מאתר למעי הגס הדיסטלי, מודל הרומן של הסחה קוליטיס בעכברים C57BL/6

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מאתר למעי הגס דיסטלי מספק מודל מאתר הסחה האנושי קוליטיס, קוליטיס בעיקר לימפוציטית קטע המעי הגס נכללו הנחל צואה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הסחה קוליטיס (DC) הוא מצב קליני תכופים המתרחשים אצל חולים עם קטעי המעי נכללו הנחל צואה כתוצאה enterostomy להסיט. האטיולוגיה של המחלה נשאר מעורפל אבל נראה שונים של מחלות מעי דלקתיות קלאסית כמו קוליטיס ומחלת קרוהן. במחקרי לפענח את המנגנונים הקשורים pathophysiological המובילים להתפתחות של מחלה זו יש כבר את מימושן היעדרה של מודל מאתר המתאים. פרוטוקול זה יוצר מודל מאתר של DC המקל על הלימוד התפקיד של מערכת החיסון ביחסיו עם microbiome בפיתוח של DC. במודל זה באמצעות בעלי חיים C57BL/6, דיסטלי חלקי המעי הגס אינם נכללים הנחל צואה על-ידי יצירת למעי הגס הדיסטלי, מפעילה את התפתחות קל עד בינוני דלקת מקטעי מעי שלא נכללו מתרבה נגעים סימן ההיכר של האדם DC עם תגובה דלקתית מערכתית מתונה. בניגוד לדגם עכברוש, מספר רב של מודלים מאתר מהונדס גנטית על רקע C57BL/6 הינם זמינים. השילוב של בעלי חיים אלה עם המודל שלנו מאפשר את התפקידים פוטנציאלי של ציטוקינים בודדים, נוגדנים או קולטנים של מולקולות ביו (למשל, אינטרלויקין (IL)-17; IL-10, כימוקין CXCL13, כימוקין רצפטורים CXCR5, CCR7 ו sphingosine-1-פוספט הקולטן 4) לפנות לבדיקה בפתוגנזה של DC. הזמינות של זנים העכבר congenic על רקע C57BL/6 במידה רבה מקלה על העברת הניסויים להקים את התפקידים של סוגי תאים נפרדים מעורב האטיולוגיה של DC. בסופו של דבר, המודל מציע את ההזדמנות כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות מקומיים (למשל, שינוי של microbiome המקומי או טיפול אנטי דלקתי מקומי) על חסינות הרירית בקטעים המעי הנגוע, שאינן מושפעות ו- הומאוסטזיס המערכת החיסונית מערכתית.

Introduction

בשנים האחרונות, מספר ניכר של קוליטיס שאינן זיהומיות ישויות שונות ממחלות מעי דלקתיות קלאסית (IBDs; כלומר-, או קוליטיס ulcerosa קרוהן) יש כבר קליניות, histopathologically מאופיין אצל בני אדם. המנגנונים הקשורים pathophysiological המובילים להתפתחות של צורות אלה קוליטיס אינם לגמרי מובנים חלקית כי המתאים מודלים בעלי חיים נדירים. קוליטיס הסחה הוא אחד הישויות הללו תיאר לאחרונה. למרות שהמונח הוטבע בשנת 1980 על ידי Glotzer1, התיאור הראשוני של הפנוטיפ דומה ניתנה בשנת 1972 על-ידי Morson2. המחלה מתפתחת ב 50 91% מהחולים עם הטיית enterostomy, בעוצמתה קליני משתנה3,4. לאור השכיחות שנתי של 120,000 חולי למעי הגס ב ארצות הברית של אמריקה, ישות מחלה זו מהווה בעיה בריאות חשובה.

המטרה הכוללת של פיתוח פרוטוקול זה היה לספק מודל DC מאתר זה מסתמכת על גורם קוליטיס דומה כי ראיתי בוושינגטון האנושית ואת זה מתרבה התכונות histopathological של המחלה האנושית. לעומת דגמים אחרים מאתר קוליטיס, קוליטיס אינדוקציה במודל שלנו אינה דורשת מהונדסים בעלי חיים (למשל, העכברים הטרנסגניים IL-7, N-קדהרין עכברים שלילי דומיננטי או עכברים TGFβ- / - ), היישום של כימית מעצבן חומרים (למשל, לתוספי סולפט נתרן (DSS) - קוליטיס המושרה, או חומצה sulfonic trinitrobenzene (TNBS) - induced קוליטיס) או ההעברה של אוכלוסיות תאים מסוים בעכברים לקוי מערכת החיסון (כמו העברתגבוהה CD45RB מודל של קוליטיס) (לסקירה, ראה5). לעומת דגמים אחרים, המערכת החיסונית שלם של מודל DC שלנו מאפשרת הערכה של מנגנון אימונולוגי מעורב בפיתוח DC. המגבלה של דלקת הרירית את פלח המעי נשלל מאפשר הערכה של השלכה שלה על חסינות הרירית בחלקים אחרים מערכת העיכול, על הומאוסטזיס החיסון בתאים חיסוניים אחרים של מערכת העיכול (למשל , Mesenteriale הלימפה ותיקונים של פייה), וביום של הומאוסטזיס המערכת החיסונית של האורגניזם כולו. בסופו של דבר, המודל שלנו מהווה כלי המתאים עבור חוקרים את מנגנוני שליטה גירויים דלקתיות מקומיים שמקורם שינויים בסביבת המקומי הרגיל הן microbiome המקומי כמו גם אנטיגנים מסולקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הרשות וטרינרי ממשלתי (לדנציג Landesamt Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei מקלנבורג-מערב פומרניה, (LALLF M-V)).

1. לפני הניתוח טיפול והכנה של החיה

  1. עם ההגעה במתקן של בעלי חיים, חלק חיות (C57Bl/6) לקבוצות גודל דומה, לכלוא כל קבוצה ביחד ולשמור קבוצות קבועה לאורך כל הניסויים.
    הערה: השתמש חיות מאותו המין. הממצאים המתוארים התקבלו עם עכברים זכרים.
    הערה: אם זכר בעלי חיים משמשים, קבוצות כלוב יחד מתחיל כאשר הם בגיל 7 שבועות, כך ניתן ליצור היררכיה, ובכך למזער את הסיכון של התנהגות אגרסיבית במהלך הניסויים.
  2. לפחות שבוע לפני הניתוח, לעבור אנרגיה גבוהה (> 14 MJ/kg) וחלבון גבוהה (> 20%) להאכיל המכיל את כל יסודות קורט חיוניים וויטמינים (לפרטים, ראה רשימת חומרים).
    הערה: מבטיח כל העכברים שוקלים לפחות 25 g כאשר הניתוח מבוצע.
  3. זירוז אלחוש, שיכוך כאבים באמצעות הזרקת בקרום הבטן של קטאמין (i.p. 87 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים הידרוכלוריד (i.p. 13 מ"ג/ק"ג). המתן עד העכבר סובלנית גירוי מכני, למשל הבוהן זפת, ללא תגובה מוטורית.
  4. אבטח את העכבר narcotized עם קלטות במצב פרקדן על אנדרליי חום מוצב השולחן מבצע, המבטיח של אובדן חום גוף מהמם מיצוב במהלך מבצע והימנעות יציב.
    הערה: אנדרליי חום צריך טמפרטורת פני שטח של 36 ° C עד 40 מעלות צלזיוס; טמפרטורת הפעלה החדר צריך להיות 21 ° C.

2. מבצע דיסטלי למעי הגס

  1. לגלח את השיער בבטן. לפני תחילת הניתוח, לחטא את השדה מבצע שלוש פעמים באמצעות אלכוהול 70% של iodophor. לעטוף את שדה הפעולה כדי להבטיח תנאים אספטי.
  2. לבצע פתיחת בטן החציוני של 15 מ מ על-ידי אם את שרירי הבטן ואת של הצפק לאורך לינאה אלבה, ובכך למזער את אובדן דם.
  3. להשתמש מלקחיים atraumatic דה-בייקי שני, משוך בזהירות את המעי האטום, ileum מסוף, עולה ואת המעי הגס של חלל הצפק.
    הערה: הקפד להגביל באופן מכני מניפולציה של המעי כדי למנוע פגיעה במבנים מצע המעי העליון.
  4. לזהות את הקוטב cecal, עולה המעי הגס ו המעי הדק (דמויות 1a ו 1b).
    הערה: זיהוי נכון של הגס עולה הוא מהותי עבור מיקום נכון של למעי הגס. במקרים בהם האנטומיה של האזור ileocecal רב-משמעי, הנוכחות של טלאים של פייה מזהה המעי הדק, הנוכחות של צואה בנוי המאפיינת את המעי הגס.
  5. להשתמש בסרגל כדי לקבוע את המיקום של למעי הגס בעתיד. זה צריך להיות ממוקם 20 מ מ דיסטלי לשסתום ileocecal עבור למעי הגס דיסטלי.
  6. עושים חתך 3 מ מ השני בקיר הבטן ברבע העליון נכון. משוך על קטע המעי הגס שזוהה קודם לכן דרך החתך כדי ליצור לולאה, נזהר שלא לעוות את הלולאה.
  7. להעביר בזהירות קליבר 22 גמיש הזרקה דרך לפדר האחורי. . שמור על עצמך שלא יגרמו נזק למבנים וסקולרית מצע המעי העליון.
  8. לחזור המעי חלל הצפק.
  9. לתקן את שני הקצוות של הצינור הגמיש על העור באמצעות תפרים פשוטים, בתפר resorbable (למשל, polyglactin 910 או polyfil 4-0 1/2 c).
  10. לפני סגירת את פתיחת בטן, לבצע החייאה נוזלים באמצעות זריקה בקרום הבטן של 0.5 מ ל 0.9% תמיסת מלח.
  11. סגור של הצפק, השכבה שריר בתפר רצוף באמצעות בתפר resorbable (למשל, polyglactin 910 או polyfil 4-0 1/2 c). סגור את העור בתפר רצוף באמצעות בתפר resorbable (למשל, polyglactin 910 או polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. פתח את לולאת המעי הגס יהיו exteriorized על ידי ביצוע של חיתוך של סכומי ביניים באמצעות מספריים משובחים. למנוע כל פגיעה מצע המעי. לא transect המעי הגס לחלוטין.
  13. לתקן כל הפתיחה למעי הגס באמצעות שלושה תפרים מלא-עובי יחיד הצפק, העור באמצעות a monofil, תפר שנספג (למשל, polydioxanone או monofil, 6-0 3/שמיניות). הלולאה מביא, שהוא הקצה פונקציונלי-למעי הגס, ואת הלולאה efferent, אשר פיסטולה ריריות, מופרדים באופן ברור בנקודה זו (איור 1 c).
    הערה: זמן הפעולה צריכה להיות פחות מ-20 דקות כדי להגביל הפסדים תרמיים של נוזלים.
  14. לאחר סיום הניתוח, לחיטוי מכשירים באמצעות פתרון נטולת אלדהיד לחיטוי באמבט אולטראסוני לפי ההוראות של היצרן.

3. המזויפים מבצע (Colotomy)

  1. בצע שלבים 1.1. דרך 2.4.
  2. להשתמש בסרגל כדי לקבוע את מיקום colotomy בעתיד. Colotomy שנמצאת באותו המרחק מן השסתום ileocecal כמו למעי הגס ב קבוצת הניסוי.
  3. פתח את המעי הגס לפחות שני שלישים והיקפו באמצעות מספריים משובחים.
  4. סגור colotomy עם שכבה אחת, מלא-עובי קטע התפר באמצעות a monofil, שנספג תפר (למשל, polydioxanone, monofil, 6-0 3/שמיניות).
    הערה: זמן הפעולה צריך להיות פחות מ-20 דקות בשביל מנתח experimented, הגבלת הפסדים תרמיים של נוזלים.
  5. בצע שלבים 2.10. , 2.11. 2.14.

4. לאחר הניתוח טיפול

  1. לחזור חיות הכלובים. מספקים אווירה היטב מחוסמת של 37 ° C (למשל, עם מנורת אינפרא-אדום) עד עכברים ער לגמרי. לאחר מכן, לשמור על עכברים בסביבת טמפרטורה, לחות-מוסדר (21 ° C; 30% ± 10% לחות יחסית). לאפשר גישה חופשית מזון ומים לשתיה. כדי להקל על ספיגת נוזלים, לספק הזנה בבעלי חיים ספוגי מים נוספים.
  2. מתחילים כאבים לאחר הניתוח על ידי הזרקת 0.1 מ"ג/ק"ג גוף במשקל הבופרנורפין ספורטינג כאשר בעלי חיים מראים תגובת גירוי מכני. להיות זהירים כדי למנוע דיכאון בדרכי הנשימה.
  3. תוספת שתייה עם 1 מ"ג/מ"ל טרמדול עבור המשך כאבים במהלך השבוע לאחר הניתוח הראשון.
  4. כדי לפצות על צריכת הנוזלים ירד עקב צמצום הניידות, לספק משטח מוצק לשתות בכלוב בשבוע הראשון לאחר הניתוח.
  5. שוקל החיות והתנהגות בעלי חיים ציון מדי יום במהלך השבוע הראשון, בכל יום שני במהלך שארית החודש הראשון, בכל יום שלישי במהלך החודש השני באמצעות התוצאה חומרת המחלה המתוארים Kleinwort. et al. 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הניתוח הוא נסבל היטב הן את ניסיוני (למעי הגס) והקבוצות דמה (colotomy). התמותה Perioperative לא יעלה על 10% בעת ניתוח וניהול perioperative מבוצע כהלכה. בשבוע שלאחר הניתוח הראשון, הרזיה משמעותית נתפסת בשתי הקבוצות ניסיוני, שאם. חיות של קבוצת המזויפים להשיג שלהם נאדיר משקל בדרך כלל לקראת היום הרביעי לאחר הניתוח, אך היא מתרחשת יום אחד מאוחר יותר קבוצת הניסוי. ירידה במשקל מודגש יותר בקבוצה ניסיוני, להגיע 21.7% ממשקל הגוף הראשונית. לעומת זאת, בעלי החיים המזויפים לאבד 10.8% של הגוף הראשונית שלהם, משקל (איור 2)6. לאחר נקודת השפל משקל בשבוע הראשון לאחר הניתוח, משקל הגוף עולה באופן רציף בשתי הקבוצות ניסיוני, אבל עם מדרון לאט יותר בקבוצת הניסוי. הסימנים והתסמינים של דלקת מעיים חמורה (קרי, הפרשות דם או המעיים נוזלית להתרחש גם את ניסיוני ולא דמה קבוצה6). התמותה הכולל במהלך 60 הימים הראשונים במשככי הוא בסביבות 40% בקבוצה למעי הגס על 10% בקבוצה colotomy. רוב מקרי מוות מתרחשים במהלך השבוע שלאחר הניתוח הראשון (61% בקבוצה ניסיוני, 66% בקבוצה דמה). הסיבות העיקריות למוות מוצגים באיור3.

דיסטלי למעי הגס בעכברים תוצאות בפיתוח של קוליטיס בעיקר לימפוציטית מתרבה התכונות היסטולוגית סימן ההיכר של DC אנושי. שינויים אלה להגדיל עם המשך של הדרה מעיים. קריפטה אורך מתקצר משמעותית בקטעים שלא נכללו המעי. קיצור זה מגיע מובהקות סטטיסטית אחרי 14 ימי הסחה צואה (איור 3 א). אורך קריפטה בגביע תא מניבי פוחת לאחר 30 ימים בקטעים שלא נכללו המעי (איור 3b). מספרי הטלפון הנייד גביע מוחלטת מופחתים משמעותי גם באולמות קטע המעי נשלל לאחר 14 ימים לאחר הניתוח (איור 3 c). הנגע סימן ההיכר של DC, הפיתוח של זקיקי הלימפה רירית, נדרש משך זמן ארוך יותר של צואה סטייה. למרות עלייה במספר זקיקי הלימפה יכול להיות שנצפו מוקדם ככל שבועיים, ההבדלים להיות משמעותי לאחר חודשיים (דמויות 5a-c). כל השינויים histopathological תיאר לפני מודגשת יותר ב דיסטלי יותר באזורים הפרוקסימלית של הקטעים שלא נכללו המעי. לחדור neutrophilic טיפוסי סימן לדלקת חריפה היא בדרך כלל לא נצפו (דמויות 5 d-e).

סימן השלכה מערכתית של דלקת מעיים מקומית, ספירת נויטרופילים הם משמעותי מוגברת בבעלי חיים למעי הגס מוקדם ככל 14 ימים לאחר הניתוח. הבדל זה נשמר עד לסוף תקופת תצפית (60 יום). ספירת טסיות הינם מעט מוגברת אצל בעלי חיים עם הסחה שטיפת המעי הגס לאחר 60 ימים (איור 6). רמת ההמוגלובין, המטוקריט מופחתים 14 ימים לאחר הפעולה בקבוצה למעי הגס לעומת הקבוצה המזויפים.

הוכח כי מחסור בויטמינים ב מכרסמים גורמים מופחת נפח corpuscular רשע (MCH) ואני מתכוון ערכי המוגלובין corpuscular (MCV)7. המודל שלנו, אנו רואים עליות הראשונית בשני פרמטרים אלה לאחר 14 ו 30 ימים. MCV והן MCH לחזור לערכים נורמליים אחרי מעקב ארוך יותר (איור 7). זה מראה שאת למעי הגס דיסטלי לא תגרום בויטמינים משמעותיים קלינית במהלך לטווח ארוך.

Figure 1
איור 1: אנטומיה של אזור cecal, הליך כירורגי. (א) ייצוג גרפי של האנטומיה לאחר הניתוח. (ב) טופוגרפיה של פול פוט cecal וציוני אנטומיים. (ג) Graphical ייצוג הפתחים למעי הגס. איור 1a שונתה Kleinwort et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: גוף פיתוח משקל. משקל הגוף מוצג כאחוז של משקל הגוף לפני הניתוח. הגוף משקל עקומות של למעי הגס, שאם לחשוף בעלי חיים (colotomy), כי הירידה במשקל לאחר הניתוח הראשוני היה גבוה באופן משמעותי בקבוצה למעי הגס לעומת הקבוצה דמה (p < 0.001). ערכים הם אמצעי ± לשגיאות תקן של הממוצע לאורך 21-26 חיות לכל קבוצה (חיות 21 התקבל colostomies; 26 בעלי החיים היו בקבוצה דמה). איור זה השתנה Kleinwort et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: גורם המוות. סיבוכים מיוצגים כמו אחוזי התמותה כל סיבה, מומחשים בתרשים עוגה (קבוצה למעי הגס (א), (ב) שאם קבוצה). סיבוכים לאחר הניתוח נקבעו על ידי necropsy. תסמונת לבזבז הוגדר מתמדת במשקל גדול מ- 33% של משקל הגוף הראשונית, אין ממצאים אחרים ב- necropsy. Ileus ודליפה anastomotic אובחנו ב- necropsy. פיונית סיבוכים הוגדרו אבצס peristomal והפרדות mucocutaneous בלוטת. סיבוכים אחרים מורכבת הפצע התבקעות של פתיחת בטן, איסכמיה של המעי, מקרים לא ברור בשלב זה necropsy. הבדלים משמעותיים בתחום ההפצה של סיבוכים לאחר הניתוח נראו בין קבוצות (p = 0.021, נותחה באמצעות הבדיקה המדויקת פישר לניתוח דו צדדי של עד 6 × 6 מגירה טבלאות). היו חיות 39 בקבוצה למעי הגס 29 בקבוצה המזויפים. איור זה השתנה Kleinwort et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: האוכלוסייה אורך ותא בגביע הקריפטה. אורך קריפטה ומספרי תא בגביע היו נחושים באמצעות פרפין מקטעים של פי הטבעת לאחר צביעת המחזורית חומצה-שיף. (א) קריפטה אורך היה ירד באופן משמעותי בתוך פי הטבעת של בעלי חיים הסחה קוליטיס (DC). (ב) האורך של אזור תא בגביע מניבי התת-קרקעי נמדד ולהגדיר כיחס באורך מלא הקריפטה. 30 ו 60 ימים במשככי, האחוז של תאי גביע קריפטה-אורך-מיסב היה ירד בקבוצה DC. (ג) וגביע תא מספרים הצטמצמו באופן משמעותי אצל בעלי חיים DC לעומת הקבוצה המזויפים. גרפים ב (א) עד (ג) מציגים אמצעי, תקן שגיאות לאורך 5 עד 9 חיות לכל קבוצה (למעי הגס 14 ו- 30 ימים, שאם 14 ימים: n = 8; למעי הגס 60 ימים: n = 5; שאם 30 ו 60 ימים: n = 9); ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. איור זה השתנה Kleinwort et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: זקיקי הלימפה, תסנין דלקתי. (א) זקיקי הלימפה של נקודתיים מוטה ובעלי המזויפים נספרו במקטעי פרפין של החלחולת מוכתם hematoxylin ואאוזין. הגרף מציג את תקן שגיאות ואמצעים מעבר בעלי חיים 5 עד 9 לכל קבוצה (למעי הגס 14 ו- 30 ימים, שאם 14 ימים: n = 8; למעי הגס 60 ימים: n = 5; לשלוט 30 ו 60 ימים: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. (ב), (ג) נציג דוגמאות סעיפים של הרקטום למעי הגס (b) ובעלי דמה (ג) 60 יום במשככי מוכתם hematoxylin ואאוזין. זקיק הלימפה הבולטים (∗) היה נוכח רירית של עכבר למעי הגס. סולם העמודות מייצגות 100 מיקרומטר. (ד) ו- (e) צביעת עם chloroacetate התגובה esterase במקטעי פרפין בוצע לזהות גרנולוציטים נויטרופילים. על חתכי רוחב של החלחולת מוסחת, לחדור neutrophilic דלקתית חריפה נצפתה בקבוצה למעי הגס (d) וגם בבעלי דמה (e) עד 60 יום במשככי. סולם העמודות מייצגות 100 מיקרומטר. איור זה השתנה Kleinwort et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ספירת נויטרופילים, טסיות. ספירת דם של דגימות דם ורידי נקבעו על ידי מנתח המטולוגיה וטרינרי. (א) ספירת נויטרופילים היו גדל באופן משמעותי בקבוצה למעי הגס בהשוואה לבעלי שאם עד 60 יום במשככי. (ב) ספירת טסיות דם היו מעט גבוהות בקבוצה למעי הגס 60 יום במשככי. הגרף מציג את תקן שגיאות ואמצעים מעבר בעלי חיים 5 עד 9 לכל קבוצה (למעי הגס 14 ו- 30 ימים, שאם 14 ימים: n = 8; למעי הגס 60 ימים: n = 5; שאם 30 ו 60 ימים: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: פרמטרים של תאי הדם האדומים. ספירת דם של דגימות דם ורידי נקבעו על ידי מנתח המטולוגיה וטרינרי. (א) המוגלובין ו- (ב) המטוקריט ירדו באופן משמעותי בקבוצה למעי הגס בהשוואה לקבוצת המזויפים. (ג) אבל corpuscular נפח (MCH) היה גבוה באופן משמעותי 14 ו 30 יום במשככי בקבוצה למעי הגס לעומת הקבוצה המזויפים חזר להיות תקין לאחר 60 ימים. (ד) אומר ערכי המוגלובין corpuscular (MCV) היו גבוהות לאחר 30 ימים, אבל כבר לא לאחר 60 יום במשככי בקבוצה למעי הגס בהשוואה שאם בעלי חיים. הגרף מציג את תקן שגיאות ואמצעים מעבר בעלי חיים 5 עד 9 לכל קבוצה (למעי הגס 14 ו- 30 ימים, שאם 14 ימים: n = 8; למעי הגס 60 ימים: n = 5; שאם 30 ו 60 ימים: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המודל מאתר של DC הוצג פרוטוקול זה אמין מתרבה התכונות histopathological של האדם DC (למשל, פיתוח דה נובו של זקיקי הלימפה submucosa של מקטעי מעי מודלק, קריפטה קיצור הפחתות מספרי הטלפון הנייד גביע). מלבד יתרון זה, מודל זה הנגרמת על ידי גורם מפעילה דומה מאוד, מציג עם קורס קליני של בינוני עד סיכון מתון כמו במקרה של בני אדם המושפע ביותר.

