Evaluación de estrés celular y la inflamación en discretos núcleos de cerebro secretoras de oxitocina en la rata Neonatal antes y después de la primera alimentación de calostro

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Immunology and Infection

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar los núcleos cerebrales en el cerebro de rata neonatal en conjunto con la primera alimentación de calostro. Esta técnica permite el estudio del estrés de la escasez de nutrientes en el cerebro como modulado por señales del enterocyte.

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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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Abstract

El objetivo de este protocolo es aislar núcleos de ideas ricos de receptores de oxitocina en el cerebro neonatal, antes y después de la primera alimentación de calostro. La expresión de proteínas conocidas para responder al estrés metabólico se midió en aislamientos de núcleos cerebrales mediante Western blot. Esto se hizo para determinar si la insuficiencia de nutrientes inducida por el estrés metabólica en el cuerpo desencadena estrés neuronal. Previamente hemos demostrado que la insuficiencia de nutrientes en los recién nacidos provoca estrés metabólico en el intestino. Además, la oxitocina calostro modula marcadores de autofagia, la inflamación y la respuesta de estrés celular en villi de intestino de rata recién nacido antes y después de la primera alimentación. Señalización de marcadores de proteínas asociados con el estrés del retículo endoplásmico [ER acompañante inmunoglobulina proteína (BiP), traducción en eucariotes iniciación factor 2A (eIF2a) y eIF2a quinasa quinasa proteína R (p-PKR)], así como dos inflamación-señalización proteínas [factor nuclear-κB (NF-kB) y κB inhibidor (IkB)], se midieron en núcleos del cerebro del recién nacido [núcleo del tracto solitario (NTS), núcleo paraventricular (PVN), núcleo supra óptico (hijo), cortex (CX), núcleos del estriado (STR), y núcleo preóptica medial (MPO)] antes de la primera alimentación (sin imprimación por el calostro) y después del comienzo del oficio de enfermera (preparado por el calostro). Expresión de BiP/GRP78 y p-eIF2a era upregulated en unprimed y regulada en tejido preparado de NTS. NF-kB se mantuvo (alto) en el citoplasma CX, STR y MPO, mientras que NF-kB era baja y sin cambios en NTS, PVN e hijo en ambas condiciones. El colectivo BiP y p-eIF2 los resultados son consistentes con una respuesta de estrés. eIf2a se fosforila por kinasa dependiente de dsRNA (p-PKR) en el hijo, CX, STR y MPO. Sin embargo, en las noches (y en menor medida en PVN), eIf2a se fosforila por otra quinasa, control general nonderepressible-2 (GCN2). Los mecanismos de modulación de estrés observados previamente en los enterocitos del intestino del recién nacido parecen espejarse en algunas regiones del cerebro ricas en OTR. El NTS y PVN pueden utilizar un mecanismo de fosforilación diferentes (bajo deficiencia de nutrientes) de otras regiones y refractaria a los efectos de la escasez de nutrientes. Colectivamente, estos datos sugieren que las respuestas cerebrales a la tensión de la escasez de nutrientes se compensan con señalización de enterocitos calostro preparado.

Introduction

En contraste con nuestra comprensión del desarrollo temprano del cerebro que ocurre en el transcurso de días-a-semanas después del parto, relativamente poco se sabe acerca de la miríada de cambios dinámicos que ocurren en las primeras horas de vida en ratas. Un desafío clave ha sido el pequeño tamaño del cerebro de rata neonatal y un requisito para herramientas de alta tecnología aislar regiones discretas del cerebro o las células. Estudios a menudo evaluación gene transcripción y traducción no1,2, que no da una comprensión firme de los niveles funcionales de moléculas de señalización activadas. Otros examinan la expresión usando immunohistochemistry para referencia regiones del cerebro, que no permite la cuantificación de los niveles de expresión3. Ningún estudio hasta la fecha ha estudiado la activación de la señalización de vías asociadas con calostro primera ratas de alimentación en regiones discretas del cerebro, que requiere rápido aislamiento y sacrificio y medición de la expresión de la proteína y fosforilación de la proteína mediante Western borrar. Mientras que el microdissection del cerebro se realiza en los cerebros más viejos y más grandes, no hemos identificado una referencia realizando un golpe sola célula cerebral en un cerebro de P0. Este papel presenta un protocolo para aislar regiones restringidas del cerebro neonatal utilizando una técnica de perforación relativamente baja y un procedimiento de Western blot para medir la expresión de proteínas en muestras relativamente pequeñas. Este protocolo puede ser conveniente para las preguntas de investigación que requieren la evaluación de la expresión de proteínas y modificaciones postraduccionales (por ej., fosforilación) en regiones relativamente restringidas de pequeños cerebros de cualquier especie, siempre que el usuario puede identificar visualmente la región cerebral de interés con un atlas y puntos de referencia identificables.

Esta técnica fue desarrollada para entender los cambios que ocurren en el cerebro como resultado de calostro primera las ratas neonatales de la alimentación, que es rico en oxitocina (OT). OT ha sido mucho tiempo conocido por su capacidad para estimular contracción uterina y de bajada de leche. Sin embargo, OT ahora se sabe que desempeñan una amplia gama de papeles en la regulación de muchas funciones corporales y conductas4. Por ejemplo, OT se opone a la tensión y la inflamación en relación con los comportamientos de adaptación afiliativo5, retrasa el vaciamiento gástrico y disminuye el tránsito intestinal. Se han identificado receptores de OT (OTR) en las neuronas entéricas y epitelio intestinal6,7,8. Los efectos gastrointestinales de los OT son particularmente importantes para el niño durante el período postnatal temprano. Por ejemplo, lactancia materna se asocia con la entrega de cantidades significativas de OT para el intestino neonatal9,10, y los datos muestran que el OTR es overexpressed fuertemente en vellosidades duodenales durante la leche lactantes período8.

In vitro los experimentos usando una línea celular de tripa han demostrado a nivel celular que la oxitocina modula moléculas importantes en la tensión de señalización vía11,12 y juega un papel regulador en la traducción de proteínas 12. estos estudios sugieren que los componentes de la leche, incluyendo oxitocina exógena de la madre, son importantes en la respuesta de la proteína desdoblada en recién nacidos para reducir el estrés celular13.

Estudios in vivo y ex vivo han demostrado que el calostro OT modula los marcadores de autofagia, la inflamación y la respuesta de estrés celular en villi de intestino de rata recién nacida. Enterocitos recién nacidos sufren estrés celular substancial en su lado luminal cuando el intestino está expuesto simultáneamente a microbiota de la madre en el calostro14,15 y numerosas proteínas, incluyendo las hormonas como OT9 , 10 , 16.

Los efectos de la OT en el cerebro han sido estudiados17. Sin embargo, los mecanismos de señalización de OT demostrados en el intestino durante el periodo postnatal temprano no han sido estudiados en el cerebro. En este trabajo, un método para aislar los núcleos cerebrales discretas en el tallo cerebral de rata neonatal y el hipotálamo mediante electroforesis se utiliza para las regiones del cerebro aislado de perfil. El objetivo general de este método es capturar el estado de señalización en áreas del cerebro lo más cerca posible al nacimiento, antes y después de la primera leche de cochinillo, en el tejido cerebral con el índice más bajo de glial/neuronal de la célula. El fundamento para el desarrollo de esta técnica es que permite el rápido aislamiento de las regiones del cerebro restringido, microscópico en cachorros neonatales con una colección más homogéneo de neuronas ex vivo estudios mediante un Western Blot automatizados metodología, ofreciendo resultados muy consistentes en muestras relativamente pequeñas disecadas. Un defecto de trabajo previo incluye más disección bruta (rebanadas de cerebro o todo el cerebro) y mayores de18,de animales19. El cerebro de los cachorros jóvenes es increíblemente dinámico, con olas de diferenciación glial después del nacimiento. Para estudiar cambios en el cerebro influenciados por primera alimentación de los cachorros, es necesario estudiar restringidos núcleos neuronales con disección reproducible.

Leche alimentación generalmente se analiza para su impacto inmunológico y nutricional para la salud o gene expresión (por ejemplo, en los enterocitos20,21), mientras que raramente se estudia su efecto en las áreas del cerebro durante el desarrollo del cerebro. Se analizó el efecto del tránsito de la leche en el intestino en función del cerebro en referencia a gut colecistoquinina receptores vagales relé núcleos del vástago de cerebro, pero no de caminos señalización intracelular22. Existe una vasta literatura sobre vulnerabilidad del cerebro en desarrollo de recién nacido a la desnutrición de las madres durante el embarazo23, pero no se abordan las señales de estrés y la inflamación. Importante, aprovecha el método actual de un fenómeno en recién nacidos de la rata de día cero que aísla los estímulos calostro nacido sangre del relais vagal de los estímulos viscerales. Éste es el período de hypo respuesta llamado estrés caracterizado por inmaduros núcleo del tractus solitarius (NTS)-circuito hipotalámico inmediatamente después del nacimiento24,25 que restringe el NTS, núcleo paraventricular (PVN), y núcleo supraóptico (SON) las señales a los estímulos nacidos de sangre.

Este método es útil para el análisis de múltiples vías de señalización y relativamente restringida a las células neuronales, siempre que el tejido cerebral se cosecha en el día-0 postnatal en ratas, además de si las madres han sido impugnadas o no por cualquier tipo de tratamiento durante el embarazo. Camadas pueden ser analizadas para los efectos del calostro versus la alimentación señalización de alimentación. Al comparar las señales entre las áreas del cerebro con pobres versus rendimiento proteína rica, este método permite en capilar determinación de proteína total de las bandas polipeptídicas paralelas a inmune-cuantificación de antígenos de la proteína de los capilares. Este método permite la comparación cuantitativa, utilizando unidades arbitrarias, de los resultados obtenidos por el mismo anticuerpo sin curvas cuantitativas estándar y de referencia para proteína total por tubo capilar. Comparar resultados obtenidos por los diferentes anticuerpos es posible sólo mediante curvas estándar cuantitativas.

Este método permite la evaluación de la señalización que ocurre entre el intestino y el cerebro y que puede afectar a la función en ambos órganos26bidireccional. La asociación entre la oxitocina e ingesta de alimentos, que ha sido extensamente estudiada en años recientes27, respalda un vínculo entre la oxitocina mayor señalización y disponibilidad de nutrientes. Estos estudios apoyan también el concepto de converse esa energía déficit está acoplado con la reducción en la señalización hipotalámica oxitocina.

Estudios anteriores del efecto de la OT en la actividad cerebral demostraron que inflamación intestinal inducida produce transcripción cFos en corteza piriforme, PVN y amígdala hipotalámica que era refractaria a la vagotomía28. Sin embargo, la infusión sistémica de OT con secretina disminuyó la respuesta cerebral de cFos a la reacción inflamatoria provocada en la tripa28. Esto sugiere que el efecto de la OT exógena se llevó a cabo por rutas diferentes relés vagales, posiblemente a través de moléculas de señalización transmitidos por la sangre por el área postrema6,29.

En este estudio, se evaluaron las vías de señalización del estrés celular previamente observadas en el intestino que en el cerebro. La hipótesis fue que los componentes de la leche pueden proteger o diferir el efecto de la inflamación en la permeabilidad del intestino a metabolitos microbianos y otros, y a su vez, los efectos en el cerebro la función. Las diferencias claramente antagónicas en IkB versus BiP señalización encontrada en las vellosidades, antes y después de cebado por calostro13, sugieren que los cerebros de los recién nacidos, aún en el proceso de desarrollo, pueden detectar estas señales de calostro-inducida del intestino.

Se midieron marcadores de proteínas señalización utilizados en los experimentos anteriores de tripa que se asocian a estrés del retículo endoplásmico. Incluyen las chaperonas de ER BiP, traducción iniciación factor eIF2a (que sirve como una respuesta de estrés integrador30), eIF2a quinasa p-PKR y dos proteínas de señalización de la inflamación (NF-kB y su inhibidor IkB).

Se eligieron seis regiones cerebrales basadas en su capacidad en adultos secretan o responder a OT. El NTS, situado en la médula superior, es el primer relais de la entrada visceral y recibe señalización directa de neuronas sensoriales vagales en el intestino31 citoquinas posiblemente nacido de sangre, toxinas y hormonas a través de la zona-postrema adyacente32. El PVN, núcleo supraóptico (hijo), núcleos del estriado (STR), corteza cerebral (CX) y núcleo preóptica medial (MPO) reciben señales desde el intestino a través del NTS.

Resultados mostraron que la respuesta celular al estrés durante el período postnatal inmediato antes del cebado de calostro e inmediatamente después de primera alimentación es diferente en NTS en comparación con el PVN y el hijo. Señalización en CX, STR y MPO diferenciaron de ése del PVN y del hijo, así. Las distintas funciones de OT se mostraron anteriormente para modular el estrés celular y la inflamación en el intestino se sintió probablemente por algunas áreas del cerebro. Colectivamente, los datos indican que a nivel celular, durante las primeras horas después del nacimiento, el cerebro responde al estrés metabólico asociado con la escasez de nutrientes. Los datos también muestran que la magnitud y dirección de los efectos moduladores de calostro de alimentación dependen de la región y que en algunas regiones, reflejan efectos de OT se muestra anteriormente en el intestino.

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Protocol

Este estudio fue aprobado por los comités de uso en la Universidad de Columbia y el Instituto psiquiátrico del estado de Nueva York y de institucional Animal Care.

1. preparación de tejido

  1. Pedir tiempo ratas preñadas de vendedor.
  2. Siga ratas embarazadas tiempo observando sus abdómenes de cada vez mayores en las semanas después de su llegada y posteriormente buscando cachorros en la fecha prevista para el parto mediante la inspección de la jaula cada 2 h hasta que entrega.
  3. Quitar los cachorros con una mano enguantada por la cola antes de su primer alimento para cachorros sin imprimación (no vientre blanco leche es evidente al ver abdomen) o después de la primera alimentación para cachorros preparados (momento en el que un estómago blanco será visible en su abdomen) como se describe en el timeli NE (Figura S1).
    Nota: La primera alimentación de calostro se denomina como cebado el cachorro; así, un cachorro es unprimed hasta la primera alimentación, después de lo cual son calostro preparado.
  4. Rápidamente decapitar el cachorro sin anestesiar con unas tijeras afiladas, limpieza quirúrgicas.
  5. Quite el cerebro cortando la piel hacia abajo de la línea media y la superficie superior del cráneo a la nariz. Entonces, con fórceps, suavemente Levante lejos del hueso para exponer el cerebro (figura 1A) y localizar el bregma, marcando con un lápiz como se quitan las placas de hueso (figura 1B).
  6. Rápidamente Coloque todo el cerebro en un molde de cerebro de polimetil metacrilato en temperatura para coronal corte a temperatura ambiente (figura 1).
  7. Sin demora, hacer 500 rebanadas de mm de espesor utilizando una hoja de afeitar nueva. Coloque las rebanadas de rostrales a caudal en una placa de Petri para mantener la orientación de las secciones (figura 2).
  8. Rápidamente añadir líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF; 1,0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118,6 mM NaCl, 3,0 mM KCl, 203,3 mM MgCl2-6 H2O) sin glucosa e incubar las rebanadas durante 60 min a 28-30 ° C, agitando constantemente en un Agitador orbital para metabólicamente y diferencialmente la unprimed versus tejidos calostro preparado.
  9. Identificar los núcleos cerebrales que se requieren para perforar utilizando un cerebro atlas33 y puntos de referencia anatómicos en la sección de tejido. Esta rebanada con los núcleos de interés en una placa Petri y muévala al microscopio de disección.
  10. Una vez visualizado, rápidamente golpe 4 de 6 núcleos diferentes utilizando una herramienta de perforación, seleccionando el tamaño mejor perforar el núcleo en cuestión y consistente entre las muestras (figura 2).
    Nota: El segmento restante del cerebro ahora tendrá un agujero donde quitó tejido cerebral. En este estudio, hemos suprimido los siguientes núcleos usando el debajo de coordenadas. Todo anterior posterior (A / P) son coordenadas del vértice (excepto n, que es referente al Calamus Scriptorius). Todas las coordenadas (D/V) dorsal/ventral son de la superficie de la corteza (excepto n, que es de la superficie de la médula). Las siguientes coordenadas incluyen A / P, medial/lateral (M/L) y D/V en mm: 1) núcleo del tracto solitario (NTS, A / P, 0.4 a 0.8; L, ± 0,2; D/V, 0,3 (desde la superficie de la médula), 2) núcleo paraventricular (PVN, -0.8; ± 0,2; 0), 3) núcleo supra óptico (hijo, -1,1; ± 1.4; 4.3), 4) corteza (CX, área de la corteza parcial 1, -2.8; ± 1.5; 0,6), 5) núcleos estriado (STR,-0.0; ± 1,6; 1,8) y 6) preoptic intermedio núcleo (MPO, -0,6; ± 0,2; 4.2).
  11. Sumergir rápidamente los núcleos perforados en 0,06 mL de tampón de extracción de proteína helada, que contiene inhibidores de la proteasa y los inhibidores de fosfatasas por 60 minutos (consulte el paso 2.3).

2. extracción de proteínas

  1. Preparar la solución de extracción de proteína utilizando el kit de la lisis de proteínas (Tabla de materiales) el día antes de la entrega del cachorro esperado.
  2. Descongelar (sobre hielo) la solución acuosa congelada (-20 ° C) de los inhibidores de proteasa y fosfatasa del kit de buffer de lisis y coloque la solución de DMSO de los inhibidores de las proteasas/fosfatasas y tampón de lisis en hielo.
  3. Añadir 1,85 mL de tampón de lisis en un tubo de 15 mL limpia y helada. Luego, Añadir 0,1 mL de solución acuosa de inhibidores y 0,05 mL de inhibidores disuelto en DMSO. Por último, tapa y brevemente agitar el tubo y conservar a-20 ° C hasta su uso.
  4. 24 tubos de microcentrífuga limpio (0,5 mL) para el procedimiento de lisis de la etiqueta. 12 tubos designados por el cerebro para el grupo sin imprimación el calostro (U) [6 izquierda (L) y 6 derecha núcleos de cerebro (R)] y etiqueta según siglas de núcleos, lado y la condición (por ej., n-L-U, n-R-U, etc.). El segundo grupo de 12 tubos para las muestras de calostro preparado de la etiqueta.
  5. Etiqueta dos juegos adicionales de tubos como hecho en el paso 2.4 para los extractos de proteína stock (usando tubos tipo Eppendorf de 1,5 mL) y para el primer juego de preparación de la muestra (usando tubos de 0,5 mL). Mantener los tubos en dos separadas etiquetadas congelación cajas (cada una diseñada para 100 tubos). Se utilizará una caja para las muestras sin imprimación y otro para las muestras de cebada.
  6. Descongelar la solución de lisis en hielo el día que los cachorros se entregan y mientras incuban rebanadas de cerebro en ACSF, alícuota 0,06 mL de solución de lisis en los tubos de lisis del procedimiento (del paso 2.4) y agregar núcleos Punzones e incubar en hielo durante 60 minutos.
  7. Centrifugue los núcleos sometidos a lisis incubados por 30 min en una centrífuga refrigerada mini a 14000 rpm (10.000 x g) y aspirar cuidadosamente 0,055 mL del sobrenadante con una pipeta correctamente ajustada. Transferir el sobrenadante a los tubos comunes de 1.5ml previamente enfriado (de paso 2.5) y ponerlos en hielo. Antes de congelar (a-20 ° C) los tubos comunes de proteína, transferencia de 0,012 mL de sobrenadante en los tubos previamente enfriado de 0.5 mL para la primera preparación de la muestra (del paso 2.5) y dejarlos en hielo.

3. preparación para la medición de proteínas en el capilar

  1. Utilice un kit y preparar los reactivos para la separación según las indicaciones del fabricante. Añadir 0,003 mL de reactivo de la master mix a cada una de las 12 muestras de 0,5 mL etiquetado tubos (del paso 2.5) en el hielo que contienen 0,012 mL de los extractos de proteína.
  2. Abra el bloque calefactor a 95 ° C y añadir 0,004 mL del reactivo preparado en el paso 3.1 a escalera biotinilado peso molecular (MW) en un tubo con 0,016 mL de agua desionizada. Para desnaturalizar la escalera y muestras, coloque el tubo de la escalera y las 12 muestras de extractos proteicos sin imprimación en el bloque de calor a 95 ° C por 5 min y almacenarlos a 4 ° C hasta su uso.
  3. Repita los pasos 2.0 a 3.2, de extracción de proteínas para la preparación de la muestra, para los núcleos perforados de ratas calostro preparado.

4. electroforesis preparación

  1. Descongelar la biotina etiquetado reactivo (almacenado en el congelador a-80 oC) en el Banco y preparar el kit de detección de proteína en hielo a 4 º C siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Mezclar 0,15 mL de luminol con 0,15 mL de peróxido y carga 0.01 mL en 25 pozos (fila E, pozos de 1-25) de la placa de la máquina automatizada de la occidental. 0,008 mL de estreptavidina-HRP de carga del kit en pocillos D1 a D25
  3. Carga 0,01 mL de la solución diluyente de anticuerpos en pocillos C1 a C25 y B1.
  4. Girar las 24 muestras de proteína y escalera los tubos brevemente (2-3 segundos) en un minicentrifuge a piscina por agua evaporada de los casquillos de tubo.
  5. Cargar 0,003 mL de 12 muestras sin imprimación en pozos A2 A13, 0,003 mL de 12 muestras de calostro preparado en pocillos A14 a A25 y 0,005 mL de la escalera biotinilado en A1 bien.
  6. Deje la fila F vacío y carga 0,45 mL de tampón de lavado en cada uno de los 5 compartimentos en cada una de las 3 filas por debajo de la fila F. cubierta la placa con su tapa de plástico para evitar la evaporación durante los procedimientos restantes.
  7. Vortex brevemente la biotina descongelada etiquetado reactivo y agregar 0,15 mL de reactivo a su tubo designado; luego añadirle 0,15 mL del agente de la reconstitución de proteínas totales y mezclarlas a homogeneidad.
  8. Retire la cubierta de la placa y coloque 0.01 mL de agentes 1 y 2 en pozos B2 a B25. Cubrir la placa y centrifugar durante 10 min a 1.000 x g para eliminar cualquier burbuja de aire de las distintas soluciones. Utilice un plato vacío en la centrifugadora para el equilibrio.

5. electroforesis

  1. Mientras el plato gira, abrir un archivo de ejecución en el equipo de conexión de la máquina occidental automatizado indicando en la página de menú desplegable "archivo" para ejecutar un análisis de proteína total y haciendo clic en el lugar respectivo.
  2. Anotar las muestras por pozo en el equipo. A continuación, retire la placa de la quitar la tapa de la centrífuga y retire cuidadosamente la cubierta de aluminio de los compartimentos de la solución de separación.
  3. Colocar la placa en el instrumento occidental automatizado, retire la tapa de la caja del cartucho capilar, inserte el cartucho en su lugar designado y cierre la puerta.
  4. Haga clic en el botón "Ejecutar" y cuando se le solicite con el tipo de ensayo ("proteína total"), escriba el nombre de las muestras (por ejemplo, "pintura 2-13 y calostro preparado 14-25"). Haga clic en "Aceptar" y cuando te pregunte por la fecha de ejecución activado y número de identificación del archivo run, tome nota de la hora cuando termina el plazo.
  5. Al final de la carrera (170 min después del inicio), abra la puerta del instrumento, retire el cartucho capilar y deséchela en la eliminación de objetos punzantes. Deseche la placa en la eliminación de la materia biológica.
  6. Haga clic en el icono de las curvas de separación en la página de análisis del archivo ejecutar y comprobar que todas las muestras han ejecutado correctamente y muestran múltiples curvas de proteínas en los capilares.

6. Análisis de proteínas de señalización

  1. En un tubo etiquetado 1,5 mL, Añadir 0,003 mL de conejo anti anticuerpo phospho-eIF2a (p-eIF2a) y suspender en 0,3 mL (dilución 1: 100) en diluyente del kit de detección adecuada de anticuerpos. Luego, mantenerla en hielo.
  2. Etiquetar un tubo de luminol y agregar 0,15 mL de luminol y 0,15 mL de peróxido de este kit del módulo de detección y dosificación 0,01 mL en los pocillos E1 a E25 de una placa occidental fresca, automatizada.
  3. Dosificación 0,01 mL del secundario anti anticuerpos en pocillos D2 a D25 y añadir 0,01 mL de estreptavidina-HRP kit de D1 bien.
  4. Dosificación 0,01 mL del anticuerpo primario (en el paso 6.1) en los pocillos C2 a C25 y agregar 0,01 mL de la solución 2 diluyente de anticuerpos en pocillos C1 y B1 a B25.
  5. Deje en blanco los pocillos de la fila F y llenar 0,45 mL de tampón de lavado en el 5 compartimiento de 3 filas debajo de la fila F.
  6. Girar brevemente las muestras refrigeradas durante 3 s y añadir 0,003 mL de cada muestra a la columna A en el mismo orden que fueron agregadas para el análisis de proteína total, a partir de A2 a A25. Añadir 0,005 mL de la escala de MW biotinilado bien A1 y cubrir la placa.
  7. Centrifugar la placa como hecho en el paso 4.8. Mientras el plato gira, abrir (en el software automatizado de Western-asociada y la computadora) un nuevo archivo de ejecución e indicar en la página de la lista desplegable de "Archivo" para ejecutar un ensayo de tamaño molecular haciendo clic en el lugar respectivo.
  8. En la página de ensayo, escriba los nombres de muestra en cada tubo capilar, luego escriba el nombre del anticuerpo primario en el lugar asignado y el anticuerpo de anti-conejo secundario debajo de él.
  9. Al final de la centrifugación, repita pasos 5.3 – 5.5, excepto el nombre del archivo ejecutado este tiempo debe ser "p-eIF2a en unprimed 2 – 13 y 14 – 25 calostro preparado".
  10. Después de la separación de electroforesis, compruebe el archivo ejecutado para picos de reactividad inmune de antígenos en tamaños de 40-43 kDa. Que MW de los picos de este tamaño, haga clic debajo de la curva e indicar dentro de la lista desplegable agregar MW a la cima, que asegura que el tamaño y cantidad arbitraria por debajo de la curva se registran.

7. procesamiento de los resultados

  1. Abrir un archivo de hoja de cálculo para proteína total run en el occidental automatizado ejecute archivo y proporcionar un número de identificación.
  2. Abra el archivo de ejecución de la prueba de proteína total en la página de análisis en el modo de curva y marque todos los picos en los tubos capilares. Luego, copiar y pegarlos en la hoja de cálculo y sumar las áreas bajo la curva de los picos registrados en el capilar entero.
  3. En una columna independiente, organizar la cantidad total de proteína para cada columna con el número capilar, nombres de los núcleos cerebrales respectivos y los números de identificación de los archivos de gestión.
  4. Abrir una hoja de cálculo para el antígeno p-eIF2a y en una sola columna, anote el área bajo la curva de cada capilar side-by-side con su respectivo número capilar, nombre del núcleo del cerebro y número de identificación de archivo ejecutado.
  5. Copiar la columna de proteína total (paralelo a las cantidades de p-eIF2a curva) en una tercera hoja de cálculo y calcular p-proporciones de proteínas eIF2a:total en la tercera columna.
  6. Recoger resultados de los pasos 4 a 6 para cada núcleo cerebral, organizarlos en grupos de núcleos y generar un gráfico de barras.

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Representative Results

Las bandas representativas del immunoreactivity en relación con proteínas totales muestran núcleos cerebrales con muy baja proteína cosechado. Esto requiere el uso de la técnica de Western blot automatizados, que es muy sensible comparado con el canónico Western blot. Este enfoque puede funcionar con menos proteína fortyfold por capilar en comparación con el por carril en manchas blancas /negras occidentales.

Efectos diferenciales de cebado el calostro en niveles de BiP en núcleos del cerebro

Secciones coronales de cerebro de rata fueron cosechadas antes el calostro primera alimentación (sin imprimación) y después de la primera alimentación (cebada). Las muestras fueron fraccionadas por electroforesis capilar (en WES) y las proteínas se cuantificaron con el kit para tinción de proteínas totales en el capilar (ver protocolo). Fraccionamiento capilar inmune adicional sobre el occidental automatizado proporciona identificación de los antígenos de la proteína respectiva. En la Figura 3A, representativa expresión de la proteína BiP se muestra en el panel superior, con la correspondiente proteína total que se muestra a continuación. BiP es una proteína de chaperonas de ER. En la figura 3B, immunoreactivities cuantificados son presentados por gráficos de barras con respecto a la proteína total correspondiente.

Dentro de las muestras de tejido sin imprimación, BiP niveles en NTS fueron significativamente superiores en comparación con otras regiones (p < 0.05, n = 4 núcleos). Oscurecimiento del tejido del intestino con calostro tuvo un efecto opuesto en NTS, en comparación con BiP aumento en otras regiones, en relación con el tejido sin imprimación (figura 3B). Disminución de BiP en NTS (figura 3B) y no tuvo ningún efecto en el PVN y SOPT. Sin embargo, cebado aumentó BiP en CX, STR y MPO en relación con tejido sin imprimación. Este dato implica que niveles de BiP en los núcleos cerebrales probado varios responden de diferente manera gut cebado y allí no todavía todo demostrada la diafonía entre los varios núcleos probados.

Efectos diferenciales de cebado el calostro en niveles de ElF2a y p-elF2a en núcleos del cerebro

Muestras de tejido de cerebro fueron preparadas, analizadas y cuantificadas como se muestra en la Figura 3A y 3B. Como con los niveles de BiP (figura 3B), elF2a y p-elF2a niveles en NTS fueron elevados en la condición sin imprimación en relación con otros núcleos (Figura 4B y 4C). Como se demuestra con los niveles de BiP, la respuesta en n al oscurecimiento del tejido del intestino con calostro fue opuesta a la en otros núcleos. Niveles de elF2a y p-elF2a en n se redujeron en relación con el tejido sin imprimación. En todos los otros núcleos probados, cebado de aumento en los niveles de elF2a y p-elF2a en relación con el tejido sin imprimación (Figura 4B y 4C).

Fosforilación de elF2a por quinasa GCN2 en NTS y PVN después de cebado de calostro

Muestras de tejido de cerebro fueron preparadas, analizadas y cuantificadas como se muestra en la figura 3. Cebado fallecido p-PKR en PVN (χ2 p = 0.025), a diferencia de todas las demás regiones donde fue aumentado. Contrario a p elF2a resultados (figura 4), los niveles de p-PKR fueron bajos en las muestras sin imprimación en relación con las muestras cebadas en NTS (figura 5A). Fosforilación de elF2a generalmente es catalizada por la cinasa PKR en respuesta a virus34 y OT en el intestino, como previamente demostrado11. Sin embargo, el hecho de que p-PKR los niveles eran muy bajos en pintura versus NTS preparado (en relación con otros núcleos, figura 5A) fuertemente sugiere que otra quinasa debe estar involucrado en fosforilar elF2a (figura 4). En consecuencia, niveles de GCN2 probaron en NTS y PVN porque también es una quinasa conocida de elF2a35. Niveles de p-GCN2 (forma activa) fueron mayores en las muestras sin imprimación en comparación con muestras de cebada en NTS y PVN (figura 5B) y GCN2 (forma inactiva), en comparación con p-GCN2, inversamente se expresó en el PVN (figura 5). pGCN2 en n (figura 5) fue expresado inversamente a pPKR (figura 5A) en NTS no cebada y cebada. En el tejido preparado, p-eIF2a fue considerablemente menor en n que en el resto de las regiones del cerebro [PVN (p < 0,01), hijo (p < 0,01), CX (p < 0.01) y MPO (p = 0.02)]. Esto indica que pGCN2, en vez de pPKR, era responsable de la inhibición de eIF2 en NTS.

Cebado de calostro inhibe el NF-kB en CX, STR y MPO

La figura 6A muestra que niveles de IkB fueron significativamente superiores en hijo pintura muestras de cebada vs. Niveles de IkB en hijo, CX, STR y MPO marcado una tendencia mayor en la misma dirección. En la figura 6, los niveles de NF-kB en CX, STR y MPO fueron significativamente superiores en cebada versus tejido sin imprimación. Sin embargo, los niveles de NF-kB fueron significativamente menores en tejido NTS preparado, lo que sugiere que el calostro tenía un efecto antiinflamatorio distintas en esta región del cerebro. Citosólica de NF-kB fue mayor (retenidas) en unprimed n las muestras, mientras que su inhibidor IkB fue baja y sin cambios en las muestras de cebada. Esto sugiere que un mecanismo antiinflamatorio distinto es regulación de NF-kB en NTS. Este efecto del estrés de escasez de nutrientes es constante con resultados actuales que hacen hincapié en marcadores BiP y p-eIF2a están regulados por la presencia de cebado de calostro (figuras 3 y 4, respectivamente), también se muestra en la anterior BiP y p-elF2a resultados10. La razón de la distinta respuesta del IkB y NF-kB en NTS comparado con CX, STR y MPO no se entiende todavía completamente. Sin embargo, es consistente con la observación que el NTS, que transmite señales desde el intestino al cerebro, pueden desempeñar un papel crucial en la respuesta única y opuesto frente a otras regiones del cerebro en comparación a los inflamación periférica36. Niveles de IkB en CX, STR y MPO fueron bajos (figura 6A), en comparación a los niveles de NF-kB en las mismas áreas (figura 6). Si bien este hallazgo aparentemente contradice la premisa que IkB es obligatoria y retención NFkB en el citosol, cálculos diferentes de los datos que combina y comparan muestras todo preparadas en CX, STR y MPO usando análisis de regresión demuestra NF-kB muy se correlaciona con la IkB (p < 0.0001, n = 24)

Figure 1
Figura 1: disección de cerebro de rata neonatal. (A) el cerebro disecado aparece con huesos quitados rostral a bregma. (B) el cerebro se muestra después de que se ha dibujado una línea en bregma, después de lo cual se retiraron las placas de hueso restante. (C) el cerebro se muestra en un molde de cerebro del metacrilato de polymethyl justo antes de ser cortado con una cuchilla de afeitar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: rodajas de rostral a caudal con golpes (círculos rojos) del cerebro. Abreviaturas: CX: corteza, lóbulo parietal; MPO: área preóptica medial; NTS: solitarios núcleo del tractus; PVN: núcleo paraventricular; HIJO: núcleo supraóptico; y STR: estriado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: respuesta de BiP/GRP78 en NTS es invertida a la de otros núcleos. (A) expresión de la proteína BiP representante en la parte superior del panel en relación con la proteína total presentada en el panel de abajo. Es de notar que la densidad de proteína total en varios de los tubos capilares son heterogéneos, y se utilizan para igualar la respectiva expresión de BiP por proteína en panel B. (B) se muestra el BiP media en relación con la proteína total en los núcleos del cerebro de muestras sin imprimación ( azul) versus calostro preparado muestras (marrón). Asteriscos de colores respectivos señalan diferencias significativas (p < 0.05, n = 4 núcleos) entre BiP en NTS versus BiP en los otros núcleos. Expresión de BiP en unprimed versus muestras cebadas en NTS se invierten significativamente a las de STR (χ2 p = 0.028, n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: activo e inactivo de la eIF2a (p-eIF2a) respuesta a cebado calostro versus muestras sin imprimación en NTS invertida a la de otros núcleos. (A) representante eIF2a eIF2a p proteína expresiones y se muestran en los paneles superiores. Los carriles de la proteína total se presentan en la parte inferior. (B) se muestra es la eIF2a promedio de 4 muestras expresada en relación con la proteína total (desde el panel inferior A) en núcleos del cerebro de las muestras sin imprimación (azul) frente a muestras de calostro preparado (marrón) y (C) la forma inactiva de eIF2a (p-eIF2a). Asteriscos de colores respectivos señalan diferencias significativas (p < 0.05, n = 4 núcleos) entre ambas formas de eIF2a en NTS versus niveles respectivos en los otros núcleos. Expresión activa de la eIF2a en unprimed versus muestras cebadas en NTS se invierten significativamente a los CX, STR y MPO (χ2 p < 0.05 versus todos los tres núcleos, números = 4). Barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: NTS expresa eIF2a quinasa p-GCN2 de acuerdo con el nivel de p-eIF2 e inversamente al nivel p-PKR. (A) el nivel de p-PKR (quinasa activada dsRNA de eIF2a) se expresa en pintura versus NTS calostro preparado inversamente a 1) el nivel de p-PKR en PVN (χ2 p = 0.025) y 2) su esperado objetivo sustrato eIF2a después su fosforilación (a p-eIF2a, figura 2). Tenga en cuenta que el patrón de p-PKR en hijo, CX, STR y MPO de unprimed versus calostro preparado muestras se ajusta a los patrones respectivos de eIF2a de p de la figura 2. (B) activado eIF2a quinasa (p-GCN2) en pintura versus preparado n muestras sigue un patrón similar de la expresión de la eIF2a p de la figura 2 y un patrón inverso de pPRK expresión de la Figura 3A2 p = 0.028). C = nivel medio de GCN2 inactivos. Barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: expresión citoplásmica de NF-kB y de IkB en núcleos del cerebro de las muestras de intestino sin imprimación y pintado de calostro. (A) media expresión citoplásmica de IkB en relación con la proteína total (desde el panel C) en núcleos del cerebro indicado. (B) representante bandas citoplásmicos de la proteína IkB se presentan en la parte superior del panel y la densidad de la proteína total en los carriles respectivos en la parte inferior. (C) media expresión citoplásmica de NF-kB en relación con la proteína total (desde el panel D) en núcleos del cerebro indicado. Bandas representativas de citoplásmico (D), de bandas de NF-kB se presentan en la parte superior del panel y la densidad total proteína citoplásmica en carriles respectivos en la parte inferior. Color asteriscos señalan diferencias significativas entre las muestras indicadas (p < 0.05, n = 4). Tenga en cuenta que niveles citoplasmáticos de NF-kB son más altos en el calostro preparado CX, STR y MPO que en núcleos hipotalámicos NTS, PVN e hijo en desacuerdo con los niveles de NF-kB inhibidor (IkB). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: esquema comparando hipótesis OT señalización en regiones de intestino y cerebro calostro preparado. (A) calostro OT en enterocitos activa su receptor a través de la interacción directa con el OTR, reducción de la inflamación por IkB mayor señalización corriente abajo. Traducción de la proteína es inhibida por el aumento de p-PKR, que disminuye la actividad elF2a a través de la fosforilación. Homeostasis se restaura a través de la mayor expresión del gen de BiP de13,37. (B) neuronales o OT circulatorio activa su receptor en el CS, STR y MPO regiones del cerebro, disminuyendo la inflamación y proteína traducción a través de las mismas moléculas como el intestino (ver panel A). (C) los hipotéticos efectos de oscurecimiento del calostro en la región n del cerebro son distintas, y contrario de los paneles A y B. GCN2, que es sensible a la fuente de aminoácidos, aumenta la traducción eIF2a y proteína. Al mismo tiempo, bajos niveles de IkB permiten NF-kB entrar en el núcleo y provocar inflamación. Tenga en cuenta que BiP actúa del mismo modo para restaurar la homeostasis en el intestino y en n en el cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure
Suplementario Figura 1: esquema que muestra la línea de tiempo del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Una técnica de microdisección de discretos, núcleos del cerebro de OTR-ricos en el cerebro de rata neonatal se presenta en este documento. Se reconoce bien que las neuronas son altamente especializadas, incluso dentro de núcleos bien caracterizados en el cerebro. Este enfoque altamente reproducible para aislar determinados núcleos ricos en OTR permite comprobación de hipótesis robusta. Mediante Western Blot automatizados, la consistencia y reproducibilidad de los resultados mejoraron aún más. Mientras que una limitación de esta técnica sigue siendo la variabilidad de golpe modesto cerebro; Esta técnica representa un avance sobre unicelulares, todo el cerebro o cerebro rebanada enfoques. Sola célula enfoques son complicados por proporcionar tomas de complemento muy limitado. Usando todo el cerebro, ninguna resultados pueden ser diluidas si el efecto se limita a una región del cerebro o subtipo neuronal. Enfoques de corte de cerebro sin microdisección pueden introducir profundas variaciones en los resultados dentro de apenas micras en un segmento, que es especialmente problemático para el hipotálamo en este estudio, debido a la agrupación apretada de distintos núcleos. Usando un punzón estandarizado y la ayuda de un microscopio, se redujo la variabilidad en las mediciones de proteína.

Hay varios pasos fundamentales dentro de este protocolo. Estos incluyen la adherencia al momento de la cosecha de tejido con respecto a la primera alimentación, usando un volumen mínimo de tampón de extracción de proteína, incubación de rebanadas de cerebro en ACSF que pueden utilizarse inhibidores moleculares o estimulantes y usando un sensible aparato inmunológico electroforético. Posibles modificaciones incluyen la elección de los reactivos para la incubación y la duración de la incubación y extendiendo el tiempo de inanición sin imprimación para comparar cerebros en tiempos equivalentes. Limitaciones importantes son la presencia de algunas células no neuronales (incluso durante este período neonatal muy temprano) y un número limitado de muestras que se pueden preparar de una camada de recién nacidos en un día. Además, este enfoque es totalmente dependiente de cuando nacen los cachorros. Con respecto a los métodos existentes, expresión génica en el cerebro a esta edad es típico y más convenientemente evaluado a nivel transcripcional. Sin embargo, para análisis de señalización de la célula, el enfoque proteómico ejecutado por equipo de instalación de la base es más costoso que el escritorio instrumentos automatizados. El método de Western blot convencional requiere mucho más proteína, lleva varios días en completarse y consiste en varios pasos de manipulación por el personal técnico. Este enfoque automatizado requiere 0.8 μg de proteína por tubo capilar, una vez cargado en el instrumento todos los pasos se realizan sin humanos manos interferencia y toma 2 h y 50 min para completar la carrera. Esta técnica puede utilizarse para estudiar el desarrollo cerebral postnatal inmediata en ratas y amplia gama de modelos de ratón manipulado genéticamente.

Usando esta técnica, se investigaron los efectos de OT a nivel celular, específicamente en el período muy crítico entre el nacimiento y alimentación, cuando el OTR máximo se expresa en el epitelio8. Los efectos moduladores de OT en célula de señalización de moléculas en las células de intestino, tanto en un celular línea37 y en vivo13, fueron demostrados previamente. En el presente estudio, se evaluaron los efectos observados en células intestinales en las regiones del cerebro ricas en OTR. La expresión de BiP/GRP78 y p-eIF2a era upregulated en unprimed (coherente con una esperada respuesta al estrés) y o en tejido NTS cebado (de acuerdo con una respuesta atenuada al estrés), mientras que NF-kB era alto y estable en condiciones de 38. expresiones de BiP y NF-kB eran los mismos en las demás regiones probadas en condiciones no cebadas y cebadas. eIf2a se fosforila por kinasa dependiente de dsRNA (pPKR) en el hijo, CX, STR y MPO. Sin embargo, en las noches y en menor medida en PVN, eIf2a se fosforila por otra quinasa, control general nonderepressible-2 (GCN2). Un esquema que representa la hipótesis de diferencias en la señalización en el cerebro y el intestino provocada por la exposición de calostro se presenta en la figura 7.

Esto hace de técnica de microdisección posible para poner a prueba hipótesis relacionadas con el impacto del primer calostro alimenta relacionadas con el estrés de señalización en los núcleos de OTR-ricos discretos en el cerebro neonatal. Estos datos sugieren que los mecanismos de modulación de estrés observados previamente en los enterocitos del intestino del recién nacido se reflejan en regiones específicas del cerebro ricas en OTR, como se muestra en mayor retención citosólica de NFKB (PVN, hijo CX, STR y MPO). Los resultados también indican que el NTS y PVN utilizan un mecanismo de fosforilación diferentes de las otras regiones que pueden ser refractarios a los efectos de la escasez de nutrientes. Colectivamente, los datos indican que señalización de las células en el cerebro asociados con la escasez de nutrientes y hormonal durante las primeras horas siguiente nacimiento es similar a la celular en el intestino en las mismas condiciones. Este dato apoya la importancia de la leche materna en el momento del nacimiento para la modulación del estrés en el intestino y el cerebro. Estos resultados subrayan la necesidad de más exploración del impacto del calostro en la función cerebral.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Manon Ranger y Alexandra Schulz por su asistencia en la preparación de este protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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