Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol laat zien hoe een model met een lage resolutie ab initio en structurele details van een wasmiddel-ontbindend membraan eiwit in small-angle neutron scattering met contrast-matching van het detergent oplossing te verkrijgen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oliver, R. C., Naing, S. H., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De biologische small-angle neutron scattering instrument bij de High-Flux isotoop Reactor van Oak Ridge National Laboratory is gewijd aan het onderzoek van biologische materialen, verwerking biobrandstoffen en bio-geïnspireerde materialen ter bekleding van nanometer te micrometer lengte schalen. De methoden die hier gepresenteerd voor het onderzoek van de fysische eigenschappen (dat wil zeggen, de grootte en vorm) van membraaneiwitten (hier, MmIAP, een intramembrane aspartyl protease vanaf Methanoculleus marisnigri) in oplossingen van micel-vormende wasmiddelen zijn zeer geschikt voor deze small-angle neutron scattering instrument, onder anderen. Andere biofysische karakterisering technieken worden belemmerd door hun onvermogen om aan te pakken van het wasmiddel bijdragen in een complexe structuur van de proteïne-wasmiddel. Daarnaast biedt toegang tot de Bio-Deuteration Lab unieke mogelijkheden voor de voorbereiding van grootschalige teelten en uiten van deuterium-geëtiketteerden eiwitten voor verbeterde verstrooiing signaal van het eiwit. Terwijl dit techniek biedt geen structurele details in hoge resolutie, de structurele kenniskloof voor membraaneiwitten bevat vele adresseerbare onderzoeksgebieden zonder in de buurt van de atomaire resolutie. Bijvoorbeeld, deze gebieden bepaling van oligomere Staten, complexvorming, conformationele wijzigingen tijdens perturbation, en vouwen/ontvouwen evenementen te omvatten. Deze onderzoeken kunnen gemakkelijk worden bereikt door de toepassingen van deze methode.

Introduction

Membraaneiwitten worden gecodeerd door een naar schatting 30% van alle genen1 en vertegenwoordigen een grote meerderheid van de doelen voor de moderne geneesmiddelen. 2 deze eiwitten voeren een breed scala van vitale cellulaire functies,3 maar ondanks hun overvloed en belang — vertegenwoordigen slechts ongeveer 1% van de totale structuren die zijn neergelegd in de voor structurele Bioinformatics (RCSB) eiwit Collaboratory onderzoek Gegevens Bank. 4 vanwege hun gedeeltelijk hydrofobe aard, structurele bepaling van membraan-gebonden eiwitten is buitengewoon uitdagende. 5 , 6 , 7

Zoals vele biofysische technieken monodispers deeltjes in oplossing voor meting vereisen, isoleren van membraaneiwitten van inheemse membranen en het stabiliseren van deze eiwitten in een oplosbare nabootsen van de inheemse membranen geweest een actief gebied van het onderzoek in de afgelopen decennia. 8 , 9 , 10 deze onderzoeken hebben geleid tot de ontwikkeling van vele nieuwe amfifiele samenstellingen aan membraaneiwitten, zoals nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 solubilize en amphipols. 16 , 17 het gebruik van detergenten micellen blijft echter een van de meest voorkomende en eenvoudige manieren om te voldoen aan de eisen van de oplosbaarheid van een bepaald eiwit. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 helaas geen enkele wasmiddel of magische mengsel van detergentia momenteel bestaat die voldoet aan alle membraaneiwitten; Dus, deze voorwaarden moeten empirisch worden gescreend voor de unieke vereisten van elke proteïne. 26 , 27

Detergentia monteren zelf in oplossing boven hun kritische micel concentratie aan statistische structuren vorm genaamd micellen. Micellen zijn samengesteld uit vele wasmiddel monomeren (meestal variërend van 20-200) met hydrofobe alkyl-ketens vormen een micel kern en hydrofiele kop groepen gerangschikt in een micel shell laag geconfronteerd met de waterige oplosmiddelen. Het gedrag van detergentia en micel vorming is klassiek beschreven door Charles Tanford in The hydrofobe Effect,28 en maten en vormen van micellen van veelgebruikte detergentia in membraan eiwit studies zijn gekenmerkt met behulp van kleine-hoek verstrooiing. 29 , 30 wasmiddel organisatie over membraaneiwitten is ook onderzocht, en de vorming van eiwit-wasmiddel complexen (PDC's) met wasmiddel moleculen rond het eiwit in een rangschikking die lijkt op het keurige wasmiddel wordt verwacht micellen. 31

Een toegevoegd voordeel bij het gebruik van detergentia is dat de resulterende micel eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd door de integratie van andere detergentia. Veel detergenten vertonen ideale mengen, en selecteer Eigenschappen van gemengde micellen kunnen zelfs worden voorspeld op grond van de onderdelen en de verhouding van het mengen. 22 echter de aanwezigheid van wasmiddel kan nog presenteren uitdagingen voor biofysische karakterisaties door bij te dragen aan de algehele signaal. Bijvoorbeeld met x-stralen en lichtverstrooiing technieken is signaal van wasmiddel in de PDC vrijwel niet te onderscheiden van eiwit. 32 onderzoeken met single-deeltje cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) meestal rekenen op gevangen (bevroren) deeltjes; structurele details van het eiwit zijn nog steeds verduisterd door bepaalde wasmiddelen of een hoge concentratie van wasmiddel die wordt toegevoegd aan de achtergrond. 33 alternatieve benaderingen naar het interpreteren van de volledige structuur van de PDC (met inbegrip van het wasmiddel) zijn aangebracht door middel van computationele methoden die willen reconstrueren het wasmiddel rond een bepaald membraan eiwit. 34

Voor het geval van neutronen verstrooiing produceert de rangschikking van de kern-shell van wasmiddel in de micel een form-factor die tot de waargenomen verstrooiing bijdraagt. Gelukkig, kunnen oplossing onderdelen worden gewijzigd, zodat ze niet aan de netto waargenomen verstrooiing bijdragen. Dit proces van "contrast overeenkomende" wordt bereikt door het vervangen van deuterium voor waterstof te bereiken een verstrooiing lengte dichtheid die overeenkomt met de achtergrond (buffer). Een verstandige keuze van wasmiddel (met beschikbare Halfzwaar tegenhangers) en hun verhouding van mengen moeten worden beschouwd. Voor detergentia micellen, kan deze vervanging worden uitgevoerd met een sopje met dezelfde hoofd groep maar met een Halfzwaar alkylketen (d-staart in plaats van h-staart). Aangezien de detergentia goed gemengd zijn,35 hun aggregaten zal een soortelijke massa hebben verstrooiing lengte die is de mol-fractie gewogen gemiddelde van de twee componenten (h vliegengordijn en d vliegengordijn). Wanneer dit gemiddelde contrast consistent met die van de hoofd groep is, kunnen de uniforme statistische structuren gekoppeld worden volledig als u wilt verwijderen van alle bijdragen aan waargenomen verstrooiing.

Wij presenteren hier een protocol om te manipuleren het neutron contrast van wasmiddel micellen door integratie van chemisch identiek wasmiddel moleculen met deuterium-geëtiketteerden alkyl ketens. 19 , 36 , 37 dit toestaat volledige gelijktijdige contrast matching van micel kern en shell, dat een unieke mogelijkheid van neutronen verstrooiing is. 35 , 38 met deze aanzienlijk verfijnd detailniveau, contrast bijpassende kunnen anders onhaalbaar studies van membraan eiwit structuren. Bovendien, kan deze contrast-matching aanpak worden uitgebreid naar andere systemen waarbij wasmiddel, zoals polymeer uitwisseling reacties39 en olie-water dispergeermiddelen,40 of zelfs andere solubilizing agenten, zoals bicelles,41 nanodiscs,42 of blok copolymeren. 43 A vergelijkbare aanpak zoals omschreven in dit manuscript, maar het tewerkstellen van een enkele wasmiddel soorten met gedeeltelijke deuterium substituties op de alkyl-keten en/of hoofd-groep, werd onlangs gepubliceerd. 37 terwijl dit verwacht kan worden dat de willekeurige verdeling van waterstof en deuterium gedurende het wasmiddel verbeteren ten opzichte van de hier gepresenteerde benadering het beperkte aantal beschikbare posities over het wasmiddel voor vervanging en in twee stappen wasmiddel synthese vereist poses extra uitdagingen voor behandeling.

Stap 1 en 2 van het protocol hieronder vaak overlappen omdat eerste experiment plannen gebeuren moet een kwaliteit wijzigingsvoorstel in te dienen. Indiening van het voorstel is echter hier als de eerste stap om te benadrukken dat dit proces ruim van tevoren een neutron experiment moet worden gestart. Ook opgemerkt moet worden dat een vereiste stap, die moet worden aangetoond door het voorstel, is dat de biochemische en fysische karakterisering (met inbegrip van de zuiverheid en stabiliteit) van het monster ter ondersteuning van de noodzaak van studies van de neutron. Een algemene discussie van small-angle neutron verstrooiing (SANS) valt buiten het bestek van dit artikel. Een korte maar grondige inleiding is beschikbaar in het referentiewerk Karakterisering van materialen door Kaufmann,44 en een leerboek gericht op biologische kleine-hoek totaaloplossing verstrooiing is onlangs verschenen. 45 meer aanbevolen lectuur wordt verwezen in de sectie discussie. Kleine hoek verstrooiing gebruikt de zogenaamde verstrooiing vector Q als het centrale aantal dat het proces van de verstrooiing beschrijft. Dit artikel maakt gebruik van de algemeen aanvaarde definitie Q = 4π zonde (θ) / λ, waar θ de helft van de hoek tussen inkomende en verspreide lichtbundel en λ is de golflengte van de neutronenstraling in Angstroms is. Andere definities bestaan dat gebruik verschillende symbolen zoals de ' voor de verstrooiing vector, en die verschillen kunnen met een factor 2π of met behulp van nanometer in plaats van Angstrom (Zie ook bespreking van Figuur 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding en indiening van een Neutron faciliteit Beam tijd en een Instrument voorstel

  1. Raadpleeg online bronnen voor het identificeren van neutronen verstrooiing voorzieningen waarmee algemene neutron lichtbundel tijd gebruikerstoegang, zoals Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Een kaart van neutron faciliteiten en informatie over neutron onderzoek wereldwijd is online beschikbaar. 46 worden zich ervan bewust dat deze voorzieningen meestal regelmatig oproepen tot voorstellen; Hiermee bepaalt u wanneer de volgende keer dat lichtbundel beschikbaar zal zijn. Neutronen zijn gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen; Zoekresultaten voor small-angle neutron scattering (SANS) instrumenten, met name die met mogelijkheden voor biologische monsters.
  2. Middelen die van de neutron faciliteiten gebruiken om te helpen navigeren het verzendproces neutron lichtbundel tijd voorstel. Neem contact op met een Neutron Scattering wetenschapper (NOD's) die is gekoppeld aan het instrument waarop u van toepassing zal zijn. Herziening van de faciliteit van het neutron actuele informatie met betrekking tot het voorstel dringt, deadlines en advies voor indiening; voor Oak Ridge is dit online beschikbaar. 47 de lichtbundel tijd voorstel volgens alle richtlijnen voor een succesvolle inzending indienen.
  3. Als Halfzwaar eiwit is vereist (zie 2.2), worden neutronen verstrooiing faciliteiten vaak ondersteund door laboratoria en expertise gewijd aan de productie van Halfzwaar materialen. Als u wilt verzoeken om toegang tot de Lab (BDL) van de Bio-Deuteration op ORNL, selecteer de BDL als het tweede instrument in het voorstel-systeem. Terwijl het voorstel van de SANS is herzien voor haalbaarheid en door een wetenschappelijke overwegingscommissie, worden BDL verzoeken alleen gescreend voor haalbaarheid. Om te helpen met de evaluatie van de haalbaarheid BDL, dienen een ingevulde informatie aanvraag formulier48 die het eiwit expressie protocol en de geschatte opbrengst beschrijft (beschikbaar online).
  4. Na succesvolle peer-review van het voorstel van de tijd van de bundel, de toegekende datum lichtbundel tijd voorafgaand aan het experiment worden bevestigd. Zorg ervoor dat alle monster en buffer gegevens en formules correct worden vermeld in het voorstel voor een goede beoordeling. Wijzigingen in de voorgestelde proefopzet, met inbegrip van wijzigingen in de samenstelling van de steekproef en buffer, eisen mededeling van de faciliteit.
    Opmerking: Wijzigingen moeten zo spoedig mogelijk met de toegewezen NSS worden besproken.

2. Bepaal Neutron Contrast Match punten en het nodige Contrast voor eiwit meting

  1. Verzamel informatie (van leverancier van productinformatie online databanken, gepubliceerde waarden, enz.) met betrekking tot de atomaire composities en volumes voor het wasmiddel systeemonderdelen contrast-gepaard gaan. Deze informatie wordt gebruikt om te bepalen van neutronen verstrooiing lengte dichtheden (SLDs) en dus contrast match punten (CMPs) in oplossing, die is van cruciaal belang voor het verkrijgen van kwaliteit SANS gegevens en structurele informatie voor het membraan eiwit van belang in de context van een PDC. Een tabel samen te vatten de fysieke eigenschappen en contrast match punten voor detergentia gebruikte in biofysische studies van membraaneiwitten is opgenomen (tabel 1).
  2. Neutron SLDs met behulp van de web-applicatie MULCh bepalen: ModULes voor de analyse van Contrast variatie gegevens49 (beschikbaar online50 -gratis). Een link naar de Gebruikershandleiding bevindt zich op de home page. Toegang tot de website en lees de begeleidende documentatie. Figuur 1 en Figuur 2 geven een overzicht van Contrast module input en output voor twee verwante voorbeelden.
    Opmerking: Andere websites voor de berekening van SLDs zijn beschikbaar, zoals degene die worden onderhouden door het National Institute of Standards and Technology (NIST) Center voor Neutron onderzoek. 51
    1. De Contrast-module openen door te klikken op 'Contrast' gelegen in het linker navigatievenster. Tekst voor de projecttitel van een opgeven en voer hieronder voor twee componenten (BV, wasmiddel hoofd groep en staart) als ' subeenheid 1' en ' subeenheid 2'.
    2. De molecuulformule voor elk onderdeel in het tekstvak 'Formule' invoeren.
      Opmerking: het keuzerondje ben ' onder 'Stof Type' moet worden geselecteerd om een moleculaire formule invoeren. Bovendien gebruiken de letter 'X' in de formule om aan te geven gemakkelijk uitwisselbaar waterstofatomen. Eiwitten, RNA of DNA sequenties kunnen worden ingevoerd als de overeenkomstige 'P', 'R', of waren ' keuzerondjes worden geselecteerd. Als meerdere exemplaren van een onderdeel binnen de subeenheid bestaan, kan de waarde voor 'Nmolecules' dienovereenkomstig worden gewijzigd. Een praktisch voorbeeld hier betreft lipide-achtige detergenten die twee identieke staarten, waardoor de formule voor een staart worden geboekt met de Nmolecules gelijk is aan 2.
    3. Geef het volume in kubieke Angstroms voor elk onderdeel in het vak onder 'Volume (Å3)'. Gebruik van de Tanford formule28 voor alkyl kettingen van lengte n, Vstaart = 27,4 + n * 26,9, geschatte staart volume berekenen, of het verkrijgen van moleculaire volumes van productinformatie verstrekt of waarden in gepubliceerd de literatuur.
    4. Voer voor de onderdelen van de buffer. Wijzigen van de 'nummer ontbonden soorten in het oplosmiddel' via het dropdownmenu toevoegen of verwijderen van rijen voor elk onderdeel van de buffer. In het geval van micel-vormende detergentia, omvatten de gratis wasmiddel monomeren als aparte buffer onderdelen van het wasmiddel critical micelle concentratie (CMC).
    5. Klik op 'Verzenden' om het neutron contrast berekeningen uitvoeren en het genereren van een resultatenpagina waarmee een tabel van verstrooiing lengte dichtheid en contrast match punten, alsmede de formules voor het bepalen van deze parameters op een bepaald percentage voor D2O in de buffer. Bekijk de verstrooiing parameters met bijzondere aandacht voor de component CMPs. Als de wedstrijd punten (binnen 10% D2O lijken) en de gratis micel concentratie laag is, dan de gemiddelde CMP kan worden gebruikt voor de aanpassing van contrast het wasmiddel bijdragen. In de meeste gevallen zal de CMP van het wasmiddel hoofd groep en staart verschillen met meer dan 10-15% produceren van een kern-shell form factor in de SANS-gegevens die directe collectie van het signaal van de verstrooiing van het alleen eiwit camoufleren.
  3. Het contrast tussen wasmiddel hoofd groep en staart te beoordelen. Wanneer de wasmiddel hoofd groep en alkyl keten staart CMPs zijn niet goed afgestemd, kunnen de beschikbaarheid en de opneming van een detergens deuterium-gesubstitueerde toestaan verstrooiing lengte dichtheden van select componenten worden gemanipuleerd. In de meeste gevallen zal hiervoor vormen een gemengde micel door middel van de opneming van een identieke wasmiddel met deuterium-gesubstitueerde alkyl ketens. De toevoeging van deuterium verhoogt de verstrooiing lengte dichtheid van de kern gevormd door de staarten van alkyl keten. Het gewenste eindpunt, is in dit geval zodanig dat het hoofd groep shell CMP en de kern van de keten alkyl CMP ongeveer gelijke waarden hebben.
    1. De CMP van de detergenten micel kern te worden ongeveer gelijk is aan de CMP van de hoofd groep shell door het bepalen van de juiste verhouding van vermenging tussen h vliegengordijn en d vliegengordijn die behaalt compleet contrast matching met de hoofd groepen te verhogen. Een voorwaarde voor deze bepaling is kennis van de CMP voor een deuterium-gesubstitueerde alkyl keten staart. N-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) verkrijgbare tegenhanger is beschikbaar met alle alkyl keten waterstof vervangen door deuterium (d25-DDM). Herhaal de contrast-berekeningen die worden beschreven in stap 2.1 voor een was-staart ' in plaats van de 'h-staart'.
    2. Bereken de molverhouding van h-staart naar d-staart nodig zijn voor het contrast-matching met het hoofd groep CMP. De volgende formule kan helpen met deze bepaling:
      CMPhoofd = CMPh-tail * χh-staart + CMPd-tail * χd-tail
      waar CMP is de verstrooiing lengte dichtheid en χ is de volume-fractie voor het wasmiddel hoofd, h-staart, of d-tail onderdeel. Voor gebufferde oplossingen van DDM, opneming van 44% van het gewicht (43% door mole) van het totale wasmiddel als d25-DDM met deuterium-gesubstitueerde alkyl ketens produceert een enkele CMP in 48,5% D2O voor zowel de kop en de staart onderdelen.
  4. De mate van deuterium vervanging voor het membraan eiwit te overwegen. Voor het meten van voldoende verstrooiing signaal uit de eiwitten, moet de CMP voor het eiwit ten minste 15% D2O in oplossing uit de buurt van het wasmiddel CMP en meetomstandigheden. Het signaal toeneemt met het kwadraat van deze % verschil. Aangezien de CMP van een labelloze eiwit treedt meestal op met ~ 42% D2O in oplossing (een CMP vergelijkbaar met veel wasmiddel hoofd groepen), is deuterium-labeling van het eiwit bijna altijd een noodzaak. 52

3. express en zuiveren van de membraan proteïne van belang

  1. LB (lysogenie Bouillon) medium voor te bereiden en te groeien van Escherichia coli (E. coli) cellen herbergen een afleidbare expressie vector voor de doelgroep eiwit sequentie.
    1. Minimale media voor te bereiden. Los in de H2O of D2O, 7.0 g/L (NH4)2dus45,25 g/L Na2HPO41,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L diammoniumwaterstofcitraat waterstof, 5,0 g/L glycerol, 1,0 mL/L 20% w/v MgSO 4·7H2O en 1,0 mL/L Holme metaalsporen (0,50 g/L CaCl2·2H2O 0.098 g/L CoCl2, 0.102 g/L CuSO4, 16.7 g/L FeCl3·6H2O, 0.114 g/L MnSO4· H2O en 22.3 g/L Na2EDTA·2H2O 0.112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Voorbereiding van geschikte antibiotische voorraadoplossingen met H2O of D2O.
    3. Bereiden van een stamoplossing van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside H2O of D2O.
    4. Steriel-filter alle oplossingen in droge, steriele recipiënten met behulp van fles-top vacuüm en syringe filters met een poriegrootte 0,22 micron.
  2. Aanpassen van E. coli cellen deuterium-geëtiketteerden middellange voorafgaand aan schaal-up voor overexpressie van een Halfzwaar eiwit.
    1. Inoculeer 3 mL LB medium met een geïsoleerde kolonie van een agarplaat lysogenie Bouillon (LB) of van cellen uit een bevroren glycerol voorraad. Groeien van cellen bij 37 ° C in een schudden incubator van 250 toeren per minuut of verlaag de temperatuur tot 30 ° C of lager om te voorkomen dat de overmatige groei van de cultuur, wanneer 's nachts aan het broeden.
      Opmerking: De procedure van de aanpassing kan worden gevarieerd. 55 , 56 , 57
    2. Zodra de LB-cultuur is uitgegroeid tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van ~ 1, Verdun het 1:20 in 3 mL H2O minimaal medium en groeien tot een OD600 ~ 1. Herhaal de 1:20 verdunnen met minimaal medium met 50, 75 en 100% D2O (of tot het gewenste D2O percentage).
      Opmerking: als de D2O inhoud wordt verhoogd, de groei zal afnemen. De relatie tussen het percentage2O D in de groei media en deuterium substitutie in het eiwit is gemeld in de literatuur. 58 , 59 , 60
    3. Blijven groeien van de cultuur in een bioreactor te verhogen van het rendement van Halfzwaar cel massa (Figuur 3).
      Opmerking: Stapsgewijze procedures voor het bioreactor operatie hebben elders onderzocht. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Oogst en lyse cellen van E. coli voor membraan extractie en eiwit zuivering
    1. Pellet de cellen door centrifugeren bij ~ 6.000 x g gedurende ~ 30-45 min bij 4 ° C.
    2. De cel pellet verzachten door onderdompelen in buffer op ijs voor ~ 30 min. Vervolgens voorzichtig resuspendeer de pellet cel in buffer door zachtjes pipetteren met een serologische Pipetteer, of zachte wiegen op een 2D rocker, om een eindconcentratie van ~ 1 g natte cel massa/10 mL buffer.
      Opmerking: een buffer voorbeeld is 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur), pH 7.5, 200 mM NaCl aangevuld met een tablet protease inhibitor van de omwenteling.
    3. Lyse geresuspendeerde cellen met drie passeert een hogedruk homogenizer op 10.000 psi tijdens het koelen van de uitstroom.
      Opmerking: Afhankelijk van de vereiste schaal, is het andere lysis methodes gebruikt (bijvoorbeeld door de Franse pers of ultrasoonapparaat) mogelijk.
    4. Pellet cel puin door centrifugeren bij ~ 4000-5000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap totdat het supernatans wordt verduidelijkt.
    5. Ultracentrifuge (~ 150.000 x g gedurende 30-45 minuten) de bovendrijvende vloeistof uit de voorgaande stap, waarin de oplosbare en membraan breuken. De pellet na ultracentrifugatie de breuk van het membraan bevat.
    6. Resuspendeer de pellet membraan in een grote Dounce homogenizer en isoleren van de membraan-fractie opnieuw door ultracentrifugatie (stap 3.3.5). Herhaal deze stap ten minste eenmaal Schakel losjes afhankelijke eiwitten.
    7. Solubilize membranen door het zachte wiegen voor ~ 30 min bij 4 ° C in een buffer met wasmiddel geschikt voor zuivering. Solubilisatie blijkt wanneer de opschorting van helder transparant verandert. Onoplosbaar materiaal verwijderen door ultracentrifugatie (~ 150.000 x g voor 30-45 min).
      Opmerking: Een voorbeeld-buffer is 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazool en 4% (m/v) DDM voor zuivering door Ni2 + chromatografie van de affiniteit.
  4. Het zuiveren van het eiwit volgens een protocol eerder ontwikkeld voor geprotoneerd vormen.
    Opmerking: Zie Naing et al. voor een voorbeeld zuivering protocol voor een hexahistidine gelabeld M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl protease (d-MmIAP). 65 de uiteindelijke opbrengst was ~ 1 mg Halfzwaar van 5 L Halfzwaar cultuur celgroei, die werd gebruikt in het experiment van SANS (Figuur 4).
  5. Wisselen de gezuiverde proteïne in de "definitieve Exchange Buffer" voor de aanpassing van contrast.
    1. Bereiden van 200 mL "Definitieve Exchange Buffer" met het juiste mengsel voor contrast matching, bijvoorbeeld20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl en 0,05% totale DDM (0.028% DDM en 0,022% d25-DDM) in 49% D2O.
    2. Een kolom uitsluiting grootte met equilibreer > 2 kolom volumes (CV) van "Definitieve Exchange Buffer" in 3.5.1 met behulp van een systeem van snelle proteïne vloeibare chromatografie (FPLC).
    3. Na het injecteren van het monster, de kolom uitvoeren en isoleren van breuken die overeenkomt met de proteïne van belang.
    4. Het concentreren van de eiwitten aan de gewenste eindconcentratie (2-5 mg/mL).
      Opmerking: Een volume van ~ 300 μL is vereist voor het vullen van een 1 mm cilindrische kwarts cuvette gebruikt voor SANS.
    5. Reserveren van een aliquoot deel van gecompenseerde buffer voor SANS achtergrond aftrekken.
      Opmerking: Het monster kan worden genomen, rechtstreeks vanuit de bereid buffer of idealiter vanuit een schone elutie breuk aan het eind van de FPLC run.

4. Maak van de laatste voorbereidingen voor Beam tijd en verzamel SANS gegevens

  1. Nadat het voorstel is aanvaard, en toegang tot de site is goedgekeurd, alle vereiste opleiding tevoren toegewezen bundel afsluiten. Het gaat hierbij om prearrival, web-based training en on-site radiologische, laboratorium, instrument-specifieke opleiding.
    Opmerking: Opleiding eisen kan dicteren voorschot aankomst voor beginnende gebruikers. Meer informatie is online beschikbaar. 66
  2. Monsters en buffers voor gegevensverzameling laden.
    Opmerking: Een overzicht van de biologische small-angle neutron scattering (Bio-SANS) instrument samplegebied milieu is afgebeeld in Figuur 5.
    1. Monsters en buffers in kwarts cellen laden. Kwarts cellen zijn verkrijgbaar bij het instrument wetenschapper of faciliteit. Gebruik gel-laden tips om toegang tot de smalle opening van de meeste monster cellen.
    2. Zorgen dat de lichtbundel sluiter is gesloten, daarna aanpak van het voorbeeldgebied milieu en plaats de quartz-cellen in de monster-wisselaar. De positie van de wisselaar monster voor elk monster cel opnemen.
    3. Controleren van het gebied en zorgen dat het pad van de lichtbundel is vrij van obstructie, dan verlaten het samplegebied van milieu en open de sluiter van de lichtbundel.
      Opmerking: Zorgvuldig volgen alle faciliteit wet- en regelgeving, alle boekingen gehoorzamen en luisteren naar advies van de wetenschapper van het instrument. Monsters kunnen niet worden verwijderd uit de bundel en gemanipuleerd na blootstelling aan de straal zonder volgende speciale voorzorgsmaatregelen. Neem contact op met een radiologische controle technicus (RCT) voorafgaand aan deze procedures.
  3. Uitvoeren van tabel scan voor automatische gegevensverzameling
    1. Bedienen van het instrument door middel van aangepaste controle LabVIEW-gebaseerde software, Spectrometer Instrument controleomgeving (SpICE). Volg de instructies voor het instrument operatie geboden door de Neutron Scattering wetenschapper. Een overzicht van de windows tabel scan operatie wordt gegeven in Figuur 6.
    2. Na het invoeren van de informatie die nodig is in de juiste gebieden, de tabel scan uit te voeren en een geautomatiseerde gegevensverzamelingsprocedure zal beginnen. Voortgang via het tabblad 'Tabel Scan Status'.

5. Verminder SANS gegevens van 2D-afbeelding naar 1D Plot

  1. Het identificeren van elk monster en buffer gegevensbestand van de nummers opgenomen scan. Elke meting zal een unieke scan-nummer worden toegewezen. Deze informatie is nuttig tijdens data reductie te identificeren van elke overeenkomstige monster en buffer-pair.
  2. MantidPlot software en Python script gebruikt voor vermindering
    1. Neutron Scattering gebruikers zijn voorzien van accountgegevens voor toegang tot hun gegevens op het externe Cluster analyse. 67 Meld u aan bij de externe analyse-Cluster en "MantidPlot" uit te voeren vanaf de opdrachtregel. Figuur 7 en Figuur 8 worden verstrekt bij de volgende stappen uit.
    2. Een vermindering van de BlockFlash2 User Script te verkrijgen van de Neutron Scattering wetenschapper (dit gebeurt meestal tijdens het experiment); Dit script is Python gebaseerde en bevat alle nodige kalibratie en schalen aanpassingen om de verstrooiing van 2D-afbeelding naar een 1D-perceel van verspreide intensiteiten als een functie van de hoek van de verstrooiing, I(Q).
    3. Open het meegeleverde gebruiker vermindering Script in MantidPlot en plaats van de overeenkomstige scan nummers of de identificatie voor de steekproef en buffer pairs in de desbetreffende lijst.
    4. Het script voor het genereren van verminderde gegevens als een tekstbestand met vier kolommen (kolomvolgorde is Q, I(Q), I(Q) error fout,, Q fout) op de opgegeven locatie. De passende werkruimte in MantidPlot vlak tikken en uitgezocht "Plot met fouten..." voor een eerste onderzoek van de verstrooiing profielen.

6. het analyseren van gegevens voor structurele Parameters van het deeltje verstrooiing

  1. Het verminderde gegevensbestand van de analyseserver overbrengen naar een lokale computer met behulp van beveiligde FTP-bestandsoverdracht. Dit kan worden uitgevoerd met het gebruik van software zoals FileZilla of CyberDuck. Aanvullende instructies en details voor het aansluiten op het bestandssysteem van analyse server vindt u op de inlogpagina van analysis.sns.gov.
  2. Download de ATSAS software suite65,68 (hele ATSAS suite). 69 70 van de afzonderlijke programma's zijn ook online beschikbaar voor het analyseren van de gegevens van de SANS, namelijk het vaststellen van structurele parameters en ab initio modellen.
    Opmerking: Er zijn vele opties beschikbaar voor SANS data-analyse van biomacromoleculen. 45
  3. PRIMUS71 gebruiken voor gegevens uitzetten, schalen en aftrekken en Guinier analyse van de buffer.
    1. Start de ATSAS 'SAS Data-analyse' toepassing en laden de beperkte gegevens bestanden overeenkomt met de monster en buffer-pair.
      1. Om de buffer op de juiste schaal, selecteer een gegevensbereik bij hoge Q (Q > 0,5 Å-1) waar beide profielen zijn vergelijkbaar en plat, en klik op de knop 'Schaal' onder de 'operaties' tab. Een schaalfactor zal worden toegepast op de buffer, zodanig dat deze twee vlakke gebieden moeten overlappen. Wees voorzichtig: moet er een fysieke plausibele reden die schalen van de intensiteit van de buffer rechtvaardigt zodat deze overeenkomen met het monster. Als het verschil groot, raadpleegt u een instrument wetenschapper voor geldige approaches to achtergrond aftrekken. 44 , 45 , 72
      2. Vergroot het bereik van de gegevens te bekijken van alle punten. Klik op 'Aftrekken' als deze bewerking wilt uitvoeren. De buffer-afgetrokken datafile in de legenda rechts klikken en opslaan van dit bestand voor latere analyse. Figuur 9 een overzicht van het gebruik van het tabblad 'Activiteiten'.
    2. Een analyse van de Guinier van de buffer-afgetrokken voorbeeldgegevens met behulp van het tabblad 'Analyse' van de 'SAS Data-analyse' toepassing uitvoeren.
      1. Controleer of dat het juiste bestand is geselecteerd in de lijst en klik op 'Radius van Gyration'. Een automatische poging voor het uitvoeren van een Guinier past zal worden verstrekt door te klikken op de knop 'Autorg'.
      2. Uitbreiden van het bereik met gegevens die alle van de lage-Q-gegevens bevatten en beginnen het gegevensbereik vernauwing door high-Q punten weg te nemen tot de Qmax * Rg limiet is onder 1.3. De plot van storingswaarden gebruiken om te controleren of gegevens lineair in de fit bereik. De Guinier past levert een geschatte Rg en I0 voor de verstrooiing deeltjes.
      3. Kleine aanpassingen aan de fit regio en controleren van de gevoeligheid van deze waarden aan het bereik van de gegevens die worden gebruikt in de pasvorm. Figuur 10 bis aantoont het gebruik van het hulpprogramma 'Radius van Gyration'.
  4. Verkrijgen van de verdelingsfunctie (P(r)) in GNOM. 73 de output bestand gegenereerd hier zal worden gebruikt als input voor de ab initio modelleren proces.
    1. Start de Wizard distributie afstand binnen de 'Analyse' tab. verkrijgen van een goede pasvorm aan de gegevens is essentieel voor het verkrijgen van een kwaliteit-model. Voor meer informatie over het verkrijgen van nauwkeurige past, Raadpleeg de beoordeling74 door Putnam, et al..
      Opmerking: The GNOM programma bevat aanvullende informatie over de pasvorm dan de afstand Distribution Wizard. Cijfer 10B toont juist gebruik van het hulpprogramma 'Afstand verdeling', en Figuur 11 illustreert enkele van de gemeenschappelijke fouten die zijn opgetreden.
    2. Bepalen Dmax, de maximumafstand van de interatoom binnen het molecuul.
      1. Een waarde voor Dmax schatten door het vak wilt afdwingen Rmax unchecking = 0 en een hoge waarde in te voeren voor Dmax (150 Å, bijvoorbeeld). De eerste x-snijpunt in de plot van P(r) levert deze raming.
      2. Incrementele wijzigingen aan deze Dmax-waarde en het bereik van de gebruikte gegevens of aantal punten gebruikt in de pasvorm voor het optimaliseren van de GNOM passen tot de gegevens en de resulterende P(r)-curve.
    3. Blijven verfijnen de GNOM pasvorm en slaat de GNOM-uitvoerbestanden met goede fit parameters voor latere ab initio modellering stappen.
  5. Simuleren SANS profielen van hoge resolutie VOB modellen met behulp van het programma CRYSON. 75
    1. Open het programma en selecteer optie '0'. Selecteer de naam van het VOB-bestand in de pop-up file browser. Druk op enter om de standaardinstellingen, met uitzondering van keten deuteration breuken en de Fractie van D2O opgeven in het oplosmiddel te bereiken van de juiste contrast parameters te accepteren.
    2. Past het model aan een experimentele gegevensset door het invoeren van 'Y' en het gegevensbestand in de pop-up file browser te selecteren. De overige standaardwaarden accepteren en uitvoerbestanden zal worden geschreven in de locatie van de VOB-bestanden. Het bestand '.fit' bevat informatie voor het profiel van de voorspelde verstrooiing van het hoge resolutie 3D-model.

7. Maak Ab Initio modellen van de SANS gegevens.

Opmerking: DAMMIF76 en77 binnen de ATSAS softwaresuite DAMMIN is gebruikt om te reconstrueren dummy atoom modellen (dammen) met behulp van een gesimuleerde onthardende proces van de GNOM uitgang, die gegevens bevat die P(r), of informatie over de waarschijnlijkheid of frequentie van interatoom afstanden binnen het deeltje verstrooiing. Deze programma's kunnen worden uitgevoerd in de batchmodus of op de ATSAS-Online webserver.

  1. De PRIMUS vorm Wizard starten via de knop 'Dammif' op het tabblad 'Analyse' van 'SAS Data Analysis', en gebruik een handmatige selectie van parameters. De ingang voor de wizard wordt geïllustreerd in Figuur 12.
    1. Definieer de Guinier variëren van de pasvorm (stap 6.3.2) en gaat u verder met de volgende stap met behulp van de navigatieknoppen. Definieer fit waarden uit de P(r) plot (stap 6.4) en gaat u verder met de volgende stap.
    2. Parameters voor de ab initio modelleren proces bieden. Typ een voorvoegsel voor de bestandsnamen van de uitvoer van het model (bijvoorbeeld SANSEnvelope), Kies ofwel 'snelle' of 'slow' modus modellering, voer een waarde voor het aantal modellen (17 aanbevolen voor statistische significantie), selecteren uit de beschikbare opties voor deeltje symmetrie, anisometry en hoekige schaal (indien bekend). Zorg ervoor dat de vakken worden gecontroleerd tot gemiddelde modellen met DAMAVER en verfijnen van het uiteindelijke model met DAMMIN.
    3. Het proces met behulp van de 'commit'-knop starten. Zodra het proces voltooid is, bekijken en opslaan van de werkmap.
      Opmerking: de typische modelleren proces voor een enkele, kleine eiwit kan duren een paar uur met een doorsnee personal computer. Bestanden worden opgeslagen in tijdelijke mappen totdat opgeslagen.
  2. Overlay en superponeren de finale SANS envelop met een verwante high-resolution model met behulp van SUPCOMB binnen ATSAS. Plaats een kopie van de hoge resolutie VOB-model te passen aan de SANS-envelop in de werkmap. SUPCOMB uitvoeren vanaf de opdrachtregel met behulp van de VOB-bestandsnamen als twee argumenten met de structuur van de sjabloon bovenaan: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Opmerking: De tweede bestandsnaam vermeld zal worden herschreven als een nieuw bestand met een 'r' toegevoegd aan het einde en hebben nieuwe coördinaten voor superpositie op de structuur van de sjabloon.
  3. Visualiseer de ab initio modelresultaten PyMOL (pymol.org), een programma voor het bekijken van 3D moleculaire grafische gebruiken. Figuur 13 biedt een overzicht van de bewerkingen PyMOL.
    Opmerking: Er zijn publicatie richtlijnen voor structurele modelleren van kleine-hoek verstrooiing gegevens van biomoleculen in oplossing. 78
    1. Lanceer de toepassing PyMOL en open de .pdb bestanden overeenkomt met de 3D SANS envelop en de SUPCOMB uitgelijnde high-resolution structuur worden bekeken.
    2. Visualiseer de SANS-envelop door dit model als een oppervlak vertegenwoordigen. Klik op de 'S' knop naast het model en kies ' Toon: als: oppervlak '.
    3. De structuur van de ruggengraat eiwit met een hoge resolutie visualiseren door dit model als een cartoon vertegenwoordigen. Selecteer de 'S' knop naast dit model en kies ' Toon: als: Cartoon'. De keten als een regenboog van N - tot C-terminus weergeven door op de knop 'C' en ' door keten: Chainbows'.
    4. Het wijzigen van de transparantie van de oppervlakte vertegenwoordiging voor de duidelijkheid. Selecteer in de menubalk van de 'Setting', ' transparantie» oppervlak» 40% '.
    5. Maak de achtergrond wit en niet-dekkend. Selecteer in de menubalk 'Display', ' achtergrond»' en selecteer 'Opaque' uit te vinken deze optie en 'Witte' ter gelegenheid van deze kleur voor de achtergrond.
      Opmerking: extra bewerkingen en gebruik voor PyMOL vindt u op PyMolWiki.org.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een lichtbundel tijd en instrument voorstel moet duidelijk overbrengen van alle informatie die nodig is aan de Commissie ter beoordeling zodat een geldige van de voorgestelde experiment kunnen worden beoordeeld. Communicatie met een NSS is zeer aanbevolen voor onervaren gebruikers. De NSS kan beoordelen eerste haalbaarheid en gids voorstel indienen om te benadrukken van de haalbaarheid, veiligheid en het potentieel voor hoge impact wetenschap. De informatie in het voorstel moet bevatten achtergrondinformatie en context voor het belang van het onderzoek; kennis die wordt verondersteld te winnen en hoe dit van invloed op de huidige kennis op het aanverwante gebied van de wetenschap; een beschrijving van het werk, monsters, methoden en procedures die zullen worden ingezet; en, indien van toepassing, vorige productiviteit van het team bij de faciliteit, met inbegrip van relevante publicaties en resultaten. Nuttige middelen, zoals voorstel sjablonen en tips voor het voorbereiden van het voorstel, zijn beschikbaar voor gebruikers via de Neutron Science User Portal (neutrons.ornl.gov/users).

Planning van het experiment is een dynamisch proces dat vaak begint tijdens de eerste stadia van de indiening van het voorstel, maar niet volledig tot vlak voor het experiment kan worden opgevat. Echter Houd er rekening mee dat wijzigingen die aanzienlijk van de beschrijving in het voorstel afwijken (met inbegrip van wijzigingen in de buffer voorwaarden of de samenstelling van de steekproef) moeten worden goedgekeurd door de faciliteit voorafgaand aan de start van het experiment.

Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat een methode voor het uitdrukken en het zuiveren van het membraan eiwit van belang in wasmiddel micellen in oplossing is succesvol gebleken. Het membraan eiwit van belang is in dit geval een intramembrane aspartyl protease (IAP), die heeft een gevestigde zuivering protocol en heeft eerder vastgesteld oplosbaar en actief in de buffer met DDM micellen.

Hier tonen we neutron contrast cristalloïden de MULCh: Contrast module voor een oplossing van IAP eiwitten in contrast-matched gemengd DDM / d25-DDM micellen. De hierin beschreven strategie was eerst bepaalt de mate van het mengen tussen de twee detergentia die nodig is om een volledige contrast match van de micel. Het eindresultaat was om te bepalen van de relatieve contrast van elke component en de achtergrond (H2O/D2O ratio) moet contrast-match de verstrooiing van wasmiddel om alleen het eiwit verstrooiing observeren.

Figuur 1 toont een juiste input voor de MULCh Contrast-module en de daaruit voortvloeiende output voor contrast berekeningen van de DDM wasmiddel hoofd groep en de staart als subeenheden 1 en 2, respectievelijk. De formule gebruikt voor de hoofd groep is C12H14X7O11 met een volume van 348 Å3en de alkyl formule voor de staart van de keten wordt gegeven als C12H25 met een volume van 350 Å3.

Het blijkt uit de Contrast module output dat de DDM hoofd groep en staart verschillende verstrooiing lengte dichtheden hebben, en dus contrast tussen deze twee onderdelen worden nageleefd. Voor DDM hebben het hoofd groepen een CMP in 49% D2O terwijl de alkyl keten staarten hebben een CMP in 2% D2O, met hun gemiddelde CMP die zich voordoen in 22% D2O. Het doel van de volgende stap zal dus voor het ontwerpen van een gemengde micel waarin deuterium-gesubstitueerde alkyl ketens te verhogen van de gemiddelde CMP van het wasmiddel staarten zodat deze overeenkomen met de CMP van de hoofd groepen. De contrast-berekening werd herhaald voor een gesubstitueerde wasmiddel, DDM met een volledig-Halfzwaar staart (d25-DDM), waardoor ook in tegenstelling tussen de hoofd-Fractie en de staart. Echter contrast waarden van de h-staarten en d vliegengordijn aanzienlijk verschillen. Herinneren dat wasmiddel mengsels staan bekend om goed gemengde micellen in oplossing,22 dus een mix van deze h en d-vliegengordijn in de micel kern een gemiddelde SLD gelijk is aan die van het hoofd moet produceren groep shell, een micel met één CMP oplevert. Aangezien de hoofd groep voor DDM zowel d25-DDM geldt, is de strategie het vinden van een mengsel van deze detergentia die produceert een gemiddelde contrast waarde uit de gemengde staarten die overeenkomt met het contrast van de hoofd groepen.

De doel-gemiddelde CMP voor het wasmiddel tails is die van de maltoside hoofd groepen, of 49% D2O. Voor het inschatten van de verhouding van de gemiddelde CMP van elke component h-staart en d-tail mengen moeten bekend zijn. Deze waarden voor sommige gemeenschappelijke detergentia en verkrijgbare deuterium geëtiketteerd tegenhangers vindt u in tabel 1. Deze CMP-waarden voor DDM en d25-DDM gebruiken, de molaire fractie van h vliegengordijn en d vliegengordijn die voldoet aan de vergelijking waarin stap 2.2 is χd vliegengordijn = 0,43.

Figuur 2 toont een meer geavanceerde input voor de MULCh Contrast-module die kan worden gebruikt om te bevestigen de definitieve gemengd-micel contrast wedstrijd voorwaarden en bepalen de mate van deuteration op het eiwit nodig. Hier, verwijst subeenheid 1 naar de contrast-matched gemengde micel met 2 componenten en DDM d25-DDM, terwijl subeenheid 2 naar de M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl protease (MmIAP verwijst) gegeven door haar aminozuur opeenvolging. De SLD van het eiwit heeft al verheven door expressie in Halfzwaar groei media aan opbrengst een CMP voor de proteïne in buffer met ~ 92% D2O. De mate van scheiding tussen het eiwit van match punt in 92% D2O en de meting voorwaarde (48,5% D2van O) suggereert dat voldoende verstrooiing signaal zal worden verkregen van het eiwit.

Productie van d-MmIAP werd uitgevoerd met Rosetta 2 E. coli cellen herbergen van de pET22b-MmIAP-vector. Minimaal medium met labelloze glycerol in 90% D2O werd geselecteerd als het groeimedium. Na aanpassing aan de 90% D2O minimaal medium, het volume van de cultuur was geschaald tot 400 mL en gebruikt om te enten 3,6 L van verse 90% D2O minimaal medium in een 5.5 L bioreactor schip.

Figuur 3 biedt een spoor van de waarden van het proces tijdens de teelt van de fed-batch. Op het moment van de inenting, de temperatuur instelpunt was 30 ° C, het gehalte aan opgeloste zuurstof (DO) set punt was 100%, de agitatie instelpunt was 200 rpm en het debiet van perslucht was 4 L/min. De pH-waarde werd boven de punt van een set van 6,9 met behulp van een 10% w/v oplossing van natriumhydroxide in 90% D2O. gehouden Eenmaal de Prikker gesignaleerd uitputting van de eerste 5 g/L van glycerol voeding (30% w/v glycerol, 0,2% MgSO4 in 90% D2O) is gestart, die voortgezet gedurende de teelt. Na ongeveer 7 uur voeden, de temperatuur van cultuur werd teruggebracht tot 18 ° C en isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside is toegevoegd aan een eindconcentratie van 1 mM. Bij het oogsten van de cultuur, werd ongeveer 145 g versgewicht van cel plakken verzameld via centrifugeren (6.000 x g voor 45 min)

Zuivering van d-MmIAP ging wat betreft het enzym geprotoneerd behalve dat enzym opbrengst aanzienlijk lager was en definitieve zuiverheid iets lager dan typische was. Vanaf 5 L, ~ 20 g van natte membranen werd geïsoleerd, die allemaal was ontbindend in DDM voor zuivering en geladen op de eerste Ni2 + affiniteit kolom. Zuivering rendement maximaliseren, was de breuk doorstroomtest verdund en opnieuw opnieuw op Ni2 + affiniteit kolom. De procedure werd een derde keer polijsten van het geconcentreerde d-MmIAP monster herhaald door grootte uitsluiting chromatografie (Figuur 4).

Figuur 5 toont een kwarts monster cel en haar verwante monster wisselaar setup. Monster omgevingen worden beheerd door de Bio-SANS productieteam en NSS. Een scala aan verschillende omgevingen kan geregeld worden met temperatuurregeling, controle van de vochtigheid, mechanische tumbling, hoge temperatuur en aanhoudende druk, onder andere metingen uit te voeren.

Figuur 6 toont Bio-SANS operaties en uitvoering van de geautomatiseerde tabel scant. De tabel scan is zodanig geconfigureerd dat deze intuïtief en gebruiksvriendelijk. Op het eerste tabblad (Load Samples), wordt informatie verstrekt over de steekproef wisselaar en installatie, zoals identificatie van monsters op elke positie in het monster wisselaar, cel diktes en monster type (open lichtbundel, monster, achtergrond, enz.). Extra metadata-codes kunnen hier ook worden toegepast. Op het volgende tabblad (Plan Experiment), worden de configuratie van het instrument en eventuele bijbehorende parameters (zoals temperatuurregeling) gedefinieerd. Deze stap wordt georganiseerd door de NOD aan het begin van het experiment. De gebruiker moet gewoon de tijd van de meting voor elk monster (in seconden) invoeren. Het laatste tabblad (uit te voeren scant) biedt een samenvatting van de tabelgegevens scan en de geautomatiseerde scan moet worden uitgevoerd.

Na de 2D verstrooiing beelden zijn geregistreerd, moet deze gegevens worden teruggebracht tot een 1D-perceel van de intensiteit versus Q - een functie van de hoek van de verstrooiing. Tijdens de data reductie, afbeelding correcties zoals pixel gevoeligheid maskers en donkere achtergrond aftreksom ook toegepast. MantidPlot-software is ontworpen om te interpreteren de raw Bio-SANS instrument gegevens. De NOD zal in het algemeen helpen verminderen en het ophalen van de laatste gegevens aan het einde van het experiment.

Figuur 7 biedt een overzicht van de externe analyse cluster toegang tot MantidPlot en het Script-venster gebruikt voor data reductie. Ruwe gegevens zijn toegankelijk op het cluster (analysis.sns.gov) van de externe analyse via UCAMS/XCAMS gebruikersverificatie. Na inloggen op de remote desktop, kan de MantidPlot-software worden gestart vanaf een terminal-venster door het simpelweg uitvoeren van 'MantidPlot' onder elk pad. Het Script-venster openen in MantidPlot en de vermindering van de BlockFlash2 User Script bewerken zoals aangegeven door de NOD. Het uitvoeren van dit script genereert de verminderde gegevensbestanden, die vervolgens kunnen worden overgedragen naar een lokale machine voor analyse met behulp van secure FTP.

Figuur 8 toont uitzetten en weergeven van de gegevens na het uitvoeren van de gebruiker vermindering Script. verminderd gegevens in het venster van de werkruimten verschijnt. Uiteindelijke samengevoegde gegevens zal hebben standaard het achtervoegsel-_f toegevoegd. Klik met de rechtermuisknop zal toestaan Plot Spectrum met fouten worden geselecteerd en de gegevens worden uitgezet. Weergavevoorkeuren worden benaderd door voorkeuren in de menubalk 'Beeld' te selecteren. Opmaak van assen en plotten bereik is gemakkelijk te bereiken door te dubbelklikken op de assen. Verstrooiing profielen van buffers, die geen verstrooiing deeltjes van significante omvang bevatten moeten worden weergegeven als een relatief platte lijn (constante intensiteit). Voor monsters, moet intensiteit worden waargenomen op lagere verstrooiing hoeken (Q) met exponentiële afname op de achtergrond van een plat onsamenhangend.

Afbeelding 9 geeft een overzicht van de correcte buffer aftrekken met behulp van het softwarepakket SAS Data-analyse (of primusqt) volgt op de vermindering van de gegevens. De onsamenhangende achtergrond (intensiteit op high-Q) is heel vaak iets mismatch tussen het monster en de buffer. Voor juiste aftrekken, moeten de gegevens in deze regio overlappen. De schaal correctie geldt een intensiteit schaalfactor voor de gegevens die in overlappende gegevens resulteert, en het aftrekken kan worden uitgevoerd. Als de schaalfactor in buffer gegevenspunten met grotere intensiteit dan overeenkomstige punten in de steekproef resulteert, zullen deze punten negatief en niet gesmolten in een logboek plot. Als negatieve waarden in het bestand buffer-afgetrokken overvloedig zijn, maak een kleine daling in de buffer schaalfactor en de aftrekking weer uitvoeren.

Figuur 10 biedt een voorbeeld gebruik van de Primus Guinier en afstand distributie Wizards. Een analyse van de Guinier biedt een voorlopige raming van de straal van de deeltjes van traagheidsstralen uit de verstrooiing van de lage-hoek-gegevens. Als gegevens aanpak nul, moet een lineaire regio aanwezig zijn in de gegevens. Montage van een regel in deze regio kan de R-g worden vastgesteld van de helling en een I0 tot worden geëxtrapoleerd uit het snijpunt van de intensiteit bij Q = 0. Een opwaartse trend in de gegevens geeft als Q nul nadert aggregatie in de steekproef, terwijl neerwaartse trends meestal indicatief van interparticle repulsions zijn. Deze trends zijn meest duidelijk wanneer de verdeling van storingswaarden niet-stochastische is. De bovengrens van de Guinier geschikt voor de bolvormige deeltjes wordt beperkt door Q * Rg < 1.3 ('s' wordt gebruikt in plaats van Q in de ATSAS-software).

De R-g bepaald voor d-MmIAP van deze Guinier fit 15,4-inch ± 1.1 Å met een geschatte was ik0 gegeven als 0.580 ± 0,001.

De afstand distributie wizard kunt systematische veranderingen moeten worden aangebracht in de parameters van de P(r) passen. De P(r)-curve is een indirecte Fourier-transformatie van de kromme aan de experimentele gegevens aanpassen. Daarom is het essentieel om te verifiëren dat de pasvorm in het linker paneel komt nauwkeurig overeen met de experimentele gegevens. Voor de pasvorm die is aangegeven in dit voorbeeld, een Dmax van 46 Å werd verkregen.

Figuur 11 ziet u veelvoorkomende fouten in Dmax selectie. Een Dmax die is vaak kunstmatig groot veroorzaakt P(r) waarden tot negatieve zoals de P(r) functie over de x-as oscilleert. Een Dmax die kunstmatig klein leidt tot een afgeknotte P(r) curve met een abrupte overgang naar Rmax = 0.

De eerste stappen in de Wizard Primus vorm zijn identiek aan de Guinier en de afstand distributie Wizards. Zodra deze informatie is verstrekt aan het verkrijgen van goed past bij de experimentele gegevens, is de ab initio model setup geconfigureerd.

Figuur 12 illustreert een juiste input voor de Primus vorm Wizard. Hier, experimentele SANS gegevens voor de IAP was voorzien van een schaal in Angstroms, en het verwachte bestand prefix "SANSEnvelope" kreeg. Een set van 17 eerste dummy atoom modellen werden gevraagd te worden gegenereerd met behulp van de modus van de "snelle" model met geen symmetrie (P1) toegepast en geen anisometry geselecteerd. De set van 17 modellen zal worden uitgelijnd, gemiddeld en gefilterd met DAMAVER, en het gemiddelde model verfijnd met behulp van DAMMIN. Inspectie van het voorvoegsel-damsel.log tekstdocument geeft een samenvatting van het selectiecriterium en eventuele modellen verwijderd uit de set. Het uiteindelijke verfijnde model werd geschreven als SANSEnvelope-1.pdb.

Het programma SUPCOMB wordt gebruikt voor het uitvoeren van een superpositie van de SANS-envelop model met de hoge resolutie model, met alleen de twee VOB structuur bestanden als invoer. Standaard is de "r" toegevoegd aan de bestandsnaam van de omgebogen en bovenliggende.

Eenmaal de SANS envelop en hoge resolutie structuur hebben bovenop geweest, deze modellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van moleculaire afbeeldingen weergeven programma. De resultaten van PyMOL zijn geschikt voor beelden van de kwaliteit van de publicatie en kunnen worden gebruikt om te benadrukken biofysische resultaten met betrekking tot de structurele onderzoek. Wij tonen hier, een paar PyMOL basisbewerkingen gebruikt 3D representaties en uitzicht op de resulterende bovenliggende structuren op te geven.

Figuur 13 geeft een overzicht van de PyMOL visualisatieproces. Zodra de VOB structuur bestanden zijn geopend in PyMOL, moeten de modellen zichtbaar in het venster PyMOL Viewer. Wijzigen van de vertegenwoordigingen van elk model met de 'S' knop naast de naam van elk bestand. Gebruik een oppervlakte vertegenwoordiging voor de SANS-envelop en een vertegenwoordiging van de cartoon van de ruggengraat van de eiwitten uit het hoge resolutie model. Selecteer een geschikte kleurenschema van opties beschikbaar zijn onder de 'C' knop. Voor eiwit kettingen biedt een "chainbow"-kleuring een kleurverloop van N - tot C-terminus op de steun van de interpretatie. Transparantie wordt toegepast op de oppervlakte vertegenwoordiging bij de betere visualisatie van de eiwitstructuur toestaan binnen de envelop. Voor publicatie afbeeldingen, wordt een witte achtergrond aanbevolen. Zodra deze visualisatie-wachtrijen zijn toegepast, kunnen de 3D structuren worden onderzocht. Manipulaties van de vooruitzichten en molecuul rotatie/vertaling kunnen worden uitgevoerd door op te klikken en te slepen van de structuur.

Figure 1
Figuur 1. Gebruik van de module MULCh Contrast om het contrast parameters voor onderdelen van dodecyl maltoside (DDM). Input waarden worden weergegeven in het venster aan de linkerkant met de latere uitvoer naar rechts. De Contrast module input pagina wordt geopend door te klikken op 'Contrast' (groen cirkeltje) van het navigatiemenu aan de linker kant van elk scherm. Invoervakken voor de titel van het project, buffer componenten en subeenheden 1 en 2 worden als zodanig geëtiketteerd. Uitvoerpagina bevatten belangrijke deeltje eigenschappen van de informatie en contrast voor het beschreven systeem. Relevante tabellen en berekende match punten hebben is boxed in oranje voor duidelijkheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Gebruik van de module MULCh Contrast om contrast parameters voor onderdelen van het membraan eiwit-wasmiddel complex. In dit geval heeft input gekregen om te beschrijven van het algehele systeem van de PDC in gebufferde oplossing. Subeenheid 1 beschrijft de contrast-matched micel samengesteld uit DDM met 43% door molletje als d25-DDM gemengd. Subeenheid 2 beschrijft het membraan eiwit, met de volgorde van de aminozuur MmIAP invoerfilter als de formule. Het deuteration niveau (groen cirkeltje) beschrijving van het eiwit de mate van deuterium vervanging, en heeft een directe invloed op de SLD en berekende wedstrijd-punt dat voor het eiwit zal worden geschat. Resultaten (oranje doos) wijzen erop dat wedstrijd-punt voor de gemengde wasmiddel in 48,5% D2O, treedt terwijl het eiwit van wedstrijd-punt bij ~ 90% D2O. optreedt Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. De bereiding van de monsters – Bioreactor trace. De proces-waarden die worden weergegeven zijn temperatuur instelpunt (oranje lijn), gehalte aan opgeloste zuurstof (DO) instelpunt (blauwe lijn), agitatie instelpunt (rode lijn) en samengeperste lucht debiet (roze lijn). Pomp 1 (groene lijn) werd gebruikt voor pH-control. De Prikker doen om 18:40 gesignaleerd van uitputting van de eerste glycerol en werd gebruikt om te starten met het voederen van glycerol oplossing via pomp 2 (zwarte lijn). X-as geeft uren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Sample voorbereiding – FPLC en SDS-pagina karakterisatie van het monster. Uiteindelijke grootte uitsluiting chromatografische voor d- MmIAP geëquilibreerd met 20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl, 48,5% D2O en 0,05% total DDM, waarvan 44% (m/v) staart-Halfzwaar d25-DDM is. Inzet: De analyse van de SDS-pagina met Coomassie kleuring. Gepoolde fracties worden aangeduid als A, B en C. regio "B" werd gebruikt in het experiment van de SANS. Geannoteerde molecuulgewicht marker is kDa. Afbeelding is gereproduceerd met toestemming van Naing et al. 65 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 5
Figuur 5. Gegevensverzameling – Quartz banjo sample cel en autosampler setup. (A) een lege kwarts banjo cel wordt weergegeven tegen het blok autosampler rusten. Cellen zijn gevuld met monster en ingevoegd in een van de 15 beschikbare posities. (B) het monster blok is gemonteerd achter een diafragma selector (niet afgebeeld) tussen de Beam buis Extender en silicium raam bij de ingang van de tank van de detector. Slangen verbinden een temperatuurgevoelig waterbad en kanalen in het monster blok bieden temperatuurregeling op de posities van de steekproef. De pijl geeft de richting van de lichtbundel neutron. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. Het verzamelen van de gegevens – overzicht van SPICE operaties en scannen van de tabel. De tabel scan-activiteiten zijn toegankelijk vanaf de knop "Tabel scannen" op het uiterst linkse menu van de software van de controle van het instrument van SPICE. Groene pijlen duiden de actieve lusje bij de bovenkant van het scherm en oranje dozen gebieden in de tabel voor de actieve gebruiker ingangen markeren. (A) het eerste tabblad van de tabel scan wordt gebruikt om informatie over de monster-wisselaar en monster cel posities. Labels, monster diktes en monster typen voorzien in elke positie gebruikt in de monster-wisselaar. De 'Kan scannen' vakje aan te vinken, zal de corresponderende rij aan de tabel scan wachtrij toevoegen. (B) op het tweede tabblad details over het instrument configuratie en meting tijd voor elk monster (in seconden) zijn opgenomen. Instrument configuraties zijn vooraf geconfigureerd door de Neutron Scattering wetenschapper en aan gebruikers op basis van gegevens verstrekt in het voorstel van de lichtbundel tijd en instrument verstrekt. Aanvullende parameters kunnen worden toegevoegd aan het besturingselement instrument, zoals de mogelijkheid om te definiëren van temperatuur basiswaarden en houden van momenten, van de wachtrij van de meting. (C) het laatste tabblad bevat een overzicht van de metingen te worden gemaakt voor elke rij in de tabel. Als er geen veranderingen nodig zijn, wordt de automatische scan gestart door te klikken op de knop 'Uit te voeren scant'. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7. Data reductie – overzicht van vermindering script en MantidPlot activiteiten. MantidPlot software is toegankelijk op het cluster analyse door te typen "mantidplot" in een terminal opdrachtprompt op elke actieve map (de gele cirkel en pijl zijn toegevoegd voor nadruk). Zodra de software open is, toegang krijgen tot het script-venster (of uitgezet door de knop in het groen) en open het script dat wordt geleverd door de Neutron Scattering wetenschapper. Volg de instructies in het script, dat alleen de nummers van de scan voor elk monster en buffer voor geautomatiseerde vermindering in een lijst worden opgenomen mocht, evenals het scannen van nummers voor de lege cel voor aftrekken en lege balk voor transmissie en balk bepaling van het centrum. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8. Data-analyse-plotten van gegevens met behulp van MantidPlot. Data wordt verwezen als 'Workspaces' in MantidPlot. De werkruimte gebied wordt gevuld met bestandsnamen zoals geproduceerd door de vermindering van de BlockFlash2 user script. Gegevens in de werkruimte voor 1D gegevensverzamelingen kunnen worden uitgezet door met de rechtermuisknop op de werkruimte en te selecteren "Plot Spectrum met fouten...". Extra gegevens kunnen worden toegevoegd aan het huidige perceel door simpelweg te slepen werkruimten. Opmaak van het perceel venster (zoals voor log-log percelen) kan worden uitgevoerd door de 'Voorkeuren' in de menubalk 'Beeld' te selecteren of te dubbelklikken op de aslabels. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9. Data-analyse – ATSAS-software: basisbewerkingen en buffer aftrekken. De primusqt applicatie (SAS Data-analyse) biedt visualisatie voor goede achtergrond (buffer) aftrekken. De buffer-bestand moet worden geschaald voor aftrekken zodat gegevens overlappen bij high-Q (waar de verstrooiing is plat als gevolg van de resterende signaal van onsamenhangende achtergrond). Wanneer deze high-Q cellenbereik met gegevens is geselecteerd, zal de werking van de schaal een schaalfactor toepassing naar de lagere gegevensbestand in de tabel die overlapping in de gedefinieerde regio produceert. Na de schalen, kan de buffer-bestand worden afgetrokken om de opbrengst van de netto verstrooiing-Profiel van het deeltje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10. Data-analyse – bepaling van Guinier en P(r) (afstand distributie). (A) de Primus Guinier Wizard wordt gebruikt voor het uitvoeren van een analyse van de Guinier, het verstrekken van een eerste raming van I0 en Rg. Het particle type en het bereik van gegevens te passen worden gebruikt voor het definiëren van de pasvorm. Een plot van de pasvorm en de bijbehorende storingswaarden worden weergegeven aan de linkerzijde, terwijl Guinier termen (ik0 en Rg), Q * Rg grenzen en kwaliteit van lineaire fit worden geleverd als output op het gebied gemarkeerd door het oranje vak. (B) de Primus afstand Distribution Wizard wordt gebruikt voor het uitvoeren van de afstand distributie analyse, verstrekken van de P(r)-curve die bepaalt de waarschijnlijkheid van interatoom afstanden binnen het deeltje verstrooiing en omvat de Dmax of de maximale de afstand van het interatoom. Parameters die zijn aangegeven met de oranje vakje kunnen systematisch worden onderzocht om te bepalen van een goede afstand-verdelingsfunctie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 11
Figuur 11. Onjuiste resultaten van de analyse van de verdeling afstand. Een goed geselecteerde Dmax moet produceren een P(r) curve die met een geleidelijke verval tot nul pieken. DMax waarden die te groot zal waarschijnlijk negatieve P(r) waarden produceren of trillingen in de buurt van de x-as op hoge waarden van r. Dmax waarden die kunstmatig klein vaak resulteren in P(r) bochten waar de bovengrens afgekapt worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 12
Figuur 12. Modeling- Ab initio model instellen met behulp van de Wizard Primus vorm. Ab initio modellering parameters worden geleverd in een enkele inputvenster. Een voorvoegsel wordt geleverd voor de namen van de bestanden van de uitvoer met andere opties voor de verwerking beschikbaar. Gloeien procedure kunnen snel (grotere kralen met snellere afkoeling) of langzaam (kleinere kralen met langzamere afkoeling). Aantal herhalingen moet van voldoende grootte na te gaan van de reproduceerbaarheid van model functies. Deeltje symmetrie en anisometry kunnen worden geleverd, indien bekend. Hoekige schaal moet overeenkomen met de eenheden van de gemeten gegevens. DAMAVER gemiddeld zal uitlijnen en gemiddelde van alle modellen van de dummy atoom, en vervolgens een selectiecriterium dat uitsluit van eventuele uitschieter modellen toe te passen. Een kern van vaste atomen uit het gemiddelde model zal verder worden verfijnd met behulp van DAMMIN, als deze optie is geselecteerd. Dit verfijnde model moet de 3D met lage resolutie envelop van de experimentele SANS profiel vertegenwoordigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 13
Figuur 13. Visualisatie-Experimental SANS envelop en overlay met hoge resolutie model met behulp van PyMOL. Na het openen van de VOB structuur bestanden in PyMOL, modellen worden weergegeven in de PyMOL Viewer. Actieve modellen staan in de tabel aan de rechterkant, samen met de actieknoppen die kunnen worden gebruikt om het model en haar vertegenwoordiging te manipuleren. Basishandelingen zijn geboden voor het visualiseren van deze modellen waarmee regio's van de overeenkomst (of mismatch) tussen de SANS envelop en hoge resolutie structuur kan worden geïdentificeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1. Fysische eigenschappen van detergentia gebruikte in membraan eiwit onderzoeken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Structurele biologie onderzoekers profiteren van aanvullende structurele technieken zoals oplossing verstrooiing verkrijgen van biochemische en structurele informatie (zoals de totale omvang en vorm) van biomoleculen in oplossing. SANS is een bijzonder aantrekkelijk techniek voor het bepalen van de lage resolutie structuren van membraaneiwitten, een kern focus van moderne structurele biologie en biochemie. SANS vereist hoeveelheden van gezuiverde eiwitten die vergelijkbaar zijn met die van kristallografische proeven (1 mg/voorbeeld). De onlangs groeiende commerciële beschikbaarheid van hoge zuiverheid Halfzwaar detergentia relevante membraan eiwit studies maakt toegankelijk een middel om te manipuleren deze waterstof/deuterium inhoud voor SANS experimenten van membraan eiwit-wasmiddel complexen, het toestaan van het eiwit signaal rechtstreeks worden geregistreerd. Wanneer succesvol, een ab initio model moleculaire envelop kan worden berekend op basis van gegevens verzameld over slechts enkele uren. Dus, membraan eiwit biochemici, biophysicists en structurele biologen kunnen gemakkelijk profiteren van SANS te verkrijgen van de felbegeerde eerste 3D-modellen van membraaneiwitten in oplossing, structuren in complex met bindende partners of substraten en modellen verkregen door SANS kan worden gebruikt voor de geleidelijke invoering van diffractie gegevens. Routine gebruik van SANS te karakteriseren membraaneiwitten zou transformatieve voor het membraan eiwit biochemie veld en hebben rimpel effecten van basisstructuur functie Geneesmiddelenontwikkeling. Het voordeel van het neutron contrast matching met deuterium vervanging maakt SANS een waardevolle techniek voor de studie van eiwit-eiwit, eiwit-DNA of andere biomoleculaire complexen, die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd in hun waterstof/deuterium-inhoud.

