La detección de Immunohistochemical de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en desarrollo y en la Retina de ratón Postmitotic

Developmental Biology
 

Summary

El objetivo de este informe es describir el protocolo para la detección de immunohistochemical robusto de marcadores epigenéticos, 5-METILCITOSINA (5mC) y 5-hidroximetilcitosina (5hmC) en el desarrollo y postmitotic retina de ratón.

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Singh, R. K., Diaz, P. E., Binette, F., Nasonkin, I. O. Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina. J. Vis. Exp. (138), e58274, doi:10.3791/58274 (2018).

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Abstract

La epigenética del desarrollo retiniano es un campo de investigación muy estudiado, que promete traer un nuevo nivel de comprensión acerca de los mecanismos de una variedad de enfermedades degenerativas retinianas e identificar nuevos enfoques de tratamiento. La arquitectura nuclear de retina de ratón está organizada en dos patrones diferentes: convencional e invertida. Convencional es universal donde la heterocromatina se localiza en la periferia del núcleo, mientras que la eucromatina activa reside en el interior nuclear. Por el contrario, patrón nuclear invertida es exclusiva de los núcleos de célula del fotorreceptor barra adulto donde la heterocromatina se localiza al centro nuclear y eucromatina reside en la periferia nuclear. Metilación del ADN se observa predominantemente en chromocenters. Metilación del ADN es una modificación covalente dinámica sobre los residuos de citosina (5-METILCITOSINA, 5mC) de dinucleótidos CpG que se enriquecen en las regiones promotoras de varios genes. Tres metiltransferasas de ADN (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B) participan en la metilación del ADN durante el desarrollo. 5mC detectar con técnicas de inmunohistoquímica es muy desafiante, contribuyendo a la variabilidad en los resultados, como todas las bases de ADN incluyendo bases 5mC modificado están ocultos dentro de la hélice de ADN de doble hebra. Sin embargo, la delineación detallada de 5mC distribución durante el desarrollo es muy informativo. Aquí, describimos una técnica reproducible para la detección de immunohistochemical robusto de 5mC y otro epigenético ADN marcador 5-hidroximetilcitosina (5hmC), que colocalizes con la cromatina transcripcionalmente activa, "abierta" en el desarrollo y retina de ratón postmitotic.

Introduction

Regulación epigenética del desarrollo y la homeostasis postmitotic de retina de ratón son un área interesante de investigación, que promete traer una nueva comprensión de mecanismos biológicos de control determinación de destino retinogénesis y celular, de células específicas del tipo función metabólica así como patologías de celular, muerte celular y la regeneración1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. cromatina sufre cambios dinámicos en el desarrollo, así como en respuesta a señales externas variables ya sea estrés, metabólica o célula muerte estímulos6,14,15, 16 , 17 , 18. en los núcleos de ratón, la cromatina se divide en activa eucromatina y heterocromatina inactiva6,19,20. En el núcleo de interfase, eucromatina reside en la región interna del núcleo mientras que la heterocromatina líneas la periferia nuclear y el nucleolo. Este patrón se llama convencional y se conserva altamente en eucariotas. Por el contrario, núcleos de vástago en animales nocturnos como el ratón y la rata han invertido patrón donde el núcleo está ocupado por la heterocromatina en el centro rodeado por eucromatina formando la cáscara más externa6,18, 20. Al nacer, núcleos de barra tienen arquitectura nuclear convencional. Inversión de núcleos de la barra se produce durante el desarrollo de remodelación de la arquitectura nuclear convencional. Durante este proceso, la heterocromatina periférica se separa de la periferia nuclear y chromocenters fusionan para formar una sola chromocenter en el centro del núcleo6,18.

Metilación del ADN genómica participa en el control de la conformación de la cromatina local21. Metilación del ADN se produce en el 5' posición de los residuos de citosina de dinucleótidos CpG que se enriquecen en la región promotora de muchos genes en ratón genomas22,23,24,25,26 así como en intergénicas y regiones intrón, que llevan elementos reguladores27. La metilación de islas CpG en promotores proximales21,24 y secuencias CpG en gen potenciadores27,28 es importante en la regulación el estado dinámico de la cromatina bivalente, que contiene muchos factores de desarrollo genes/transcripción desempeñan un papel importante en el desarrollo, cáncer y envejecimiento29,30,31,32,33,34 . Tres DNA metiltransferasas (DNMTs) participan en la metilación del ADN en ratón desarrollo35. Tres DNMTs todos se expresan durante el desarrollo retina de ratón36 y cambios específicos de retina en Dnmt genes impacto desarrollo retiniano2,7. Hidroximetilcitosina (5hmC) es el producto oxidativo de desmetilación de la 5-METILCITOSINA (5mC). Las tres enzimas de translocación (TET) de diez-once participan en 5mC desmetilación37,38,39. Hidroximetil-C modificación se enriquece en promotores, los órganos de la gene e intergénicas secuencias genómicas en gen ricos y regiones activamente transcrito27,40.

Hay una variedad de enfoques descritos para la determinación de cambiar patrones de metilación del ADN en las células41,42,43,44,45,46, algunos de ellos que permite cuantificación de los cambios globales de la metilación del ADN y otros centrándose en cambios precisos en regiones ricas en CpG en promotores y potenciadores. Métodos para la detección y cuantificación de 5hmC fueron también reportados47, incluyendo inmunohistoquímica13. Técnicas de inmunohistoquímica que permiten seguimiento robusto de 5mC y 5hmC cambios en núcleos de desarrollo y postmitotic células, son muy informativos para delinear la cromatina dinámica en situ en respuesta a cambios internos o externos que afectan las células4,13,48,49. Sin embargo, este enfoque es propenso a subestimar la metilación del ADN y cambios hydroxymethylation debido a dificultades técnicas, asociadas con la detección de modificaciones de la citosina en las preparaciones histológicas. Esto es porque las bases de la DNA no polar, incluyendo 5mC y citosina 5hmC modificado, se ocultan en el centro de la doble cadena DNA hélice50y requiere desenmascarar. Esto es especialmente difícil en las preparaciones histológicas congeladas, que rápidamente pueden perder organización informativa del tejido original cuando se aplica el tratamiento áspero.

La retina de ratón es un excelente modelo para disecar la contribución de la metilación del ADN al desarrollo neuronal y la homeostasis postmitotic. Sólo hay 6 tipos de neuronas (fotorreceptores de la barra y el cono, amacrinas, células bipolares, horizontales y del ganglio), tipo de célula glial (glía de Müller) y un neuroepitelial células tipo (epitelio retiniano del pigmento)51. Tipos de células retinianas se informaron tener patrones distintos de ADN metilación18,,19, que recientemente se ha estudiado en la resolución de la solo-base1,5,9,12. Recientemente reportamos aplicación inmunohistoquímica a delinear 5mC patrón de distribución dentro de núcleos de células de la retina y cambios en los núcleos de la retina de ratón adulto, donde se han quitado todos tres metiltransferasas de ADN dirigiéndose a condicional 7. en comparación con un número de informes, donde la presencia de metilación del ADN en células de la retina sólo podría considerarse positiva o negativa señal en hipermetilados células en apoptosis, nuestro enfoque activada detección específica cromatina acuerdo dentro de los núcleos de células retinianas, que tenemos varios grupos registran y anteriormente5,6,7,18,19,36 , 52. aquí, describimos la técnica de inmunohistoquímica (IHC) de detección de 5mC y 5hmC en secciones histológicas fijadas en paraformaldehido congeladas en detalles así como demuestran los datos, que hemos sido capaces de reproducir desde nuestro informe original7 .

Protocol

Todos los procedimientos con los ratones fueron realizados según protocolos aprobados por Hospital Oakland Research Institute Comité animal uso y cuidado infantil y se adhirió a la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) instrucción para el uso de animales en oftálmica e investigación de la visión.

1. tejido preparación para la inmunotinción

  1. Eutanasia a ratones C57 BL/6J en el día embrionario (E) 16, día postnatal (P) 0, P15 y P90 por dióxido de carbono (CO2) seguido por decapitación (ratones E16 y P0).
  2. Ojos de ratón inmediatamente enucleate punza con aguja 29 1/2 en el lado dorsal del ojo. Incubar durante 5 minutos (min) en 1 mL de 4% paraformaldehido (PFA) en el pH de la solución salina con tampón fosfato (1 x PBS) 8.0 a temperatura ambiente.
  3. Para hacer tazas de ojo de P0, P15 y P90, diseccionar a córnea y lente con tijeras oftálmicas finas mientras los ojos están en el 4% del PDC.
    Nota: Omitir este paso para E16 ojos como los ojos son demasiado pequeños.
  4. Fijar las tapas de oculares (P0, P15 y P90) y los ojos todo (E16) en 4% PFA por 20 min a temperatura ambiente. Luego lavar las tazas de ojo y ojos todo dos veces en 1 mL de PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente.
  5. Cryoprotect el ojo tazas y todo ojos en 1xPBS, pH 8,0 conteniendo 10% de sacarosa durante 1 hora. Mantener en 20% de sacarosa en PBS 1 x durante 1 hora y luego saturar en sacarosa al 30% en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C.
  6. Al día siguiente, incrustar las tapas oculares y los ojos todo de corte óptima temperatura compuesto (OCT), (500 μl) en cryomolds, rápido-congele en un baño de hielo seco/etanol y almacenar a-80 ° C.
  7. Retirar los moldes con tapas oculares integrados y los ojos todo de-80 ° C y deje que se equilibre a-20 ° C durante 1 hora antes de cryosectioning.
  8. Corte secciones retiniana (12 μm de espesor) paralelo al eje de temporonasal a través de la cabeza del nervio óptico con un criostato a-20 ° C.
  9. Monte las secciones retinianas en microscopio diapositivas53 y conservar a-80 ° C.

2. Immunostaining con los anticuerpos mC 5 y 5-hmC

  1. Delimitar las secciones de retinales montadas en portaobjetos con un lápiz de la barrera hidrofóbica. La pluma de la barrera hidrofóbica reduce el volumen de anticuerpos necesaria para teñir el tejido.
  2. Lávese las secciones de retinales una vez con 200 μL de PBS 1 x durante 10 minutos.
  3. Permeabilizar las secciones retinianas con 200 μL de 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x (PBS-T) por 10 min a temperatura ambiente.
  4. Desnaturalizar secciones retinianas por 30 min con 200 μL de recién hechos 2 ácido clorhídrico (HCl) de N en PBS 1 x en una incubadora de 37 ° C.
    Nota: Titulación cuidadosa del tratamiento de ácido clorhídrico es necesario para optimizar la señal de la 5mC.
  5. Siempre incluyen biológicos repeticiones (3-4) al tiempo que optimiza la señal de 5mC54.
    Nota: Hicimos recuperación de antígeno en los 4 puntos de tiempo (15 min, 30 min, 1 h y 2 h) y encontraron 30 min de incubación es óptimo para la señal de 5mC. Incubación más larga con ácido clorhídrico degrada la estructura de los núcleos hacia la imposibilidad de localizar 5mC señal al núcleo.
  6. Después de la desnaturalización, neutralizar las secciones retinianas mediante la adición de 100 μl de 0,1 M Tris-HCl (pH 8.3) en secciones de retinales durante 10 minutos.
  7. Incubar las secciones en 500 μl de solución de bloqueo (5% de suero de cabra normal suero preinmunizado en 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x) por 1 h a temperatura ambiente en una cámara de humedad.
  8. Después de bloquear, añadir anti-5mC; anticuerpos anti-5hmC diluyen 1: 500 en el bloqueo de solución a las secciones de retinales.
  9. Incubar retiniana secciones durante la noche a 4 ° C en cámara.
  10. El siguiente lavado de día, secciones de retinales 3 veces (10-15 min cada vez) con 0.1% PBS-T y luego incubar en el bloqueo de solución con los correspondientes anticuerpos secundarios (anti-conejo de cabra y cabra anti-ratón IgG, diluido; 1: 1000), con DAPI (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) solución (1 μg/mL) a temperatura ambiente durante 1 h en solución de bloqueo.
    Nota: Evite secar secciones durante todas las etapas de inmunodetección.
  11. Lavar los portaobjetos tres veces con 1 mL de 0.1% PBS-T.
  12. Después del último lavado, Monte las secciones con medio de montaje acuoso bajo un cubreobjetos y sellar con esmalte de uñas incoloro.

3. confocal inmunohistoquímica

  1. Orientar a las secciones para tener el lado del epitelio pigmentario de la retina de la Copa óptica siempre frente a una forma (por ejemplo, arriba), para la consistencia.
  2. Realizar la captura de la imagen de immunostained retiniana secciones 63 X (magnificación de una lente objetivo) con 2 X o 3 X zoom.
  3. Generar múltiples secciones ópticas de cada imagen seleccionada (z-pilas) en todos los 3 canales (rojo, verde y azul, RGB) usando 0.35 μm paso.
    Nota: El aumento final de un espécimen visualizado en 10-20 X (magnificación de una lente objetivo) será 63 X, respectivamente, cuando se combina con un 10 (típicamente usada) X lente ocular.
    Visualizar pila óptica comprimido para localizar la señal de 5mC y 5hmC

Representative Results

Para determinar la distribución de 5-METILCITOSINA (5mC) y 5-hidroximetilcitosina (5hmC) durante el desarrollo de la retina y de retina postmitotic, immunostained C57BL/6J ratón retiniana sección de E16, P0, P15 y P90 con anticuerpos específicos a 5mC y 5hmC.

En E16 la 5mC tinción era fuerte en chromocenters de los núcleos de la célula mientras que la coloración débil se observó en los núcleos de células enteras (Figura 1a). La tinción de 5hmC fue confinada a los núcleos celulares y estuvo ausente de la chromocenters (Figura 1b).

En retina de P0, la señal de la 5mC fue localizada a la chromocenters de los núcleos celulares y la periferia nuclear (Figura 2a, flecha y punta de flecha). También observamos la coloración débil de 5mC entre la chromocenters de los núcleos celulares. La señal de 5hmC estaba fuertemente presente en los núcleos de la célula excepto el chromocenters (figura 2b). Encontramos que más núcleos se tiñen con 5mC y 5hmC en capas neuroblástica interna (INBL) (figura 2 c, línea de puntos)

En la retina de P15, encontramos la coloración fuerte de 5mC y 5hmC en la capa nuclear externa (ONL), la capa nuclear interna (INL) y la capa de células ganglionares (GCL) (figura 3). En ONL (fotorreceptores de la barra), la señal de la 5mC estuvo presente en la chromocenters de los núcleos celulares y la periferia nuclear (figuras 3a-3C, 3 g). La señal de 5hmC fue encontrada en los núcleos celulares todo excepto el chromocenters (figuras 3d-3f). La microscopía electrónica de transmisión hecha en P15 retina muestra distribución de heterochromatic dominios en núcleos de la célula de vástago similar a ésa encontrada con 5mC señal de anticuerpo (figuras 3 h y 3i).

La tinción de 5mC en INL y GCL era fuerte en el chromocenters de los núcleos de células y tinción débil también se observó en los núcleos de célula entera (figuras 3j-3 l y 3r-3t). En contraste con 5mC, fue localizada la señal de 5hmC a los núcleos de célula entera excepto la chromocenters de INL y GCL (figuras 3 m-3o y 3u-3w). Se observa fuertes señal 5hmC en la periferia de núcleos de célula del GCL.

En fotorreceptores de varilla adultos, la señal de la 5mC se restringió a la chromocenter y periferia nuclear de los núcleos celulares (figuras 4a-4C) mientras que 5hmc señal fue confinado a la periferia nuclear (figuras 4 d-4f).

Figure 1
Figura 1. Localización de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en retina de ratón embrionario día 16.
El immunostaining de C57BL/6J retina con los anticuerpos a 5mC (rojo a) y 5hmC (verde, b). En E16, 5mC señal es muy fuerte en chromocenters de los núcleos celulares y también presente en los núcleos de células enteras en nivel mucho más bajo. 5hmC de tinción se limitó exclusivamente a los núcleos celulares. Panel c representa 5mC combinado y 5hmC imagen. Los núcleos son contratinción con DAPI (azul, c). Márgenes representan aumentos del área que se indica con asterisco en las imágenes. Barra de escala: 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. La coloración de Immunohistochemical de la 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en retina de ratón en el día postnatal 0.
Inmunomarcación de C57BL/6J retina con los anticuerpos a 5mC (rojo a) y 5hmC (verde, b). En la retina de P0, 5mC y 5hmC están presentes en la capa externa neuroblástica (ONBL) y capas neuroblástica interna (INBL). a) señal 5mC está fuertemente presente en el chromocenters (flecha) y la periferia nuclear de los núcleos celulares (flecha). Coloración débil de 5mC también se observa entre el chromocenters de núcleos celulares. b) 5hmC de tinción se limita al núcleo celular y señal fuerte se observa en INBL (línea de puntos en el panel c). Panel c representa 5mC combinado y 5hmC imagen. Los núcleos son contratinción con DAPI (azul, c). Márgenes representan aumentos del área que se indica con asterisco en las imágenes. Barra de escala: 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. distribución de 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina en retina de ratón en el día postnatal 15.
Inmunotinción de C57BL/6J retina con anticuerpos anti-5mC y 5hmC (a-g, j-y). En la capa nuclear externa (ONL) (fotorreceptores de la barra), 5mC señal (rojo, un) generalmente coincide con la chromocenters de los núcleos celulares (punta de flecha, b) y también se localiza en la periferia nuclear (flecha, b). Panel b (rojo) y c (gris) representan aumentos del área se indica con asterisco en la imagen de un. La señal de 5hmC (verde, d) se limita a los núcleos de célula entera excepto el chromocenters. Grupo e (verde) y f (gris) representan la ampliación de área que se indica con asterisco en la imagen d. Panel g representa 5mC combinado y 5hmC imagen. Los núcleos son contratinción con DAPI. Panel h y son imagen de microscopio electrónico de transmisión de núcleos de fotorreceptor en la distribución de demostración día postnatal 15 de heterochromatic dominios. Flecha negra en panel h señala barra único fotorreceptor núcleo agrandado en panel i. puntas de flecha rojos en el panel que del punto i heterochromatic dominios dentro de núcleo del fotorreceptor de la barra mientras que las flechas rojas señalan a la heterocromatina en la periferia nuclear. INL (j-q) y los núcleos de célula GCL (r-y), la señal de la 5mC (rojo) se localiza a la chromocenters presente en la periferia y tinción débil se detecta también en el resto de los núcleos celulares. Grupo k (rojo) y yo (gris) representan aumentos del área que se indica con asterisco en la j imagen. La tinción de 5hmC (verde) en los núcleos de célula INL y GCL se limita al núcleo de toda célula. Nota 5hmC fuerte tinción en la periferia nuclear de las células GCL. X y p panel representan 5mC combinado y 5hmC imagen mientras que y y q panel representan la ampliación de área que se indica con asterisco en la imagen p y x respectivamente. Los núcleos son contratinción con DAPI. Barra de escala: 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. 5-METILCITOSINA y 5-hidroximetilcitosina distribución en núcleos de fotorreceptores de varilla de retina de ratón C57BL/6J en día postnatal 90.
La tinción de 5mC (rojo, un) está fuertemente presente en el chromocenter de los núcleos celulares y también débil presente en la periferia nuclear. Panel b (rojo) y c (gris) representan aumentos del área se indica con asterisco en la imagen de un. La tinción de 5hmC (verde, d) se limita exclusivamente a la periferia nuclear Panel e (verde) y f (gris) representan aumento de zonas indicadas con asterisco en la imagen d. Panel g representa 5mC combinado y 5hmC imagen al panel h es ampliación de zona con asterisco en la imagen que g. núcleos son contratinción con DAPI (azul). Barra de escala: 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hydroxymethylation y metilación del ADN son modificaciones de ADN dinámicos y reversibles, que modulatethe diversos mecanismos biológicos en el desarrollo, así como en postmitotic células. Aquí, describimos una técnica reproducible para detectar 5mC y 5hmC ADN modificaciones en situ por técnica de inmunohistoquímica (usando anticuerpos anti-5mC y anti-5hmC) en secciones congeladas de paraformaldehído-fijo de la retina de ratón y proporcionar directrices para la mejora y estandarización de los resultados, especialmente cuando se comparan a varias muestras diferentes. Anteriormente utilizó este método para delinear 5mC cambios en retina de ratón con retina específica selección de Dnmt1, Dnmt3a y Dnmt3b ADN metiltransferasa genes y divulga el agotamiento (esperado) de 5mC marcas en sus retinas7 .

El paso crítico en la detección de immunohistochemical de 5mC es la optimización del tratamiento de las secciones histológicas con HCl: menos de 15 min pretratamiento no se espera que produce resultados reproducibles, considerando que el tratamiento excesivo con el HCl destruye la central nuclear arquitectura. Se encontraron mejores resultados después de 30 min de incubación con ácido clorhídrico. Recomendamos utilizar siempre recién diluido HCl y solución PFA 4% recién hecho para la fijación de tejido de desnaturalización y retina ADN.

Para solucionar los resultados, se recomienda incluir tres o cuatro repeticiones biológicas y optimizar la señal de la 5mC. Mientras que cada individuo de la coloración de immunohistochemical puede generar resultados ligeramente diferentes (regiones heterochromatic más o menos brillantes), que se espera en immunohistochemical método, 5mC y 5hmC distribución nuclear dentro del conjunto de los de las secciones se espera que sea muy reproducible, para mientras se sigue el protocolo.

Esta técnica tiene también limitaciones como constantemente se observó variabilidad en la distribución de la 5mC en los núcleos de célula del fotorreceptor dentro de la misma sección. Encontramos algunos núcleos demostradas 5mC fuerte señal, mientras que los núcleos de célula adyacente no demostraron ninguna señal de 5mC. Esto es debido a la limitación en desenmascarar antígenos 5mC por tratamiento de ácido clorhídrico en secciones congeladas.

La importancia de esta técnica permite 5mC localización sin DNasa y proteinasa K tratamiento conduce a la mejor preservación de chromocenters. Esta técnica es esperar a trabajar enérgicamente en las secciones de todos los tejidos de animales vertebrados, 5mC transporte, marcas 5hmC y procesada con un enfoque similar, no sólo retina de ratón, para mientras se sigue el protocolo.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por una subvención SBIR (1R44EY027654-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
29G1/2 ULTRA-FINE BD Biosciences 329461
Ophthalmic scissor Fine Science tools, Inc.  15000-03
PAP pen RPICORP.com 195505
Microslide Superfrost plus VWR 48311-703
Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscope Science 15710
1x PBS Corning 21-031-CV
Sucrose Sigma S9378
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) VWR 4583
Triton X 100 Sigma T9284
6 N HCl VWR analytical  BDH7204-1
Tris-HCl pH 8.3 Teknova T1083
Goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
5mC Genway Biotech  GWB-BD5190
5hmC Active Motif 39791
LaminB1 Abcam Ab16048
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch 111-225-1444
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-585-166
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306
Prolong Gold Antifade medium Thermo Fisher Scientific P36930
Equipment
MICRM HM 550 Thermo Fisher Scientific 388114
Confocal microscope Zeiss

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