כדי להשיג תוצאות לשחזור, מקובל perioperative קטלני, הכרחי להתאמן בטכניקות מיקרוכירורגיות בא לידי ביטוי. עם זאת, ניתן לבצע הפעולה למעי הגס והן דמה (colotomy) עם perioperative נמוך מאוד בהירושימה (< 10%). כמה צעדים מבצעית בעלות חשיבות גדולה: 1) מעי הגס ומסוף לזהות באופן חיובי. במקרים בו האנטומיה של האזור ileocecal לא ברור, המעי הגס יכול להיות מזוהה על ידי הנוכחות של צואה בנוי ואת ileum מסוף על ידי הנוכחות של המדבקות של פייה. 2) כאשר exteriorizing הלולאה למעי הגס, מבטיח שמצע המעי לא הוא העווה, וכך להימנע איסכמיה מצע המעי העליון ועל מכניים ileus. 3) כאשר ניקב את מצע המעי עם הצינור הגמיש, מבטיח שבמגזר נטולת כלי נבחר, ובכך למנוע דימומים וסיבוכים מצע המעי העליון איסכמיה. 4) בעת יצירת חתך קטן בדופן הבטן, בדוק אם יש מספיק hemostasis. אם יש צורך, להשתמש התרמו-קרישה כדי לעצור דימום מכלי שריר. 5) מבטיח המעי הגס לולאה פתוחה לפחות-שני שליש והיקפו, כי הקיר האחורי הוא מספיק אוזני, ומבטיח חסימה מלאה של מעבר צואה המקטעים המעי הדיסטלי. 6) מבטיח כי בשני הקצוות למעי הגס קבועים היטב על העור כדי למנוע מעבר פתוח אל חלל הצפק וכתוצאה סיכוני זיהום גבוה יותר או ileus מכני כי הזרם צואה יכול לצאת. בדרך כלל, כל הניתוחים יכול להתבצע ללא זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ כירורגי. באופן כללי, ניצול של התקנים אלה דורש הכשרה נוספת.

אפילו כאשר המורכבות של הניתוחים הוא רק בינוני, ישנם נושאים מהותיים רבים פעיל ו- perioperative כדי להיחשב לסיים בהצלחה את הניסוי עם תוצאות לשחזור.

זה חיוני להישרדות לטווח ארוך עם למעי הגס קבע שיש עכברים של המעי האטום ללא פגע. קבוצת הניסוי עם צמוד לשסתום ileocecal הפרוקסימלית שנזקקו להחלפת בגדים הראו שיעור תמותה של 100% בשבוע הראשון לאחר הניתוח בגלל אובדן משקל בלתי הפיך (נתונים לא מוצג). לכן, הוא בעל חשיבות עליונה לבחירה באתר למעי הגס לפחות 20 מ מ דיסטלי שסתום של Bauhin. התבוננות זו יכול להיות בגלל הפיזיולוגיה של מערכת העיכול מכרסמים. התחבורה רטרוגרדית מן המעי הגס הפרוקסימלית. המעי מתרחשת אצל המינים הללו. המעי הוא היכן הסינתזה של חומרים מזינים ידי occurs8 microflora חיידקי. ערכי MCV נורמלי ו MCH במהלך לטווח ארוך מציינים כי בעלי חיים דיסטלי שנזקקו להחלפת בגדים אינם סובלים בויטמינים משמעותית. יתר על כן, coprophagy הוא חלק חיוני של ההתנהגות התזונתית של מכרסמים בסביבות הטבעי שלהם. בעת יצירת המודל, היינו מאוד מודאגים כי perturbing את coprophagy בשל הנוכחות של למעי הגס קבוע יכול לגרום חוסרים תזונתיים, (למשל, ויטמין B). עם זאת, אמנם זה בעיה בתנאים שבו גישה חומרים מזינים היא מוגבלת, בעבר הוכח ש-coprophagy זה מאבד מערכו התזונתי בתנאים ניסיוני עם עודף ללא מים ומזון מאוזן תזונתית9 . בתנאים ניסיוני שלנו, זה חיוני כדי למטב את התנאים של צריכת תזונה לאחר הניתוח. השתמשנו תזונת בעלי חיים היה תוכן חלבון גבוהה, אופטימיזציה חלבון איכותי, גדלה צפיפות אנרגיה. בעלי חיים היו התאקלם דיאטה זו לפחות שבועיים לפני הניתוח. במשככי, הזנה ספוגי מים הוצע ad libidum faciliate מזון, צריכת הנוזלים.

חשוב לנצל את עכברים מאותו המין בשתי הקבוצות ניסיוני, העמדת פנים. סקס הוכח להשפיע באופן משמעותי את הקורס לא רק של דלקת מערכתית, אלא גם של דלקת מעיים שונות קוליטיס בהשפעת כימיקלים מודלים10,11,12. באופן כללי, חיות זכר יפתחו מחלה מובהק יותר עם דלקת רבתי, נזק קריפטה יותר, פחות התחדשות, רמות גבוהות יותר של ציטוקינים פרו-דלקתיים, החלמה איטית של אובדן משקל10. יתרון נוסף של שימוש חיות זכר הוא טוב יותר משקולות גיל מתאימים הגוף לפני הניתוח, שמוביל פיצויים טוב יותר של תקופת אובדן משקל לאחר הניתוח הראשוני. למרות זאת, עכברים הנשי ניתן להשתמש בפרוטוקול אם ספציפי שאלות (למשל, השפעתה של סקס יש לטפל ההורמונים על הביטוי של DC. שימוש בעכברים זכרים דורש יותר מאמץ בשמירה על תנאי מגורים יציב. עכברים זכרים נוטים יותר אגרסיבי אינטראקציות שמוביל לפציעה ומוות. עכברים זכרים חיים הירארכיות הוקמה עם זכר דומיננטי אחד. לאחר ההירארכיה בקבוצה הוא הוקם, המשך הלחימה הוא פחות נפוץ13,14. מסיבה זו, אנו הקימו את הקבוצות ניסיוני עם ההגעה של העכברים במתקן שלנו בעלי חיים לפחות שבועיים לפני הניתוח, שמר על קבוצות אלה עד הניסויים הסתיים. באופן כללי, קבוצות ניסיוני של 5 עד 7 חיות הוחזקו בכלוב אחד. תחזוקה של חברתי יציב, מתנאי הדיור היה בעל חשיבות עליונה לא רק כדי לצמצם התנהגויות אגרסיביות של חיות ניסוי. תנאי דיור הוכחו להשפיע על עלייה במשקל, כמו גם פרמטרים אימונולוגי15,16,17.

הרגישות קוליטיס בהשפעת כימיקלים, מהונדס גנטית מודלים משתנה במידה ניכרת בין עכבר זנים18,19,20. בפרוטוקול הנוכחי הוקם בשנת C57Bl/6 עכברים, זן עכבר עם רקע גנטי מוגדר היטב, של המערכת החיסונית מאופיין היטב21,22,23 המציג ביניים חזק דלקתיות התגובה לתוספי חומצה גופרתית קוליטיס נתרן-induced דגם20 ונחשב זן Th1 ומופת23. השימוש של זנים אחרים העכבר יכול להיחשב כאשר נדרשת פעילות המחלה חמורה יותר או סביבת Th2.

לסיכום, פרוטוקול שלנו מהווה כלי חשוב להערכת את התפקיד של סוגים שונים של תאים חיסוניים, ציטוקינים, נוגדנים אחרים מולקולות האיתות בפתוגנזה של DC. מספר רב של מודלים מהונדס גנטית עכברים הינם זמינים עם רקע C57BL/6, יכול להיות משולב עם המודל שלנו (למשל, עכברים לקוי של IL-17, IL-10, כימוקין CXCL13, כימוקין-קולטנים CXCR5 CCR7 ו sphingosine-1-פוספט קולטן 4). הזמינות של זנים העכבר congenic על רקע C57BL/6 בעיקר להקל על העברת הניסויים להקים את התפקיד של סוגי תאים נפרדים מעורב האטיולוגיה של DC. בסופו של דבר, המודל מציע את ההזדמנות כדי להעריך את השפעת התערבויות מקומיים (למשל, שינוי של microbiome מקומיים, טיפול אנטי דלקתי מקומי) על חסינות הרירית בקטעים המעי הנגוע, שאינן מושפעות ועל מערכתית הומאוסטזיס המערכת החיסונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אף אחד

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics