इसके विपरीत-झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक विश्लेषण और अटल बिहारी Initio मॉडलिंग के लिए छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर प्रयोगों में डिटर्जेंट मिलान

Biochemistry

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Summary

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे एक कम संकल्प एबी initio मॉडल और एक डिटर्जेंट-solubilized झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक विवरण के समाधान में छोटे कोण न्यूट्रॉन बिखरने का उपयोग करने के विपरीत-डिटर्जेंट के मिलान के साथ प्राप्त करने के लिए ।

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Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

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Abstract

जैविक छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर साधन ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला के उच्च प्रवाह आइसोटोप रिएक्टर में जैविक सामग्री की जांच करने के लिए समर्पित है, जैव ईंधन प्रसंस्करण, और जैव प्रेरित सामग्री को कवर करने के लिए नैनोमीटर माइक्रोमीटर लंबाई तराजू । शारीरिक गुणों की जांच के लिए यहां प्रस्तुत तरीकों (यानी, आकार और आकार) झिल्ली प्रोटीन की (यहां, MmIAP, एक intramembrane aspartyl Methanoculleus marisnigriसे चिढ़ा) micelle के समाधान में डिटर्जेंट बनाने इस छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर साधन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल, दूसरों के बीच । अंय भौतिक लक्षण वर्णन तकनीक उनकी अक्षमता को एक प्रोटीन-डिटर्जेंट जटिल संरचना में डिटर्जेंट योगदान पते से बाधा है । इसके अतिरिक्त, जैव Deuteration प्रयोगशाला के लिए उपयोग बड़े पैमाने पर खेती की तैयारी और प्रोटीन से बढ़ाया तितर बितर संकेत के लिए ड्यूटेरियम-लेबल प्रोटीन व्यक्त करने के लिए अद्वितीय क्षमताओं प्रदान करता है । हालांकि इस तकनीक के उच्च संकल्प पर संरचनात्मक विवरण प्रदान नहीं करता है, झिल्ली प्रोटीन के लिए संरचनात्मक ज्ञान अंतर के पास परमाणु संकल्प की आवश्यकता के बिना अनुसंधान के कई क्षेत्रों के पते शामिल हैं । उदाहरण के लिए, इन क्षेत्रों में oligomeric राज्यों के निर्धारण, जटिल गठन, गड़बड़ी के दौरान संरचना परिवर्तन, और तह/ इन जांच आसानी से इस पद्धति के अनुप्रयोगों के माध्यम से पूरा किया जा सकता है ।

Introduction

झिल्ली प्रोटीन सभी जीन1 के एक अनुमानित 30% से इनकोडिंग और आधुनिक औषधीय दवाओं के लिए लक्ष्य का एक मजबूत बहुमत का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । 2 इन प्रोटीन महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों की एक विस्तृत सरणी प्रदर्शन,3 लेकिन उनके बहुतायत और महत्व के बावजूद-केवल संरचनात्मक Bioinformatics (RCSB) प्रोटीन के लिए अनुसंधान Collaboratory में जमा कुल संरचनाओं के बारे में 1% का प्रतिनिधित्व डेटा बैंक । 4 उनके आंशिक रूप से hydrophobic प्रकृति के कारण, झिल्ली बंधे प्रोटीन के संरचनात्मक संकल्प बेहद चुनौतीपूर्ण हो गया है । 5 , 6 , 7

के रूप में कई भौतिक तकनीक माप के लिए समाधान में monodisperse कणों की आवश्यकता होती है, देशी झिल्ली से झिल्ली प्रोटीन अलग और एक घुलनशील देशी झिल्ली की नकल में इन प्रोटीन स्थिर अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र रहा है हाल ही में दशकों. 8 , 9 , 10 इन जांचों ने कई उपन्यास amphiphilic सभाओं के विकास के लिए नेतृत्व किया है solubilize झिल्ली प्रोटीन, जैसे nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 और amphipols । 16 , 17 हालांकि, डिटर्जेंट micelles का उपयोग एक दिया प्रोटीन की घुलनशीलता आवश्यकताओं को संतोषजनक करने के लिए सबसे आम और सीधा दृष्टिकोण में से एक रहता है । 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 दुर्भाग्य से, कोई भी डिटर्जेंट या डिटर्जेंट का जादू मिश्रण वर्तमान में मौजूद है कि सभी झिल्ली प्रोटीन संतुष्ट; इस प्रकार, इन शर्तों empirically प्रत्येक प्रोटीन की अनूठी आवश्यकताओं के लिए जांच की जानी चाहिए । 26 , 27

डिटर्जेंट स्वयं अपने महत्वपूर्ण micelle एकाग्रता के ऊपर समाधान में इकट्ठा करने के लिए कुल संरचनाओं micelles बुलाया फार्म । Micelles कई डिटर्जेंट मोनोमर से बना रहे है (आमतौर पर 20-200 से लेकर) hydrophobic alkyl जंजीरों के साथ एक micelle कोर और हाइड्रोफिलिक सिर एक micelle खोल जलीय विलायक सामना परत में व्यवस्था समूहों के गठन । डिटर्जेंट और micelle गठन का व्यवहार क्लासिक Hydrophobic प्रभावमें चार्ल्स Tanford द्वारा वर्णित किया गया है,28 और आकारों और आकार और झिल्ली प्रोटीन अध्ययन में आमतौर पर इस्तेमाल किया डिटर्जेंट से micelles छोटे कोण बिखरने का उपयोग कर विशेषता । 29 , झिल्ली प्रोटीन के बारे में 30 डिटर्जेंट संगठन भी अध्ययन किया गया है, और प्रोटीन के गठन-डिटर्जेंट परिसर (पीडीसी) डिटर्जेंट एक व्यवस्था है कि साफ डिटर्जेंट जैसा दिखता है में प्रोटीन आसपास के अणुओं के साथ की उंमीद है micelles । 31

डिटर्जेंट का उपयोग करने में एक जोड़ा लाभ यह है कि जिसके परिणामस्वरूप micelle गुण अंय डिटर्जेंट शामिल द्वारा चालाकी से किया जा सकता है । कई डिटर्जेंट आदर्श मिश्रण का प्रदर्शन, और मिश्रित micelles के गुण का चयन भी घटकों और मिश्रण के अनुपात से भविष्यवाणी की जा सकती है । 22 हालांकि, डिटर्जेंट की उपस्थिति अभी भी भौतिक characterizations के लिए चुनौतियों का समग्र संकेत करने के लिए योगदान द्वारा मौजूद कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक्स-रे और प्रकाश बिखरने तकनीक के साथ, PDC में डिटर्जेंट से संकेत व्यावहारिक रूप से प्रोटीन से अलग है । एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) के साथ ३२ जांच आम तौर पर फंस (जमे हुए) कणों पर भरोसा करते हैं; प्रोटीन के संरचनात्मक विवरण अभी भी कुछ डिटर्जेंट या डिटर्जेंट की एक उच्च एकाग्रता है जो पृष्ठभूमि के लिए कहते हैं द्वारा अस्पष्ट हैं । ३३ पूर्ण PDC संरचना (डिटर्जेंट सहित) की व्याख्या की ओर वैकल्पिक दृष्टिकोण गणना के तरीके जो एक दिया झिल्ली प्रोटीन के आसपास डिटर्जेंट पुनर्निर्माण की तलाश के माध्यम से किया गया है । ३४

न्यूट्रॉन कैटरिंग के मामले के लिए, micelle में डिटर्जेंट की कोर-शैल व्यवस्था एक फार्म का कारक है जो मनाया तितर बितर करने के लिए योगदान देता है । सौभाग्य से, समाधान घटकों को इस तरह बदला जा सकता है कि वे नेट में योगदान नहीं तितर बितर मनाया । इस "विपरीत मिलान प्रक्रिया" हाइड्रोजन के लिए प्रतिस्थापन ड्यूटेरियम द्वारा प्राप्त करने के लिए एक तितर बितर लंबाई घनत्व है कि मैच पृष्ठभूमि (बफर) की है । डिटर्जेंट की एक विवेकपूर्ण विकल्प (उपलब्ध deuterated समकक्षों के साथ) और मिश्रण के अपने अनुपात पर विचार किया जाना चाहिए । डिटर्जेंट micelles के लिए, इस प्रतिस्थापन एक ही सिर समूह के साथ एक डिटर्जेंट का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक deuterated alkyl श्रृंखला होने (डी के बजाय एच पूंछ पूंछ) । चूंकि डिटर्जेंट अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं,३५ उनके समुच्चय एक तितर बितर लंबाई घनत्व है कि दो घटकों के तिल अंश भारित औसत है (एच पूंछ और डी पूंछ) होगा । जब इस औसत कंट्रास्ट सिर समूह की है कि के साथ संगत है, वर्दी समग्र संरचनाओं पूरी तरह से मनाया तितर बितर करने के लिए सभी योगदान को हटाने के लिए मिलान किया जा सकता है ।

हम यहां मौजूद एक प्रोटोकॉल ड्यूटेरियम-लेबल alkyl जंजीरों के साथ रासायनिक समान डिटर्जेंट अणुओं को शामिल करके डिटर्जेंट micelles के न्यूट्रॉन कंट्रास्ट में हेरफेर करने के लिए । 19 , ३६ , ३७ यह micelle कोर और शेल, जो न्यूट्रॉन कैटरिंग की एक अनूठी क्षमता है की एक साथ विपरीत मिलान पूरा परमिट । ३५ , विस्तार के इस महत्वपूर्ण परिष्कृत स्तर के साथ ३८ , इसके विपरीत मिलान झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं के अंयथा व्यावहारिक अध्ययन सक्षम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, इस विपरीत मिलान दृष्टिकोण ऐसे बहुलक विनिमय प्रतिक्रियाओं३९ और तेल-पानी dispersants,४० या यहां तक कि अंय solubilizing एजेंटों, जैसे डिटर्जेंट, शामिल अंय प्रणालियों के लिए बढ़ाया जा सकता है bicelles,४१ के रूप में nanodiscs,४२ या ब्लॉक copolymers. ४३ इस पांडुलिपि में उल्लिखित के रूप में एक समान दृष्टिकोण है, लेकिन alkyl चेन और/या सिर समूह पर आंशिक ड्यूटेरियम प्रतिस्थापन के साथ एक भी डिटर्जेंट प्रजातियों को रोजगार हाल ही में प्रकाशित किया गया था । ३७ जबकि यह हाइड्रोजन और ड्यूटेरियम के यादृच्छिक वितरण में सुधार की उंमीद की जा सकती है यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की तुलना में डिटर्जेंट भर, प्रतिस्थापन और दो के लिए डिटर्जेंट पर उपलब्ध पदों की सीमित संख्या-कदम डिटर्जेंट संश्लेषण पर विचार के लिए अतिरिक्त चुनौतियों बन गया आवश्यक है ।

चरण 1 और 2 प्रोटोकॉल के नीचे विस्तृत अक्सर प्रारंभिक प्रयोग योजना के बाद से ओवरलैप करने के लिए एक गुणवत्ता प्रस्ताव प्रस्तुत किया जाना चाहिए । हालांकि, प्रस्ताव प्रस्तुत करने पर जोर दिया है कि इस प्रक्रिया को एक न्यूट्रॉन प्रयोग के अग्रिम में अच्छी तरह से शुरू किया जाना चाहिए पहले कदम के रूप में यहां माना जाता है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक शर्त कदम है, जो प्रस्ताव द्वारा प्रदर्शन किया जाना चाहिए, के लिए जैव रासायनिक और भौतिक लक्षण वर्णन है (शुद्धता और स्थिरता सहित) न्यूट्रॉन अध्ययन की आवश्यकता का समर्थन नमूना । छोटे कोण न्यूट्रॉन कैटरिंग (बिना) के एक सामान्य चर्चा इस लेख के दायरे से बाहर है. एक संक्षिप्त लेकिन पूरी तरह से परिचय Kaufmann,४४ और एक व्यापक जैविक छोटे कोण समाधान तितर बितर पर ध्यान केंद्रित पाठ्यपुस्तक द्वारा सामग्री के संदर्भ काम लक्षण वर्णन में उपलब्ध है हाल ही में प्रकाशित किया गया है । ४५ आगे की सिफारिश की पढ़ने चर्चा अनुभाग में दिया जाता है । छोटे कोण बिखरने का उपयोग करता है तथाकथित कैटरिंग वेक्टर क्यू के रूप में केंद्रीय मात्रा है कि तितर बितर प्रक्रिया का वर्णन करता है । यह आलेख व्यापक रूप से स्वीकृत परिभाषा Q = 4π सिन (θ)/λ का उपयोग करता है, जहां θ आवक और बिखरी किरण के बीच आधा कोण है और λ में न्यूट्रॉन विकिरण की तरंग दैर्ध्य Angstroms है. अंय परिभाषाएं मौजूद है कि इस तरह के ' के रूप में बिखरने वेक्टर के लिए विभिंन प्रतीकों का उपयोग करें, और है कि एक कारक 2π द्वारा या Angstrom के स्थान पर nanometers का उपयोग करके अलग हो सकता है ( चित्रा 10की भी चर्चा देखें) ।

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Protocol

1. एक न्यूट्रॉन सुविधा बीम समय और साधन प्रस्ताव तैयार करने और प्रस्तुत

  1. सामान्य उपयोगकर्ता न्यूट्रॉन बीम समय पहुँच, जैसे ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला (ORNL) प्रदान न्यूट्रॉन कैटरिंग सुविधाओं की पहचान करने के लिए ऑनलाइन संसाधनों से परामर्श करें । न्यूट्रॉन सुविधाओं और दुनिया भर में न्यूट्रॉन अनुसंधान के बारे में जानकारी का एक नक्शा ऑनलाइन उपलब्ध है. ४६ ध्यान रखें कि इन सुविधाओं में आम तौर पर प्रस्तावों के लिए नियमित कॉल है; यह निर्धारित करता है जब अगली बीम समय उपलब्ध हो जाएगा । न्यूट्रॉन आवेदनों की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाता है; छोटे कोण न्यूट्रॉन कैटरिंग (बिना) उपकरणों, विशेष रूप से जैविक नमूनों के लिए क्षमताओं के साथ उन के लिए खोज ।
  2. न्यूट्रॉन बीम समय प्रस्ताव प्रस्तुत करने की प्रक्रिया को नेविगेट करने में मदद करने के लिए न्यूट्रॉन सुविधाओं द्वारा प्रदत्त संसाधनों का उपयोग करें. एक न्यूट्रॉन कैटरिंग साइंटिस्ट (एनएसएस) के साथ परामर्श करें जो उस इंस्ट्रूमेंट से संबद्ध हो, जिसके लिए आप आवेदन करेंगे । प्रस्ताव कॉल, समय सीमा, और सबमिशन के लिए सलाह के बारे में न्यूट्रॉन सुविधा की वर्तमान जानकारी की समीक्षा करें; ओक रिज के लिए यह ऑनलाइन उपलब्ध है । ४७ एक सफल प्रस्तुत करने के लिए सभी दिशा निर्देशों के बाद बीम समय प्रस्ताव प्रस्तुत करते हैं ।
  3. यदि deuterated प्रोटीन की आवश्यकता है (२.२ देखें), न्यूट्रॉन कैटरिंग सुविधाओं अक्सर प्रयोगशालाओं और deuterated सामग्री के उत्पादन के लिए समर्पित विशेषज्ञता द्वारा समर्थित हैं. ORNL में बायो-Deuteration लैब (बीडीएल) तक पहुंच का अनुरोध करने के लिए, प्रस्ताव प्रणाली में दूसरा साधन के रूप में बीडीएल का चयन करें । जबकि बिना प्रस्ताव व्यवहार्यता के लिए समीक्षा की है और एक वैज्ञानिक समीक्षा समिति द्वारा, बीडीएल अनुरोध केवल व्यवहार्यता के लिए जांच की जाती है । बीडीएल व्यवहार्यता समीक्षा के साथ मदद करने के लिए, एक पूर्ण जानकारी अनुरोध फार्म४८ है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल और अनुमानित उपज (उपलब्ध ऑनलाइन) का वर्णन सबमिट करें ।
  4. बीम समय प्रस्ताव की सफल सहकर्मी की समीक्षा के बाद, प्रयोग के अग्रिम में बीम समय की पुरस्कृत तारीख की पुष्टि करें । सुनिश्चित करें कि सभी नमूना और बफ़र विवरण और सूत्र उचित समीक्षा के लिए प्रस्ताव में सही रूप से सूचीबद्ध हैं । प्रस्तावित प्रायोगिक योजना में कोई भी परिवर्तन, नमूना और बफर संरचना में परिवर्तन सहित, सुविधा की अधिसूचना की आवश्यकता है ।
    नोट: आवंटित एनएसएस के साथ ही बदलाव की जितनी जल्दी चर्चा होनी चाहिए ।

2. निर्धारित न्यूट्रॉन कंट्रास्ट मैच अंक और प्रोटीन माप के लिए आवश्यक कंट्रास्ट

  1. जानकारी इकट्ठा (आपूर्तिकर्ता के उत्पाद की जानकारी से, ऑनलाइन डेटाबेस, प्रकाशित मूल्यों, आदि) परमाणु रचनाओं और डिटर्जेंट प्रणाली घटकों के लिए मात्रा से संबंधित करने के लिए कंट्रास्ट-मिलान । यह जानकारी न्यूट्रॉन कैटरिंग लंबाई घनत्व (SLDs) का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है और इस प्रकार विपरीत मिलान अंक (CMPs) में समाधान है, जो गुणवत्ता संस डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और एक के संदर्भ में ब्याज की झिल्ली प्रोटीन के लिए संरचनात्मक जानकारी Pdc. एक तालिका शारीरिक गुण और इसके विपरीत झिल्ली प्रोटीन के भौतिक अध्ययन में आमतौर पर इस्तेमाल किया डिटर्जेंट के लिए मिलान अंक सारांश (तालिका 1) शामिल है ।
  2. वेब अनुप्रयोग गीली का उपयोग कर न्यूट्रॉन SLDs का निर्धारण: कंट्रास्ट भिन्नता डेटा४९ (उपलब्ध ऑनलाइन५० नि: शुल्क) के विश्लेषण के लिए मॉड्यूल. उपयोगकर्ता मैंयुअल के लिए एक लिंक मुख पृष्ठ पर स्थित है । वेबसाइट का उपयोग और साथ प्रलेखन पढ़ें । चित्रा 1 और चित्रा 2 इसके विपरीत मॉड्यूल इनपुट और दो संबंधित उदाहरण के लिए उत्पादन का एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं ।
    नोट: SLDs की गणना के लिए अंय वेबसाइटों उपलब्ध हैं, जैसे कि एक राष्ट्रीय मानक और प्रौद्योगिकी संस्थान (NIST) न्यूट्रॉन रिसर्च के लिए केंद्र द्वारा बनाए रखा । ५१
    1. ' कंट्रास्ट ' बाईं ओर नेविगेशन फलक में स्थित क्लिक करके कंट्रास्ट मॉड्यूल खोलें । किसी प्रोजेक्ट शीर्षक के लिए पाठ दें और दो घटकों के लिए नीचे विवरण दर्ज करें (उदा., डिटर्जेंट हेड ग्रुप और पूंछ) ' उपइकाई 1 ' और ' उपइकाई 2 ' के रूप में ।
    2. ' सूत्र ' पाठ बॉक्स में प्रत्येक घटक के लिए आणविक सूत्र दर्ज करें.
      नोट: रेडियो बटन ' ' ' के तहत ' पदार्थ प्रकार का चयन किया जाना चाहिए एक आणविक सूत्र में प्रवेश । साथ ही, आसानी से विनिमय करने वाला हाइड्रोजन परमाणुओं को इंगित करने के लिए सूत्र में ' X ' अक्षर का उपयोग करें । प्रोटीन, आरएनए, या डीएनए दृश्यों में प्रवेश किया जा सकता है अगर इसी ' पी ', ' R ', या ' d ' रेडियो बटन का चयन कर रहे हैं । यदि किसी घटक की एकाधिक प्रतिलिपियाँ उपइकाई के भीतर मौजूद हैं, तो ' Nmolecules ' के लिए मान तदनुसार परिवर्तित किया जा सकता है. एक व्यावहारिक उदाहरण यहां लिपिड की तरह डिटर्जेंट दो समान पूंछ युक्त से संबंधित है, एक पूंछ के लिए फार्मूला की अनुमति 2 के बराबर Nmolecules के साथ प्रवेश किया जाएगा ।
    3. ' खंड (Å3) ' के नीचे दिए गए बॉक्स में प्रत्येक घटक के लिए क्यूबिक Angstroms में वॉल्यूम दर्ज करें । लंबाई n, Vपूंछ = २७.४ + n * २६.९ की alkyl श्रृंखला के लिए Tanford के सूत्र28 का प्रयोग करें, अनुमानित पूंछ मात्रा की गणना करने के लिए, या उत्पाद प्रदान की गई जानकारी से आणविक मात्रा प्राप्त या में प्रकाशित मूल्यों साहित्य ।
    4. बफ़र घटकों के लिए विवरण दर्ज करें । एक बफर घटक के लिए पंक्तियों को जोड़ने या हटाने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग कर ' संख्या में भंग प्रजातियों ' बदलें । micelle के मामले में डिटर्जेंट बनाने, डिटर्जेंट क्रिटिकल micelle एकाग्रता (सीएमसी) में अलग बफर घटकों के रूप में मुक्त डिटर्जेंट मोनोमर शामिल हैं ।
    5. न्यूट्रॉन के विपरीत परिकलनों को निष्पादित करने के लिए ' Submit ' पर क्लिक करें और एक परिणाम पृष्ठ जेनरेट करे जो किसी भी दिए गए प्रतिशत पर इन पैरामीटर्स को निर्धारित करने के लिए सूत्र के साथ-साथ लंबाई घनत्व और कंट्रास्ट मिलान अंक की एक तालिका प्रदान करता है जिसमें डी2ओ बफ़र । घटक CMPs के लिए विशेष रूप से ध्यान के साथ कैटरिंग पैरामीटर्स की समीक्षा करें । यदि मैच अंक (10% डी2ओ के भीतर) समान है और मुक्त micelle एकाग्रता कम है, तो औसत सीएमपी इसके विपरीत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-डिटर्जेंट योगदान मिलान । ज्यादातर मामलों में, डिटर्जेंट सिर समूह और पूंछ के सीएमपी अधिक से अधिक 10-15% से अलग है, एक कोर के बिना डेटा जो अकेले प्रोटीन से तितर बितर संकेत के प्रत्यक्ष संग्रह गड़बड़ाने में खोल फार्म का कारक उत्पादन होगा ।
  3. डिटर्जेंट सिर समूह और पूंछ के बीच इसके विपरीत का आकलन करें । जब डिटर्जेंट सिर समूह और alkyl श्रृंखला पूंछ CMPs अच्छी तरह से मिलान नहीं कर रहे हैं, उपलब्धता और एक ड्यूटेरियम के शामिल-डिटर्जेंट विकल्प का चयन घटकों की लंबाई घनत्व बिखरने की अनुमति कर सकते है हेरफेर किया जाएगा । ज्यादातर मामलों में, यह ड्यूटेरियम के साथ एक समान डिटर्जेंट के शामिल करने के माध्यम से एक मिश्रित micelle गठन की आवश्यकता होगी-alkyl जंजीरों प्रतिस्थापित । ड्यूटेरियम के अलावा alkyl श्रृंखला पूंछ द्वारा गठित कोर के बिखरने लंबाई घनत्व उठाती है । इस मामले में वांछित समापन बिंदु, इस तरह की है कि सिर समूह शैल सीएमपी और alkyl चेन कोर सीएमपी लगभग बराबर मान है.
    1. डिटर्जेंट micelle कोर के सीएमपी उठाएं लगभग एच पूंछ और डी पूंछ कि सिर समूहों के साथ पूरा विपरीत मिलान प्राप्त करता है के बीच मिश्रण के उचित अनुपात का निर्धारण करके सिर समूह खोल के सीएमपी के बराबर हो । इस निर्धारण के लिए एक शर्त एक ड्यूटेरियम के लिए सीएमपी के ज्ञान है alkyl श्रृंखला पूंछ प्रतिस्थापित । n-Dodecyl β-D-maltoside (डीडीएम) के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समकक्ष ड्यूटेरियम (d25-डीडीएम) द्वारा प्रतिस्थापित सभी alkyl चेन हाइड्रोजन के साथ उपलब्ध है । ' h-पुच्छ ' के स्थान पर एक ' सोंच-पट ' के लिए चरण २.१ में उल्लिखित कंट्रास्ट परिकलनों को दोहराएँ.
    2. सिर समूह सीएमपी के साथ कंट्रास्ट-मिलान के लिए आवश्यक डी-टेल करने के लिए एच-पूंछ के तिल अनुपात की गणना. निम्नलिखित सूत्र इस निर्धारण के साथ सहायता कर सकता है:
      सीएमपीसिर = सीएमपीएच पूंछ * χएच पूंछ + सीएमपीडी-पूंछ * χडी-पूंछ
      जहां सीएमपी तितर बितर लंबाई घनत्व है और χ डिटर्जेंट सिर, एच पूंछ, या डी-पूंछ घटक के लिए मात्रा अंश है । के लिए d25-ड्यूटेरियम के साथ डीडीएम-स्थानापन्न alkyl चेन के रूप में कुल डिटर्जेंट के ४४% वजन से (४३% तिल द्वारा) के डीडीएम समाधान के buffered के लिए, दोनों सिर और पूंछ घटकों के लिए ४८.५% डी2में एक एकल सीएमपी पैदा करता है ।
  4. झिल्ली प्रोटीन के लिए ड्यूटेरियम प्रतिस्थापन की डिग्री पर विचार करें । प्रोटीन के लिए पर्याप्त तितर बितर संकेत को मापने के लिए, प्रोटीन के लिए सीएमपी से दूर डिटर्जेंट सीएमपी और माप की स्थिति से समाधान में कम से 15% D2हे होना चाहिए । इस% अंतर के वर्ग के साथ संकेत बढ़ जाती है । एक unlabelेड प्रोटीन की सीएमपी के बाद से आम तौर पर ~ ४२% D2के साथ होता है समाधान में ओ (एक सीएमपी कई डिटर्जेंट सिर समूहों के समान), प्रोटीन के ड्यूटेरियम लेबल लगभग हमेशा एक आवश्यकता है । ५२

3. एक्सप्रेस और शुद्ध ब्याज की झिल्ली प्रोटीन

  1. पौंड (lysogeny शोरबा) मध्यम तैयार है और ई कोलाई (ई. कोलाई) कोशिकाओं एक inducible अभिव्यक्ति वेक्टर लक्ष्य प्रोटीन अनुक्रम के लिए बंदरगाह हो जाना ।
    1. न्यूनतम मीडिया तैयार करें । या तो एच2ओ या डी2ओ में, भंग ७.० g/l (NH4)2सू4, ५.२५ g/l ना2HPO4, १.६ g/l KH2पो4, ०.५० g/l diammonium हाइड्रोजन साइट्रेट, ५.० g/l ग्लिसरॉल, १.० एमएल/एल के 20% w/वी MgSO 4· 7H2हे, व १.० मिलि/l के Holme स्ट्रेस मेटल्स (०.५० g/l CaCl2· 2H2o, ०.०९८ g/l CoCl2, ०.१०२ g/l CuSO4, १६.७ g/l FeCl3· 6H2हे, ०.११४ g/l MnSO4· ज2ओ, २२.३ g/l ना2EDTA · 2H2o, व ०.११२ g/l ZnSO4· एचओ). ५३ , ५४
    2. एच2ओ या डी2ओ का उपयोग कर उचित एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    3. एक isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside स्टॉक समाधान एच2ओ या डी2ओ का उपयोग कर तैयार करें ।
    4. बाँझ-एक ०.२२ माइक्रोन ताकना आकार के साथ बोतल टॉप वैक्यूम और सिरिंज फिल्टर का उपयोग सूखी, बाँझ कंटेनरों में सभी समाधान फिल्टर ।
  2. अनुकूलन ई. कोलाई कोशिकाओं ड्यूटेरियम करने के लिए-एक deuterated प्रोटीन की अधिकता के लिए पैमाने से पहले मध्यम लेबल ।
    1. Inoculate पौंड मध्यम के एक Lysogeny शोरबा (पौंड) से एक अलग कॉलोनी के साथ 3 मिलीलीटर प्लेट या एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से कोशिकाओं आगर । २५० RPM पर एक मिलाते हुए मशीन में ३७ ° c पर कोशिकाओं को विकसित या 30 डिग्री सेल्सियस या नीचे के तापमान को कम करने के लिए संस्कृति के अधिक वृद्धि जब रातोंरात गर्मी से बचने के लिए ।
      नोट: अनुकूलन प्रक्रिया विविध किया जा सकता है । ५५ , ५६ , ५७
    2. एक बार पौंड संस्कृति ~ 1 के ६०० एनएम (आयुध डिपो६००) में एक ऑप्टिकल घनत्व हो गया है, यह 1:20 एच2ओ ंयूनतम मध्यम के 3 मिलीलीटर में पतला और ~ 1 के एक आयुध डिपो६०० के लिए विकसित । ५०, ७५ और १००% D2o (या वांछित डी2ओ प्रतिशत तक) वाले न्यूनतम माध्यम का उपयोग कर 1:20 कमजोर पड़ने को दोहराएँ ।
      नोट: डी2ओ सामग्री के रूप में वृद्धि हुई है, विकास दर में कमी आएगी । ग्रोथ मीडिया और प्रोटीन में ड्यूटेरियम प्रतिस्थापन में डी2ओ प्रतिशत के बीच संबंध को साहित्य में बताया गया है । ५८ , ५९ , ६०
    3. deuterated सेल मास (चित्रा 3) की उपज बढ़ाने के लिए एक प्रतिक्रियाकर्ता में संस्कृति बढ़ रही जारी रखें ।
      नोट: प्रतिक्रियात्मक कार्रवाई के लिए चरण दर चरण प्रक्रियाओं की समीक्षा कहीं गई है । ६१ , ६२ , ६३ , ६४
  3. फसल और लाइसे ई. झिल्ली निष्कर्षण और प्रोटीन शुद्धि के लिए कोलाई कोशिकाओं
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 30-45 मिनट के लिए ~ ६,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
    2. ~ 30 मिनट के लिए बर्फ पर बफर में भिगोने से सेल गोली नरम । फिर, धीरे बफर में एक सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक, या कोमल एक 2d घुमाव पर कमाल के साथ pipetting द्वारा सेल गोली resuspend, के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ~ 1 ग्राम गीला सेल मास/
      नोट: एक उदाहरण बफ़र है ५० mm HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड), pH ७.५, २०० mM NaCl पूरक के साथ एक चिढ़ाना अवरोधक गोली ।
    3. लाइसे १०,००० साई में एक उच्च दबाव homogenizer के माध्यम से तीन गुजरता के साथ resuspend कोशिकाओं जबकि बहिर्वाह द्रुतशीतन ।
      नोट: पैमाने पर आवश्यक के आधार पर, अन्य lysis तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, फ्रेंच प्रेस या sonication द्वारा).
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ~ ४,०००-५,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली सेल मलबे । supernatant स्पष्ट किया है जब तक इस चरण को दोहराएँ ।
    5. Ultracentrifuge (~ १५०,००० 30-45 मिनट के लिए एक्स जी) पूर्व कदम है, जो घुलनशील और झिल्ली भागों शामिल से supernatant । ultracentrifugation के बाद गोली झिल्ली अंश शामिल हैं ।
    6. एक बड़े Dounce homogenizer में झिल्ली गोली resuspend और ultracentrifugation (चरण 3.3.5) द्वारा फिर से झिल्ली अंश अलग । ढीला बाध्य प्रोटीन को दूर करने के लिए इस कदम को कम से एक बार दोहराएँ ।
    7. कोमल कमाल से Solubilize झिल्ली एक बफर में 4 ° c पर ~ 30 मिनट के लिए शुद्धि के लिए उपयुक्त डिटर्जेंट युक्त । Solubilization स्पष्ट है जब निलंबन बादल से पारदर्शी करने के लिए बदल जाता है । ultracentrifugation द्वारा अघुलनशील सामग्री निकालें (~ १५०,००० x g 30-45 मिनट के लिए) ।
      नोट: एक उदाहरण बफ़र है ५० mm HEPES, pH ७.५, ५०० mm NaCl, 20 mm imidazole and 4% (w/v) डीडीएम द्वारा शुद्धि के लिए नी2 + अपनत्व क्रोमैटोग्राफी.
  4. पहले protonated रूपों के लिए विकसित एक प्रोटोकॉल निंनलिखित प्रोटीन शुद्ध ।
    नोट: See Naing एट अल. एक उदाहरण के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल के लिए एक hexahistidine टैग की गईं एम. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl (डी-MmIAP) को छेड़ो । ६५ अंतिम उपज था ~ 1 5 एल deuterated सेल संस्कृति विकास, जिनमें से सभी के बिना प्रयोग (चित्रा 4) में इस्तेमाल किया गया था से deuterated की मिलीग्राम ।
  5. एक्सचेंज "अंतिम एक्सचेंज बफर में शुद्ध प्रोटीन" इसके विपरीत मिलान के लिए ।
    1. "अंतिम एक्सचेंज बफर" के २०० मिलीलीटर तैयार कंट्रास्ट मिलान के लिए सही मिश्रण है, जैसे,20 मिमी HEPES, पीएच ७.५, २५० mM NaCl, और ०.०५% कुल डीडीएम (०.०२८% डीडीएम और ०.०२२% d25-डीडीएम) में ४९% डी2ओ ।
    2. Equilibrate एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली का उपयोग 3.5.1 में "अंतिम एक्सचेंज बफर" के > 2 कॉलम खंड (CV) के साथ एक आकार अपवर्जन कॉलम ।
    3. नमूना इंजेक्शन के बाद, कॉलम चलाने के लिए और ब्याज के प्रोटीन के लिए इसी अलग भिन्न ।
    4. वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन ध्यान केंद्रित (2-5 मिलीग्राम/एमएल) ।
      नोट: ~ ३०० μL का एक खंड एक 1 मिमी बेलनाकार क्वार्ट्ज cuvette के लिए इस्तेमाल को भरने के लिए आवश्यक है ।
    5. आरक्षित पृष्ठभूमि घटाव के बिना मिलान बफर के एक aliquot ।
      नोट: aliquot सीधे तैयार बफर से लिया जा सकता है, या आदर्श FPLC चलाने के अंत में एक साफ रेफरेंस अंश से ।

4. बीम समय के लिए अंतिम तैयारी करें और संस डेटा इकट्ठा

  1. प्रस्ताव को स्वीकार कर लिया गया है और साइट का उपयोग अनुमोदित किया गया है के बाद, सौंपा बीम समय के अग्रिम में सभी आवश्यक प्रशिक्षण पूरा करें । यह आगमन, वेब आधारित प्रशिक्षण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पर साइट रेडियोलॉजिकल, प्रयोगशाला, और साधन विशेष प्रशिक्षण शामिल हैं ।
    नोट: प्रशिक्षण की आवश्यकताएं पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए अग्रिम आगमन तय कर सकती हैं । अधिक जानकारी ऑनलाइन उपलब्ध है । ६६
  2. डेटा संग्रह के लिए नमूने और बफ़र्स लोड करें ।
    नोट: जैविक छोटे कोण न्यूट्रॉन कैटरिंग (बायो संस) साधन नमूना पर्यावरण क्षेत्र का अवलोकन चित्रा 5में दिखाया गया है ।
    1. लोड नमूनों और बफ़र्स क्वार्ट्ज कोशिकाओं में । क्वार्ट्ज कोशिकाओं साधन वैज्ञानिक या सुविधा से उपलब्ध हैं । अधिकांश नमूना कक्षों के संकीर्ण खुलने तक पहुंचने के लिए जेल-लोडिंग युक्तियों का उपयोग करें ।
    2. सुनिश्चित करें कि बीम शटर बंद है, तो नमूना पर्यावरण क्षेत्र दृष्टिकोण और नमूना परिवर्तक में क्वार्ट्ज कोशिकाओं जगह है । प्रत्येक नमूना कक्ष के लिए नमूना परिवर्तक स्थिति रिकॉर्ड ।
    3. क्षेत्र की जाँच करें और सुनिश्चित करें बीम पथ रुकावट से मुक्त है, तो नमूना पर्यावरण क्षेत्र छोड़ दो और बीम शटर खुला ।
      नोट: ध्यान से सभी सुविधा नियमों और विनियमों का पालन करें, सभी पोस्टिंग पालन, और साधन वैज्ञानिक की सलाह ध्यान । नमूने बीम से हटाया नहीं जा सकता है और विशेष सावधानियों का पालन किए बिना बीम के लिए जोखिम के बाद हेरफेर । इन कार्यविधियों से पहले एक रेडियोलॉजिकल नियंत्रण तकनीशियन (RCT) के साथ परामर्श करें ।
  3. स्वचालित डेटा संग्रह के लिए तालिका स्कैन निष्पादित करें
    1. कस्टम नियंत्रण LabVIEW आधारित सॉफ्टवेयर, स्पेक्ट्रोमीटर साधन नियंत्रण पर्यावरण (स्पाइस) के माध्यम से साधन संचालित । न्यूट्रॉन कैटरिंग साइंटिस्ट द्वारा प्रदान किए गए इंस्ट्रूमेंट ऑपरेशन के निर्देशों का पालन करें । चित्र 6में तालिका स्कैन कार्रवाई windows का ओवरव्यू प्रदान किया गया है ।
    2. उपयुक्त क्षेत्रों में आवश्यक जानकारी दर्ज करने के बाद, तालिका स्कैन निष्पादित करें और एक स्वचालित डेटा संग्रह प्रक्रिया शुरू हो जाएगी । ' तालिका स्कैन स्थिति ' टैब के माध्यम से प्रगति की निगरानी करें ।

5.2d छवि से 1 डी प्लॉट करने के लिए कम संस डेटा

  1. रिकॉर्ड किए गए स्कैन नंबरों से प्रत्येक नमूना और बफ़र डेटा फ़ाइल की पहचान करें । प्रत्येक माप एक अनंय स्कैन संख्या असाइन किया जाएगा । यह जानकारी प्रत्येक संगत नमूना और बफ़र जोड़ी की पहचान करने के लिए डेटा कमी के दौरान उपयोगी है ।
  2. कमी के लिए MantidPlot सॉफ्टवेयर और अजगर स्क्रिप्ट का प्रयोग करें
    1. न्यूट्रॉन कैटरिंग उपयोगकर्ता दूरस्थ विश्लेषण क्लस्टर पर उनके डेटा तक पहुँचने के लिए खाता विवरण के साथ प्रदान किए जाते हैं । ६७ दूरस्थ विश्लेषण क्लस्टर में लॉग ऑन करें और आदेश पंक्ति से "MantidPlot" निष्पादित । चित्रा 7 और चित्रा 8 इन चरणों की सहायता प्रदान की जाती है ।
    2. न्यूट्रॉन कैटरिंग वैज्ञानिक से एक उपयोगकर्ता कमी स्क्रिप्ट प्राप्त करें (यह आमतौर पर प्रयोग के दौरान होगा); इस स्क्रिप्ट अजगर है आधारित है और सभी आवश्यक अंशांकन शामिल होंगे और समायोजन स्केलिंग को तितर-बितर कोण के एक समारोह के रूप में बिखरे हुए तीव्रता का एक 1 डी प्लॉट में 2d तितर बितर छवि को कम करने के लिए, मैं (क्यू) ।
    3. MantidPlot में प्रदान की गई उपयोगकर्ता कमी स्क्रिप्ट खोलें और उपयुक्त सूची में नमूना और बफ़र जोड़ों के लिए संबंधित स्कैन संख्या या पहचान रखें ।
    4. एक चार-स्तंभ पाठ फ़ाइल (स्तंभ क्रम है q, i (q), मैं (q) त्रुटि, q त्रुटि) निर्दिष्ट स्थान के रूप में कम डेटा जनरेट करने के लिए स्क्रिप्ट निष्पादित करें । सही MantidPlot में उपयुक्त कार्यक्षेत्र पर क्लिक करें और चुनें "त्रुटियों के साथ साजिश..." कैटरिंग प्रोफाइल के एक प्रारंभिक परीक्षा के लिए ।

6. विकैटरिंग पार्टिकल के संरचनात्मक मापदंडों के लिए डेटा का विश्लेषण करें

  1. कम डेटा फ़ाइल विश्लेषण सर्वर से सुरक्षित FTP फ़ाइल स्थानांतरण का उपयोग कर किसी स्थानीय कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें । इस तरह के FileZilla या CyberDuck के रूप में सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ किया जा सकता है । अतिरिक्त निर्देश और विश्लेषण सर्वर फ़ाइल सिस्टम से कनेक्ट करने के लिए विवरण analysis.sns.gov लॉगिन पृष्ठ पर उपलब्ध कराए गए हैं ।
  2. ATSAS सॉफ्टवेयर सुइट६५,६८ (पूरे ATSAS सुइट) डाउनलोड करें । ६९ व्यक्तिगत कार्यक्रम७० भी बिना डेटा का विश्लेषण, अर्थात् संरचनात्मक मापदंडों और एबी initio मॉडल का निर्धारण करने के लिए ऑनलाइन उपलब्ध हैं ।
    नोट: कई विकल्प biomacromolecules के बिना डेटा विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं । ४५
  3. प्लॉटिंग डेटा, बफ़र स्केलिंग और घटाव, और Guinier विश्लेषण के लिए प्राइमस७१ का उपयोग करें ।
    1. ATSAS ' SAS डेटा विश्लेषण ' आवेदन शुरू और नमूना और बफर जोड़ी के लिए इसी कम डेटा फ़ाइलों को लोड ।
      1. बफ़र को ठीक से स्केल करने के लिए, उच्च Q (q > ०.५ Å-1) पर एक डेटा श्रेणी का चयन करें जहां दोनों प्रोफाइल समान और सपाट हैं, और ' ऑपरेशन ' टैब के अंतर्गत स्थित ' स्केल ' बटन पर क्लिक करें । एक पैमाने पर कारक है कि इन दो फ्लैट क्षेत्रों ओवरलैप चाहिए बफर करने के लिए लागू किया जाएगा । सावधानी का प्रयोग करें: एक सुखद शारीरिक कारण है कि बफर तीव्रता स्केलिंग नमूने से मेल करने के लिए औचित्य साबित होना चाहिए । यदि विसंगति बड़ी है, पृष्ठभूमि घटाव के लिए मांय दृष्टिकोण के लिए एक साधन वैज्ञानिक से परामर्श करें । ४४ , ४५ , ७२
      2. सभी बिंदुओं को देखने के लिए डेटा श्रेणी बढ़ाएँ. इस कार्रवाई को करने के लिए ' घटाना ' क्लिक करें । ठीक क्लिक करें बफ़र-घटाया datafile लेजेंड में और अनुवर्ती विश्लेषण के लिए इस फ़ाइल को सहेजें । चित्रा 9 ' संचालन ' टैब के उपयोग की रूपरेखा ।
    2. ' एसएएस डेटा विश्लेषण ' अनुप्रयोग के ' विश्लेषण ' टैब का उपयोग कर बफ़र-घटाया नमूना डेटा का एक Guinier विश्लेषण निष्पादित करें ।
      1. सुनिश्चित करें कि उचित फ़ाइल सूची में चयनित और ' परिचलन की त्रिज्या ' पर क्लिक किया है । एक Guinier फिट करने के लिए एक स्वचालित प्रयास ' Autorg ' बटन पर क्लिक करके प्रदान किया जाएगा ।
      2. सभी निम्न-q डेटा शामिल करने के लिए उपयोग किए गए डेटा की श्रेणी का विस्तार करें और Qmax * Rg सीमा १.३ के नीचे है जब तक कि उच्च-q बिंदुओं को दूर ले जाकर डेटा श्रेणी को सीमित करना शुरू । यह सत्यापित करने के लिए अवशिष्टों की साजिश का उपयोग करें कि डेटा फ़िट श्रेणी में रेखीय हैं. Guinier फिट पैदावार एक अनुमानित आरजी और मैं बिखरने कणों के लिए0
      3. फ़िट क्षेत्र में छोटे समायोजन करें और फ़िट में उपयोग किए गए डेटा की श्रेणी में इन मानों की संवेदनशीलता पर नजर रखें. चित्रा 10A ' परिचलन के त्रिज्या ' उपकरण के उपयोग को दर्शाता है ।
  4. GNOM में संभाव्यता वितरण फ़ंक्शन (P (r)) प्राप्त करें । ७३ आउटपुट फ़ाइल यहाँ जनरेट किया गया अब initio मॉडलिंग प्रक्रिया के लिए एक इनपुट के रूप में उपयोग किया जाएगा ।
    1. ' विश्लेषण ' टैब के भीतर दूरी वितरण विज़ार्ड प्रारंभ करें । डेटा के लिए एक अच्छा फिट प्राप्त करने के लिए एक गुणवत्ता मॉडल प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । सटीक फिट बैठता है प्राप्त करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया समीक्षा७४ Putnam, एट अल द्वारा देखें ।
      नोट: GNOM प्रोग्राम दूरी वितरण विज़ार्ड से बाहर फ़िट के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है । चित्रा 10B ' दूरी वितरण ' उपकरण के समुचित उपयोग को दर्शाता है, और चित्रा 11 का सामना करना पड़ा आम त्रुटियों के कुछ दिखाता है ।
    2. निर्धारित Dmax, अणु के भीतर अधिकतम परमाणु दूरी ।
      1. Rmax = 0 और Dmax (१५० Å, उदाहरण के लिए) के लिए एक बड़ा मान दर्ज करने के लिए बाध्य करने के लिए बॉक्स को अनचेक करके Dmax के लिए मान का अनुमान लगाएं । पहले एक्स-इंटरसेप्ट के प्लाट में पी (आर) के इस अनुमान से पैदावार होती है.
      2. इस Dmax मान और उपयोग किए गए डेटा की श्रेणी में वृद्धिशील परिवर्तन करें या GNOM फ़िट करने के लिए डेटा और परिणामी P (r) वक्र ऑप्टिमाइज़ करने के लिए फ़िट में उपयोग किए गए बिंदुओं की संख्या ।
    3. GNOM फिट को परिष्कृत और बाद एबी initio मॉडलिंग चरणों के लिए अच्छा फिट मापदंडों के साथ GNOM उत्पादन फ़ाइलों को बचाने के लिए जारी रखें ।
  5. उच्च संकल्प PDB मॉडल प्रोग्राम CRYSON का उपयोग करने से बिना संस प्रोफाइल अनुकरण । ७५
    1. प्रोग्राम खोलें और ' 0 ' विकल्प का चयन करें । पॉपअप फ़ाइल ब्राउज़र में PDB फ़ाइल नाम का चयन करें । डिफ़ॉल्ट सेटिंग को स्वीकार करने के लिए enter दबाएं, सिवाय चेन deuteration अंशों को निर्दिष्ट करने के लिए और D2O के अंश विलायक में उचित कंट्रास्ट पैरामीटर्स को प्राप्त करने के लिए ।
    2. ' Y ' दर्ज करके और पॉपअप फ़ाइल ब्राउज़र में डेटा फ़ाइल का चयन करके एक प्रयोगात्मक डेटा सेट करने के लिए मॉडल फ़िट करें । शेष डिफ़ॉल्ट मान स्वीकार करें, और आउटपुट फ़ाइलें PDB फ़ाइल स्थान में लिखा जाएगा । '. fit ' फ़ाइल में उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3d मॉडल से अनुमानित कैटरिंग प्रोफ़ाइल के लिए जानकारी होती है.

7. संस डेटा से एबी Initio मॉडल बनाएं ।

नोट: DAMMIF७६ और DAMMIN७७ ATSAS सॉफ्टवेयर सुइट के भीतर GNOM उत्पादन से एक नकली एनीलिंग प्रक्रिया का उपयोग कर डमी एटम मॉडल (बांधों) का पुनर्निर्माण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें P (r) डेटा, या संभाव्यता के बारे में जानकारी या तितर बितर कण के भीतर एक परमाणु दूरी की आवृत्ति । ये प्रोग्राम या ATSAS-ऑनलाइन वेब सर्वर पर बैच मोड में चलाया जा सकता है ।

  1. ' एसएएस डेटा विश्लेषण ' के ' विश्लेषण ' टैब पर ' Dammif ' बटन से प्राइमस आकृति विज़ार्ड प्रारंभ करें, और पैरामीटर्स का एक मैन्युअल चयन का उपयोग करें । विज़ार्ड के लिए इनपुट चित्र 12में सचित्र है ।
    1. फ़िट (चरण 6.3.2) से Guinier श्रेणी निर्धारित करें और नेविगेशन बटन का उपयोग करके अगले चरण पर आगे बढ़ें. P (r) प्लॉट (चरण ६.४) से फ़िट मान निर्धारित करें और अगले चरण पर आगे बढ़ें ।
    2. अटल initio मॉडलिंग प्रक्रिया के लिए पैरामीटर प्रदान करें । मॉडल आउटपुट फ़ाइल नाम (जैसे, SANSEnvelope) के लिए एक उपसर्ग दर्ज करें, या तो ' फास्ट ' या ' धीमी गति ' मोड मॉडलिंग का चयन, मॉडलों की संख्या के लिए एक मूल्य दर्ज करें (17 सांख्यिकीय महत्व के लिए अनुशंसित), कण समरूपता के लिए उपलब्ध विकल्पों में से चुनें, anisometry, और कोणीय पैमाने पर (यदि जाना जाता है) । सुनिश्चित करें कि बक्से DAMAVER के साथ औसत मॉडल की जांच की और DAMMIN के साथ अंतिम मॉडल को परिष्कृत कर रहे हैं ।
    3. ' कमिट ' बटन का उपयोग कर प्रक्रिया आरंभ । प्रक्रिया पूर्ण होने के बाद, देखें और कार्य निर्देशिका को सहेजें ।
      नोट: एक एकल, छोटे प्रोटीन के लिए ठेठ मॉडलिंग की प्रक्रिया एक ठेठ व्यक्तिगत कंप्यूटर के साथ कुछ घंटों के लिए ले जा सकते हैं । सहेजी गई फ़ाइलें अस्थाई निर्देशिकाओं में संग्रहीत की जाती हैं ।
  2. ओवरले और ATSAS के भीतर SUPCOMB का उपयोग कर एक संबंधित उच्च संकल्प मॉडल के साथ अंतिम बिना लिफाफा मिलाना । उच्च संकल्प PDB मॉडल की एक प्रति प्लेस करने के लिए काम निर्देशिका में बिना लिफाफा फिट हो । पहले सूचीबद्ध टेम्पलेट संरचना के साथ दो तर्क के रूप में PDB फ़ाइल नाम का उपयोग करते हुए आदेश पंक्ति से SUPCOMB निष्पादित करें: $ SUPCOMB काम करता है । PDB SANSEnvelope PDB
    नोट: दूसरा फ़ाइल नाम सूचीबद्ध एक "आर" अंत करने के लिए संलग्न है और टेंपलेट संरचना पर superimposition के लिए नए निर्देशांक होने के साथ एक नई फ़ाइल के रूप में फिर से लिखा जाएगा ।
  3. पयमोल (pymol.org), एक 3 डी आणविक ग्राफिक्स देखने के कार्यक्रम का उपयोग कर एबी initio मॉडल परिणाम कल्पना । चित्र 13 पयमोल कार्रवाइयों का ओवरव्यू प्रदान करता है ।
    नोट: समाधान में छोटे कोण बिखरने वाले डेटा के संरचनात्मक मॉडलिंग के लिए प्रकाशन दिशानिर्देश हैं । ७८
    1. पयमोल आवेदन शुरू करने और 3 डी बिना लिफाफे और SUPCOMB-गठबंधन उच्च संकल्प संरचना को देखा जा करने के लिए संगत. pdb फ़ाइलें खोलें ।
    2. एक सतह के रूप में इस मॉडल का प्रतिनिधित्व करके संस लिफाफा कल्पना । ' के मॉडल के बगल में ' बटन पर क्लिक करें और चुनें ' शो: के रूप में: भूतल ' ।
    3. एक कार्टून के रूप में इस मॉडल का प्रतिनिधित्व करके उच्च संकल्प प्रोटीन रीढ़ की संरचना कल्पना । इस मॉडल के बगल में ' बटन का चयन करें और ' शो: के रूप में: कार्टून ' का चयन करें । ' c ' बटन और ' श्रृंखला द्वारा: Chainbows ' का चयन करके श्रृंखला को एन-टू सी टर्मिनस से इंद्रधनुष के रूप में प्रदर्शित करें ।
    4. स्पष्टता के लिए सतह प्रतिनिधित्व की पारदर्शिता को संशोधित करें । ' सेटिंग ' मेनू बार से, चुनें ' पारदर्शिता» भूतल» ४०% ' ।
    5. पृष्ठभूमि सफेद और गैर अपारदर्शी बनाओ । ' प्रदर्शन ' मेनू पट्टी से, चुनें ' पृष्ठभूमि» ' और पृष्ठभूमि के लिए इस रंग को चिह्नित करने के लिए इस विकल्प और ' सफेद ' अचयनित करने के लिए ' अपारदर्शी ' का चयन करें.
      नोट: अतिरिक्त संचालन और पयमोल के लिए उपयोग करता है PyMolWiki.org पर पाया जा सकता है ।

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Representative Results

एक बीम समय और साधन प्रस्ताव स्पष्ट रूप से समीक्षा समिति के लिए आवश्यक सभी जानकारी देना चाहिए ताकि प्रस्तावित प्रयोग का एक वैध मूल्यांकन किया जा सकता है । एक एनएसएस के साथ संचार अत्यधिक अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए सुझाव दिया है । एनएसएस व्यवहार्यता, सुरक्षा, और उच्च प्रभाव विज्ञान के लिए क्षमता पर जोर देने के लिए प्रारंभिक व्यवहार्यता और गाइड प्रस्ताव प्रस्तुत करने का आकलन कर सकते हैं । प्रस्ताव में दी गई जानकारी में शोध के महत्व के लिए पृष्ठभूमि जानकारी और संदर्भ शामिल होना चाहिए; ज्ञान है कि प्राप्त होने की उंमीद है और कैसे इस प्रभावों विज्ञान के संबंधित क्षेत्र में वर्तमान समझ; काम, नमूने, विधियों, और प्रक्रियाओं है कि नियोजित किया जाएगा का विवरण; और, यदि लागू हो, तो प्रासंगिक प्रकाशनों और परिणामों सहित सुविधा पर टीम की पिछली उत्पादकता । उपयोगी संसाधन, जैसे प्रस्ताव टेम्पलेट्स और प्रस्ताव तैयार करने के लिए युक्तियाँ, न्यूट्रॉन साइंस उपयोगकर्ता पोर्टल (neutrons.ornl.gov/users) के माध्यम से उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं.

प्रयोग की योजना बना एक गतिशील प्रक्रिया है कि अक्सर प्रस्ताव प्रस्तुत करने के आरंभिक चरणों के दौरान शुरू होता है, लेकिन पूरी तरह से कल्पना नहीं हो सकता है जब तक सिर्फ प्रयोग करने से पहले । हालांकि, ध्यान रखें कि प्रस्ताव में वर्णन (बफ़र शर्तों या नमूना संरचना में परिवर्तन सहित) से काफी विचलित होने वाले किसी भी परिवर्तन को प्रयोग के प्रारंभ से पूर्व सुविधा द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल मानता है कि समाधान में डिटर्जेंट micelles में ब्याज की झिल्ली प्रोटीन को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक विधि सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है । इस मामले में, ब्याज की झिल्ली प्रोटीन एक intramembrane aspartyl को छेड़ो (आईएपी) है, जो एक की स्थापना की शुद्धिकरण प्रोटोकॉल है और पहले से घुलनशील है और डीडीएम micelles युक्त बफर में सक्रिय होना निर्धारित किया गया है ।

यहाँ, हम गीली का उपयोग न्यूट्रॉन इसके विपरीत गणना का प्रदर्शन: इसके विपरीत में आईएपी प्रोटीन का एक समाधान के लिए कंट्रास्ट मॉड्यूल-मिलान मिश्रित डीडीएम/d25-डीडीएम micelles. इस के साथ साथ इस रणनीति को पहले दो micelle के एक पूर्ण विपरीत मैच को प्राप्त करने के लिए आवश्यक डिटर्जेंट के बीच मिश्रण की डिग्री का निर्धारण किया गया । अंत परिणाम के लिए प्रत्येक घटक और पृष्ठभूमि (एच2ओ/डी2ओ अनुपात) के सापेक्ष विपरीत निर्धारित करने के लिए आवश्यक इसके विपरीत-डिटर्जेंट से बिखरने मैच के लिए केवल प्रोटीन बिखरने का पालन करें ।

1 चित्रा गीली इसके विपरीत मॉड्यूल के लिए एक उचित इनपुट और डीडीएम डिटर्जेंट सिर समूह और 1 के रूप में पूंछ और 2, क्रमशः के विपरीत गणना के लिए परिणामी उत्पादन दर्शाता है । हेड ग्रुप के लिए उपयोग किया जाने वाला फार्मूलाc 12h14X7O11 है जो कि ३४८ å3की मात्रा के साथ है, और alkyl चेन टेल फॉर्मूला ३५० å3की मात्रा के साथ c12h25 के रूप में दिया गया है ।

इसके विपरीत मॉड्यूल उत्पादन से स्पष्ट है कि डीडीएम सिर समूह और पूंछ अलग बिखरने लंबाई घनत्व है, और इस प्रकार दो घटकों के बीच विपरीत मनाया जाएगा । डीडीएम के लिए, प्रमुख समूहों ४९% d2में एक सीएमपी है हे, जबकि alkyl श्रृंखला पूंछ 2% d2में एक सीएमपी है, उनके औसत सीएमपी के साथ 22% डी2में होने वाली ओ. इसलिए, अगले कदम का उद्देश्य एक मिश्रित micelle है कि ड्यूटेरियम को शामिल किया गया है alkyl श्रृंखला के लिए डिटर्जेंट पूंछ के औसत सीएमपी बढ़ाने के लिए सिर समूहों के सीएमपी मैच डिजाइन करना होगा । इसके विपरीत गणना एक स्थानापन्न डिटर्जेंट, एक पूरी तरह से deuterated पूंछ (d25-डीडीएम), जो इसी तरह सिर समूह और पूंछ के बीच विपरीत परिणाम के साथ डीडीएम के लिए दोहराया गया था । हालांकि, एच के विपरीत मूल्यों-पूंछ और डी पूंछ काफी अलग हैं । याद है कि डिटर्जेंट मिश्रण अच्छी तरह से समाधान में मिश्रित micelles उत्पादन के लिए जाना जाता है,22 इन एच के एक मिश्रण और micelle कोर में डी-पूंछ एक औसत SLD सिर समूह खोल के बराबर उत्पादन करना चाहिए, एकल सीएमपी के साथ एक micelle उपज । चूंकि प्रमुख समूह दोनों डीडीएम और d25-डीडीएम के लिए आम है, रणनीति इन डिटर्जेंट का एक मिश्रण है कि मिश्रित पूंछ कि सिर समूहों के विपरीत मैच से एक औसत विपरीत मूल्य का उत्पादन मिल रहा है ।

डिटर्जेंट पूंछ के लिए लक्ष्य औसत सीएमपी है कि maltoside सिर समूहों, या ४९% D2हे । प्रत्येक एच पूंछ और डी-टेल घटक के औसत सीएमपी मिश्रण के अनुपात का अनुमान करने के लिए जाना जाना चाहिए । कुछ आम डिटर्जेंट और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ड्यूटेरियम लेबल समकक्षों के लिए इन मूल्यों 1 तालिकामें प्रदान की जाती हैं । डीडीएम और d25-डीडीएम के लिए इन सीएमपी मूल्यों का प्रयोग, एच के तिल अंश-पूंछ और डी-पूंछ है कि चरण २.२ में प्रदान की समीकरण संतुष्ट χडी पूंछ = ०.४३ है ।

चित्रा 2 गीली विपरीत मॉड्यूल है कि अंतिम मिश्रित-micelle विपरीत मैच की स्थिति की पुष्टि करें और प्रोटीन पर आवश्यक deuteration की डिग्री का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता करने के लिए एक और अधिक उन्नत इनपुट प्रदर्शित करता है । यहाँ, उपइकाई 1 2 घटकों, डीडीएम और d25-डीडीएम के साथ इसके विपरीत मिलान मिश्रित micelle को संदर्भित करता है, जबकि उपइकाई 2 अपने अमीनो अम्ल अनुक्रम द्वारा दिए गए एम. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl टीज़ (MmIAP) को संदर्भित करती है । प्रोटीन के SLD deuterated वृद्धि मीडिया में अभिव्यक्ति द्वारा ऊंचा किया गया है जिसमें बफर में प्रोटीन के लिए एक सीएमपी उपज ~ ९२% D2हे । ९२% d2में प्रोटीन के मिलान बिंदु के बीच अलगाव की डिग्री और माप शर्त (४८.५% d2o) से पता चलता है कि पर्याप्त कैटरिंग सिग्नल प्रोटीन से प्राप्त किया जाएगा ।

d-MmIAP के उत्पादन Rosetta 2 ई. कोलाई pET22b-MmIAP वेक्टर बंदरगाह कोशिकाओं के साथ किया गया था । ९०% D2में अनलेबल्ड ग्लिसरॉल के साथ मिनिमल मीडियम को विकास माध्यम के रूप में चुना गया । ९०% d2करने के लिए अनुकूलन के बाद, संस्कृति की मात्रा ४०० मिलीलीटर तक स्केल किया गया था और एक ५.५ एल प्रतिक्रिया पोत में ताजा ९०% D2हे न्यूनतम माध्यम के ३.६ एल inoculate करने के लिए इस्तेमाल किया.

आरेख 3 फेड-बैच की खेती के दौरान प्रक्रिया मानों का एक ट्रेस प्रदान करता है । टीका के समय, तापमान निर्धारित बिंदु 30 डिग्री सेल्सियस, भंग ऑक्सीजन (DO) निर्धारित बिंदु १००% था, आंदोलन सेट बिंदु २०० rpm था, और संकुचित हवा के प्रवाह की दर 4 एल//। । पीएच ९०% D2में सोडियम हीड्राकसीड के 10% डब्ल्यू/वी समाधान का उपयोग कर ६.९ के एक सेट बिंदु के ऊपर आयोजित किया गया था । एक बार, प्रारंभिक 5 जी/L ग्लिसरॉल, खिला (30% डब्ल्यू/वी ग्लिसरॉल, ०.२% MgSO4 में ९०% D2O), जो खेती भर में जारी रखा गया था की कमी के संकेत दिया । लगभग 7 घंटे के भोजन के बाद, संस्कृति का तापमान 18 डिग्री सेल्सियस तक कम हो गया था और isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside 1 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया था । संस्कृति कटाई पर, लगभग १४५ जी गीला वजन सेल पेस्ट के माध्यम से एकत्र किया गया था (६,००० ४५ मिनट के लिए एक्स जी )

डी का शुद्धि-MmIAP कि एंजाइम उपज को छोड़कर protonated एंजाइम के लिए के रूप में काफी कम था और अंतिम शुद्धता ठेठ से कुछ कम था दीं । 5 एल से, ~ गीला झिल्ली के 20 जी अलग किया गया था, जिनमें से सभी solubilized शुद्धि के लिए डीडीएम में था और पहली Ni 2 पर लोड+ संबध कॉलम । शुद्धि उपज को अधिकतम करने के लिए, प्रवाह के माध्यम से अंश पतला था और Ni2 + संबध स्तंभ पर पुन: चलाएँ । प्रक्रिया को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 4) द्वारा केंद्रित डी-MmIAP नमूना चमकाने से पहले एक तीसरी बार दोहराया गया था ।

चित्रा 5 एक क्वार्ट्ज नमूना सेल और उसके संबंधित नमूना परिवर्तक सेटअप दर्शाया गया है । नमूना वातावरण बायो संस संचालन टीम और एनएसएस द्वारा प्रबंधित कर रहे हैं । विभिन्न वातावरण की एक किस्म तापमान नियंत्रण, आर्द्रता नियंत्रण, यांत्रिक tumbling, उच्च तापमान, और अन्य लोगों के बीच निरंतर दबाव के साथ माप प्रदर्शन करने के लिए व्यवस्थित किया जा सकता है ।

चित्रा 6 जैव बिना संचालन और स्वचालित तालिका स्कैन के निष्पादन को दर्शाता है । तालिका स्कैन सहज और उपयोगकर्ता के अनुकूल होने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है । पहले टैब (लोड नमूनों पर), नमूना परिवर्तक, सेल मोटाई, और नमूना प्रकार (खुला बीम, नमूना, पृष्ठभूमि, आदि) में प्रत्येक स्थिति में नमूनों की पहचान के रूप में इस तरह के नमूने परिवर्तक और सेटअप, के बारे में जानकारी प्रदान की जाती है । अतिरिक्त मेटाडेटा टैग यहां भी लागू किया जा सकता है । अगले टैब पर (योजना प्रयोग), साधन विन्यास और किसी भी जुड़े मापदंडों (जैसे तापमान नियंत्रण) परिभाषित कर रहे हैं. प्रयोग के प्रारंभ में एनएसएस द्वारा इस चरण की व्यवस्था की जाती है । उपयोगकर्ता बस इनपुट प्रत्येक नमूने के लिए माप बार (सेकंड में) होना चाहिए । अंतिम टैब (स्कैन निष्पादित) तालिका स्कैन डेटा का एक सारांश प्रदान करता है और स्वचालित स्कैन निष्पादित करने के लिए अनुमति देता है ।

2 डी कैटरिंग छवियों के बाद दर्ज कर रहे हैं, इस डेटा की तीव्रता बनाम एक 1 डी भूखंड के लिए कम किया जाना चाहिए Q-कैटरिंग कोण के एक समारोह । डेटा में कमी के दौरान, पिक्सेल संवेदनशीलता मास्क और गहरी पृष्ठभूमि घटाव जैसे छवि सुधार भी लागू होते हैं । MantidPlot सॉफ्टवेयर के लिए कच्चे जैव-बिना साधन डेटा की व्याख्या डिजाइन किया गया था । एनएसएस आम तौर पर प्रयोग के अंत में अंतिम डेटा को कम करने और पुन: प्राप्त करने में सहायता करेगा ।

आरेख 7 MantidPlot और स्क्रिप्ट विंडो डेटा कमी के लिए उपयोग करने के लिए दूरस्थ विश्लेषण क्लस्टर पहुँच का ओवरव्यू प्रदान करता है । Raw डेटा UCAMS/XCAMS उपयोगकर्ता प्रमाणन के माध्यम से दूरस्थ विश्लेषण क्लस्टर (analysis.sns.gov) पर पहुंच योग्य हैं । दूरस्थ डेस्कटॉप में प्रवेश करने के बाद, MantidPlot सॉफ्टवेयर बस किसी भी रास्ते के तहत ' MantidPlot ' को क्रियान्वित करके एक टर्मिनल खिड़की से शुरू किया जा सकता है । MantidPlot में स्क्रिप्ट विंडो खोलें और उपयोगकर्ता कमी स्क्रिप्ट एनएसएस द्वारा निर्देशित के रूप में संपादित करें । इस स्क्रिप्ट को निष्पादित कम डेटा फ़ाइलें, जो तब विश्लेषण के लिए एक स्थानीय मशीन को सुरक्षित FTP का उपयोग कर स्थानांतरित किया जा सकता है उत्पंन होगा ।

चित्र 8 उपयोगकर्ता कमी स्क्रिप्ट निष्पादित करने के बाद प्लॉट करने और डेटा को देखने का प्रदर्शन करता है । कम डेटा कार्यस्थान विंडो में दिखाई देगा । डिफ़ॉल्ट रूप से, अंतिम मर्ज किए गए डेटा में प्रत्यय _f संलग्न होगा । राइट-क्लिक करें त्रुटियों के साथ भूखंड स्पेक्ट्रम का चयन किया जा करने की अनुमति देगा और डेटा प्लॉट किया जा करने के लिए । प्रदर्शन प्राथमिकताएं ' दृश्य ' मेनू पट्टी से वरीयताओं का चयन करके पहुँचा रहे हैं. अक्षों को डबल-क्लिक करके अक्षों का स्वरूपण और प्लॉटिंग श्रेणी आसानी से पहुंच योग्य है । बफ़र्स की कैटरिंग प्रोफ़ाइल, जिसमें महत्वपूर्ण आकार का कोई स्कैटरिंग कण होते हैं, अपेक्षाकृत सपाट रेखा (निरंतर तीव्रता) के रूप में दिखाई देने चाहिए. नमूनों के लिए, तीव्रता कम तितर बितर कोण पर देखा जाना चाहिए (क्यू) एक फ्लैट बेतुका पृष्ठभूमि के लिए घातीय क्षय के साथ ।

चित्रा 9 उचित बफर घटाव का उपयोग कर SAS डेटा विश्लेषण (या primusqt) सॉफ्टवेयर पैकेज डेटा में कमी के बाद एक सिंहावलोकन प्रदान करता है । अक्सर बेतुका पृष्ठभूमि (उच्च क्यू में तीव्रता) थोड़ा नमूना और बफर के बीच बेमेल है । उचित घटाव के लिए, इस क्षेत्र में डेटा ओवरलैप करना चाहिए । स्केल सुधार डेटा में अधिव्याप्त डेटा पर तीव्रता स्केल फ़ैक्टर लागू करता है, और घटाव किया जा सकता है । यदि स्केल फ़ैक्टर बफ़र डेटा बिंदुओं में नमूना में संगत बिंदुओं की तुलना में बड़ी तीव्रता के साथ परिणाम है, तो इन बिंदुओं को ऋणात्मक हो जाएगा और एक लॉग प्लॉट में रेंडर नहीं किया । बफ़र-घटाई गई फ़ाइल में ऋणात्मक मान प्रचुर मात्रा में हैं, तो बफ़र स्केल फ़ैक्टर में एक छोटी कमी बनाने और घटाव पुन: निष्पादित करें ।

चित्र 10 प्राइमस Guinier और दूरस्थ वितरण विज़ार्ड के उदाहरण उपयोग प्रदान करता है । एक Guinier विश्लेषण कम कोण बिखरने डेटा से परिचलन के कणों त्रिज्या का एक प्रारंभिक अनुमान प्रदान करता है । डेटा approach शूंय के रूप में, एक रेखीय क्षेत्र डेटा में मौजूद होना चाहिए । इस क्षेत्र में एक लाइन की फिटिंग आरजी ढलान से निर्धारित किया जा करने के लिए और एक I0 Q = 0 में तीव्रता अवरोधन से extrapolated होने की अनुमति देता है । क्यू दृष्टिकोण शून्य के रूप में डेटा में वृद्धि की प्रवृत्ति नमूने में एकत्रीकरण को इंगित करता है, जबकि नीचे रुझान आमतौर पर कण आवेगों का संकेत कर रहे हैं. इन प्रवृत्तियों सबसे स्पष्ट कर रहे है जब अवशिष्ट का वितरण गैर stochastic है । गोलाकार कणों के लिए Guinier फिट की ऊपरी सीमा q * Rg < १.३ (' s ' ATSAS सॉफ्टवेयर में क्ष के स्थान पर प्रयोग किया जाता है) द्वारा विवश है ।

आरजी इस Guinier फिट से d-MmIAP के लिए निर्धारित एक अनुमान मैं ०.५८० ± ०.००१ के रूप में दिए गए0 के साथ १५.४ ± १.१ Å था ।

दूरी वितरण विज़ार्ड व्यवस्थित परिवर्तन P (r) फ़िट के पैरामीटर्स के लिए किए जाने की अनुमति देता है । पी (नि.) वक्र प्रयोगात्मक डेटा के लिए फिट वक्र के एक अप्रत्यक्ष रूपान्तर रूपांतरण है । इसलिए, यह सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि बाएँ फलक में फ़िट सही प्रयोगात्मक डेटा को प्रतिबिंबित करता है । इस उदाहरण में दिखाए गए फ़िट के लिए, ४६ Å का एक Dmax प्राप्त किया गया था ।

चित्र 11 Dmax चयन में सामांय त्रुटियों को दिखाता है । एक Dmax जो कृत्रिम रूप से बड़ी है अक्सर कारण p (r) मान ऋणात्मक बनने के लिए p (r) फ़ंक्शन x-अक्ष के बारे में झूलती है । एक Dmax जो कृत्रिम रूप से छोटा है Rmax = 0 करने के लिए एक अचानक संक्रमण के साथ एक कटा हुआ P (r) वक्र करने के लिए लीड ।

प्राइमस आकृति विज़ार्ड में पहला चरण Guinier और दूरस्थ वितरण विज़ार्ड के समान हैं । एक बार यह जानकारी प्रयोगात्मक डेटा के लिए अच्छा फिट प्राप्त करने के लिए प्रदान किया गया है, अटल initio मॉडल सेटअप विन्यस्त है.

चित्र 12 प्राइमस आकृति विज़ार्ड के लिए एक उचित इनपुट दिखाता है । यहां, आईएपी के लिए प्रयोगात्मक बिना डेटा Angstroms में एक पैमाने के साथ प्रदान की गई थी, और "SANSEnvelope" की अपेक्षित फ़ाइल उपसर्ग दिया गया था. 17 प्रारंभिक डमी एटम मॉडलों का एक सेट के लिए कोई समरूपता (P1) और नहीं चुना anisometry के साथ "फास्ट" मॉडल मोड का उपयोग कर उत्पंन होने का अनुरोध किया गया । 17 मॉडलों के सेट गठबंधन किया जाएगा, औसत, और DAMAVER के साथ फ़िल्टर्ड, और औसत मॉडल DAMMIN का उपयोग परिष्कृत । उपसर्ग-damsel. log पाठ दस्तावेज़ का निरीक्षण चयन मापदंड और सेट से छोड़े गए किसी भी मॉडल का सारांश प्रदान करता है । अंतिम परिष्कृत मॉडल SANSEnvelope-1. pdb के रूप में लिखा गया था ।

कार्यक्रम SUPCOMB उच्च संकल्प मॉडल के साथ संस लिफाफा मॉडल के एक superimposition प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इनपुट के रूप में केवल दो PDB संरचना फ़ाइलों के साथ । डिफ़ॉल्ट रूप से, "r" reoriented और आरोपित फ़ाइल नाम के लिए जोड़ा जाता है ।

एक बार बिना लिफाफा और उच्च संकल्प संरचना आरोपित गया है, इन मॉडलों को किसी भी आणविक कार्यक्रम देखने ग्राफिक्स का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । पयमोल से परिणाम प्रकाशन गुणवत्ता छवियों के लिए उपयुक्त है और संरचनात्मक जांच से संबंधित भौतिक परिणामों पर जोर दिया जा सकता है । यहां, हम कुछ बुनियादी पयमोल 3d अभ्यावेदन और परिणामस्वरूप आरोपित संरचनाओं के विचारों को उपलब्ध कराने के लिए इस्तेमाल किया आपरेशनों का प्रदर्शन ।

चित्र 13 पयमोल विज़ुअलाइज़ेशन प्रक्रिया का ओवरव्यू प्रदान करता है. एक बार PDB संरचना फ़ाइलें पयमोल में खोला गया है, मॉडल पयमोल दर्शक विंडो में दिखाई जानी चाहिए । प्रत्येक फ़ाइल नाम के आगे ' बटन का उपयोग कर प्रत्येक मॉडल के निरूपण बदलें । बिना लिफाफे और उच्च संकल्प मॉडल से प्रोटीन रीढ़ की एक कार्टून प्रतिनिधित्व के लिए एक सतह प्रतिनिधित्व का उपयोग करें । ' C ' बटन के अंतर्गत उपलब्ध विकल्पों में से एक उपयुक्त रंग योजना का चयन करें । प्रोटीन चेन के लिए, एक "chainbow" रंग एन से एक रंग ढाल प्रदान करता है सी के लिए-व्याख्या सहायता के लिए टर्मिनस । लिफाफे के भीतर प्रोटीन संरचना के बेहतर दृश्य की अनुमति देने के लिए सतही प्रतिनिधित्व पर पारदर्शिता लागू की जाती है । प्रकाशन छवियों के लिए, एक सफेद पृष्ठभूमि की सिफारिश की है । एक बार इन दृश्यावलोकन कतार लागू किया गया है, 3d संरचनाओं की जांच की जा सकती है । परिप्रेक्ष्य और अणु रोटेशन के जोड़तोड़/अनुवाद क्लिक करके और संरचना खींचकर प्रदर्शन किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1. dodecyl maltoside (डीडीएम) के घटकों के लिए कंट्रास्ट पैरामीटर्स निर्धारित करने के लिए गीली कंट्रास्ट मॉड्यूल का उपयोग । इनपुट मान दाईं ओर अनुवर्ती आउटपुट के साथ बाईं तरफ स्क्रीन में दिखाए जाते हैं. इसके विपरीत मॉड्यूल इनपुट पृष्ठ प्रत्येक स्क्रीन के बाईं ओर पर नेविगेशन मेनू से ' कंट्रास्ट ' (ग्रीन सर्कल) पर क्लिक करके पहुँचा है. प्रोजेक्ट शीर्षक, बफ़र घटकों, और 1 और 2 के लिए इनपुट क्षेत्रों के रूप में लेबल किए गए हैं । आउटपुट पृष्ठों में वर्णित सिस्टम के लिए महत्वपूर्ण कण जानकारी और कंट्रास्ट गुण होते हैं । प्रासंगिक तालिकाओं और गणना मिलान अंक स्पष्टता के लिए नारंगी में बॉक्स्ड किया गया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. गीली कंट्रास्ट मॉड्यूल का उपयोग झिल्ली प्रोटीन-डिटर्जेंट परिसर के घटकों के लिए विपरीत मापदंडों का निर्धारण करने के लिए । इस उदाहरण में, इनपुट बफ़र्ड समाधान में समग्र PDC सिस्टम का वर्णन करने के लिए दिया गया है । उपइकाई 1 d25-डीडीएम के रूप में तिल से ४३% के साथ डीडीएम से बना इसके विपरीत मिलान मिश्रित micelle का वर्णन करता है । 2 यूनिट के सूत्र के रूप में MmIAP इनपुट के लिए एमिनो एसिड अनुक्रम के साथ झिल्ली प्रोटीन, का वर्णन करता है । deuteration स्तर (ग्रीन सर्कल) ड्यूटेरियम प्रतिस्थापन के प्रोटीन की डिग्री का वर्णन करता है, और SLD और परिकलित मिलान-बिंदु है कि प्रोटीन के लिए अनुमानित किया जाएगा पर सीधा प्रभाव पड़ता है । परिणाम (नारंगी बॉक्स) संकेत मिलता है कि मिश्रित डिटर्जेंट के लिए मिलान-बिंदु ४८.५% d2में हो जाएगा, जबकि प्रोटीन का मिलान-बिंदु पर होता है ~ ९०% d2o. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3. नमूना तैयारी-प्रतिक्रिया स्ट्रेस । प्रक्रिया प्रदर्शित मूल्यों तापमान सेट बिंदु (नारंगी रेखा), भंग ऑक्सीजन (DO) निर्धारित बिंदु (नीली रेखा), आंदोलन सेट (लाल रेखा), और संपीड़ित हवा के प्रवाह की दर (गुलाबी रेखा) हैं । 1 पंप (ग्रीन लाइन) पीएच नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था । 18:40 intial ग्लिसरॉल के संकेत घट में कील करते है और 2 पंप (काली लाइन) के माध्यम से ग्लिसरॉल समाधान की खिला शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । X-अक्ष घंटे को नोट करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. नमूना तैयारी-FPLC और एसडीएस-नमूना के पृष्ठ लक्षण वर्णन । अंतिम आकार बहिष्करण वर्णलेख के लिए डी-MmIAP equilibrated के साथ 20 मिमी HEPES, पीएच ७.५, २५० मिमी NaCl, ४८.५% डी2ओ और ०.०५% कुल डीडीएम, जिनमें से ४४% (डब्ल्यू/वी) है टेल-deuterated d25-डीडीएम. इनसेट: एसडीएस-Coomassie धुंधला के साथ पृष्ठ विश्लेषण । परित अंशों लेबल ए, बी, और C. क्षेत्र "बी" संस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था । व्याख्या आणविक वजन मार्कर केडीए में है । छवि Naing एट अल से अनुमति के साथ reproduced । ६५ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 5
चित्रा 5. डेटा संग्रह-क्वार्ट्ज बाजा नमूना सेल और नमूना सेटअप । (एक) एक खाली क्वार्ट्ज बाजा सेल नमूना ब्लॉक के खिलाफ आराम कर दिखाया गया है । कोशिकाओं के नमूने से भरा है और 15 उपलब्ध पदों में से एक में डाला जाता है । (ख) नमूना ब्लॉक एक एपर्चर चयनकर्ता के पीछे मुहिम शुरू की है (नहीं दिखाया गया है) बीम ट्यूब भरनेवाला और सिलिकॉन खिड़की के बीच डिटेक्टर टैंक के प्रवेश द्वार पर । नमूना ब्लॉक भर में एक तापमान नियंत्रित पानी स्नान और चैनलों को जोड़ने hoses नमूना पदों पर तापमान विनियमन प्रदान करते हैं । तीर न्यूट्रॉन किरण की दिशा को इंगित करता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. डेटा संग्रह – स्पाइस ऑपरेशंस और टेबल स्कैन का अवलोकन. टेबल स्कैन संचालन स्पाइस इंस्ट्रूमेंट कंट्रोल सॉफ्टवेयर के सुदूर बाएँ मेनू पर ' टेबल स्कैन ' बटन से पहुँचा जा सकता है. हरे तीर सक्रिय उपयोगकर्ता आदानों के लिए तालिका में स्क्रीन और नारंगी बक्से हाइलाइट क्षेत्रों के शीर्ष पर सक्रिय टैब निरूपित करते हैं । (A) तालिका स्कैन का पहला टैब नमूना परिवर्तक और नमूना कक्ष स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है । नमूना परिवर्तक में प्रयुक्त प्रत्येक स्थिति के लिए लेबल, नमूना मोटाई, और नमूना प्रकार प्रदान करें । ' स्कैन करें ' बॉक्स की जांच करने से संबंधित पंक्ति को तालिका स्कैन कतार में जोड़ देगा । (ख) दूसरे टैब पर, साधन विन्यास और प्रत्येक नमूने के लिए माप समय के बारे में विवरण (सेकंड में) दर्ज कर रहे हैं. यंत्र विन्यास न्यूट्रॉन कैटरिंग साइंटिस्ट द्वारा कॉन्फ़िगर किए गए हैं और बीम समय और साधन प्रस्ताव में दिए गए विवरण के आधार पर उपयोगकर्ताओं को प्रदान किए जाते हैं. अतिरिक्त पैरामीटर माप कतार के दौरान, तापमान setpoints को परिभाषित करने और बार पकड़ करने की क्षमता के रूप में साधन नियंत्रण में जोड़ा जा सकता है । (C) अंतिम टैब तालिका में प्रत्येक पंक्ति के लिए किए जाने वाले माप का ओवरव्यू प्रदान करता है. यदि कोई परिवर्तन की जरूरत है, स्वचालित स्कैन पर क्लिक करके शुरू की है ' स्कैन निष्पादित ' बटन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. डेटा में कमी-कमी स्क्रिप्ट और MantidPlot आपरेशनों का अवलोकन । MantidPlot सॉफ्टवेयर विश्लेषण क्लस्टर पर किसी भी सक्रिय निर्देशिका में एक टर्मिनल कमांड प्रॉम्प्ट में "MantidPlot" टाइप करके पहुँचा जा सकता है (पीला वृत्त और तीर जोर के लिए जोड़ रहे हैं). एक बार सॉफ्टवेयर खुला है, स्क्रिप्ट विंडो का उपयोग (हरे रंग में चिह्नित बटन द्वारा toggled) और न्यूट्रॉन कैटरिंग वैज्ञानिक द्वारा प्रदान की गई स्क्रिप्ट खोलें । स्क्रिप्ट में दिए गए निर्देशों का पालन करें, जो केवल स्वचालित कमी के लिए एक सूची में दर्ज किया जा करने के लिए प्रत्येक नमूने और बफर के लिए स्कैन नंबर की आवश्यकता होती है, साथ ही पारेषण और बीम के लिए घटाव और खाली बीम के लिए खाली सेल के लिए स्कैन संख्या केंद्र निर्धारण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8. डेटा विश्लेषण – MantidPlot का उपयोग करके डेटा की साजिश रचने. डेटा MantidPlot में ' कार्यस्थानों ' के रूप में संदर्भित हैं । कार्यस्थान क्षेत्र उपयोगकर्ता कमी स्क्रिप्ट द्वारा उत्पादित के रूप में फ़ाइल नाम के साथ पॉपुलेटेड किया जाएगा । 1 डी डेटा सेट के लिए कार्यस्थान डेटा कार्यस्थान पर राइट-क्लिक करके और "त्रुटियों के साथ स्पेक्ट्रम प्लॉट करें" का चयन करके प्लॉट किया जा सकता है. अतिरिक्त डेटा बस खींच और कार्यस्थानों छोड़ने के द्वारा वर्तमान भूखंड के लिए जोड़ा जा सकता है । प्लॉट विंडो का स्वरूपण (जैसे लॉग-लॉग प्लॉट्स के लिए) ' दृश्य ' मेनू पट्टी से ' प्राथमिकताएं ' चुनकर, या अक्ष लेबल्स पर डबल-क्लिक करके किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9. डेटा विश्लेषण-ATSAS सॉफ्टवेयर: बुनियादी संचालन और बफर घटाव । primusqt आवेदन (एसएएस डाटा विश्लेषण) उचित पृष्ठभूमि (बफर) घटाव के लिए दृश्य प्रदान करता है । बफ़र फ़ाइल घटाव के लिए स्केल किया जाना चाहिए ऐसी है कि डेटा उच्च-Q पर ओवरलैप (जहां बिखरने बेतुका पृष्ठभूमि से शेष संकेत का एक परिणाम के रूप में फ्लैट है) । इस उच्च-Q श्रेणी के डेटा का चयन किया जाता है, जब स्केल प्रक्रिया एक स्केल फ़ैक्टर को निर्धारित क्षेत्र में ओवरलैप का उत्पादन करता है जो तालिका में कम डेटा फ़ाइल के लिए लागू होंगे । स्केलिंग के बाद, बफ़र फ़ाइल कण की नेट कैटरिंग प्रोफ़ाइल yield करने के लिए घटाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10. डाटा विश्लेषण – Guinier और पी (आर) (दूरी वितरण) निर्धारण । (क) प्राइमस Guinier विज़ार्ड का उपयोग एक Guinier विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, जो I0 और Rgका आरंभिक अनुमान प्रदान करता है । कण प्रकार और फिट करने के लिए डेटा की श्रेणी फिट परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है । फिट और इसी अवशिष्ट का एक भूखंड बाईं ओर दिखाया जाता है, जबकि Guinier शर्तें (I0 और Rg), Q * rg सीमाएं, और रेखीय फ़िट की गुणवत्ता नारंगी बॉक्स द्वारा चिह्नित क्षेत्र में आउटपुट के रूप में प्रदान की जाती हैं । (ख) प्राइमस दूरी वितरण विज़ार्ड का उपयोग दूरी वितरण विश्लेषण करने, पी (आर) वक्र प्रदान करने के लिए किया जाता है जो तितर-बितर कण के भीतर की संभावना को परिभाषित करता है और इसमें Dmax या अधिकतम परमाणु दूरी । नारंगी बॉक्स द्वारा इंगित पैरामीटर व्यवस्थित एक उचित दूरी वितरण समारोह निर्धारित करने के लिए जांच की जा सकती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11. दूरी वितरण विश्लेषण से अनुचित परिणाम । एक ठीक से चयनित Dmax एक पी (आर) वक्र उत्पादन करना चाहिए कि एक क्रमिक क्षय के साथ चोटियों शूंय है । Dmax मान बहुत बड़े हैं जो ऋणात्मक p (r) मान या दोलनों के निकट x-अक्ष पर उच्च मान r. Dmax मान जो कृत्रिम रूप से छोटे होते हैं जो अक्सर p (r) घटता में परिणाम जहाँ ऊपरी बाउंड छोटा दिखाई देता है का उत्पादन होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12. मॉडलिंग- एबी initio मॉडल सेटअप प्राइमस आकृति विज़ार्ड का उपयोग कर । एबी initio मॉडलिंग पैरामीटर एक एकल इनपुट विंडो में प्रदान की जाती हैं । उपलब्ध संसाधन के लिए अंय विकल्पों के साथ आउटपुट फ़ाइल नामों के लिए उपसर्ग प्रदान किए जाते हैं । एनीलिंग प्रक्रिया तेजी से (तेजी से ठंडा करने के साथ बड़ा मोती) या धीमी गति से (धीमी शीतलन के साथ छोटे मोतियों) हो सकता है । दोहरावों की संख्या मॉडल सुविधाओं के reproducibility की जांच करने के लिए पर्याप्त आकार की होनी चाहिए । कण समरूपता और anisometry प्रदान किया जा सकता है, अगर जाना जाता है । कोणीय पैमाने मापा डेटा की इकाइयों के अनुरूप होना चाहिए. DAMAVER औसत संरेखित होगा और सभी डमी एटम मॉडल औसतन, और फिर एक चयन कसौटी जो किसी भी ग़ैर मॉडल शामिल नहीं है लागू होते हैं । औसत मॉडल से फिक्स्ड परमाणुओं की एक कोर आगे DAMMIN का उपयोग कर परिष्कृत किया जाएगा अगर यह विकल्प चुना है । इस परिष्कृत मॉडल 3 डी कम प्रयोगात्मक प्रोफ़ाइल के संकल्प लिफाफा प्रतिनिधित्व करना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्र 13. दृश्य-प्रयोगात्मक बिना लिफाफा और उच्च संकल्प मॉडल पयमोल का उपयोग कर के साथ ओवरले । पयमोल में PDB संरचना फ़ाइलों को खोलने के बाद, मॉडल पयमोल व्यूअर में दिखाई देते हैं । सक्रिय मॉडल तालिका में सही करने के लिए सूचीबद्ध हैं, कार्रवाई बटन जो मॉडल और उसके प्रतिनिधित्व में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ साथ । बुनियादी आपरेशनों इन मॉडलों जो बिना लिफाफा और उच्च संकल्प संरचना के बीच समझौते के क्षेत्रों (या बेमेल) की पहचान करने की अनुमति visualizing के लिए प्रदान की जाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1. आमतौर पर झिल्ली प्रोटीन जांच में प्रयुक्त डिटर्जेंट के भौतिक गुण । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

संरचनात्मक जीवविज्ञान शोधकर्ताओं समाधान में जैव रासायनिक और संरचनात्मक विवरण (जैसे समग्र आकार और आकार के रूप में) प्राप्त करने के लिए हल बिखरने की तरह पूरक संरचनात्मक तकनीक का लाभ ले लो । संस झिल्ली प्रोटीन, आधुनिक संरचनात्मक जीवविज्ञान और जैव रसायन का एक मुख्य ध्यान के कम संकल्प संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक तकनीक है । संस शुद्ध प्रोटीन crystallographic परीक्षणों के उन लोगों के तुलनीय की मात्रा की आवश्यकता है (1 मिलीग्राम/ हाल ही में उच्च पवित्रता deuterated डिटर्जेंट झिल्ली प्रोटीन अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक के वाणिज्यिक उपलब्धता का विस्तार सुलभ बनाता है एक झिल्ली प्रोटीन के बिना प्रयोग के लिए इस हाइड्रोजन/ड्यूटेरियम सामग्री-डिटर्जेंट परिसर में हेरफेर करने का मतलब है, प्रोटीन संकेत सीधे दर्ज करने की अनुमति । जब सफल, एक एबी initio मॉडल आणविक लिफाफा सिर्फ कई घंटे से अधिक एकत्र आंकड़ों से गणना की जा सकती है । इस प्रकार, झिल्ली प्रोटीन, भौतिक विज्ञानी, और संरचनात्मक जीव आसानी से संस का लाभ लेने के लिए समाधान में झिल्ली प्रोटीन के प्रतिष्ठित प्रारंभिक 3 डी मॉडल प्राप्त कर सकते हैं, बाध्यकारी भागीदारों या सब्सट्रेट के साथ जटिल में संरचनाओं, और मॉडल प्राप्त बिना संस विवर्तन डेटा चरणबद्ध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संस के नित्य उपयोग के लिए झिल्ली प्रोटीन की विशेषताएं झिल्ली प्रोटीन जैव रसायन क्षेत्र के लिए परिवर्तनकारी होगा और बुनियादी संरचना समारोह से दवा की खोज और विकास के लिए तरंग प्रभाव है । न्यूट्रॉन ड्यूटेरियम प्रतिस्थापन के साथ मिलान के विपरीत का जोड़ा लाभ प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान तकनीक संस बनाता है-प्रोटीन, प्रोटीन डीएनए, या अंय गैर आणविक परिसरों, जो आसानी से अपने हाइड्रोजन/ड्यूटेरियम सामग्री में हेरफेर किया जा सकता है ।

छोटे कोण बिखरने उपकरण डिजाइन और सिद्धांत के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए, निम्नलिखित समीक्षाएं सिफारिश कर रहे हैं: जैव-बिना साधन ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला,७९ छोटे कोण छितरा के उच्च प्रवाह आइसोटोप रिएक्टर पर संरचनात्मक जीवविज्ञान-सीमा का विस्तार करते हुए नुकसान से परहेज,७२ और छोटे कोण समाधान में जैविक अणुओं के बिखरने अध्ययन । ८० न्यूट्रॉन कैटरिंग वैज्ञानिक भी वर्तमान साधन विन्यास और किसी दिए गए सिस्टम के लिए इष्टतम मापदंडों पर चर्चा कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, निचले Q पर डेटा (जो कैटरिंग कोण और न्यूट्रॉन तरंग दैर्ध्य का एक समारोह है) आम तौर पर बड़े सिस्टम के लिए वांछित है । बायो-संस में सबसे आम साधन विन्यास ०.००३ Å-1 का Qमिन प्रदान करता है और केडीए के सैकड़ों तक बड़ा प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के लिए उपयुक्त है । एक से युक्त समाधान ~ 3 मिलीग्राम एमएल-1 की झिल्ली प्रोटीन की अनुमानित आकार की 30 केडीए (मोनोमर) इसके विपरीत-मिलान micelles में ४८.५% D2के साथ समाधान में एक ठेठ माप समय के आसपास 8 घंटे के लिए प्रत्येक नमूना, बफर, और खाली सेल की आवश्यकता है (24 घंटे = 1day कुल) । एक दिए गए विपरीत हालत में साधन माप बार लगभग तितर बितर कण आणविक द्रव्यमान और एकाग्रता के उत्पाद के अनुसार किया जा सकता है । हालांकि, किसी भी गैर-विशिष्ट प्रोटीन एकत्रीकरण, जो नमूना की एकाग्रता पर एक व्यावहारिक ऊपरी सीमा स्थानों सहित गैर-आदान-प्रदान शर्तों के तहत कैटरिंग कणों मापा जाना चाहिए । घंटे की लंबी माप कुछ प्रोटीन की स्थिरता पर सीमा जगह है । सौभाग्य से, बिना माप प्रशीतित तापमान पर नियमित रूप से किया जा सकता है प्रोटीन जीवन समय में सुधार, और कम ऊर्जा न्यूट्रॉन के कार्यरत बीम माप के दौरान किसी भी विकिरण क्षति का कारण नहीं है ।

इस प्रक्रिया का एक सिंहावलोकन और एक नमूना डिटर्जेंट के विपरीत मैच बिंदु पर मापा से न्यूट्रॉन बिखरने की सफल रिकॉर्डिंग की ओर कई महत्वपूर्ण कारकों का निर्धारण इस पांडुलिपि में प्रस्तुत कर रहे हैं । यह डिटर्जेंट सिर समूह और alkyl श्रृंखला घटकों के बीच एक समान न्यूट्रॉन इसके विपरीत के साथ एक डिटर्जेंट मिश्रण डिजाइनिंग द्वारा कुल डिटर्जेंट की एक पूरी मैच प्राप्त करने की ओर महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है । इस एक डिटर्जेंट मैच बिंदु पर माप एक तितर बितर प्रोफ़ाइल केवल ब्याज की झिल्ली प्रोटीन के लिए जिंमेदार ठहराया और एक एबी initio झिल्ली प्रोटीन का प्रतिनिधित्व लिफाफा डेटा से खंगाला जा करने की अनुमति दी । डेटा विश्लेषण और अटल initio मॉडलिंग प्रोटोकॉल भी संभावित ऐसी जांच से प्राप्त जानकारी है, जो समग्र संरचना, गठन के परिवर्तन, अंय लोगों के अलावा oligomeric राज्यों, पता उद्देश्य सकता है प्रदर्शित करता है । एक सीमा है कि केवल बहुत कुछ डिटर्जेंट की तारीख को ड्यूटेरियम प्रतिस्थापन के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । 19

जबकि perdeuteration आवश्यक नहीं हो सकता है, इस मामले में उद्देश्य के साथ एक प्रोटीन प्राप्त करने के लिए होना चाहिए > 65% ड्यूटेरियम लेबलिंग प्रोटीन में. वैकल्पिक रूप से, अगर चुनिंदा के साथ डिटर्जेंट-deuterated सिर समूहों और पूंछ उपलब्ध है, और डिटर्जेंट micelle के सीएमपी १००% डी2ओ के पास होता है, तो प्रोटीन से पर्याप्त इसके विपरीत ड्यूटेरियम लेबलिंग के लिए आवश्यकता के बिना प्राप्त किया जा सकता है । प्रोटीन के उचित deuteration स्तर निर्धारित करने के लिए पर्याप्त बिखरने जब डिटर्जेंट के विपरीत मैच बिंदु पर मापा प्राप्त करने के लिए । वहां कई झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि,८१ जो इस लेख के दायरे से परे रहने के साथ जुड़े चुनौतियों का सामना कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, deuteration के उच्च स्तर वर्तमान में नहीं कर रहे है (अभी तक) eukaryotic प्रणालियों के लिए संभव है । जब तक हम महसूस इस कुछ eukaryotic प्रोटीन के लिए एक सीमा है, सबसे झिल्ली प्रोटीन बैक्टीरियल orthologs है जिसके लिए इस विधि उपयुक्त है ।

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Disclosures

लेखक Volker एस शहरी, साई वेंकटेश पिंगली, केविन एल Weiss, और रयान सी ओलिवर केंद्र शासित प्रदेशों के माध्यम से अनुबंधित कर रहे है-हमारे साथ बैटल डो को न्यूट्रॉन विज्ञान उपयोगकर्ता कार्यक्रम और जैव-बिना उपकरण ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है इस लेख में प्रयुक्त ।

यह पांडुलिपि यूटी-बैटल, LLC, अनुबंध DE-AC05-अमेरिका के ऊर्जा विभाग (डो) के साथ 00OR22725 के तहत सह लेखक किया गया है । अमेरिकी सरकार को बरकरार रखे हुए है और प्रकाशक, प्रकाशन के लिए लेख को स्वीकार करके, स्वीकार करता है कि अमेरिकी सरकार को बरकरार रखता है एक अनंय, भुगतान किया, अटल, दुनिया भर में लाइसेंस प्रकाशित करने के लिए या इस पांडुलिपि के प्रकाशित फार्म का पुनरुत्पादन, या अनुमति दूसरों को ऐसा करने के लिए, अमेरिकी सरकार के प्रयोजनों के लिए । डीईओ डो पब्लिक सेस योजना के अनुसार संघीय रूप से प्रायोजित शोध के इन परिणामों को सार्वजनिक पहुंच प्रदान करेंगे । ८२

Acknowledgments

जैव और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय ORNL संरचनात्मक आणविक जीव विज्ञान (CSMB) और जैव के लिए केंद्र में अनुसंधान समर्थित वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधाएं प्रभाग, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान, अमेरिकी विभाग के कार्यालय द्वारा समर्थित सुविधाओं का उपयोग कर की ऊर्जा । Lieberman लैब में झिल्ली प्रोटीन पर संरचनात्मक कार्य NIH (DK091357, GM095638) और NSF (०८४५४४५) द्वारा समर्थित किया गया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

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