TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Burada, maya RNA-modifiye enzim, Mod5, biyokimyasal karakterizasyonu için bir iletişim kuralı tanımlamak ve nasıl diğer RNA enzimler için bu iletişim kuralı uygulanırsa tartışıyorlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chambers, A. E., Richardson, A. E., Read, D. F., Waller, T. J., Bernstein, D. A., Smaldino, P. J. An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity. J. Vis. Exp. (140), e58100, doi:10.3791/58100 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

N6- isopentenyladenosine RNA değişiklikleri işlevsel olarak farklı ve prokaryot ve ökaryotlar arasında son derece korunmuş. En son derece korunmuş N6- isopentenyladenosine değişiklikler biri A37 konumunu tRNA bir alt oluşur. Bu değişiklik çeviri ve sadakat tRNA benzeşim ribozom artırarak artırır. Mutasyon bu değişiklik ökaryotlarda sorumlu enzim mitokondrial disfonksiyon ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarında ile ilişkilidir. Bu nedenle, substrat özgüllüğü ve biyokimyasal faaliyetleri Bu enzimlerin anlama normal ve patolojik ökaryotik biyoloji anlamak için önemlidir. Yöntemleri çeşitli bir dizi6A değişiklikler ben karakterize etmek için istihdam edilmiştir. Burada olduğunu isopentenylation Mod5 tarafından algılanması için doğrudan bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem RNA'ların kuluçka ardından RNase T1 sindirim ve ben6A değişiklikleri algılamak için 1 boyutlu jel elektroforez analiz bir rekombinant isopentenyl transferaz ile kullanır. Buna ek olarak, bu protokolün diğer RNA enzimler karakterize etmek için potansiyel uyum ele alınmıştır.

Introduction

En azından 163 ayrı posttranscriptional RNA değişiklikler, farklı ve içerik bağımlı işlevler için RNA'ların veriyor, doğrudan RNA yapısını etkileyen ve diğer RNA'ın etkileşimleri etkileyen bu değişiklikler ile tespit edilmiştir molekülleri1,2. Sayısı ve çeşitliliği RNA değişiklikler için takdir arttıkça, güvenilir bir şekilde RNA Modifikasyon ve onları katalizler enzimler sorguya çekebiliriz deneyleri geliştirmek için önemlidir.

TRNA, bitişik Anti-kodonu 3' yan3,4temel 37 at tespit edilmesi için ilk RNA değişiklikler oluşur. Bir isopentenyl grubu dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) adenozin 37 N6 konuma aktarılır (ben6A37) bir alt kümesi sitoplazmik ve mitokondrial tRNA 3,5 . Ben6A37 geliştirir çeviri sadakat ve verimliliği artırarak tRNA'ın benzeşme ribozom4,6 ve6A37 stres tepkisi bakteri7için önemli. Bu değişikliği gerçekleştirmek enzim tRNA isopentenyl Transferazlar denir ve bakteri8,9, mantarlar10, solucanlar11, bitkiler12ve daha yüksek Ökaryotlar13 son derece korunmuş , insanlar14dahil olmak üzere.

İnsan tRNA isopentenyl transferaz gen, TRIT1, mutasyonların insan hastalığı ile ilişkilidir. Örneğin, TRIT1 bir mutasyon büyük olasılıkla mitokondrial protein sentez15,16bir kusur nedeniyle şiddetli bir mitokondriyal hastalığı ile ilişkilidir. Ayrıca, TRIT1 bir tümör baskılayıcı gen17,18 açıklanan ve melanom19, meme20, gastrik21ve akciğer kanserleri22 de dahil olmak üzere kanserlerinin bazı türleri karıştığı ,23. Son olarak, TRIT1 ve Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl Transferazlar deli dana gibi amiloid lifleri24,25,26toplama eğilimli proteinleri vardır. Her ne kadar bunun için doğrudan kanıt değil henüz gösterilen bu gözlemler potansiyel tRNA isopentenyl Transferazlar nörodejeneratif hastalıklarda işe bulaştırmak.

İsopentenyl Transferazlar bir isopentenyl transferaz aktivitesini çeviri ve hastalık, doğrudan6ölçmek yöntemleri oynadıkları rolü göz önüne alındığında bu enzimler Normal'in altında ve hastalık durumlarında bir mekanik anlamak için önemlidir. Yöntemleri giderek artan sayıda vitro isopentenylation deneyleri, pozitif hibridizasyon dahil olmak üzere6A RNA değişiklik ben algılamak kullanılabilir ben yokluğunda (PHA6) deneyleri,6ince katman Kromatografi (TLC), amino asit kabul aktivite deneyleri ve kütle spektrometresi yaklaşımlar (Ref. 4yorum).

Bir vitro isopentenylation tahlil 14C-DMAPP ve etiketsiz tRNA kullanır nitelendirdi. Bu tahlil, radyoaktif karbon 14C-DMAPP tarafından isopentenyl transferaz RNA aktarılır. Bu tahlil son derece hassas olmakla birlikte, genellikle bu belirli kalıntı9,20,27değiştiren belirlemek zordur. PHA6 deneyleri itimat hantal üzerinde ben6A değiştirme değiştirilmiş kalıntı kapsayan bir 32P olarak etiketlenmiş sonda hibridizasyon ile müdahale. Bu nedenle, hibridizasyon bir i yokluğunda büyük6bir değişiklik18,28,29. PHA6 deneyleri son derece hassas ve hücresel lysates çıkarılan toplam RNA analiz yeteneğine sahip. Ayrıca, sondalar özel ilgi RNA tasarlamak için bu yöntemi önemli hedef esneklik sağlıyor. Ancak, PHA6 deneyleri artıkları sonda hedeflenen bölge içinde oluşur ve bu nedenle Roman değişiklik siteleri tanımlamak daha az muhtemel değişiklikler karakterizasyonu için sınırlıdır. Buna ek olarak, bağlama yokluğu modifikasyonu göstergesidir gibi diğer değişiklikler veya RNA bağlama etkiler mutasyonlar veri analizi yıkmak da.

Başka bir yaklaşım Benzil DEAE selüloz (BD) selüloz kromatografi tRNA30olarak6A değişiklikleri amino asit kabul aktivite olarak ben, bir okuma ile birleştirir. Bu yaklaşım doğrudan işlev deneyi ' nın6A değişiklik, ama ben6A değişiklik algılamak için dolaylı bir yaklaşımdır ve çözünürlük RNA içinde belirli bir kalıntı değişiklikler eşlemek için yoksun. TLC yaklaşım toplam tRNA algılamak için kullanılan ben6A değişiklikler. Bu yaklaşımda, dahili olarak 32tRNA P olarak etiketlenmiş tek nükleotid sindirmek ve iki boyutlu TLC analiz isopentenylation tanımlamak için kullanılır. Bu yaklaşım son derece hassas saptamada toplam6A belirli bir RNA örnek ama sindirim tüm sırası bilgi kaybolmadı; Böylece, araştırmacı hiçbir şekilde hangi artıkları değiştirilmiş31olmuştur saptayacak yeterliliğe sahip değildir.

Daha yakın zamanlarda, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemleri kantitatif tür hücre tipleri ve deneysel koşullar32,33arasında toplam RNA Modifikasyon karşılaştıran geliştirilmiştir, 34. Bu metodoloji sınırlamasından kimlik ve hangi değiştirilmiş nükleozit yapıldı RNA içinde pozisyon34türetilmiş belirlemek daha az yetenekli olmasıdır. Ayrıca, uzmanlık ve ekipman bu deneyler yürütmek için gerekli bu yaklaşım pratiklik sınırlayın.

Buna ek olarak, bazı yeni nesil sıralama teknolojileri RNA Modifikasyon transcriptome çapında34eşlemek için geliştirilmiştir. Immunoprecipitation RNA'lar ile antikor belirli bir değişiklik (RIP-Seq) belirli bir belirli değişiklik35,36içeren tüm serileri tanımlamak için Dedektif etkinleştirin. Ayrıca, ters transkriptaz tabanlı yaklaşımlar Kimya-Seq ve rasgele uyuşmazlığı sıralama gibi ters transkripsiyon tepki değiştirilmiş artıkları37,38,39tedirginlikler güveniyor. RNA Modifikasyon transcriptome çapında eşlemek için bu tekniklerin avantaj rağmen RIP-seq ve kimya-Seq teknolojileri güvenilir antikor veya reaktif kimyasallar belirli her değişiklik için sırasıyla34mevcut eksikliği ile sınırlıdır. Ayrıca, ters transkriptaz enzimler Kimya-Seq gerçekleştirmek için gereken ve rasgele uyuşmazlığı sıralama teknikleri istikrarlı RNA yapılar tarafından engellemiştir. TRNA çok değiştirilmiş ve yapısal istikrarlı yapısı onları bu teknikleri kullanarak sorguya çekmek özellikle zor olun. Bugüne kadar yeni nesil teknolojileri dayandırılmış henüz6değişiklikler34ben eşlemek için kullanılmıştır değil.

Burada, ben6A tRNA değişiklikler içinde vitroalgılamak için basit ve doğrudan bir yaklaşım açıklar. Kuluçka RNA'lar ile rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferaz (Mod5), ardından RNase T1 sindirim ve 1 boyutlu jel elektroforez analiz6A değişiklikler ben eşlemek için bu yöntemi kullanır. Bu yaklaşım doğrudan ve verileri çözümlemek için küçük özel uzmanlık gerektirir. Ayrıca, bu yöntem diğer RNA enzimler, kovalent değiştirmek RNA ya da RNA'ın hareketlilik bir jel ile molekül ağırlığı enzimler de dahil olmak üzere değiştirme için uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Protokol Ref. 24uyarlanmıştır.

1. RNA ve enzim ilgi elde etmek

  1. Kullanım vitro dahili 32ile P etiketli RNA transkripsiyonu ve rekombinant His6-Mod5 ifade ve E. coli, yukarıda açıklanan24olarak gelen saf.
    1. Tanıtmak vitro transkripsiyonu RNA'ların (Bölüm 3) T7 RNA polimeraz etiketlenmemiş ATP, UTP, CTP, GTP ve jel saf, etanol çöktürülmüş α-ATP, 10 µCi huzurunda kullanarak 1 x TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,1 mM EDTA) resuspended ve-80 ° C'de depolanan 24.
  2. Alternatif olarak, piyasada bulunan fluorescently etiketli RNA'lar ilgi edinin. Herhangi bir tercih edilen ifade sistem ilgi enzyme(s) üretmek.
    Dikkat: RNA iç floresan etiketlerinde RNA yapısı ve tanıma enzimler tarafından değiştirebilirsiniz.

2. % 20 Polyacrylamide jel Denaturing hazırlamak

Not: 40 cm uzunluğunda dikey levha jel RNA parçaları yeterli çözünürlüğü elde etmek için tavsiye edilir. Kullanılan jel genişliği çözümlenmesi için örnekleri sayısı tarafından belirlenir.

  1. Cam plakanın iyice temizleyin. İlk olarak, sabun ve su ile yıkayın, de deiyonize suyla durulayın ve son olarak isopropanol ve hav bırakmayan mendil ile temiz.
  2. Tabakalar ve çubukları bir araya getirin.
  3. 100 mL % 20 akrilamid, 7, 5 M üre, 1 x TBE jel yapmak için aşağıdaki reaktifleri mix: üre jel 80 mL konsantre (237,5 g/L akrilamid, 12,5 g/L metilen bisacrylamide, 7, 5 M üre deiyonize su), üre jel seyreltici 10 mL (7.5M üre deiyonize su) ve üre jel arabellek (0,89 M Tris-bor-20 mM EDTA tampon pH 8.3 ve 7,5 M üre) 10 mL.
    Not: Jel çözüm hacmi jel boyutlarına göre ayarlanması gerekir.
  4. N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ve taze hazırlanmış % 10 amonyum Persülfat (APS) 800 µL 40 µL ekleyin.
  5. Jel çözüm büyük bir şırınga çizme ve cam plakanın arasında dağıtmak. İle parmak camının kabarcık oluşumunu önlemek için dökme sırasında dokunun.
  6. Jel için 30 dk kuvvetlendirmek izin.
  7. Bağlayıcı klipleri kullanarak dikey jel aparatı üzerine katılaşmış jel kelepçe.
  8. Üst ve alt arabellek chambers 1 ile doldurmak x TBE.
  9. Jel, yükleme öncesinde iki saat önceden 20, jel çalıştırmak Anne, en küçük oligonucleotides - depar arabellek sınırı izin vermek 2 h için Aksi takdirde küçük nukleotid ve oligonucleotides eğilimi tampon ön tarafta daraltmak için.

3. RNA Isopentenylation tahlil

  1. 17 µL, son hacmi tepkileri hazırlamak 58 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1.2 mM ATP, 5.8 mM MgCl2, 0.2 mM DMAPP, 10 U RNase inhibitörü (Örneğin, SuperRNaseIn), 40.000 BGBM dahili 32P olarak etiketlenmiş RNA, 5.3 µM içeren Mod5 ve 1,2 mM 2 - mercaptoethanol.
  2. Reaksiyonlar için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. Etanol-1s veya geceleme için % 100 etanol ve 3,5 M sodyum asetat pH 5.5 ve yer-20 ° c 1/10 birimlerin (1.7 µL) 2.5 birimleri (42,5 µL) kullanma RNA'ların çökelti.
  4. RNA örnekleri 15.400 x g ve 4 ° c, 20 dk santrifüj kapasitesi
  5. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve RNA Pelet 500 µL % 70 etanol ile yıkayın.
  6. Santrifüj örnekleri, 5 min 15.400 x g ve 4° c için
  7. Süpernatant ve air-dry RNA granül 15 dk ya kadar tüm etanol buharlaşıp vardır dikkatli bir şekilde çıkarın.
  8. RNA granül üre 8 M 10 µL içinde resuspend.
  9. 150 U RNase T1 ekleyin ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  10. Arabellek (%60 gliserol, % 0,1 ksilen cyanol) yükleme x 6 2 µL ekleyin.
  11. 10 µL her RNA örneği üzerinde bir ön çalışma, % 20 polyacrylamide, 7, 5 M üre jel (bakınız Bölüm 2 iletişim kuralı) yükleyin.
    Not: Radiolabeled RNA boyutu merdivenler bir ek hareket işareti olarak dahil edilebilir.
  12. 2 h için jel 25, koş anne.
  13. Jel durdurmak ve cihazlar kaldırmak.
  14. Sonu arasında iki cam plakalarının ve cam plakanın birini "alt" plaka üzerinde kalan jel ile kaldırın.
    Not: Bu adımı sırasında jel gözyaşı için dikkat ediniz.
  15. Plastik wrap bir katman üzerinde jel yer ve bir fosfor ekranda 3 h. için alternatif olarak ortaya çıkarmak, jel Kromatografi kağıt üzerinde yerleştirin ve bir jel fosfor ekran pozlama önce kurutma makinesi ile kuru.
  16. Görüntü fosfor fosfor Imager ekranda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mod5 Tirozin ile inkübe tRNA ya da serin tRNA varlığı veya yokluğu DMAPP. Değişiklik reaksiyon ürünleri hangi tüm guanosines bir 3' guanozin monophosphates (GMP)24 (Şekil 1) bırakarak 3' sonu cleaves RNase T1 sindirilmiş. RNA'ların tam sindirim, sonra bir % 20 polyacrylamide jel denaturing çözümlenir radiolabeled parçacıkları (Şekil 2A), tahmin edilebilir bir desen oluşturur. RNA DMAPP bir isopentenyl grup transfer parçası değiştirilmiş kalıntı (Şekil 1) içeren bir hareketlilik kayması neden olur.

Bu iletişim kuralı güvenilir isopentenylation kalıntılarının Mod524tarafından değiştirilmiş kurallı ve kurallı tRNA algılar. Örneğin, Mod5 tRNA, Tirozin de dahil olmak üzere yukarıda açıklanan AAA36-38 sıra gereksinimi10, içeren bir alt kümesini değiştirmek için tahmin edilmektedir Bu çalışmada kullanılan tRNA tRNA ve serin. Mod5 değiştirir DMAPP huzurunda öngörülen kalıntı ötelenen 10 tarafından belirtildiği şekilde Tirozin parçasındaki içeren nt AAA36-38 tRNA (Şekil 2B). Benzer şekilde, ne zaman tRNA Mod5 ve DMAPP, 10 tam bir kayma ile inkübe 's serin parça içeren nt AAA36-38 (Şekil 2C) görülmektedir. İlginçtir, kısmi bir kayma 7 nt parçanın o does değil içermek AAA36-38 (Şekil 2C) görülmektedir. Bu veriler AAA36-38 sıralama ve yapı Mod5 vitro aktivite için gerekli değildir öneririz; Ancak, gelecek çalışmalar LC-MS/MS veya diğer yöntemleri kullanarak değişiklik kesin kimyasal yapısını onaylamak için gereklidir.

Figure 1
Resim 1 : İsopentenyl transferaz tahlil Illustration. tRNA, dahili olarak etiketli 32ile P-adeonsine, S. cerevisiae tRNA isopentenyl transferaz (Mod5) ve ATP ile veya DMAPP olmadan inkübe gösterilir. Pozisyonlar A36-A38 antikodon bölgesi bitişik belirtilir. Kırmızı yıldız radiolabeled nükleotit temsil eder. Kuluçka RNA'ların RNase T1 ile sindirilmiş, çıkarılan ve % 20 denaturing-PAGE tarafından çözüldü. TRNA DMAPP bir isopentenyl grup transfer Elektroforez sırasında geri zekalı bir grup tarafından belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Bir isopentenyl transferaz testin RNase T1 sindirim harita ve temsilcisi sonuçları. (A) siyah üçgenler RNase T1 bölünme siteleri gösterir ve üçgenler üzerinde siyah çizgiler içeren en az bir 32P olarak etiketlenmiş adenozin ortaya çıkan parçaları gösterir. Gri vurgulanan artıkları vardır tahmin6A değişiklik siteleri (Yani, A37). (B) Tirozin tRNA ve (C) serin tRNA dahili olarak etiketli 32ile P-adenozin. S. cerevisiae isopentenyl transferaz Mod5, her RNA ile DMAPP içinde inkübe. RNA'ların ardından RNase T1 ile sindirmek ve denaturing sayfasında çözüldü. Ötelenen bantları DMAPP üzerinde bağımlı değiştirilmiş bir RNA kalıntı varlığını gösterir. Öngörülen değişiklik sitenin A37, altı çizili ve değiştirilmiş A37 artıkları vurmalar yıldız işareti ile gösterilir. Bir önceden tahmin edilemeyen ve yeni değişiklik site tespit ve olarak gösterilen "Ben6A?". Bu rakam okuma vd değiştirildi 24 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücresel ve organizma işlevinde her zamankinden daha fazla önemli ve farklı rolleri oynamak için gösterilecek RNA değişiklikler devam. Bu nedenle, enzimler değiştirme RNA sorgulamaya deneyleri gelişimi biyoloji temel yönlerini daha iyi anlamak için merkezi bir noktada bulunuyor. Bu iletişim kuralı Mod5 tRNA değişiklik etkinliği karakterize etmek için yüksek çözünürlüklü vitro tahlil açıklar.

Bu iletişim kuralının isopentenylation bir doğrudan ve kolay yorumlanabilir okuma sağlayan farklı avantajı vardır. Açıklanan protokol isopentenyl Transferazlar sağlam biyokimyasal karakterizasyonu için sağlar. Ayrıca, bu sistem enzim çeşitleri ile kullanılabilir veya RNA yüzeylerde, doğrudan belirli tortular veya etki alanları üzerinde değişiklik olması gereken rollere tespiti için izin değiştirildi. Daha büyük çözünürlük elde etmek için bu iletişim kuralı kolayca tüm dört nükleotit veya C ve U, sırasıyla ayırmak RNase P1 ve/veya RNase A, gibi diğer RNases ile paralel sindirim içerecek şekilde adapte olabilir.

Bu testin bir sınırlama nispeten düşük verim olduğunu ve böylece RNA-sıralama için pratik olarak analiz edilebilir daha az RNA'ların karşılaştırıldığında ve kütle spektrometresi34yaklaşıyor olmasıdır. Bu nedenle, o kim RNA Modifikasyon siteleri transcriptome çapında tanımlamak için amaç bu iletişim kuralının kullanılması önerilmez. Bu iletişim kuralı ile ilgi belirli RNA'ların enzim değiştirme belirli bir RNA incelenmesiyle ilgileneceğini müfettişler için kullanışlıdır. Ancak, birçok transcriptome geniş metodolojileri RNA değişiklikleri tanımlamak için kullanılan kimyasal bir yan için değiştirilmiş bir nükleotit kovalent eklenmesi gerektirir. Bu yöntem bir değişiklik protokolleri transcriptome çapında çaba40taahhütte bulunmadan önce kimyasal değişiklik optimize etmek için bireysel bir yüzey üzerinde test nerede bir ucuz ve etkili tahlil sağlar. Bu iletişim kuralı isopentenyl transferaz etkinlik, algılamak için basit ve doğrudan bir tahlil sağlasa da burada açıklandığı gibi sadece yüzde toplam RNA parçası değişiklik hesaplanır ve gruplar arasında karşılaştırıldığında. Araştırmacılar nicel enzim aktivitesi karşılaştırmalar yapmak isteyen ilk enzim konsantrasyon yansıtılmasında birimlerinin hesaplaması gerekir.

Bu yöntemin başarısı ağır birkaç kritik adım dayanmaktadır. Faiz RNA bütünlüğünü isopentenylation önce onaylandıktan önemlidir. İsopentenyl transferaz tahlil önce RNA örnek bozulma RNA Modifikasyon üzerinde önemli bir etkisi olabilir ve veri yorumu yıkmak. Ayrıca, bu tür bozulma RNase T1 sindirim yerini almıştır sonra tespit etmek zordur. Bu nedenle, bu RNA bütünlük sayfa denaturing tarafından denetlenir önerilir. Ayrıca, tam ve doğru bir şekilde RNA Modifikasyon kapsamını tanımlamak için RNase T1 sindirim tamamlanması devam emin olmak önemlidir. RNase P1 ve/veya RNase A, gibi ek RNases sindirimi RNA'ların RNase T1 ile paralel olarak bu tahlil çözünürlüğünü artırmak için kullanılabilir. Radiolabeled oligonükleotid merdivenler bilinen uzunluğu ve sıra ve sindirilmemiş RNA örnekleri sindirim değerlendirmek için kullanılabilir. Son olarak, bazı enzimler için "doğru" katlanmış durumda olan RNA Modifikasyon özgüllük bağlıdır. Vivo yapılarını benzeyen çoğu tRNA sentezlenmiş vitro cemaate yapıları ise, daha az Bazı RNA'lar, diğer sınıflar daha uzun RNA'ların41ile özellikle için olmasıdır.

TRNA Mod5 isopentenylation için belirli anlatıldığı kuralıdır, bu yöntem kovalent önemli ölçüde moleküler ağırlık veya jel hareketliliğini değiştirir bir kimyasal yan eklediğiniz diğer RNA-enzimler karakterize etmek için kolayca adapte olabilir RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

İfşa için hiçbiri.

Acknowledgments

Dr David Engelke onun rehberlik ve bu el yazması üzerinde yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. PİJAMA - Ball State University laboratuvar başlangıç fonlar; DAB - 1R15AI130950-01 vermek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
UreaGel Concentrate National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Diluent National Diagnostics EC-833 As part of a kit
UreaGel Buffer National Diagnostics EC-833 As part of a kit
10x TBE National Diagnostics EC-833 As part of a kit
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich 7727-54-0
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich T1503
Boric acid Sigma-Aldrich 10043-35-3
EDTA Sigma-Aldrich 60-00-4
ATP Sigma-Aldrich 34369-07-8
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
DMAPP Caymen Chemical 1186-30-7
Super RNaseIN ThermoFisher Scientific AM2694
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
Ethanol Sigma-Aldrich 64-17-5
Sodiume acetate Sigma-Aldrich 127-09-3
Rnase T1 ThermoFisher Scientific EN0541
Glycerol Sigma-Aldrich 56-81-5
Xylene cyanol Sigma-Aldrich 2650-17-1
Equipment and Supplies
Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) The Gel Company
Vertical gel apparatus The Gel Company S2-3040
50 mL disposable syringe Fisher Scientific 03-377-26
Stainless steel binder clips Idea Scientific 1066
Phosphoscreen Sigma-Aldrich 28-9564-74
Plastic wrap (local grocery store)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46, (D1), 303-307 (2018).
  2. Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18, (3), 202-210 (2017).
  3. Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173, (3994), 293-299 (1971).
  4. Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14, (9), 1197-1208 (2017).
  5. Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76, (12), 1152-1160 (1994).
  6. Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20, (17), 4863-4873 (2001).
  7. Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22, (5), 729-742 (2016).
  8. Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170, (9), 4147-4152 (1988).
  9. Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39, (21), 6546-6553 (2000).
  10. Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7, (1), 177-184 (1987).
  11. Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159, (1), 147-157 (2001).
  12. Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49, (2), 161-169 (2002).
  13. Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26, (23), 5533-5535 (1998).
  14. Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258, (1-2), 85-93 (2000).
  15. Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38, (5), 511-516 (2017).
  16. Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10, (6), 1004424 (2014).
  17. Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556, (1), 13-18 (2015).
  18. Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33, (24), 4900-4908 (2013).
  19. Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
  20. Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7, (24), 36092-36100 (2016).
  21. Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34, (5), 1018-1024 (2013).
  22. Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24, (35), 5502-5509 (2005).
  23. Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival. Lung Cancer. 55, (3), 271-277 (2007).
  24. Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591, (11), 1601-1610 (2017).
  25. Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
  26. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336, (6079), 355-359 (2012).
  27. Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40, (6), 1734-1740 (2001).
  28. Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17, (10), 1846-1857 (2011).
  29. Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33, (15), 2918-2929 (2013).
  30. Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5, (11), 4329-4342 (1978).
  31. Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18, (1), 11-26 (1979).
  32. Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85, (24), 12173-12181 (2013).
  33. Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9, (4), 828-841 (2014).
  34. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23, (12), 1754-1769 (2017).
  35. Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530, (7591), 441-446 (2016).
  36. Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149, (7), 1635-1646 (2012).
  37. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40, (11), 5023-5033 (2012).
  38. Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159, (1), 148-162 (2014).
  39. Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155, (6), 1409-1421 (2013).
  40. Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
  41. Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14, (12), 23672-23684 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics