스테이 시스 고주파 초음파에 의해 모니터링 하는 쥐에 의해 유도 된 깊은 정 맥 혈전 증

Immunology and Infection

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Summary

현재 프로토콜 스테이 시스 모델을 사용 하 여 정 맥 혈전 증을 얻기에 단계를 설명 합니다. 또한, 우리는 시간이 지남에 혈전 형성 및 해상도 측정 하는 비-침략 적 방법을 사용 하는.

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Rys, R. N., Blostein, M. D., Lemarié, C. A. Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography. J. Vis. Exp. (134), e57392, doi:10.3791/57392 (2018).

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Abstract

정 맥 혈전 증 1에서 500의 연례 부각 인구의 1-2%에 영향을 미치는 일반적인 상태 이다. 정 맥 혈전 증 폐 색 전 증 또는 결과 만성적인 다리 통증, 붓기, 및 궤, 특징 후 thrombotic 증후군 또는 만성 폐 고혈압 인 중요 한 만성 통해 죽음으로 이어질 수 있습니다 호흡기 타협. 가장 일반적인 심혈 관 질환 심근 경색 및 허 혈 성 뇌졸중 후 이며 암, 조직의 질환, 수술 등 주요 외상 다른 장애의 과정을 복잡 하 게 수로 모든 의료 분야에 대 한 임상 도전 이다.

실험 모델은 이러한 메커니즘을 연구 하는 데 필요한. 스테이 시스 모델 일관성 혈전 크기와 혈전의 정량 금액을 유도합니다. 그러나, 그것은 체계적으로 열 등 한 베 나 정 맥 혈전 크기에서 변화 및 모든 잘못 된 데이터 해석에의 측 지점 선 하는 데 필요한. 초음파를 사용 하 여 혈전 크기를 측정 하는 비-침략 적 기술을 개발 했습니다. 이 기술을 사용 하 여, 우리가 평가할 수 혈전 개발 및 해상도 같은 동물에서 시간이 지남에. 이 방법은 마우스 교체, 감소, 및 연구에 있는 동물의 구체화의 원리와 일치 하는 정 맥 혈전 증의 정량화에 필요한 수를 제한 합니다. 우리는 초음파로 혈전 무게와 측정으로 혈전 크기 상관의 조직학 분석 얻은 증명 하고있다. 따라서, 현재 연구에 높은 주파수의 초음파를 사용 하 여 모니터링 하는 방법 열 등 한 베 나 정 맥 stasis 모델을 사용 하 여 마우스에 깊은 정 맥 혈전 증을 유발 하는 방법을 설명 합니다.

Introduction

정 맥 혈전 색 전 증 (VTE), 깊은 정 맥 혈전 증 (DVT) 폐 색 전 증의 구성 된 심근 경색 및 뇌졸중 후 심장 혈관 죽음의 세 번째 주요 원인입니다. 그것은 1에서 5001의 연간 발생률을 인구의 1-2%에 영향을 미치는 일반적인 조건. VTE 이어질 수 있습니다: 1) 폐 색 전 증; 통해 죽음 만성적인 다리 통증, 붓기, 및 궤; 특징 2) 후 thrombotic 증후군 또는 3) 중요 한 만성 호흡 타협의 결과로 만성 폐 고혈압. VTE는 다중 요인 질병 이며 그것은 전에 백 년 이상 설명으로 혈액의 흐름, 혈관 벽, 또는 hypercoagulable 국가 응고 fibrinolytic 시스템 사이의 균형의 붕괴 때문에 손상의 스테이 시스에서 발생할 수 있습니다. Virchow에 의해 Virchow의 3 인조로 알려져 있다.

대부분의 경우에서 그것은 인간의 DVT 샘플을 얻을 수, 때문에 연구원은 DVT의 실험 동물 모델을 개발 했습니다. 쥐2, 마우스3, 토끼4, 돼지5,6개 및 비 인간 영장류7 을 포함 하 여 여러 동물 사용 되었습니다. 쥐 유전자 변형 될 수 있으며 DVT를 공부 하는 가장 자주 사용된 동물. 모든 동물에서의 자발적인 DVT 하지 쥐에서 관찰 됩니다. 따라서, 정 맥 벽의 물리적 또는 화학적 변경 마우스에서 혈전 증을 만드는 데 사용 됩니다. 우리는 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 마우스8,,910의 혈전 증을 유발 하 이전 제 2 철 염화 모델을 이용 했다. 이 분 이내 폐색 혈전을 안정적으로 생산의 장점이 고 급성 DVT 동안 항 응고 제와 항 혈소판 약물의 역할을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 터미널 절차입니다. 따라서, 공부 하 고 급성과 만성 DVT, 스테이 시스 모델 더 적당 하다. 이 모델에서는 혈전 형성 IVC, DVT 개발 Virchow의 3 인조의 요소 중 하나에서 혈액 흐름의 완전 한 중단에 의해 유도 된다. DVT 형성 FeCl3 모델11에 비해 이점이 해상도 공부 하 고이 모델을 사용할 수 있습니다.

혈전 형성 및 해상도 마이크로 이미징-고주파 초음파 시스템12을 사용 하 여 시간이 지남에 따라 비-침략 적 방법을 개발 했습니다. 우리는 이전 측정 초음파에 의해 정 맥 혈전 증의 혈전 병 적 얻은 호의 상관을 증명 하고있다. 우리가 측정 초음파 상관 혈전 무게와 혈전 영역 histochemistry9,10정량으로 얻은 두 후속 연구에서 확인 했습니다. 더 중요 한 것은, 우리는 높은 주파수 초음파 쥐12에서 깊은 정 맥 혈전의 형성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다 보여주 있다. 그것은 또한 비-침략 적 방법으로 혈전 해상도 척도를 사용할 수 있습니다.

여기, 우리는 스테이 시스 유도 혈전 증 마우스 모델 및 어떻게 혈전 형성을 모니터링할 수 있습니다 비 접촉 고주파 초음파를 사용 하 여 시간이 지남에 사용 하 여 혈전 형성을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

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Protocol

모든 절차는 기관 동물 관리 위원회의 맥 길 대학 몬트리올, QC, 캐나다에 의해 승인 되었다. 필요한 모든 장비는 테이블에 나열 된 나.

1. murine (C57BL/6J) IVC 스테이 시스 프로토콜

  1. 수술 준비
    참고: 이것은 생존 수술 하 고 따라서, 적절 한 무 균 기술을 항상 따라 해야. 이 포함 모든 물질이 가까이 다는 것을 확인, 청소 전과 사용 사이 악기를 살 균 하 고 모든 멸 균 자료에 대 한 작업 표면에 살 균 영역을 지정 합니다.
    1. 모든 수술 기구와 고압에 의해 재료를 소독. 유리 구슬 소독 기 소독 동물 일 경우 더 이상의 절차 한 번에 완료 되 고 사이 악기 팁 충분 하다.
    2. 100% 산소와 2.5 %isoflurane 혼합물으로 8-10 주 오래 된 C57Bl/6 남성 마우스 anesthetize
      참고: 산소와 필요한 isoflurane의 흐름을 조정 합니다.
    3. 집게와 발가락 사이 동물의 뒷 발을 곤란 하 게 하 여 anesthetization를 확인 합니다. 핀치에서 응답이 동물 마 취 나타냅니다.
    4. 느린 방출 진통제 (buprenorphine) 피하 주사를 통해 관리 합니다. 마우스 1 kg의 몸 무게 (1 mg/kg) 당 진통제의 1 밀리 그램의 복용량을 제공 합니다.
    5. 절차 동안 아무런 각 막 건조 되도록 동물의 두 눈에 눈 연 고를 배치 합니다.
    6. 0.2-몸 무게의 10 g 당 isotonic 체액의 0.5 mL을 피하 관리 합니다.
    7. 외과 테이프를 사용 하 여 수술 테이블에 장소에 동물을 수정. 복 부를 노출 하는 부정사 위치에 동물을 놓습니다. 저체온증을 방지 하기 위해가 열 패드에 수술을 수행 합니다.
    8. 머리에서에서 제거 마우스의 복 부 제 모 크림 1-2 분 복 부 지역 거 즈와 깨끗 하 고 증류수, 지우기에 대 한 응용 프로그램에 의해 필요한 경우.
    9. 또는, 작은 전기 면도기로 면도 하 여 복 부에서 머리를 제거 합니다.
    10. 어떤 절 개 하기 전에 Baxedin (액체 Gluconate BP 솔루션)와 복 부를 소독. 에탄올 알코올의 증발에 의해 발생 하는 과도 한 열 손실을 방지 하기 위해 거 즈로 가볍게 적용 됩니다.
  2. 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)의 노출
    1. 수술가 위를 사용 하 여 복 부 구멍 여 개복 술을 수행 합니다.
      1. 낮은 복 부에 집게와 함께 피부를 리프트 하 고 수직 절 개는 교육의 양쪽에 평행 하 게 알바. 왼쪽 또는 오른쪽에 교육의 첫 번째 절 개를 만들기 연산자의 handedness에 따라 알바. 절 개는 중간에서 초음파 이미징 나중에 지원 하기 위해 이루어집니다.
      2. 복 부의 위쪽에 두 번째, 가로 절 개를 확인 합니다.
        참고: 복 부에 침투, 시는 근육 "천을"와 있어야 다음 복 부 장기에 어떤 손상을 방지 하기 위해 수술가 위로 관통 합니다.
      3. 동물의 복 부 근육 층에 수직 및 수평 절 개를 반복 합니다. 근육을 아래 장기 손상 복 부에 침투 하는 동안 텐트를 해야 합니다.
        주의: 리프트 피부와 내장 및 다른 내부 장기에서 근육을 그들을 펑크 절 때.
    2. 피부와 근육 절 개 노출 복 부 구멍을 멀리 접어.
    3. Isotonic 솔루션은 상처의 양쪽에 적신 거 즈를 적용 하 고 내장을 외부화. 내장의 외부화를 지원 하기 위해 복 부의 양쪽에 압력을 적용 됩니다. 목화 제보 주걱으로 부드러운 움직임을 사용 하 여 내장을 이동. Isotonic 솔루션에 거 즈를 흡수 하 고 외부화 창 위에 그것을 배치.
      1. 거 즈 조직에 배치 하기 전에 미리 습 되어야 한다.
    4. 어떤 복 막 지방, 옆으로 이동 하 고 신장과 장 골 정 맥 사이 IVC 노출.
    5. 명백한 측 지점의 초기 id를 확인 합니다. 측면 지점으로 작은 표시 되지만 중요 한 정 맥 IVC, 신장 및 장 골 사이 분기 하는 혈관. 맥 관 구조는 쥐 사이 크게 달라질 수 있습니다. 마우스는 IVC의 한쪽 또는 양쪽에 측 분기 존재 할 수 있습니다.
  3. 측면 지점의 결 찰
    참고: 사이드 분기 존재 하는 경우 다음 절차 뒤에 각 한. 없는 경우 4 단계로 진행: 아래는 IVC 초기 봉합 배치. IVC의 결 찰 사이트 즉시 원심 측 분 지의 존재에 왼쪽된 신장 정 맥에 있을 것입니다.
    1. 측 분기의 각 측에 둔 해 부를 수행 합니다. 무딘 해 부 과정이 반복적으로 주변 혈관을 손상 없이 근 막 돌파 하기 위하여 부드러운 압력, 무뚝뚝한 겸 자 여.
      주의: Puncturing 또는 정 맥을 손상 하지 마십시오.
    2. 분기 들어올린 통과 정 맥 아래 6-0 비단 봉합의 섹션. 항상 해제 또는 선박을 이동 하는 때 주의. 혈관 주위 지방 질을 잡아 것이 최상 이다, 그렇지 않으면 혈관 손상의 위험이 있다.
    3. 표준 수술 매듭 묶는 기법을 사용 하 여 측면 지점 주위 수술 결 찰 봉합 집게를 사용 하 여 확인 하십시오. 완전 결 찰 100% 정 맥의 폐색을 보장 하기 위해 수행 됩니다. 적어도 3 개의 동 점 자유 투를 사용 하 여 보호 하기 위한 고 결 찰.
    4. 모든 나머지 측면 지점에 대 한 1.3 단계를 반복 합니다.
  4. IVC에서 복 부 대동맥의 해 부
    1. 왼쪽된 신장 정 맥에서 즉시 원심 IVC 주위 무딘 해 부를 수행 합니다. 복 부 대동맥 근 막 통해 IVC에 연결 되어, 따라서 IVC 및 복 부 대동맥 주위 초기 무딘 해 부 합니다.
      주의: puncturing 또는 정 맥을 손상 하지 마십시오. 파열 하거나 어느 배를 찔린 마십시오. 이것은 혈관 손상에 대 한 높은 위험 절차의 가장 중요 한 부분입니다.
    2. 계속 때까지 분명 윈도우는 IVC와 대동맥 사이 무딘 해 부를 통해 부드러운 압력을 적용.
  5. 봉합 사 배치 및 IVC 결 찰
    1. IVC와 복 부 대동맥의 아래 6-0 비단 봉합의 부분을 전달 합니다.
    2. IVC와 대동맥 사이 창을 통해 봉합을 찾습니다. 집게를 사용 하 여 봉합 하 고 복 부 대동맥 사이 IVC 스레드. 스레드를 통해 봉합 신중 하 게, 풀/펑크 IVC 및 복 부 대동맥을 하지 않으려고 합니다.
    3. 게는 IVC 주위 수술 결 찰 봉합 겸, 정 맥의 총 폐색을 보장. 다시, 왼쪽된 신장 정 맥에서 즉시 말 초는 결 찰을 확인 합니다.
    4. 3 개의 봉합은 결 찰을 확보 하 여 throw.
      참고: 그것은 또한 IVC와 대체 옵션으로 두를 분리 하기 전에 대동맥의 아래 봉합을 전달할 수 있습니다. 또는 7-0 Prolene 봉합 측면 지점과 IVC의 결 찰에 대 한 사용할 수 있습니다.
  6. 상처 폐쇄 및 수술 후 관리
    1. 복 부 대동맥 남아 있다 중단 하 고 모든 측면 지점 출혈 되었습니다 확인 합니다. IVC는 동 공이 확장 되어 나타납니다 결 찰 사이트와 혈액에서 원심 흐름 표시 됩니다.
    2. 모든 복 막 지방 및 내장 복 부 구멍에 다시 배치 합니다.
    3. 상처 봉합 집게와 6-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 닫습니다. 실행 중인 봉합 (간단한 연속)을 사용 하 고 봉합 너무 꽉 되지 것입니다 확인 하십시오. 꽉 봉합 동물과 깨어나면 그것의 감 금 소의 주위에 이동 될 때 파열 됩니다.
      1. 또는, PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon, 또는 스테인리스 클립을 사용 하 여 상처 폐쇄에 대 한.
    4. 먼저 적절 한 봉합 기술을 매를 사용 하 여 복 부 근육의 층 봉합
    5. 피부에 대 한 봉합 기술을 반복 하 고 충분 한 상처 폐쇄 확인 합니다.
      참고: 여러 동물에 대 한 동일한 봉합 바늘과 스레드를 사용 하는 경우 각 사용 전에 70% 에탄올에 모두 소독.
    6. 동물 마 취 가스에서 제거 하 고 적어도 30 분 동안 34 ° C 배양 기에 넣어.
    7. 다시, 0.2-0.5 mL 몸 무게의 10 g 당 isotonic 체액의 피하 관리 합니다. 체액 주어질 수 있다 다음 일에 수술 몸 무게를 유지 하기 위해 필요한 경우.
    8. 성공적인 수술을 보장 하는 동물의 전반적인 건강을 평가 복구까지 동물을 모니터링 합니다.
      주의: 이 같은 침략 절차에 대 한 약간의 돌출된 자세를 기대 하지만 동물 빠르면 30 분 후 작업이 정상적으로 작동 합니다.
    9. 그것의 자신의 감 금에 있는 동물을 놓고 완전히 복구 될 때까지 다른 동물 들과 함께 그것을 배치 하지 마십시오.
    10. 다시 최대 48 h postop에 대 한 진통제를 매일 관리 합니다.
    11. 복구에 동물 동안 감 금 소의 바닥에 음식을 놓습니다. 다른 특별 한 치료는 일반적으로 필요 하지 않습니다.
    12. 빨갛게, 붓기, 또는 방전 및 감염의 다른 증상에 대 한 상처 사이트를 검사 합니다.
    13. 필요한 경우 7-10 일 후에 봉합을 제거 합니다.
    14. 수술은 성공 하는 경우 즉시 안락사를 수행 (예를 들어, 중요 한 혈관 손상 및 혈액 손실) 또는 동물 수술 치료와 개선 되지 않습니다. 안락사는 48 h postop에서 일반적으로 수행 됩니다. 더 이상 실험에 대 한 7-0 Prolene 사용 하 여 측면 가지는 IVC와 5-0 Vicryl 봉합 복 부 구멍을 선.
      1. 앞에서 설명한, 제외 하 고 5 %isoflurane로 유도에 동물의 anesthetization에 의해 안락사를 수행 합니다. 이것은 100% CO2 마 취 동안 질 식 옵니다.
      2. 질 (하트 비트 및 아무 호흡의 손실)에 의해 안락사의 확인 후 완전 한 안락사를 위해 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.

2. 고주파 초음파 프로토콜

참고:이 프로토콜은 레이디 데이비스 연구소 설치류 형질 코어 SOP 고주파 초음파 이미징에서 적응. 이 프로토콜 수술 24 시간 후, 실시 하지만 동물 수술에 잘 응답으로 빨리 할 수 있습니다. 프로토콜 건강 한 쥐에서 언제 든 지 실행 될 수 있습니다 그리고 수술 전후 비교를 그렇게 자주 이루어집니다.

  1. 동물의 준비
    1. 유도 챔버에서 동물을 배치 하 고 100% 산소와 2.5 %isoflurane 혼합물으로 동물을 anesthetize.
    2. 심 박수 및 온도 모니터를 켭니다. 절차 동안 동물을 따뜻하게 유지 하는 테이블 위에 위치 열 램프.
    3. 유도 챔버에서 동물을 제거 하 고 각 막 건조 방지 하기 위해 눈 윤 활 유를 적용. 분석 플랫폼에 동물을 동물의 입/코에 마 취 튜브를 부착 하십시오.
    4. 따뜻한 초음파 37 ° C에 젤 하 고 동물의 복 부에 젤을 놓습니다. 초음파 젤은 펌프 물 젤 병 주위에 감싸인 코일을 통해 따뜻한 물 난방 시스템을 사용 하 여 예 열.
    5. 심장 박동 측정 (필요한 경우), 분석 플랫폼의 4 전극에 전극 젤을 넣고 수술 테이프로 플랫폼/전극에 동물의 발을 해결. 장소는 IVC의 이미징 부정사 위치에 동물. 이미징 시스템 초음파 분석 플랫폼은 예 열 하 고 동물을 모니터링 하기 위한 전극 포함을 포함 합니다.
    6. 온도 측정용 온도계에 전극 젤을 넣고 동물의 항문에 삽입.
    7. 열 램프 및 isoflurane 그 동물 편안 하 게, 30-70 bpm 사이 호흡 그리고 37 ° c.에 유지 되도록 필요에 따라 조정
    8. 필요한 경우, 동물의 복 부를 면도 하거나 제 모 크림으로 털을 제거 합니다. 1-2 분 동안 적용 하 고 깨끗 한 거 즈와 증류수로 닦아.
      참고: 너무 많은 머리는 이미지의 품질을 발생할 수 있습니다.
    9. 거 즈 또는 어떤 초과 초음파 젤을 잡으려고 동물의 측면에 배치 합니다.
  2. IVC 및 혈전 영상
    1. 이미징 소프트웨어를 켜고 새로운 연구를 시작.
    2. 이미징에 대 한 적절 한 scanhead를 선택 합니다. 복 부 장기는 scanhead 여기 사용 (주파수: 35 MHz, 초점 거리: 12.8 m m).
    3. 동물에 대 한 관련 정보를 기록 합니다. 이 동물을 포함할 수 있습니다 ID, 성별, 체중, 생년월일, 스트레인, 등등.
    4. 그것은 동물에 초음파 젤 감 동적 때까지 아래로 scanhead를 낮춥니다.
    5. 동물의 2 차원 이미징 시작 scanhead 조사를 시작 합니다. 이 모드에서 이미지는 2 차원, 회색의 다양 한 음영으로 표시 됩니다.
    6. IVC 및 복 부 대동맥 z-비행기를 통해 scanhead 이동 하면서 x-및 y-비행기를 통해 마우스 플랫폼을 이동 하 여 찾습니다.
      참고: 혈액이 혈관의 벽 화이트와 내부 혈액 거의 나타납니다 블랙. 복 부 대동맥 달아 고동치는 두꺼운 벽, 이미지 화면는 scanhead 이동 하 고 아래로 IVC 얇은 벽과 압축/쉽게에 확장 하는 동안. 결 찰 사이트와 혈관을 넓힐 것 이다 정 맥 벽 지점에 올 것 이다 명백한 될 것입니다. 안으로 형성 하는 어떤 혈전 초음파 영상에서 고체 되며 정 맥 벽이 하는 것 처럼 쉽게 압축 하지 않습니다. 정 맥 결 찰, 아니 혈전 형성은 위에 압축 됩니다.
    7. 위치에 IVC와 결 찰 사이트 센터 그들, 초음파의 초점에 가장 정확한 이미지를 달성 하기 위하여.
      1. 이미지 너무 어두운 명확 하 게 볼 젤을 조정 하 고 목화 제보 주걱으로 모든 기포를 제거 하는 경우.
      2. 필요한 경우 scanhead 왼쪽 이나 오른쪽으로 45 ° 기울기와 정 맥을 명확 하 게 볼 수 있는 동물 플랫폼을 재조정. 이 경우는 scanhead 간섭이 이루어집니다. 이 시나리오에서는 정 맥을 봉합을 피하기 위해 측면 각도에서 이미지 필요 합니다.
        참고: 이미지 간섭은 어두운 피부 패치를 동물, 불 쌍 한 상처 봉합 배치, 또는 초음파 젤에 거품에 의해 가장 자주 발생 합니다.
    8. 소프트웨어를 사용 하 여 어떤 원하는 구조를의 사진을 찍어 고 어떤 측정 도구를 사용 하 여 측정. 일반적인 측정은 혈전의 단면적 또는 결 찰 사이트의 너비를 포함합니다.
    9. 펄스 파 도플러 혈 류 측정을 이미징 모드를 변경 합니다. 이 모드에서는 혈관 혈액 흐름의 이미징 및 다른 변수 간의 흐름 속도의 측정.
    10. 동물의 후부 끝 낮은 분석 플랫폼을 기울기.
    11. 그것은 동물의 후부 끝에서 약 30 °의 각도에서 젤 연락는 scanhead의 각도/위치 변경.
    12. 동물 플랫폼과 scanhead를 재조 정할. 필요한 경우는 IVC와 결 찰을 재배치 합니다.
    13. 스테이 시스를 확인 하 고 원하는 어떤 이미지를 내 고 사이트 주위 혈액 흐름 측정을 확인 합니다. 혈액 흐름의 일반적인 측정에는 평균 속도, 최대 속도, 또는 중간 속도 포함 됩니다.
    14. 어떤 측정 또는 촬영 한 이미지를 저장 합니다.
  3. 청소 및 동물성 복구
    1. 초기 위치를 초기 위치로, 또한 동물 플랫폼을 위치를 scanhead를 올립니다.
    2. 거 즈와 동물에서 과잉 젤을 제거 합니다. 이렇게 부드럽게 상처 봉합 파열 하지 것입니다 있도록.
    3. 동물의 항문에서 온도계를 제거 하 고 플랫폼에서 동물을 걸릴.
    4. 그것의 감 금 소 및 34 ° C 배양 기에서 동물을 놓습니다.
    5. 복구까지 동물을 모니터링 합니다. 절차는 매우 작고 비-침략 적. 동물 신속 하 게 깨울 것 이다. 이 프로토콜의 섹션 1.6 다음 일에 동물을 모니터링을 계속 합니다.
    6. 거 즈와 소독 제 동물 플랫폼을 청소.
    7. 거 즈와 증류수 깨끗 scanhead 지우기.
      주의: scanhead를 아주 부드럽게 청소 및 증류수 만으로.
    8. 다음 동물에 대 한 2 단계를 반복 합니다.
      1. 모든 과목과 함께 한다면, 모든 이미지와 녹음 저장 되었습니다 확인 합니다. 그런 다음 모든 장비 및 소프트웨어 해제 합니다.

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Representative Results

스테이 시스 정 맥 혈전 증 모델

스테이 시스 모델에서 쥐 취는, 그리고 절 개 폭 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)로 이루어집니다. 절 개 초음파 프로브와 함께 방해 하지 것 이라고 하는 방식으로 중간 개복 술 대신 마우스의 왼쪽 또는 오른쪽에 이루어집니다. 복 부 근육과 피부는 배 다시 IVC (그림 1)을 폭로. 첫째, 옆 분 지는 6-0 비단 봉합 (그림 2)와 출혈. 그리고는 IVC 무딘 해 부 대동맥에서 구분은 실크 IVC (그림 3A-C) 주위에 배치 됩니다. IVC는 6-0 비단 봉합으로 출혈입니다. 결 찰 사이트 아래 IVC의 팽창 혈 (그림 3D)의 성공적인 중단의 표시입니다. 마지막으로, 복 막 구멍 및 피부 연속 방식 (그림 3E)에 다시 봉합 됩니다.

초음파를 사용 하 여 혈전 형성의 모니터링

와 같이 우리는 이전, 일반적으로 임상 설정에서 정 맥 혈전 증을 평가 하기 위해 사용 되는 고주파 초음파 실험 murine 모델에서 시간이 지남에 혈전 형성 및 해상도 측정 하 사용할 수 있습니다. 우리는 높은 주파수 마이크로 이미징 시스템12를 사용합니다. 결 찰, 전에 IVC 경도 보기에서 확인할 수 있습니다. 정 맥 결 찰 후 절차의 성공 구상 될 수 있다. PW 도플러 모드 (34.8 mm/s) 전에 혈액 흐름 속도 결정 하는 데 사용 수 (5.6 m m/s) 후에 결 찰. 혈전은 흐르는 보다 밀도가 있기 때문에 혈액, IVC, 초음파를 사용 하 여 결 찰 (그림 4A) 후 24 시간 안에 형성된 된 혈전 부탁 드립니다 수 있습니다. 초음파 컬러 도플러를 사용 하 여 혈관에 혈액의 흐름의 속도의 정량화 할 수 있습니다. 그림 4B같이 우리 결 찰 전에 정 맥의 흐름을 측정 하 고는 혈전 형성 후 결 찰, 흐름의 중단을 감사 수 있습니다. 24 시간에서 우리의 실험실 쇼 4.85 ± 0.22 m m2 의 평균 혈전 크기에서에서 데이터과 5.05 ± 0.47 m m2 48 시간 (± sem의 의미)에서.

Figure 1
그림 1입니다. 스테이 시스 모델: 열 등 한 베 나 정 맥 노출 절차. (A) 마우스 머리에서 복 부 제 모 크림을 사용 하 여 제거 됩니다. (B)는 첫 번째 절 개는 복 부와는 두 번째 복 부 (C)에서 왼쪽의 왼쪽에 오른쪽으로 이루어집니다. (D)는 젖은 살 균 시선 exteriorize 내장 하 여 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)와 측면 지점 (SB)는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 스테이 시스 모델: 프로시저 측면 지점 선. (A) 박람회는 IVC와 아래 하고있다 어브의 하고있다 (C) 결 찰 봉합 실크의 하고있다 (B) 배치: 왼쪽된 신장 정 맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 스테이 시스 모델: 프로시저를 열 등 한 베 나 정 맥 선. (A-B) 대동맥에는 IVC 구분 무딘 해 부. (C)는 IVC 아래 봉합 실크의 배치. (D)는 IVC의 결 찰. IVC의 팽창도 관찰 됩니다. (E)는 복 부 근육과 피부는 별도로 폐쇄 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 혈전 형성 초음파 이미징 사용 하 여 모니터링. (A) 대표 초음파 직후와 IVC의 결 찰 후 24 시간 전에, 이미지. (B) 대표 이미지 혈액의 흐름 속도 컬러 도플러에 의해 묘사 된 색상 처리를 사용 하 여. 낮은 흐름을 묘사 하는 노랑 빨강에서 색된 혈액 흐름 범위의 규모. 합자 동물에서 흐름의 부재는 색상의 부재에 의해 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

스테이 시스 모델을 사용 하 여 성공적인 정 맥 혈전 형성에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 유도 정 맥 혈전 증의 열 등 한 베 나 정 맥과 대동맥 주변 지방의 축적으로 인해 오래 된 쥐에 있는 더 많은 도전 이다. 이상적으로,이 절차를 진행 하는 쥐 8-10 주 오래 된 해야 합니다. 신중 하지 무딘 해 부 및 합자는 IVC 내 피 손상을 유도를 취해야 한다. 또한, 수술 후 적어도 30 분 동안 34 ° C 배양 기에서 동물을 유지 하 고 전체 복구 후에 다른 동물의 회사에 반환에 결정적 이다. 수술은 제대로 동물 수술 치료 동안 너무나 잘 작동 합니다. 그들은 불구가 됨, paresis, 요 실 금 등 심각한 부작용을 전시 한다. 그들은 즉시 수술 후, 감소 된 운동 및 자세를 약간 돌출된을 전시 수 있습니다 하지만이 나타나지 않습니다 종종 진통제는 효과적 이며 수술 제대로 수행으로.

스테이 시스 모델 재현 크기 측정 한 마우스에서 다른 큰 혈전을 생성합니다. 인간 처럼 정 맥 시스템의 해부학 쥐 사이 변화 하 고 IVC 분기 중단의 문제는 최근에 협 착 증, DVT13,14의 스테이 시스 모델에서 해결 되었습니다. Brandt 측면 지점에 때 흐름 제한에 의해 유도 된 혈전 형성 방지 되었다 보여주었다 < IVC 결 찰 사이트의 1.5 m m. 그러나, 쥐에서 흐름 제한에 의해 유도 된 DVT 형성 했다 영향을 받지 측면 지점 결 찰13,,1516. IVC 측 분기 C57Bl6 마우스 긴장에서의 변화는 IVC14의 완전 한 결 찰에 의해 유도 된 혈전 형성에 중요 한 영향 또한 보고 되었다. 통계적으로 작은 병 크기와 합자 측면 컨트롤에 비해 분기 하지 측면 ligating 발견 했다. 우리의 연구는 또한 측 분기 생산 일관 된 혈전 형성 및 크기의 그 결 찰을 건의 한다. 그러나, C57Bl/6에서 가장 자주 해 부 변이 다시 2의 존재 분기 (쥐의 98%)14. 그것은 다시 분기 방해는 큰 영향 혈전 크기에 시연 했다. 현재 방법론 저온으로 펜14를 사용 하 여 중단 될 수 백 가지의 효과 해결 하지 않았다. 그러나, 우리는 IVC와 측면의 그 결 찰 시연 C57Bl/6에서 일관 된 혈전 형성 귀착되 었 다 지점. 마지막으로, 같이 우리는 이전, 높은 주파수 초음파 시스템 혈전 크기의 정확한 측정을 허용 하 고 혈전 형성 및 해상도12,13의 장기와 변환에 사용할 수 있습니다. ,15.

1 주요 스테이 시스 모델의 단점은 혈전과 정 맥 벽에 정 맥으로 관리 에이전트의 최대한 효과 감소 시키는 혈액 흐름의 완전 한 방해. 약리학 대리인의 효과 테스트 하 고 싶어 하는 때 이것은 중요 한 문제가 된다. 하나의 특정 약물의 효과 테스트 하는 경우 하나 협 모델13 또는17전해 모델 사용 하 여을 원합니다. 두 모델 모두 DVT 예방 및 치료에 대 한 새로운 항 응고 제의 테스트를 허용 하는 지속적인 혈액 흐름의 혈전을 생성 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

이 작품은 심장과 스트로크 캐나다 재단에서 교부 금에 의해 그리고에 모리스와 벨라 Fainman 가족 기초에 의해 지원 되었다. 저자에 대 한 그녀의 기술 VEVO770 초음파 이미징 시스템 베로 미를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-0 perma-hand silk suture Ethicon 706G
Surgical Scissors Fine Science Tools 20830-00
Suture tying forceps Fine Science Tools 20830-00
blunt forceps (straight and curved) Fine Science Tools 20830-00
Needle Driver Fine Science Tools 13002-10
Moria Spring Scissors Fine Science Tools 15396-00
1ml syringes BD Biosciences
26G needles Becton Dickinson & Co.
VEVO 770 High Resolution Imaging System Visualsonics No longer sold
SR Buprenorphine ZooPharm Given to LDI by Vet
Surgery Microscope Leica Leica M651
Systan eye oinment Alcon 288/28062-0
2x2 sterile Gauze CDMV #104148
Cotton Tip Applicators from JGH
Transpore hypoallergenic surgical tape CDMV #7411
Ultrasound gel (Aquasonic-100) Dufort & Lavigne #AKEN4061
Incubator From JGH
Isoflurane Dispomed
Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment Dispomed
Hair remover Nair
Water heated hard pad Braintree Scientific, Inc. #HHP-2
Gaymar heater water pump TP500 MATVET Inc. #R-500305
Infra-red heating lamp electrimat inc. #1R175R-PAR
Mouse rectal temperature prope emkaTECHNOLOGIES
Sterile water From JGH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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