 하 여 인수와 비교. TIC와 FFPE 샘플 14 종양 견본에서 준비 했다 그리고 우리는 종양 내용과 순도 TIC 표본에서 평가 될 수 있는 확인. 우리가 Giemsa 얼룩 수행 된 후 종양 세포와 종양 형태 수 현미경 검사 법에 의해 사정 될 수 있습니다. 우리는 따라서 종양 세포를 정기적으로 평가 하 고 DNA 품질 검사를 수행 하는 이후 수 있었다.

DNA 양과 질 양적 실시간 PCR13,,1415에 의해 견적 되었다. 우리는 절대 DNA 수량 및 genomic DNA의 저하 수준 표시기 RQ 값 결정. 결과 더 높은 DNA 수율 TIC 표본 FFPE 표본 (표 1)와 비교를 사용 하 여 달성 되었다 나타났다. 또한, TIC DNA의 RQ 값 크게 높은 비교 되었다 FFPE DNA의 (그림 3, p = 10-8, 양측 스튜던트 t 테스트 x 2.3). 우리는 또한 RQ 값 TIC 및 FFPE DNA 다른 종양 종류에서 추출 하 고 발견 TIC DNA FFPE DNA (그림 3)에 비해 품질에서 더 높은 평가. 이러한 결과 TIC DNA는 FFPE DNA 보다 덜 조각난 표시.

우리는 다음 TIC DNA 다음 세대 시퀀싱 분석에 사용 될 수 있는지 여부를 평가. FFPE TIC DNA 주 대 장 암, 전이성 간 암 환자 (그림 4A)에서 얻은에서 준비 했다. PCR 증폭 및 라이브러리 준비 암 핫스팟 패널을 사용 하 여 실시 했다 고 이후에 타겟된 시퀀싱을 수행 했다. 그 결과, APC Q1367 * 확인 되었다 FFPE에 TIC DNA 사이트 1 (표 2)에서 추출. 또한, APC S1356 *, KRA G12D, 및 TP53 M237I 두 FFPE에서 검색 된 및 TIC DNA 추출 사이트에서 2, 3, 및 4 (표 2). 이러한 결과 동일한 체세포 돌연변이 짝된 FFPE TIC DNA 샘플 같은 종양 사이트 (그림 4B표 2) 준비에 발견 했다 제안 했다. 특히, 같은 체세포 돌연변이 주 대 장 암 (사이트 2, 사이트 1)와 두 개의 전이성 간 암 샘플 사이트 2에서 종양 클론 (그림 4B표 2) 간 전이 제안 사이 발견 했다. 함께 이러한 결과 좋습니다 TIC DNA 높은 품질 이며, 다음 세대 시퀀싱 등 유전자 테스트의 광범위를 위해 적당 하다.

Figure 1
TIC 샘플 준비에서 DNA를 얻기 위한 1 회로도 그림. 종양 조직 TIC 샘플을 준비 하는 슬라이드 유리에 감동입니다. 종양 형태와 내용을 현미경의 평가, 후 종양 DNA 추출 고 유전자 테스트를 위해 사용 될 수 있습니다. 콩을 사용 하 여 종양 DNA 얻어질 수 있다 임상 병리학 견본에서 2 일 이내. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. TIC 샘플의 준비입니다. Resected 종양 표본을 즉시 일반 유리 슬라이드 (왼쪽된 패널), 염 분 moistened 멸 균-거 즈 1 h (가운데)에 보관에 진 고 (오른쪽) 1 시간 실 온에서 보관. 샘플 #1 간세포 암 이었고 샘플 #2 했다 유방암. 현미경 사진 현미경에 장착 된 디지털 카메라를 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 실시간 양이 많은 PCR 분석에 의해 DNA 품질 검사 추정. TIC와 FFPE DNA 대 장에서 14 종양 조직에서 추출 되었다 (n = 8), 위 (n = 4), 전이성 간 암 (n = 2). TIC Giemsa FFPE 그 샘플 사이의 상대 정량화 점수의 비교. TIC DNA의 RQ 값 FFPE DNA의 그것 보다 훨씬 더 높은 했다. 두 그룹 간의 통계 분석 수행과 p-값 Excel을 사용 하 여 짝이 없는 양측 스튜던트 t 검정에 의해 계산 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. TIC와 FFPE DNA를 사용 하 여 다음 세대 시퀀싱 분석 데이터. (A) Macroscopic 및 현미경 이미지. TIC Giemsa FFPE 그 샘플 (사이트 3, 4) 전이성 간 암과 대 장 암 (사이트 1 및 2)에서 얼룩의 대표 이미지. 거시적인 이미지에 눈금 막대: 1 cm, 현미경 이미지에 눈금 막대: 100 µ m. (B) 열 지도 각 종양 사이트에 대 한 체세포 돌연변이의 분포를 보여 주는 (n = 8). 동일한 돌연변이 짝된 TIC와 FFPE DNA 샘플 중 발견 했다. 유전자 분수의 값은 100% (핑크) 1% (라이트 핑크)에서 졸업 색 눈금에 표시 됩니다. 회색 열 없음 확인 된 돌연변이 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

TIC Giemsa (n = 14) FFPE 그 (n = 14)
총 DNA (ng) 총 DNA (ng)
샘플 종양 사이트 짧은 RQ 짧은 RQ
Site1 콜론 1495 1247 0.83 939 349 0.37
Site2 콜론 991 1057 1.07 556 204 0.37
Site3 467 511 1.09 130 39 0.3
Site4 2172 2115 0.97 488 127 0.26
Site5 콜론 749 598 0.8 529 10V 0.39
Site6 330 286 0.86 211 98 0.46
Site7 636 499 0.78 154 84 0.55
Site8 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 콜론 1986 1611 0.81 476 163 0.34
Site10 콜론 280 218 0.78 209 83 0.39
Site11 콜론 1546 575 0.37 366 159 0.43
Site12 1501 1200 0.8 274 132 0.48
Site13 콜론 1556 1404 0.9 326 179 0.55
Site14 콜론 1565 1210 0.77 680 295 0.43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

표 1입니다. DNA 품질 데이터입니다. 짝 TIC (n = 14) 및 FFPE 표본 (n = 14) 결 장, 간, 그리고 위장 암에서 준비 했다. TIC 샘플 했다 Giemsa, 물 그리고 FFPE 샘플 hematoxylin와 (그가) 오신 얼룩이 있었다. DNA 샘플 추출 되었고 양적 실시간 PCR에 의해 증폭 RNaseP 소재 시 2 개의 뇌관 쌍 계량 (긴 amplicon (268 bp)와 짧은 amplicon (87 혈압)). RQ 값은 다음과 같이 계산 되었다: 긴 amplicon의 평균 값 분할 곁 짧은 amplicon의 평균 값. SD, 표준 편차; RQ, 상대 정량

샘플 이름 위치 준비 유전자 기호 변이 위치 참조 변형 코딩 적용 범위 유전자 분수
주 대 장 암 사이트 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
주 대 장 암 사이트 1 TIC APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
주 대 장 암 사이트 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
주 대 장 암 사이트 2 FFPE KRA G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52%
주 대 장 암 사이트 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
주 대 장 암 사이트 2 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89%
주 대 장 암 사이트 2 TIC KRA G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56%
주 대 장 암 사이트 2 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
전이성 간 암 사이트 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
전이성 간 암 사이트 3 FFPE KRA G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62%
전이성 간 암 사이트 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
전이성 간 암 사이트 3 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97%
전이성 간 암 사이트 3 TIC KRA G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64%
전이성 간 암 사이트 3 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
전이성 간 암 사이트 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93%
전이성 간 암 사이트 4 FFPE KRA G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60%
전이성 간 암 사이트 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
전이성 간 암 사이트 4 TIC APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
전이성 간 암 사이트 4 TIC KRA G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62%
전이성 간 암 사이트 4 TIC TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

표 2입니다. 짝 FFPE와 타겟된 시퀀싱 분석에 의해 검출 하는 TIC DNA에 돌연변이의 비교. 짝 TIC와 FFPE 샘플 2 주 대 장 암 (사이트 1 및 2)에서 준비 했다 2 전이성 간 암 (사이트 3, 4). 타겟된 시퀀싱은 이러한 DNA 샘플 수행 하 고 체세포 돌연변이 발견 했다. 변이 프로필 짝된 TIC와 FFPE DNA 샘플 사이 동일 했다.

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Discussion

이 연구에서 우리는 콩을 사용 하 여 임상 병리학 표본에서 종양 DNA를 얻기 위해 다른 방법을 제시. TIC 준비는 매우 간단 하 고 특별 한 악기10에 대 한 요구 사항 없이 FFPE 방법에 비해 더 적은 시간이 필요. (그림 1) 2 이내 TIC 준비에서 DNA 추출에 모든 절차를 완료할 수 있습니다. 이 메서드는 따라서 유전자 검사를 수행 하기 위한 처리 시간이 줄어듭니다. 특히, 분자 분석에 필요한 일 수 단축에 상당한 이점을 제공 합니다. 이 짧은 처리 시간 즉시 분자로 대상된 약물을 필요로 하는 진보적인 암 환자에 대 한 적절 한 치료를 제공할 수 있습니다. 따라서이 방법은 종양에서 유전 변경의 분석 및 암 치료에 대 한 분자로 대상된 약물의 관리에 대 한 혜택을 제공합니다.

TIC DNA 유전자 분석에 대 한 사용의 성공에 대 한 몇 가지 핵심 포인트 들이 있다. 종양 조직 화학 요법 같은 치료 나 다른 치료 때문에 회 저 성 있을 수 있습니다. 따라서, 주의을 피하기 위해 가능 한 한 종양 괴 사 성 섹션에서 샘플링 TIC 표본 준비에 필요 합니다. 또한, 초기 현미경 평가 후속 절차에 대 한 매우 중요 하다. 또한, 종양 조직의 건조 방지 성공적인 TIC 샘플 준비에 필요한입니다. 종양 조직, 건조 하는 경우이 유리 슬라이드에 적은 연결 된 셀에 결과. 그것은 종양 조직의 변성을 리드 건조 하기 때문에 종양 cellularity 및 형태를 관찰 하는 것도 어려울 것 이다.

TIC DNA를 사용 하 여 몇 가지 잠재적인 이득이 있다. 첫째, 우리는 현미경으로 첫 번째 평가 중 종양 cellularity를 확인할 수 있습니다. Stromal 세포, 세포와 정상 세포는 조직 샘플에서 풍부 했다, 이러한 정상 세포의 오염 종양 세포에 체세포 돌연변이 검색 하는 기능 하지 못하도록 것입니다. 샘플의 빠른 현미경 평가 종양 cellularity의 평가 및 적절 한 종양 DNA 샘플 DNA 추출 전에 TIC 샘플에서 가져온 여부의 추정 하는 데 도움이 있습니다. 둘째, 우리의 결과 TIC DNA는 모두 높은 품질과 수량을 보였다. FFPE DNA 타겟된 시퀀싱, exome 시퀀싱, 그리고 전체 게놈 시퀀싱16,17,18,,1920를 포함 하 여 다음 세대 시퀀싱 분석에 사용 되었습니다. 그러나 보관 FFPE DNA FFPE DNA 포 르 말린 기정 동안 조각화 될 수 있습니다 유전 분석21,22를 또한 정기적으로 사용 됩니다. 이 PCR 증폭 또는 DNA 추출, 시퀀스 범위, 대상 지역에 균일의 부족을 일으키는 문제가 발생 하 고 시퀀스 오류23,24의 위험을 증가 시킬 수 있습니다. 반면, TIC DNA는 하지 조각, 때문에 핵 산에 영향의 더 적은 가진 알코올 고정 있을 수 있습니다. TIC DNA FFPE DNA 처럼 조각화 되지 않은이 샘플 다음 세대 시퀀싱 분석, 실시간 PCR, 및 디지털 PCR를 위해 더 적당 한 될 것입니다. 사실, 우리가 이전 TIC DNA 종양 견본에서 다음-세대 시퀀싱 분석, "TIC-seq" 이라는 방법 사용할 수 있습니다 및 결과 정확 하 게 종양 체세포 돌연변이13캡처할 수 보였다. 셋째,이 기술은 재료의 광범위 한 적용 됩니다. 현재 보고서에서 우리는 수술 표본을 사용. 수술 조직, 전이성 림프절 이외에 기관지 또는 내 시경 생 검 TIC DNA를 준비 하기 위한 사용할 수 있습니다.

결론적으로, 우리는 TIC 샘플을 사용 하 여 높은-품질 종양 DNA를 준비 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시. 이 방법은 유전자 분석의 분야에서 새로운 가능성을 확장 하 고 정밀 의학 임상 설정에서 홍보할 수 있도록.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

우리는 병원과 환자 들의 의료 및 보조 직원 참여 동의 감사. 우리는 가브리엘 화이트 울프,이 보고서의 초안을 편집 하기 위해 Edanz 그룹 (www.edanzediting.com/ac)에서 박사 학위를 감사 합니다. 이 연구는 야마나시 현 (Y.H. 고 지)에서 게놈 연구 프로젝트와 부여에서는 야스다 의료 재단 (Y.H.)는 특정에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

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References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373, (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45, (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6, (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339, (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23, (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53, (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39, (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161, (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45, (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32, (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1, (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5, (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8, (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8, (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46, (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17, (1), 833 (2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34, (1), 3 (2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3, (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3, (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376, (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13, (3), 3493 (2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13, (7), 23 (2014).

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