Voor meer informatie over de kleine-hoek verstrooiing instrument ontwerp en theorie, de volgende beoordelingen worden aanbevolen: het Bio-SANS instrument bij de Hoge Flux isotoop Reactor van Oak Ridge National Laboratory,79 Small-angle verstrooiing voor structurele biologie – de grens uit te breiden terwijl het vermijden van de valkuilen,72 en Small-angle verstrooiing studies van biologische macromoleculen in oplossing. 80 de Neutron Scattering Scientist kunt ook huidige instrument configuraties en bespreken de optimale parameters voor een bepaald systeem. Bijvoorbeeld, gewenst gegevens bij lagere Q (dat is een functie van de verstrooiing hoek en neutron golflengte) is over het algemeen voor grotere systemen. De meest voorkomende configuratie van het instrument op Bio-SANS biedt een Qmin van 0.003 Å-1 en is geschikt voor grotere eiwitcomplexen tot honderden kDa. Een oplossing met ~ 3 mg mL-1 membraan eiwit van geschatte grootte van 30 kDa (monomeer) in contrast-matched micellen met 48,5% D2O in oplossing vereist een typische meting tijd rond 8 uur elke voor monster, buffer en een lege cel (24 uren = 1 dag totaal). Instrument meting keer op een bepaalde contrast voorwaarde kunnen ongeveer worden aangepast volgens het product van de verstrooiing deeltje de moleculaire massa en concentratie. Echter moeten verstrooiing deeltjes worden gemeten onder niet-interactie omstandigheden, met inbegrip van alle niet-specifieke eiwitten bundeling, die een praktische bovengrens op de concentratie van het monster legt. Urenlange metingen plaats grenzen op de stabiliteit van bepaalde eiwitten. Gelukkig, SANS metingen kan gebeuren routinematig gekoelde temperatuurflexibel ter verbetering van de levensduur van de eiwitten, en de werknemer bundel van lage-energie neutronen veroorzaakt geen stralingsschade tijdens de meting.

Een overzicht van dit proces en vaststelling van vele belangrijke factoren naar de succesvolle opname van de neutronen verstrooiing uit een monster gemeten op het punt van de wedstrijd contrast van het wasmiddel worden gepresenteerd in dit manuscript. Het gaat hierbij om de kritieke stap naar een complete wedstrijd van het statistische wasmiddel verkrijgen door het ontwerpen van een wasmiddel mengsel met een uniforme neutron contrast tussen de wasmiddel hoofd groep en alkyl keten componenten. Metingen op dit wasmiddel match aanspreekpunt bieden een verstrooiing profiel toegeschreven aan alleen de membraan eiwit van belang en toegestaan een ab initio envelop vertegenwoordigen het membraan eiwit te worden gereconstrueerd op basis van de gegevens. De data-analyse en ab initio modelleren protocollen ook tonen de potentiële informatie verkregen van deze onderzoeken, die mikken kunnen te richten op algehele structuur, conformationele wijzigingen oligomere Staten, onder anderen. Een beperking is dat tot op heden slechts zeer weinig wasmiddelen commercieel verkrijgbaar met deuterium vervangingen zijn. 19

Hoewel perdeuteration niet noodzakelijk zijn kan, in dit geval het doel moet zijn om een proteïne met > 65% deuterium-labeling in het eiwit. Als alternatief, als wasmiddel met selectief-Halfzwaar hoofd groepen en staarten is beschikbaar, en de CMP van het wasmiddel micel treedt op in de buurt van 100% D2O, dan voldoende contrast uit het eiwit kan worden bereikt zonder de noodzaak van deuterium-labeling. Bepaal het niveau van de juiste deuteration van het eiwit om voldoende verstrooiing gemeten op het punt van de contrast-wedstrijd van het wasmiddel. Er zijn talrijke uitdagingen in verband met membraan eiwit expressie en zuivering,81 die blijven buiten het bestek van dit artikel. Helaas, hoge niveaus van deuteration zijn momenteel niet (nog) mogelijk voor eukaryotische systemen. Terwijl we ons realiseren dat dit is een beperking voor sommige eukaryotische eiwitten, hebben de meeste membraaneiwitten bacteriële orthologs waarvoor deze methode geschikt is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss en Ryan C. Oliver zijn gecontracteerd door UT-Battelle met ons DOE ter ondersteuning van het Neutron Science gebruikersprogramma en Bio-SANS instrument bij het Oak Ridge National Laboratory gebruikt in dit artikel.

Dit manuscript heeft mede geschreven door UT-Battelle, LLC, onder contract DE-AC05-00OR22725 met de ons Department of Energy (DOE). De Amerikaanse regering behoudt en de uitgever, door het aanvaarden van het artikel voor publicatie, erkent dat de Amerikaanse regering een niet-exclusieve, gestorte, onherroepelijke, wereldwijde licentie behoudt te publiceren of reproduceren van het gepubliceerde formulier van dit manuscript, of toestaan anderen doen, voor de Amerikaanse regering doeleinden. DOE zal zorgen voor toegang tot deze resultaten van federale overheid gesponsorde onderzoek overeenkomstig het Plan bij DOE-toegang van het publiek. 82

Acknowledgments

De Office van biologische en milieuonderzoek in steun voor onderzoek op het Chicago Center voor structurele moleculaire biologie (CSMB) en Bio-SANS met behulp van faciliteiten ondersteund door de wetenschappelijke gebruiker voorzieningen Division, Office of Basic Energy Sciences, ons departement van energie. Ruwbouw op membraaneiwitten in het lab Lieberman werd ondersteund door de NIH (DK091357, GM095638) en de NSF (0845445).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7, (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248, (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18, (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44, (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276, (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41, (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2, (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132, (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31, (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119, (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40, (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555, (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32, (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28, (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30, (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84, (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457, (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818, (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86, (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666, (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33, (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8, (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508, (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86, (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71, (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8, (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57, (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285, (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50, (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16, (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33, (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70, (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36, (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41, (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93, (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5, (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15, (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61, (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94, (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18, (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265, (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199, (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114, (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36, (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19, (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25, (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40, (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42, (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76, (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68, (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47, (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66, (10), 1735 (2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics