Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

Biochemistry

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Summary

Este protocolo muestra cómo obtener un modelo de baja resolución ab initio y detalles estructurales de una proteína de membrana de detergente solubilizado en solución mediante dispersión de neutrones de ángulo pequeño con coincidencia de contraste del detergente.

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Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

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Abstract

El instrumento de dispersión biológica small-angle neutron en el alto flujo isótopo Reactor de Oak Ridge National Laboratory se dedica a la investigación de materiales biológicos, biocombustible procesado y materiales Bioinspirados cubriendo nanómetro a escalas de la longitud del micrómetro. Los métodos presentados aquí para investigar las propiedades físicas (es decir, tamaño y forma) de proteínas de membrana (aquí, MmIAP, una intramembranosas aspartil proteasa de Methanoculleus marisnigri) en soluciones de formación de micelas son detergentes adecuado de este instrumento de dispersión de ángulo pequeño neutrón, entre otros. Otras técnicas de caracterización biofísica se ven obstaculizados por su incapacidad para abordar las contribuciones detergentes en una estructura compleja de proteína-detergente. Además, el acceso al laboratorio Bio-grado de deuteración ofrece capacidades únicas para la preparación de cultivos a gran escala y expresión de proteínas marcado con deuterio para mayor dispersión de la señal de la proteína. Mientras que esta técnica no proporciona los detalles estructurales en alta resolución, la brecha de conocimiento estructural de proteínas de la membrana contiene muchas zonas direccionables de investigación sin necesidad de resolución atómica cerca. Por ejemplo, estas áreas incluyen la determinación de los Estados, formación de complejos, cambios conformacionales durante la perturbación y eventos plegar/desplegar. Estas investigaciones se pueden lograr fácilmente a través de aplicaciones de este método.

Introduction

Proteínas de membrana están codificadas por aproximadamente el 30% de todos los genes1 y representan una gran mayoría de objetivos de medicamentos modernos. 2 estas proteínas realizan una amplia gama de funciones celulares vitales,3 pero a pesar de su abundancia e importancia — sólo representan alrededor del 1% de estructuras total depositado en la investigación Collaboratory para bioinformática estructural (RCSB) proteína Banco de datos. 4 debido a su naturaleza parcialmente hidrofóbica, determinación estructural de proteínas de membrana-limite ha sido sumamente difícil. 5 , 6 , 7

Como muchas técnicas biofísicas requieren monodispersa partículas en solución para la medición, aislamiento de proteínas de la membrana de las membranas nativas y estabilización de estas proteínas en un imitador soluble de las membranas nativas ha sido un área activa de investigación en los últimos décadas. 8 , 9 , 10 estas investigaciones han llevado al desarrollo de muchas asambleas de novela anfifílicos para solubilizar proteínas de membrana, tales como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 y amphipols. 16 , 17 sin embargo, el uso de micelas de detergente sigue siendo uno de los enfoques más comunes y sencillos para satisfacer los requisitos de la solubilidad de una proteína determinada. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 por desgracia, no solo detergente mágica mezcla de detergentes actualmente existe o que cumpla con todas las proteínas de la membrana; así, estas condiciones deben ser defendidas empíricamente para los requerimientos únicos de cada proteína. 26 , 27

Detergentes uno mismo-montan en la solución por encima de su concentración micelar crítica para formar estructuras de agregados llamadas micelas. Micelas están compuestas de muchos monómeros detergentes (típicamente entre 20-200) con cadenas alkyl hidrofóbica formando un núcleo micelar e hidrofílicos grupos cabeza dispuestos en una capa de cáscara de micela hacia el disolvente acuoso. El comportamiento de la formación de la micela y los detergentes ha sido clásicamente descrito por Charles Tanford en El efecto hidrofóbico,28 y tamaños y formas de micelas de los detergentes comúnmente usados en estudios de proteínas de membrana han sido caracteriza usando dispersión de ángulo pequeño. 29 , 30 organización de detergente sobre las proteínas de la membrana también se ha estudiado, y se espera la formación de complejos de proteína-detergente (PDC) con las moléculas de detergente que rodean la proteína en un arreglo que se asemeja al detergente limpio micelas. 31

Añade una ventaja en el uso de detergentes es que las propiedades resultantes de la micela pueden manipularse mediante la incorporación de otros detergentes. Muchos detergentes exhiben mezcla ideal, y seleccione Propiedades de micelas mixtas se pueden incluso predecir de los componentes y la relación de la mezcla. 22 sin embargo, la presencia de detergente puede todavía presentar desafíos para caracterizaciones biofísicas contribuyendo a la señal total. Por ejemplo, con rayos x y técnicas de dispersión de la luz, la señal de detergente en el PDC es prácticamente indistinguible de la proteína. 32 investigaciones con microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM) normalmente dependen de atrapadas partículas (congeladas); detalles estructurales de la proteína son todavía oscurecidos por ciertos detergentes o una alta concentración de detergente que se añade a un segundo plano. 33 enfoques alternativos para interpretar la estructura PDC completa (incluyendo el detergente) se han hecho a través de métodos computacionales que pretenden reconstruir el detergente alrededor de una proteína de membrana dada. 34

Para el caso de dispersión de neutrones, el arreglo de core-shell de detergente en la micela produce un factor de forma que contribuye a la dispersión observada. Afortunadamente, se pueden alterar componentes de la solución tal que no contribuyen a la dispersión observada neta. Este proceso de "coincidencia de contraste" se consigue sustituyendo el deuterio por hidrógeno alcanzar una densidad de longitud de dispersión que coincide con el del fondo (buffer). Deben considerarse una elección juiciosa del detergente (con contrapartes deuterados disponibles) y su proporción de la mezcla. De micelas de detergente, esta sustitución puede realizarse usando un detergente con el mismo grupo de cabeza pero con una cadena alquil deuterados (d-cola en lugar de h-cola). Puesto que los detergentes están bien mezclados,35 los agregados tendrán una densidad de longitud de dispersión que es la fracción molar ponderada promedio de los dos componentes (h-colas y colas de d). Cuando este contraste promedio es consistente con el grupo de cabeza, las estructuras agregadas uniforme pueden combinarse completamente para quitar todas las contribuciones a la dispersión observada.

Presentamos aquí un protocolo para manipular el contraste de neutrón de micelas de detergente mediante la incorporación de moléculas detergentes químicamente idénticas con cadenas alkyl marcado con deuterio. 19 , 36 , 37 esto permite completo contraste simultáneo que empareja del núcleo micelar y la cáscara, que es una capacidad única de dispersión de neutrones. 35 , 38 este significativamente refinado nivel de detalle, coincidencia de contraste permiten lo contrario inviables estudios de estructuras de proteínas de membrana. Además, este enfoque de contraste de coincidencia se podría extender a otros sistemas con detergente, como intercambio de polímero reacciones39 y aceite-agua dispersantes,40 o incluso otros agentes solubilizantes, como bicelles,41 nanodiscs,42 o bloque copolímeros. Enfoque similar 43 A como se describe en este manuscrito, pero empleando una sola especie de detergente con sustituciones parciales del deuterio en el grupo alquil de cadena o cabeza, se publicó recientemente. 37 mientras que esto puede ser para mejorar la distribución aleatoria de hidrógeno y deuterio en el detergente en comparación con el enfoque presentado aquí, el número limitado de posiciones disponibles en el detergente para sustitución y dos etapas síntesis de detergente necesaria plantea retos adicionales para su consideración.

Pasos 1 y 2 del protocolo que se detallan a continuación a menudo se superponen puesto que el experimento inicial planificación debe hacerse para presentar una propuesta de calidad. Sin embargo, la presentación de propuesta se considera aquí como el primer paso para destacar que este proceso debe comenzar antes de un experimento de neutrones. Cabe señalar que un paso necesario, que debe ser demostrado por la propuesta, es que la caracterización bioquímica y física (incluyendo la pureza y estabilidad) de la muestra apoya la necesidad de estudios de neutrones. Una discusión general de ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) está fuera del alcance de este artículo. Una introducción breve pero exhaustiva está disponible en la obra de referencia de Caracterización de materiales por Kaufmann,44 y una solución integral de libros de texto enfocada en biológico ángulo pequeño dispersión ha sido publicado recientemente. 45 más lectura recomendada es dada en la sección de discusión. Dispersión de ángulo pequeño utiliza el llamado vector de dispersión Q como la cantidad central que describe el proceso de dispersión. Este artículo utiliza la definición ampliamente aceptada Q = 4π pecado (θ) / λ, donde θ es la mitad el ángulo entre la viga entrante y dispersa y λ es la longitud de onda de la radiación de neutrón en Angstroms. Existen otras definiciones que uso diferentes símbolos tales como ' por el vector de dispersión y que puede variar por un factor 2π o mediante nanómetros en lugar de Angstrom (véase también discusión de la figura 10).

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Protocol

1. preparar y presentar una propuesta de instrumento y neutrones instalación haz tiempo

  1. Consultar recursos en línea para identificar servicios de dispersión de neutrones que acceso usuario general neutrón viga tiempo, como laboratorio nacional de Oak Ridge (ORNL). Mapa de neutrón instalaciones e información sobre la investigación del neutrón en todo el mundo está disponible en línea. 46 ten en cuenta que estas instalaciones tienen convocatorias periódicas de propuestas; determina cuándo estará disponible la próxima vez haz. Neutrones se utilizan para una variedad de aplicaciones; buscar instrumentos de small-angle neutron scattering (SANS), particularmente ésos con capacidades para muestras biológicas.
  2. Utilizar recursos proporcionados por las instalaciones del neutrón para ayudarlo a navegar el proceso de presentación de propuesta de neutrón viga tiempo. Consulte con un neutrón dispersión científico (NSS) que está asociado con el instrumento que se aplicará. Revisar la información actual de la instalación de neutrones sobre llamadas de propuesta, los plazos y asesoramiento para la presentación; para Oak Ridge está disponible en línea. 47 presentar la propuesta de tiempo Haz todas las pautas para una presentación exitosa.
  3. Si la proteína deuterada es (véase 2.2), servicios de dispersión de neutrones a menudo cuentan con laboratorios y experiencia dedicada a la producción de materiales deuterados. Para solicitar acceso a laboratorio Bio-grado de deuteración (BDL) en ORNL, seleccione el BDL como segundo instrumento en el sistema de propuesta. Mientras que la propuesta de SANS se repasa para la viabilidad y por un Comité de revisión científica, BDL solicitudes sólo se defienden para viabilidad. Para ayudar con la revisión de factibilidad BDL, presentar una información completa solicitud formulario48 que describe el protocolo de expresión de la proteína y el rendimiento estimado (disponible en línea).
  4. Después de la revisión exitosa de la propuesta de tiempo de la viga, confirmar la fecha adjudicada de tiempo Haz antes del experimento. Asegúrese de que todos los datos de muestra y tampón y fórmulas aparecen correctamente en la propuesta para la revisión adecuada. Cualquier cambio en el plan experimental propuesto, incluyendo cambios en la composición de la muestra y tampón, exigir la comunicación de la instalación.
    Nota: Discuten cambios con el NSS asignado tan pronto como sea posible.

2. determinar el neutrón contraste puntos de partido y el contraste necesario para la medición de la proteína

  1. Recopilar información (a partir de información de producto del proveedor, las bases de datos en línea, valores publicados, etc.) relacionados con composiciones atómicos y volúmenes de los componentes del sistema detergente ser comparados en contraste. Esta información se utiliza para determinar densidades de longitud de dispersión de neutrones (SLDs) y así contrastar puntos de partido (CMP) en solución, que es fundamental para obtener calidad sin datos y estructural la información para la proteína de membrana de interés en el contexto de una PDC. Una tabla que resume los puntos coincidencia físicos propiedades y contraste para detergentes comúnmente usados en estudios de biofísicos de proteínas de membrana es incluido (tabla 1).
  2. Determinar SLDs neutrón usando la aplicación web pajote: módulos para el análisis de contraste variación datos49 (en línea disponible50 libre de cargo). Un enlace al manual del usuario se encuentra en la página de inicio. Acceder al sitio web y leer la documentación que lo acompaña. Figura 1 y figura 2 brindar un panorama de contraste módulo entrada y salida para dos ejemplos relacionados.
    Nota: Otros sitios web para calcular SLDs está disponible, como el mantenido por el Instituto Nacional de estándares y tecnología (NIST) centro para la investigación del neutrón. 51
    1. Abra el módulo de contraste haciendo clic en 'Contraste' en el panel de navegación izquierdo. Proporciona texto para un proyecto de título y entrar en detalles a continuación para dos componentes (por ejemplo, detergente grupo cabeza y cola) como ' subunidad 1' y ' subunidad 2'.
    2. Escriba la fórmula molecular de cada componente en el cuadro de texto 'Fórmula'.
      Nota: el botón de radio am' debe seleccionarse bajo 'Tipo de sustancia' para escribir una fórmula molecular. Además, utilizar la letra 'X' en la fórmula para indicar los átomos de hidrógeno fácilmente intercambiables. Secuencias de proteínas, RNA o DNA pueden introducirse si la correspondiente 'P', 'R', o había ' botones de radio seleccionados. Existan múltiples copias de un componente dentro de la subunidad, el valor de 'Nmolecules' puede cambiar en consecuencia. Un ejemplo práctico aquí se refiere a lípido-como detergentes que contengan dos colas idénticas, permitiendo que la fórmula de una cola entrar con Nmolecules igual a 2.
    3. Ingrese el volumen en Angstroms cúbicos para cada componente en el cuadro debajo de "Volumen (Å3)". Utilizar la fórmula de Tanford28 para cadenas de longitud n, Vcola de alkyl = 27,4 + n * 26,9, calcular el volumen aproximado de la cola, u obtener volúmenes moleculares de información proporcionado o publicado valores en la literatura.
    4. Ingrese datos para los componentes del tampón. Cambiar «número disuelto especie en el solvente utilizando el menú desplegable para agregar o quitar filas para cada componente de amortiguamiento. En el caso de formación de micela detergentes, incluyen los monómeros detergentes gratis como componentes buffer separado en concentración micelar crítica del detergente (CMC).
    5. Haga clic en 'Enviar' para realizar los cálculos de contraste de neutrones y generar una página de resultados que proporciona una tabla de puntos de fósforo de dispersión longitud densidad y contraste, así como fórmulas para la determinación de estos parámetros en cualquier porcentaje de D2O en el búfer. Revisión de los parámetros de dispersión con especial atención a la CMP de componente. Si los puntos de fósforo son similares (dentro del 10% D2O) y la concentración micelar libre es baja, entonces la media CMP puede ser utilizado para emparejar contraste las contribuciones detergentes. En la mayoría de los casos, la CMP del detergente grupo cabeza y cola es diferente por más de 10-15%, produciendo un factor de forma de core-shell de los datos SANS que ofusca la recogida directa de la señal de dispersión de la proteína solamente.
  3. Evaluar el contraste entre detergente grupo cabeza y cola. Cuando el detergente principal grupo alkyl cadena cola y CMP no están bien emparejados, la disponibilidad y la incorporación de un detergente sustituidas a deuterio pueden permitir dispersión densidades de longitud de seleccionarlos componentes para ser manipulado. En la mayoría de los casos, esto requerirá formación de una micela mixta a través de la incorporación de un detergente idéntico con cadenas alquil sustituidos por deuterio. La adición de deuterio aumenta la densidad de longitud de dispersión del núcleo formado por las colas de cadena alkyl. El punto final deseado, en este caso, es tal que la cabeza del grupo shell CMP y núcleo de cadena alkyl CMP tienen aproximadamente valores iguales.
    1. Levante el CMP del núcleo micelar detergente para ser aproximadamente igual a la CMP de la cáscara de la cabeza del grupo mediante la determinación de la proporción adecuada de la mezcla entre h-colas y colas d que logra el contraste completo con los grupos de cabeza. Un requisito previo para esta determinación es de conocimiento de la CP/RP para una cola de cadena alquil sustituidos por deuterio. Una contraparte comercialmente disponible para n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) está disponible con todo hidrógeno de cadena alquil sustituido por deuterio (d25-DDM). Repita los cálculos de contraste se indica en el paso 2.1 para una cola había ' en lugar de la h-cola.
    2. Calcular el ratio molar de h-cola a cola d requerida para emparejar en contraste con el grupo de cabeza CMP. La siguiente fórmula puede ayudar con esta determinación:
      CMPcabeza = CMPh-cola * χh-cola + CMPd cola * χd cola
      donde CMP es la densidad de longitud de dispersión y χ es la fracción de volumen para el componente detergente cabeza, h-cola, o cola de d. Soluciones tampón de DDM, incorporación de 44% en peso (43% por topo) del detergente total como d25-DDM con cadenas alquil sustituidos por deuterio produce un solo CMP en 48,5% D2O para los componentes de la cabeza y cola.
  4. Considerar el grado de sustitución de deuterio para la proteína de la membrana. Para medir la señal de dispersión suficiente de la proteína, la CMP para la proteína debe ser al menos 15% D2O en la solución de detergente CMP y condiciones de medición. La señal aumenta con el cuadrado de esta diferencia de %. Desde el CMP de una proteína se produce típicamente ~ 42% D2O en solución (CMP similar a muchos grupos cabeza detergentes), etiquetado de deuterio de la proteína es casi siempre una necesidad. 52

3. expresar y purificar la proteína de membrana de interés

  1. Preparar medio LB (caldo de lisogenia) y crecer Escherichia coli (e. coli) células que un vector de expresión inducible de la secuencia de la proteína objetivo.
    1. Preparar los medios de comunicación mínima. En H2O o D2O, disolver tan 7.0 g/L (NH4)24, 5,25 g/L de Na2HPO4, 1,6 g/L de KH2PO4, 0.50 g/L del diamonio hidrógeno citrato, glicerol 5,0 g/L, 1,0 mL/L de 20% p/v MgSO 4·7H2O y 1,0 mL/L de metales traza de Holme (0.50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 contabilidad CoCl2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FECLAS3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O y 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Preparar soluciones madre antibióticas apropiadas H2O o D2O.
    3. Prepare una solución Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido H2O o D2O.
    4. Estériles de filtro de todas las soluciones en secan, recipientes estériles con tapa de la botella de vacío y filtros con un tamaño de poro de 0,22 micras de la jeringuilla.
  2. Adaptar las células de e. coli antes medio marcado con deuterio de escalado para la sobreexpresión de una proteína deuterada.
    1. Inocular 3 mL de medio LB con una colonia aislada de una placa de agar caldo de lisogenia (LB) o células de un stock de glicerol congelados. Crecen las células a 37 ° C en un incubador de agitación a 250 RPM o reducir la temperatura a 30 ° C o por debajo para evitar el crecimiento excesivo de la cultura al incubar durante la noche.
      Nota: Se puede variar el procedimiento de adaptación. 55 , 56 , 57
    2. Una vez que la cultura LB ha crecido a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de ~ 1, diluirlo 1:20 en 3 mL de medio mínimo de H2O y crecer a un OD600 de ~ 1. Repetir a la 1:20 las diluciones con medio mínimo con 50, 75 y 100% D2O (o hasta el porcentaje deseado de2O de D).
      Nota: se incrementa el contenido de2O como la D, las tasas de crecimiento disminuirán. La relación entre el porcentaje de2O de D en el crecimiento los medios de comunicación y deuterio la sustitución en la proteína se ha divulgado en la literatura. 58 , 59 , 60
    3. Seguir creciendo el cultivo en un biorreactor para aumentar el rendimiento de la masa celular deuterados (figura 3).
      Nota: Procedimientos para la operación del biorreactor han sido revisados en otros lugares. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Cosecha y lyse las células de e. coli para la purificación de extracción y de la proteína de membrana
    1. Sedimenten las células por centrifugación a ~ 6.000 x g durante 30-45 min a 4 ° C.
    2. Suavizar el precipitado de células sumergiéndolos en buffer en hielo durante 30 minutos. Luego, suavemente Resuspender el precipitado de células en buffer transfiriendo suavemente con una pipeta serológica o suave balanceo en una mecedora 2D, para una concentración final de 1 ~ g líquido masa/10 mL de tampón.
      Nota: un búfer ejemplo es 50 mM HEPES (ácido de-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 4), pH 7,5, 200 mM NaCl suplementado con una tableta de inhibidor de la proteasa.
    3. Lyse células resuspendidas con tres pasa por un homogeneizador de alta presión a 10.000 psi mientras se enfría el flujo de salida.
      Nota: Según la escala requerida, otros métodos de lisis pueden ser utilizado (por ejemplo, prensa francesa o sonicación).
    4. Pelotilla restos celulares por centrifugación a 5.000 ~ 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Repita este paso hasta que el sobrenadante se clarifica.
    5. Ultracentrífuga (~ 150.000 x g durante 30-45 min) al sobrenadante del paso anterior, que contiene el soluble y fracciones de la membrana. El pellet después de la ultracentrifugación contiene la fracción de membrana.
    6. Resuspender el precipitado de la membrana en un gran homogeneizador Dounce y aislar la fracción de membrana otra vez por ultracentrifugación (paso 3.3.5). Repita este paso por lo menos una vez para eliminar proteínas límite.
    7. Solubilizar las membranas por suave balanceo ~ 30 min a 4 ° C en un tampón que contiene detergente adecuado para la purificación. Solubilización es evidente cuando la suspensión se convierte de nublado en transparente. Eliminar el material insoluble por ultracentrifugación (~ 150.000 x g durante 30-45 min).
      Nota: Un búfer de ejemplo es de 50 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazol de 20 mM y 4% (w/v) DDM para purificación por cromatografía de afinidad de Ni2 + .
  4. Purificar la proteína siguiendo un protocolo previamente desarrollado para las formas protonada.
    Nota: Véase Naing et al. , de un protocolo de purificación de ejemplo para un hexahistidine con la etiqueta M. marisnigri jumpers JR1 intramembranosas aspartil proteasa (d-MmIAP). El rendimiento final fue de 65 ~ 1 mg de deuterados de crecimiento 5 L deuterado de cultura celular, todo lo cual se utilizó en el experimento SANS (figura 4).
  5. Intercambio de la proteína purificada en el "Buffer Final de intercambio" para emparejar el contraste.
    1. Preparar 200 mL de "Buffer de intercambio Final" que contiene la mezcla correcta para contraste de coincidencia, por ejemplo,20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM de NaCl y 0.05% del total de DDM (0,028% DDM y 0.022% d25-DDM) en 49% D2O.
    2. Equilibrar una columna de exclusión de tamaño con > 2 columna volúmenes (CV) de "Buffer Final de intercambio" en 3.5.1 mediante un sistema rápido proteína líquida cromatografía (FPLC).
    3. Después de la inyección de la muestra, ejecute la columna y aislar fracciones correspondientes a la proteína de interés.
    4. Concentrado de la proteína a la concentración final deseada (2-5 mg/mL).
      Nota: Un volumen de ~ 300 μL es necesaria para llenar una cubeta de cuarzo cilíndricos de 1 mm utilizada para SANS.
    5. Una alícuota de búfer emparejado para SANS fondo de reserva.
      Nota: La alícuota puede tomarse directamente del buffer preparado, o idealmente de una fracción de elución limpio al final de la carrera FPLC.

4. hacer los preparativos finales para Haz tiempo y recoger sin datos

  1. Después de que la propuesta ha sido aceptada y ha sido aprobado el acceso al sitio, completar los entrenamiento antes de tiempo asignado de la viga. Esto incluye prearrival, así como laboratorio radiológico, in situ y formación específica para el instrumento de formación basada en web.
    Nota: Requisitos de formación puede dictar llegada de avance para los usuarios de primera vez. Más información está disponible en línea. 66
  2. Carga de muestras y buffer para recolección de datos.
    Nota: Un resumen de la dispersión de neutrones de ángulo pequeño biológica (Bio-SANS) área de medio ambiente muestra instrumento se muestra en la figura 5.
    1. Cargar las muestras y tampones en células del cuarzo. Celdas de cuarzo contáctese con el instrumento científico o instalación. Utilizar puntas de carga de gel a la abertura estrecha de la mayoría de las células de la muestra.
    2. Asegurarse de que se cierra el obturador de la viga, luego acercar al área de medio ambiente de la muestra y colocar las celdas de cuarzo en el cambiador de muestras. Registro de la posición del cambiador de muestra para cada celda de la muestra.
    3. Revise el área esté libre de obstrucción, la trayectoria de la viga entonces abandone el área de medio ambiente de la muestra y abra el obturador del haz.
      Nota: Cuidadosamente siga todas las normas de instalación regulaciones obedecer todos los posteos y escuchar consejos del científico del instrumento. Las muestras no pueden quitarse la viga y manipuladas después de la exposición a la viga sin precauciones especiales. Consulte con un técnico de Control radiológico (ECA) antes de estos procedimientos.
  3. Ejecutar escaneo de tabla para la recogida automatizada de datos
    1. Operar el instrumento a través del control personalizado software basado en LabVIEW, entorno de Control de instrumento espectrómetro (especia). Siga las instrucciones para la operación del equipo suministrado por el científico de la dispersión de neutrones. Un resumen de las ventanas de operación de exploración de tabla se proporciona en la figura 6.
    2. Después de ingresar la información requerida en las áreas apropiadas, escanear la tabla y se iniciará un proceso de recolección de datos. Monitorear el avance a través de la pestaña 'Table Scan Status'.

5. reducir sin datos de imagen 2D a 1D parcela

  1. Identificar cada archivo de datos de muestra y tampón de los números de exploración del grabado. Cada medición se asignará a un número único de exploración. Esta información es útil durante la reducción de datos para identificar cada muestra correspondiente y par de buffer.
  2. Software de MantidPlot y script en Python para la reducción de
    1. Los usuarios de dispersión de neutrones cuentan con información de la cuenta para acceder a sus datos en el clúster análisis remoto. 67 sesión en el clúster análisis remoto y ejecutar "MantidPlot" de la línea de comandos. Figura 7 y figura 8 se proporcionan para ayudar a estos pasos.
    2. Obtener una secuencia de comandos de usuario reducción de la dispersión de neutrones científico (esto ocurrirá normalmente durante el experimento); Este script está basado en Python y contiene la necesaria calibración y ajustes de escalas para reducir la imagen de dispersión 2D en una parcela de 1D de intensidades dispersas en función del ángulo de dispersión, I(Q).
    3. Abrir el Script de reducción proporcionada de usuario en MantidPlot y los correspondientes números de exploración o identificación de los pares de muestras y buffer en la lista correspondiente.
    4. Ejecutar el script para generar datos reducidos como un archivo de texto de cuatro columnas (columna orden es Q, I(Q), I(Q) error, Q error) en la ubicación especificada. Haga clic derecho en el espacio de trabajo adecuado en MantidPlot y seleccione "Parcela con errores..." para un examen inicial de los perfiles de dispersión.

6. analizar los datos para los parámetros estructurales de la partícula de la dispersión

  1. Transferir el archivo de datos reducidos de analysis server en un equipo local mediante la transferencia de archivos FTP seguro. Esto puede realizarse con el uso de software como FileZilla o CyberDuck. Instrucciones y los datos de conexión al sistema de archivos del servidor de análisis se proporcionan en la página de inicio de sesión de analysis.sns.gov.
  2. Descargar ATSAS software suite65,68 (suite ATSAS todo). 69 programas individuales70 también están disponibles en línea para el análisis de los datos SANS, es decir, determinación de parámetros estructurales y modelos ab initio .
    Nota: Muchas opciones están disponibles para SANS análisis de biomacromoléculas. 45
  3. Uso de PRIMUS71 para trazar datos, tampón escalamiento y resta y el análisis de Guinier.
    1. Lanzar el ATSAS 'Análisis de datos de SAS' aplicación y carga los datos reducidos los archivos correspondientes al par de la muestra y tampón.
      1. Para escalar el tampón correctamente, seleccione un rango de datos en alto Q (Q > 0.5 Å-1) donde ambos perfiles son similares y plana y pulse el botón de 'Escala' situado bajo las 'operaciones' ficha. Se aplicará un factor de escala en el búfer que estas dos regiones planas deben superponerse. PRECAUCIÓN: debe haber una razón física plausible que justifique la escala de la intensidad de amortiguación para que coincida con la muestra. Si la discrepancia es grande, consulte a un científico del instrumento para acercamientos válidos a fondo. 44 , 45 , 72
      2. Aumentar el rango de datos para ver todos los puntos. Haga clic en 'Restar' para realizar esta operación. Haga clic con el botón derecho el archivo de datos resta de búfer en la leyenda y guardar este archivo para posterior análisis. Figura 9 describe el uso de la pestaña de 'Operaciones'.
    2. Realizar un análisis de Guinier de los datos de la muestra resta buffer usando la pestaña de 'Análisis' de la aplicación de 'Análisis de datos de SAS'.
      1. Asegúrese de que el archivo correcto está seleccionado en la lista y haga clic en 'Radio de giro'. Intento automatizado para realizar un ajuste de Guinier se prestará haciendo clic en el botón 'Autorg'.
      2. Ampliar la gama de los datos utilizados incluyen todos los datos Q bajo y comenzar a reducir el rango de datos eliminando puntos de alta Q hasta el Qmáx * límite deg R está por debajo de 1.3. Utilice el diagrama de residuales para verificar que los datos son lineales en el rango de ajuste. Guinier ajuste produce un aproximado de Rg y0 para las partículas de dispersión.
      3. Hacer pequeños ajustes en la región de ajuste y monitoreo de sensibilidad de estos valores en el rango de datos utilizados en el ajuste. Figura 10A muestra el uso de la herramienta de 'Radio de giro'.
  4. Obtener la función de distribución de probabilidad (P(r)) en GNOM. 73 el archivo de salida generado aquí se utilizará como insumo para el ab initio modelado de proceso.
    1. Iniciar el Asistente de distribución de distancia dentro de la ficha de 'Análisis', obteniendo un buen ajuste a los datos es esencial para la obtención de un modelo de calidad. Para obtener más información sobre cómo obtener ajustes precisos, por favor vea el informe74 por Putnam, et al.
      Nota: programa el GNOM proporciona información adicional sobre el ajuste más allá del asistente de distribución de la distancia. Figura 10B se muestra el uso correcto de la herramienta de 'Distribución de distancia', y figura 11 ilustra algunos de los errores comunes encontrados.
    2. Determinar Dmax, la máxima distancia interatómicos dentro de la molécula.
      1. Estimar un valor para Dmax desmarcando la casilla de forzar Rmáx = 0 y entrar en un valor grande para Dmax (150 Å, por ejemplo). El primer x-intercepción en la parcela de reinicio rinde esta estimación.
      2. Realizar cambios incrementales en este valor Dmax y el rango de datos utilizados o el número de puntos utilizados en el ajuste para optimizar el GNOM ajuste a los datos y la curva resultante de reinicio.
    3. Seguir afinar el ajuste GNOM y guardar los archivos de salida GNOM con buen ajuste parámetros posterior ab initio pasos de modelado.
  5. Simular SANS perfiles desde modelos PDB de alta resolución utilizando el programa CRYSON. 75
    1. Abrir el programa y seleccione la opción '0'. Seleccione el nombre del archivo PDB en el explorador de archivos del popup. Pulse enter para aceptar la configuración predeterminada, excepto especificación cadena grado de deuteración fracciones y la fracción de D2O en el disolvente para alcanzar los parámetros de contraste adecuado.
    2. Ajustar el modelo a un conjunto de datos experimental por entrar en 'Y' y seleccionar el archivo de datos en el explorador de archivos del popup. Acepte los valores predeterminados restantes, y archivos de salida se escribirá en la ubicación del archivo de PDB. El archivo '.fit' contiene información para el perfil de dispersión predicha desde el modelo 3D de alta resolución.

7. crear los modelos Ab Initio de la SANS datos.

Nota: DAMMIF76 y77 dentro de la suite de software ATSAS de DAMMIN se utiliza para reconstruir modelos de átomo ficticio (presas) mediante un proceso de recocido simulado de lo GNOM de salida, que contiene datos de reinicio, o información acerca de la probabilidad o frecuencia de interatómicos distancias dentro de la partícula de la dispersión. Estos programas se pueden ejecutar en modo batch o en el servidor de web en línea ATSAS.

  1. Iniciar al asistente de forma PRIMUS desde el botón 'Dammif' en la pestaña de 'Análisis' de 'Análisis de datos de SAS' y utilizar una selección manual de los parámetros. La entrada para el asistente se ilustra en la figura 12.
    1. Definir el rango de Guinier de ajuste (paso 6.3.2) y proceder al paso siguiente utilizando los botones de navegación. Definir valores de ajuste de la parcela de reinicio (paso 6.4) y proceder al siguiente paso.
    2. Proporcionan parámetros para los ab initio modelado de proceso. Introduzca un prefijo para los nombres de salida modelo (por ejemplo, SANSEnvelope), seleccione cualquiera de los dos modelos de modo 'rápido' o 'slow', introduzca un valor para el número de modelos (17 recomendada para significación estadística), seleccione de las opciones disponibles para la simetría de la partícula, anisometry y escala angular (si se conoce). Asegúrese de que las cajas se comprueban a los modelos promedio con DAMAVER y refinan el modelo final con DAMMIN.
    3. Iniciar el proceso utilizando el botón 'confirmar'. Una vez finalizado el proceso, ver y guardar el directorio de trabajo.
      Nota: el proceso de modelado típico para una sola, pequeña proteína puede tomar hasta un par de horas con un ordenador personal típico. Los archivos se almacenan en directorios temporales hasta que guarda.
  2. Superposición y superponer la final sin envoltura con un modelo de alta resolución relacionado con SUPCOMB en ATSAS. Coloque una copia de la alta resolución modelo PDB para estar en forma a la envolvente SANS en el directorio de trabajo. Ejecute SUPCOMB desde la línea de comandos utilizando los nombres de archivo PDB como dos argumentos con la estructura de plantilla muestra en primer lugar: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Nota: El segundo nombre de archivo enumerado se reescribe como un archivo nuevo con una "r" a las final y tener nuevas coordenadas para la superposición sobre la estructura de la plantilla.
  3. Visualizar los resultados del ab initio modelo con PyMOL (pymol.org), un programa de visualización de gráficos moleculares en 3D. Figura 13 proporciona una visión general de las operaciones de PyMOL.
    Nota: Existen pautas de publicación para modelado estructural de los datos de dispersión de ángulo pequeño de biomoléculas en solución. 78
    1. Lanzamiento de la aplicación de PyMOL y abrir los archivos .pdb correspondientes a 3D sin envolvente y la estructura de alta resolución SUPCOMB-alineado para ser visto.
    2. Visualizar la envoltura SANS al representar este modelo como una superficie. Haga clic en el ' botón situado junto a la modelo y seleccione ' Mostrar: como: superficie '.
    3. Visualizar la estructura de la columna vertebral de proteína alta resolución al representar este modelo como una caricatura. Seleccione el ' botón al lado de este modelo y seleccione ' Mostrar: como: dibujos animados '. Mostrar la cadena como un arco iris de N - al c-terminal seleccionando el botón 'C' y ' por la cadena: 'Chainbows.
    4. Modificar la transparencia de la representación superficial para mayor claridad. En la barra de menú de 'Configuración', seleccione ' transparencia» superficie» 40% '.
    5. Hacer el fondo blanco y no opaco. En la barra de menú 'Display', seleccione ' fondo»' y seleccione 'Opaco' que desmarcar esta opción y 'White' con motivo de este color para el fondo.
      Nota: operaciones adicionales y usos de PyMOL pueden encontrarse en PyMolWiki.org.

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Representative Results

Una propuesta de instrumento y tiempo de viga debe transmitir claramente toda la información necesaria al Comité de revisión para que se puede hacer una evaluación válida del experimento propuesto. Comunicación con un NSS es altamente sugerido para usuarios inexpertos. El SNA puede evaluar viabilidad inicial y presentación de propuesta de guía para enfatizar el potencial para la ciencia de alto impacto, viabilidad y seguridad. La información proporcionada en la propuesta debe incluir información de antecedentes y contexto de la importancia de la investigación; conocimiento que se espera obtener y cómo esto impacta la comprensión actual en el campo relacionado de la ciencia; una descripción del trabajo, muestras, métodos y procedimientos que se emplearán; y, en su caso, la productividad anterior del equipo en la instalación, incluyendo las publicaciones relevantes y resultados. Recursos útiles, tales como plantillas de propuestas y sugerencias para la preparación de la propuesta, están disponibles para los usuarios a través del Portal de usuario de ciencia de neutrones (neutrons.ornl.gov/users).

Experimento de la planificación es un proceso dinámico que a menudo comienza durante la fase inicial de presentación de la propuesta, pero no puede concebirse plenamente hasta justo antes de que la experimento. Sin embargo, tenga en cuenta que cualquier cambio que se desvía significativamente de la descripción de la propuesta (incluyendo cambios en las condiciones de buffer o composición de la muestra) debe ser aprobado por la instalación antes de comenzar el experimento.

Este protocolo asume que se ha demostrado con éxito un método para expresar y purificar la proteína de membrana del interés en micelas de detergente en solución. En este caso, la proteína de membrana de interés es una intramembranosas aspartil proteasa (IAP), que dispone de un protocolo de purificación establecidos y previamente se ha determinado que sea soluble y activo en solución tampón que contiene micelas de DDM.

Aquí, demostramos neutrón contraste cálculo el pajote: módulo de contraste para una solución de proteínas IAP en contraste emparejado mezclado DDM / micelas d25-DDM. La estrategia esbozada en el presente documento fue primero determinar el grado de mezcla entre los dos detergentes necesarios para lograr a un partido contrario de la micela. El resultado final fue determinar el contraste relativo de cada componente y el fondo (relación de2O H2O/D) necesario contraste-partido de la dispersión de detergente para observar sólo la dispersión de la proteína.

Figura 1 se muestra una entrada apropiada para el módulo de contraste del pajote y la salida resultante para el cálculo de contraste del DDM detergente grupo cabeza y cola como subunidades 1 y 2, respectivamente. La fórmula utilizada para el grupo principal es C12H14X7O11 con un volumen de 348 Å3y la fórmula de cola de cadena alkyl es dada como C12H25 con un volumen de 350 Å3.

Es evidente desde la salida del módulo de contraste que el grupo de cabeza de DDM y la cola tienen densidades de longitud de dispersión diferentes, y así se observará el contraste entre los dos componentes. Para DDM, los grupos de cabeza tienen un CMP en 49% D2O mientras que las colas de cadena alquil un CMP en el 2% D2O, con su CMP Media que ocurre en el 22% D2O. Por lo tanto, el objetivo del siguiente paso será diseñar una micela mixta que incorpora cadenas alquil sustituidos por deuterio para aumentar el CMP Media de las colas de detergente para que coincida con la CMP de los grupos de cabeza. Se repitió el cálculo de contraste para un detergente substituido, DDM con una cola totalmente deuterados (d25-DDM), que resulta del mismo modo en contraste entre el grupo de cabeza y la cola. Sin embargo, contrasta los valores de h-colas y colas d son significativamente diferentes. Hay que recordar que detergente mezclas son conocidas por producir bien mezcladas micelas en solución,22 por lo tanto una mezcla de estos h y d-colas en el núcleo de la micela debe producir SLD media igual a la de la cabeza del grupo shell, que rinde una micela con CMP sola. Puesto que el grupo de cabeza es común a la DDM y d25-DDM, la estrategia es encontrar una mezcla de estos detergentes que produce un valor de medio de contraste desde las colas mezclados que coincide con el contraste de los grupos de cabeza.

El medio de destino CMP para el detergentes colas es de los grupos cabeza de maltoside, o 49% D2O. Para estimar la proporción de la mezcla de la CMP Media de cada componente h-cola y cola d debe ser conocido. Estos valores para algunos detergentes comunes y deuterio disponible en el comercio con sus homólogos en la tabla 1. Usando estos valores CMP para DDM y d25-DDM, la fracción molar de h-colas y colas d que satisface la ecuación proporcionada en el paso 2.2 es χcolas d = 0.43.

Figura 2 se muestra una entrada más avanzada en el módulo de pajote contraste que puede utilizarse para confirmar las condiciones de partido final de micela mixta de contraste y determinar el grado de deuteración necesario en la proteína. Aquí, subunidad 1 se refiere a la micela mixta contraste emparejado con 2 componentes, DDM y d25-DDM, mientras que la subunidad 2 se refiere a la M. marisnigri jumpers JR1 intramembranosas aspartil proteasa (MmIAP) por su secuencia de aminoácidos. El SLD de la proteína ha sido elevado por la expresión en medios de crecimiento deuterados para una CMP para la proteína en solución tampón que contiene ~ 92% D2O. El grado de separación entre el punto de coincidencia de la proteína en el 92% D2O y la condición de medición (48,5% D2O) sugiere que esa señal de dispersión suficiente será obtenida de la proteína.

Producción de d-MmIAP se llevó a cabo con células de Rosetta 2 e. coli que el vector de pET22b-MmIAP. Medio mínimo con glicerol sin etiqueta en el 90% D2O fue seleccionado como el medio de crecimiento. Después de la adaptación a un medio mínimo 90% D2O, el volumen de cultura fue escalado hasta 400 mL y solía inocular 3,6 L de medio fresco 90% D2O mínimo en un recipiente de biorreactor de 5,5 L.

La figura 3 muestra un rastro de los valores de proceso durante el cultivo fed-batch. En el momento de la inoculación, la temperatura de referencia fue de 30 ° C, la consigna de oxígeno disuelto (OD) fue del 100%, fue de la consigna de agitación 200 rpm y el caudal de aire comprimido fue 4 L/min. El pH se llevó a cabo sobre un punto de ajuste de 6,9 con una solución de 10% p/v de hidróxido de sodio del 90% D2O. Una vez la espiga señalizada agotamiento del glicerol inicial 5 g/L, alimentación (30% p/v de glicerol, 0.2% de MgSO4 en un 90% D2O) se inició, que continuaron durante todo el cultivo. Después de alrededor de 7 horas de la alimentación, la temperatura del cultivo se redujo a 18 ° C e Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido ha sido añadido a una concentración final de 1 mM. Sobre la cultura de la cosecha, aproximadamente 145 g de peso húmedo de la goma de la célula fue recogida mediante centrifugación (6.000 x g durante 45 minutos)

Purificación de d-MmIAP procedió en cuanto a la enzima protonada excepto que enzima rendimiento fue significativamente menor y pureza final fue algo más baja que la típica. De 5 L, ~ 20 g de membranas húmedas fue aislado, que fue solubilizada en DDM para purificación y cargado en la primera Ni2 + afinidad columna. Para maximizar el rendimiento de la purificación, la fracción de flujo diluida y volver a ejecutar en columna de afinidad de Ni2 + . El procedimiento se repitió una tercera vez antes de pulir la muestra concentrada d-MmIAP por cromatografía por exclusión de tamaño (figura 4).

Figura 5 representa una célula de muestra de cuarzo y su instalación de cambiador de muestra relacionados. Entornos de muestra son administrados por el Bio-sin equipo de operaciones y NSS. Una variedad de ambientes puede disponerse a realizar mediciones con control de temperatura, control de humedad, agitación mecánica, alta temperatura y presión sostenida, entre otros.

Figura 6 muestra Bio-SANS las operaciones y la ejecución de la tabla automatizada explora. El escaneo de tabla se configura para ser intuitiva y fácil de usar. En la primera pestaña (muestras de carga), se proporciona información sobre el cambiador de muestras y la instalación, tales como identificación de las muestras en cada posición del cambiador de muestras, gruesos de células y tipo de muestra (Haz abierto, muestra, Fondo, etc.). Etiquetas de metadatos adicionales pueden aplicarse aquí también. En la ficha siguiente (Plan de experimento), se definen la configuración del equipo y los parámetros asociados (tales como control de temperatura). Este paso es arreglado por el NSS al inicio del experimento. El usuario simplemente deberá escribir los tiempos de medición para cada muestra (en segundos). La pestaña final (ejecutar análisis) proporciona un resumen de los datos de escaneo de tabla y permite el análisis automatizado a ser ejecutados.

Después se registran las imágenes 2D de la dispersión, estos datos deben reducirse a una parcela de 1D de la intensidad versus Q - una función del ángulo de dispersión. Durante la reducción de datos, también se aplican correcciones de imagen tales como máscaras de sensibilidad pixel y sustracciones de fondo oscuro. MantidPlot software fue diseñado para interpretar el crudo Bio-SANS datos del instrumento. El NSS generalmente ayudará en la reducción y recuperación de los datos finales al final del experimento.

Figura 7 proporciona una visión general del acceso remoto análisis cluster a MantidPlot y la ventana Script utilizado para la reducción de datos. Datos en bruto son accesibles en el clúster análisis remoto (analysis.sns.gov) mediante la autenticación de usuario UCAMS/XCAMS. Después de iniciar sesión en el escritorio remoto, el software de MantidPlot puede ser ejecutado desde una ventana de terminal ejecutando simplemente 'MantidPlot' en cualquier ruta. Abra la ventana de Script en MantidPlot y editar el Script de reducción de usuario como se indica por el SNA. Ejecuta este script generará los archivos de datos reducidos, que luego pueden ser transferidos a un equipo local para el análisis de uso de FTP seguro.

Figura 8 muestra cómo trazar y visualizar los datos después de ejecutar los datos usuario reducido texto aparecerá en la ventana de espacios de trabajo. Por defecto, datos combinados finales tendrá el sufijo _f anexa. Haga permitirá espectro parcela con errores para ser seleccionado y los datos a ser graficados. Preferencias de visualización se acceden seleccionando preferencias en el menú 'View'. Formato de ejes y trazar la gama es de fácil acceso haciendo doble clic en los ejes. Perfiles de dispersión de buffers, que no contienen ninguna partícula de la dispersión de tamaño significativo deben aparecer como una línea relativamente plana (intensidad constante). Para las muestras, se debe observar intensidad en ángulos de dispersión más baja (Q) con decaimiento exponencial a un fondo plano incoherente.

Figura 9 proporciona una visión general de la resta de tampón apropiado utilizando el paquete de software de análisis de datos de SAS (o primusqt) después de la reducción de datos. Muy a menudo el fondo incoherente (intensidad en high-Q) es ligeramente no coinciden entre la muestra y tampón. Para la substracción apropiada, datos de esta región deben superponerse. La corrección de la escala aplica un factor de escala de intensidad a los datos que se traduce en datos superpuestos, y se puede realizar la resta. Si el factor de escala resulta en puntos de datos de búfer con mayor intensidad que los puntos correspondientes en la muestra, entonces estos puntos será negativo y no representado en una parcela de registro. Si los valores negativos en el archivo de búfer resta son abundantes, hacer una reducción menor en el factor de escala del almacenador intermediario y realizar la resta otra vez.

Figura 10 proporciona usos ejemplo de Guinier Primus y distancia distribución asistentes. Un análisis de Guinier proporciona una estimación preliminar de la radio de las partículas del giro de los datos de dispersión de bajo ángulo. Como datos acercan a cero, una región lineal debe estar presente en los datos. Montaje de una línea en esta región permite Rg por determinar de la pendiente y un0 ser extrapolados a partir de la intercepción de la intensidad Q = 0. Una tendencia ascendente en los datos como Q acerca a cero indica la agregación en la muestra, mientras que tendencias decrecientes son generalmente indicativas de repulsión entre partículas. Estas tendencias son más evidentes cuando la distribución de residuos es no estocástica. El límite superior de Guinier para partículas globulares está limitado por Q * Rg < 1.3 ('s' se utiliza en lugar de Q en el software ATSAS).

La Rg determinada para d-MmIAP de este ajuste de Guinier fue 15,4 ± 1.1 Å con un estimado I0 como 0.580 ± 0.001.

El Asistente de distribución de la distancia permite cambios sistemáticos a los parámetros de la reinicio ajuste. La curva de reinicio es una indirecta de Fourier de la curva de ajuste a los datos experimentales. Por lo tanto, es esencial verificar que el ajuste en el panel de la izquierda refleja con exactitud los datos experimentales. Para el ajuste se muestra en este ejemplo, un Dmax de 46 Å se obtuvo.

Figura 11 muestra los errores comunes en la selección de Dmax. Una Dmax que es artificialmente grande a menudo hace que los valores de reinicio para convertirse en negativo como la función de reinicio oscila sobre el eje x. Una Dmax artificialmente pequeña conduce a una curva de reinicio truncada con una brusca transición a Rmax = 0.

Los primeros pasos en el Asistente de forma de Primus son idénticos a los Guinier y distancia distribución asistentes. Una vez que se ha facilitado esta información para obtener buenos ajustes a los datos experimentales, se configura la configuración del modelo ab initio .

Figura 12 ilustra una entrada apropiada para el Asistente de forma de Primus. Aquí, experimental sin datos para la IAP fue provista de una escala en Angstroms, y fue dado el prefijo de archivo esperada de "SANSEnvelope". Un conjunto de 17 modelos de átomo ficticio inicial se pidió a generarse usando modo modelo "rápido" no simetría (P1) aplicado y no anisometry seleccionada. El conjunto de 17 modelos alineado, un promedio y filtrado con DAMAVER y el modelo promedio refinado utilizando DAMMIN. Inspección del prefijo-damsel.log documento de texto proporciona un resumen de los criterios de selección y los modelos descartados del conjunto. El modelo refinado final fue escrito como SANSEnvelope-1.pdb.

El programa SUPCOMB se utiliza para realizar una superposición de la envolvente SANS del modelo con el modelo de alta resolución, con sólo los dos estructura archivos PDB como entrada. Por defecto, "r" se anexa al nombre de archivo reorientarse y superpuestas.

Una vez los SANS el sobre y estructura de alta resolución han sido superpuestos, estos modelos pueden ser visualizados usando los gráficos moleculares viendo el programa. Los resultados de PyMOL son adecuados para imágenes de calidad de publicación y pueden utilizarse para acentuar resultados biofísicos relacionados con la investigación estructural. Aquí, demostramos algunas operaciones básicas de PyMOL utilizadas para proporcionar representaciones 3D y vistas de las estructuras superpuestas resultantes.

Figura 13 proporciona una visión general del proceso de visualización de PyMOL. Una vez que se han abierto los archivos de estructura PDB en PyMOL, los modelos deben ser visibles en la ventana del visor de PyMOL. Cambiar las representaciones de cada modelo usando el ' botón junto a cada nombre de archivo. Utilizar una representación superficial para la dotación SANS y una representación de dibujos animados de la espina dorsal de la proteína desde el modelo de alta resolución. Seleccione un esquema de color adecuado de opciones disponibles en el botón 'C'. Para las cadenas de la proteína, una coloración de "chainbow" proporciona un degradado de color desde N - al c-terminal para facilitar la interpretación. Transparencia se aplica a la representación superficial para permitir la mejor visualización de la estructura de la proteína dentro de la envolvente. Imágenes de la publicación, se recomienda un fondo blanco. Una vez que se han aplicado estas colas de visualización, se pueden examinar las estructuras 3D. Manipulaciones de la perspectiva y la molécula de rotación y traducción pueden realizarse haciendo clic y arrastrando la estructura.

Figure 1
Figura 1. Uso del módulo pajote contraste para determinar parámetros de contraste para los componentes de maltoside dodecyl (DDM). Valores de entrada se muestran en la pantalla de la izquierda con la posterior salida a la derecha. La página de entrada de módulo de contraste se accede pulsando 'Contraste' (círculo verde) en el menú de navegación a la izquierda de cada pantalla. Áreas de la entrada para el título del proyecto, buffer componentes y subunidades 1 y 2 se etiquetan como tal. Salida páginas contienen propiedades información y contraste de las partículas importantes para el sistema descrito. Tablas relevantes y puntos de fósforo calculados han sido encajonados en naranja para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Uso del módulo pajote contraste para determinar parámetros de contraste para los componentes del complejo proteína-detergente membrana. En este caso, se ha dado entrada a describir el sistema total del PDC en solución tamponada. Subunidad 1 describe el contraste emparejado mezcla micelar compuesto de DDM con el 43% por la mole como d25-DDM. Subunidad 2 describe la proteína de la membrana, con la secuencia del aminoácido para la entrada de MmIAP como la fórmula. El nivel de grado de deuteración (círculo verde) describe el grado de la proteína de sustitución de deuterio y tiene un impacto directo sobre la SLD y calculado-punto de coincidencia que se estima para la proteína. Resultados (cuadro naranja) indican ese punto de coincidencia para el detergente mezclado ocurrirá en 48,5% D2O, mientras que punto de la proteína de fósforo ocurre en ~ 90% D2O. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Preparación de la muestra – rastro del biorreactor. Los valores de proceso muestran son set point de temperatura (línea naranja), oxígeno disuelto (OD) punto (línea azul), punto de consigna de agitación (línea roja) y caudal de aire comprimido (línea rosa). Bomba 1 (línea verde) fue utilizada para el control de pH. La espiga en 18:40 indica agotamiento de glicerol inicial y se utilizó para iniciar la alimentación de solución de glicerol a través de bomba 2 (línea negra). Eje x es horas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Preparación de la muestra caracterización FPLC y SDS-PAGE de la muestra. Cromatograma de exclusión de tamaño final de d- MmIAP equilibrado con 20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl, 48,5% D2O y 0.05% total del DDM, de los cuales 44% (w/v) es cola deuterados d25-DDM. Inserción: Análisis SDS-PAGE con la tinción de Coomassie. Fracciones combinados están etiquetadas A, B, y C. región "B" se utilizó en el experimento SANS. Marcador de peso molecular anotada es en kDa. Imagen reproducida con permiso de Niang et al. 65 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 5
Figura 5. Recolección de datos – banjo de cuarzo muestra configuración celular y muestreador automático. (A) una celda de cuarzo vacío banjo aparece apoyada en el bloque de muestreadores. Las células son llenadas con la muestra e inserta en uno de los 15 puestos disponibles. (B) el bloque de la muestra está montado detrás de un selector de apertura (no mostrado) entre la viga tubo extensor y la ventana de silicio en la entrada al tanque de detector. Las mangueras que conectan a un baño de agua termostatizado y canales en todo el bloque de muestras proporcionan regulación de la temperatura en las posiciones de la muestra. La flecha indica la dirección de la viga de neutrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Recolección de datos – Resumen de operaciones especia y explorar la tabla. Las operaciones de exploración de la tabla son accesibles desde el botón 'Analizar tabla' en el menú izquierdo del software de control de instrumento especia. Las flechas verdes indican la pestaña activa en la parte superior de la pantalla y cajas naranja resaltar las áreas en la mesa de entradas del usuario activo. (A) la primera pestaña de la exploración de tabla se utiliza para proporcionar información sobre el cambiador de muestras y posiciones de la célula de muestra. Proporcionar etiquetas, espesor de la muestra y tipos de muestras para cada posición en el cambiador de muestras. Marca la casilla 'Hacer Scan' agregará la fila correspondiente a la cola de la exploración de tabla. (B) en la segunda ficha, se registran datos sobre el tiempo de configuración y medición instrumento en cada muestra (en segundos). Configuraciones de instrumento preconfiguradas por el científico de la dispersión de neutrones y a los usuarios basados en datos suministrados en la propuesta de tiempo y el instrumento de la viga. Parámetros adicionales se pueden agregar para el control de instrumentos, como la capacidad de definir puntos de referencia de temperatura y tiempos, a lo largo de la cola de la medición. (C) la ficha final proporciona un resumen de las mediciones para cada fila de la tabla. Si no hay cambios son necesarios, la exploración automática se inicia haciendo clic en el botón 'Ejecutar exploraciones'. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Reducción de datos – Resumen de operaciones de MantidPlot y escritura de reducción. MantidPlot software es accesible en el clúster análisis escribiendo "mantidplot" en un símbolo terminal en cualquier directorio activo (el círculo amarillo y la flecha se añaden énfasis). Una vez abierto el software, acceder a la ventana de comandos (activada por el botón marcado en verde) y abrir el script proporcionado por el científico de la dispersión de neutrones. Siga las instrucciones en la escritura, que sólo es necesario los números de análisis para cada muestra y tampón para introducirse en una lista de reducción automatizada, así como números de la celda vacía para sustracción y viga vacía para la transmisión y la viga de la exploración determinación del centro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8. Análisis de los datos – tramando de datos mediante MantidPlot. Datos se hace referencia como 'Espacios de trabajo' en MantidPlot. El área de trabajo se popularán con los nombres de archivo como producidos por la escritura de reducción del usuario. Datos de espacio de trabajo para conjuntos de datos 1D se pueden trazar haciendo clic en el espacio de trabajo y seleccionar "Plot Spectrum con errores...". Datos adicionales pueden agregarse a la trama actual, simplemente arrastrando y colocando espacios de trabajo. Formato de la ventana de la trama (por ejemplo en cuanto a parcelas de log-log) puede realizarse seleccionando 'Preferencias' de la barra de menú 'View', o haciendo doble clic en las etiquetas de eje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9. Análisis de datos – software ATSAS: operaciones básicas y restas buffer. La aplicación de primusqt (análisis de datos SAS) proporciona la visualización de fondo adecuada (buffer). El archivo de búfer debe escalarse para sustracción que datos se solapan en high-Q (donde la dispersión es plana como resultado de la señal restante de fondo incoherente). Cuando se selecciona esta gama high-Q de datos, la operación de la escala aplicará un factor de escala para el archivo de datos más baja de la tabla que produce superposición en la región definida. Después de escalar, el archivo de búfer puede restar para obtener el perfil de la red de dispersión de la partícula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10. Análisis de los datos – determinación de Guinier y reinicio (distribución de distancia). (A) el Asistente de Guinier Primus se utiliza para realizar un análisis de Guinier, proporcionando una estimación inicial de I0 y Rg. El tipo de partícula y la gama de datos para caber son utilizados para definir el ajuste. Una parcela del ajuste y los residuales correspondientes aparecen a la izquierda, mientras que términos de Guinier (I0 y Rg), límites deg Q * R y la calidad del ajuste lineal se proporcionan como salida en la zona marcada por el cuadro naranja. (B) el Primus distancia distribución asistente se utiliza para realizar el análisis de distribución de distancia, proporcionando el reinicio la curva que define la probabilidad de interatómicos distancias dentro de la partícula de la dispersión e incluye la Dmax o máximo distancia interatómicos. Parámetros indicados por el cuadro naranja se pueden investigar sistemáticamente para determinar una función de distribución de la distancia adecuada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11. Incorrectos resultados de los análisis de distribución de la distancia. Una Dmax correctamente seleccionada debe producir una curva de reinicio que picos con un decaimiento gradual a cero. Valores de dmáx es demasiado grandes es probable que producen valores negativos de reinicio u oscilaciones cerca del eje x en altos valores de r. Dmax valores artificialmente pequeñas a menudo resultan en curvas de reinicio donde el límite superior aparece truncado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12. Modelado – Ab initio modelo programa de instalación mediante el Asistente de Primus forma. Parámetros de modelado ab initio se proporcionan en una sola ventana de entrada. Un prefijo se suministra para nombres de archivo de salida con otras opciones de tratamiento disponibles. Procedimiento de recocido puede ser rápida (granos grandes con enfriamiento más rápido) o lento (granos más pequeños con el enfriamiento más lento). Número de repeticiones debe ser de tamaño suficiente para estudiar la reproducibilidad de las características del modelo. Anisometry y la simetría de la partícula pueden proporcionarse, si se conoce. Escala angular debe corresponder a las unidades de los datos medidos. DAMAVER promedio Alinee y promedio de todos los modelos de átomo ficticio y entonces aplicar un criterio de selección que excluye a cualquiera de los modelos aislados. Un núcleo de átomos fijos del modelo promedio será más refinado uso DAMMIN si esta opción está seleccionada. Este refinado modelo debe representar la envolvente 3D baja resolución experimental sin perfil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 13
Figura 13. Visualización – SANS Experimental sobre y superposición con el modelo de alta resolución con PyMOL. Después de abrir los archivos de estructura PDB en PyMOL, modelos aparecen en el visor de PyMOL. Los modelos activos se enumeran en la tabla a la derecha, junto con botones de acción que se pueden utilizar para manipular el modelo y su representación. Operaciones básicas se proporcionan para la visualización de estos modelos que permiten a las regiones de estructura de acuerdo (o desajuste) entre la dotación SANS y de alta resolución para ser identificados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Propiedades físicas de los detergentes comúnmente usados en las investigaciones de proteínas de membrana. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Investigadores de biología estructural, aprovechando técnicas estructurales complementarias como dispersión de la solución para obtener los datos bioquímicos y estructurales (tales como tamaño y forma) de biomoléculas en solución. SANS es una técnica particularmente atractiva para determinar estructuras de proteínas de membrana de baja resolución, un centro de atención de la moderna biología estructural y bioquímica. SANS requiere cantidades de proteínas purificadas comparables a las de los ensayos cristalográficos (1 mg/muestra). La disponibilidad comercial recientemente expansión de detergentes deuterados de alta pureza correspondientes a los estudios de proteínas de membrana hace accesible un medio para manipular este hidrógeno/deuterio contenido para SANS experimentos de complejos de proteína-detergente de membrana, permitiendo que la señal de la proteína ser grabada directamente. Cuando exitoso, puede calcularse una envoltura molecular ab initio modelo de los datos recogidos sobre apenas algunas horas. Por lo tanto, membrana proteína bioquímicos, biofísicos y biólogos estructurales pueden fácilmente aprovechar de SANS para obtener codiciados iniciales modelos 3D de proteínas de la membrana en solución, estructuras en complejo con socios o sustratos y modelos obtenidos obligatorios SANS puede utilizarse para la eliminación de datos de difracción. Uso rutinario de SANS para caracterizar las proteínas de la membrana sería transformativa para el campo de bioquímica de proteínas de membrana y tiene repercusiones de la función de la estructura básica para el descubrimiento de fármacos y el desarrollo. La ventaja del contraste de neutrones con sustitución de deuterio se hace sin una técnica valiosa para el estudio de proteínas, la proteína ADN u otros complejos biomoleculares, que pueden ser fácilmente manipulados en su contenido de hidrógeno/deuterio.

Para obtener información adicional acerca de teoría y diseño de instrumento de dispersión de ángulo pequeño, se recomiendan los siguientes comentarios: el Bio-SANS instrumento en el alto flujo isótopo Reactor de Oak Ridge National Laboratory,79 Small-angle de dispersión para biología estructural – expansión de la frontera, evitando las trampas,72 y estudios de dispersión de ángulo pequeño de macromoléculas biológicas en solución. 80 el neutrón dispersión científico también puede discutir configuraciones de instrumento actuales y los parámetros óptimos para un sistema dado. Por ejemplo, datos en Q inferior (que es una función de la longitud de onda dispersión ángulo y neutrón) se desea generalmente para sistemas más grandes. La configuración más común de instrumento Bio-SANS proporciona una Qmin de 0.003 Å-1 y es adecuado para grandes complejos de proteínas hasta cientos de kDa. Una solución que contiene 3 mg mL-1 de proteína de la membrana de un tamaño aproximado de 30 kDa (monómero) de micelas contraste emparejado con 48,5% D2O en la solución requiere un tiempo de medición típica alrededor de 8 horas cada celda vacía (24, muestra y tampón horas = 1 día de total). Tiempos de medición del instrumento en una condición de contraste dado pueden ampliarse aproximadamente según el producto de masa molecular de la partícula de la dispersión y la concentración. Sin embargo, las partículas de dispersión deberán medirse en condiciones no-que obran recíprocamente, incluyendo cualquier agregación de la proteína no específica, que pone un límite superior práctico en la concentración de la muestra. Medidas de una hora poner límites sobre la estabilidad de ciertas proteínas. Afortunadamente, SANS las mediciones se puede hacer rutinariamente a temperaturas refrigeradas para mejorar el tiempo de vida de la proteína, y el empleado haz de neutrones de baja energía no causa ningún daño de la radiación durante la medición.

En este manuscrito se presentan un resumen de este proceso y determinación de muchos factores clave hacia la exitosa grabación de la dispersión de neutrones de una muestra medida en el punto de partida de contraste del detergente. Esto incluye el paso crítico para obtener a una coincidencia completa del detergente agregada mediante el diseño de una mezcla de detergente con un contraste de neutrón uniforme entre el grupo de cabeza detergente y componentes de la cadena alquil. Las mediciones en este punto partido detergente proporcionan un perfil de dispersión atribuido a sólo la proteína de la membrana del interés y permitió ab initio ensobrado que representa la proteína de la membrana a ser reconstruido a partir de los datos. El análisis de datos y ab initio modelado protocolos también demuestran la potencial información obtenida de tales investigaciones, que podrían abordar la estructura general, los cambios conformacionales, los Estados, entre otros. Una limitación es que hasta la fecha solamente muy pocos detergentes disponibles comercialmente con las substituciones del deuterio. 19

Mientras que perdeuteration puede no ser necesario, en este caso el objetivo debe ser conseguir una proteína con > 65% deuterio etiquetado en la proteína. Como alternativa, si selectivamente deuterados detergente con colas y grupos cabeza está disponible y el CMP de la micela detergente se produce cerca de 100% D2O y contraste suficiente de la proteína puede lograrse sin necesidad de etiquetado de deuterio. Determinar el nivel de grado de deuteración apropiada de la proteína para lograr suficiente dispersión cuando se mide en el punto de partido de contraste del detergente. Existen numerosos problemas asociados con la expresión de la proteína de membrana y purificación,81 que permanecen más allá del alcance de este artículo. Desafortunadamente, altos niveles de deuteración actualmente no son (todavía) posibles para los sistemas eucarióticos. Mientras que nos damos cuenta que esto es una limitación para algunas proteínas eucariotas, la mayoría de las proteínas de membrana tienen ortólogos bacteriana para que este método es conveniente.

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Disclosures

Los autores Volker S. urbano, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss y Ryan C. Oliver son contratados a través de UT-Battelle con nosotros DOE para apoyar el programa de usuario de ciencia de neutrones y Bio-sin instrumentos en el laboratorio nacional de Oak Ridge en este artículo.

Este manuscrito ha sido co-escrito por UT-Battelle, LLC, bajo contrato DE-AC05-00OR22725 con el nosotros Departamento de energía (DOE). El gobierno estadounidense mantiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el gobierno estadounidense mantiene una licencia no exclusiva, liberada, irrevocable, en todo el mundo para publicar o reproducir el formulario publicado de este manuscrito o permitir otros a hacerlo, para fines del gobierno de Estados Unidos. DOE proporcionará acceso público a estos resultados de la investigación patrocinada por el gobierno federal según el Plan de acceso público DOE. 82

Acknowledgments

La oficina de biológicos y la investigación ambiental apoyan la investigación en el centro del ORNL para Biología Molecular estructural (CSMB) y Bio-SANS utilizando el apoyo de la división de instalaciones de usuario científica, oficina de ciencias básicas de energía, del Departamento de la energía. Trabajo estructural en las proteínas de membrana en el laboratorio de Lieberman ha sido apoyado por los NIH (DK091357, GM095638) y NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

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