Vurdere mobilnettet Stress og betennelser i diskret Oxytocin-sekresjon hjernen kjerner i Neonatal rotte før og etter første Colostrum fôring

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å isolere hjernen kjerner i neonatal rotte hjernen i forbindelse med første råmelk fôring. Denne teknikken tillater studiet av næringsstoffer insuffisiens stress i hjernen som modulert av enterocyte signalering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Målet med denne protokollen er å isolere oxytocin-reseptor rik hjernen kjerner i neonatal hjernen før og etter første råmelk fôring. Uttrykk for proteiner som er kjent for å svare på metabolske stress ble målt i hjernen-kjerner isolerer med vestlige blotting. Dette ble gjort for å vurdere om metabolske stress-indusert næringsstoffer mangel i kroppen utløst neuronal stress. Vi har tidligere vist at næringsstoffer mangel i nyfødte utløser metabolske stress i tarmen. Videre modulerer råmelk oksytosin mobilnettet stress respons, betennelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi før og etter første feed. Signalisering protein markører tilordnet endoplasmatiske retikulum stress [ER Anstandsdame bindende immunglobulin protein (BiP), eukaryote oversettelse initiering faktor 2A (eIF2a), og eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], og to betennelse-signalisering proteiner [kjernefysiske faktor-κB (NF-kB) og hemmer κB (IkB)], ble målt i nyfødt hjernen kjerner [kjernen av enslig skrift (NTS), paraventricular kjernen (PVN), supra-optisk kjernen (sønn), cortex (CX), striatum kjerner (STR), og mediale preoptic kjernen (MPO)] før den første feeden (unprimed av råmelk) og etter starten av sykepleie (primet med råmelk). Uttrykk for BiP/GRP78 og p-eIF2a var upregulated i unprimed og downregulated i primet NTS vev. NF-kB ble beholdt (høy) i CX, STR og MPO cytoplasma, mens NF-kB var lavere og uendret i NTS, PVN og sønn i begge betingelsene. Den kollektive BiP og p-eIF2 funn er i samsvar med stressrespons. eIf2a var fosforylert av dsRNA avhengige kinase (p-PKR) i sønn, CX, STR og MPO. Men var i NTS (og i mindre grad i PVN), eIf2a fosforylert av en annen kinase, generalen nonderepressible-2 kinase (GCN2). Stress-modulerende mekanismer tidligere observert i nyfødte gut enterocytes synes å gjenspeiles i noen OTR-rik hjernen regioner. NTS og PVN kan bruke en annen fosforylering mekanisme (under næringsstoffer mangel) fra andre regioner og være gjenstridig å virkningen av næringsstoffer mangel. Samlet tyder disse dataene på at hjernen Svar å næringsstoffer insuffisiens stress er forskjøvet med signalene fra råmelk-fylt enterocytes.

Introduction

I motsetning til vår forståelse av tidlig hjernens utvikling skjer i løpet av dager til uker postpartum, er relativt lite kjent om mylderet av dynamiske endringer forekommer i de første timene av livet i rotter. En viktig utfordring er den lille størrelsen på neonatal rotte hjernen og en forutsetning for high-tech verktøy å isolere diskret hjernen regioner eller enkeltceller. Studier vurdere ofte genet transkripsjon og ikke oversettelse1,2, som ikke gir en solid forståelse av funksjonelle aktivert signalnettverk molekyler. Andre undersøke uttrykk med immunohistochemistry til referanse hjernen områder, som ikke tillater for kvantifisering av uttrykket nivå3. Ingen studie hittil har undersøkt aktivering av signalnettverk trasé forbundet med rotter første råmelk feed i diskret hjernen regioner, som krever rask isolasjon og offer og måling av protein uttrykk og protein fosforylering bruker Western blotting. Mens hjernen microdissection utføres på eldre og større hjerner, har vi ikke funnet en referanse utfører en ikke-enkeltcelle hjernen punch i P0 hjernen. Dette dokumentet presenterer en protokoll for å isolere begrensede områder av neonatal hjernen ved hjelp av en relativt low-tech punch teknikk og en vestlig blotting prosedyre for å måle protein uttrykk i relativt små utvalg. Denne protokollen kan være passende for forskning spørsmål som krever vurdering av protein uttrykk og post-translasjonell modifikasjoner (f.eks., fosforylering) i relativt begrensede områder små hjerner av alle arter, forutsatt at det brukeren kan visuelt identifiserer hjernen regionen rundt med en atlas og identifiserbar landemerker.

Denne teknikken ble utviklet for å forstå endringene skjer i hjernen som følge av neonatal rottene første råmelk feed, som er rik på oksytosin (OT). OT har lenge vært kjent for sin evne til å stimulere melk laktasjon og livmor sammentrekning. Men er OT nå kjent for å spille et bredt spekter av roller i regulering av mange kroppsfunksjoner og atferd4. For eksempel OT motsetter stress og betennelse i forbindelse med adaptive affiliative atferd5forsinkelser mage tømming og bremser intestinal transitt. OT reseptorer (OTR) har blitt identifisert i enteric nevroner og intestinal epitel6,7,8. Gastrointestinale effekten av OT er spesielt viktig for barnet under tidlig barseltiden. For eksempel amming er knyttet til leveringen av betydelige mengder OT til neonatal gut9,10, og data viser at OTR er tungt overexpressed i duodenalsår villi under melk suckling perioden8.

In vitro eksperimenter ved hjelp av en gut cellen linje har vist på cellenivå at oksytosin modulerer viktig molekyler i stress signalering veien11,12 og spiller en regulerende rolle i oversettelse av proteiner 12. disse studiene tyder på at komponenter melk, inkludert eksogene oksytosin fra mor, er viktig for den oppslåtte protein responsen i nyfødte til reduserer mobilnettet stress13.

I vivo og ex vivo studier har vist at råmelk OT modulerer mobilnettet stress respons, betennelse og autophagy markørene i nyfødte rotte gut villi. Nyfødte enterocytes lider betydelig mobilnettet stress på sin luminal side når tarmen er samtidig eksponert for bakterieflora fra moren i colostrum14,15 og mange proteiner, inkludert hormoner som OT9 , 10 , 16.

Effekten av OT på hjernen har vært studert17. OT signalnettverk mekanismer demonstrert i tarmen under tidlig barseltiden har imidlertid ikke vært undersøkt i hjernen. I dette papiret brukes en metode for å isolere diskret hjernen kjerner i neonatal rotte hjernestammen og hypothalamus bruker geleelektroforese å profilere isolert hjernen regioner. Det overordnede målet med denne metoden er å fange tilstanden til celle signalisering i hjernen områder så nært som mulig til fødsel, før og etter den første melken suckling, i hjernevevet med lavest glial/neuronal indeksen. Begrunnelsen for utviklingen av denne teknikken er at det tillater for rask isolering av begrenset, mikroskopiske hjernen regioner i neonatal pups med en mer homogene samling av neurons for ex vivo studier med en automatisert vestlige blotting metodikk, tilbyr svært konsistente resultater på relativt liten dissekert prøver. En svakhet på tidligere arbeid inkluderer flere brutto disseksjon (hjernen skiver eller hele hjernen) og eldre dyr18,19. Hjernen av ung pups er utrolig dynamisk, med bølger av glial differensiering etter fødselen. For å studere hjernen endringene påvirket av pups' første mate, er studere begrenset neuronal kjerner med reproduserbar disseksjon nødvendig.

Melk feed er vanligvis analysert for dens immunologiske og ernæringsmessige innvirkning på helse eller genet uttrykk (for eksempel i enterocytes20,21), mens dens effekt på hjernen områder under hjernens utvikling er sjelden studert. Effekten av melk transitt i tarmen på hjernefunksjon var analysert i referanse gut cholecystokinin reseptorer vagal relé hjernestammen kjerner, men ikke intracellulær signalnettverk trasé22. Det er en omfattende litteratur på sårbarheten i utvikle neonate hjernen til underernæring mødre under graviditet23, men stress og betennelse signalene er adressert ikke. Viktigst, utnytter det aktuelle metoden et fenomen i dag null rotte nyfødte som isolerer blod-født råmelk stimuli fra vagal relé visceral stimuli. Dette er såkalte stress hypo-respons perioden preget av umodne kjernen løpet solitarius (NTS)-hypothalamus krets umiddelbart etter fødselen24,25 som begrenser NTS, paraventricular kjernen (PVN), og supraoptic kjernen (sønn) signaler til blod-født stimuli.

Denne metoden er nyttig for analyse av flere signalveier og begrenset relativt til nevronale celler, forutsatt at hjernevev er høstet på postnatal dag-0 i rotter, i tillegg til om mødre har blitt utfordret eller ikke av noen form for behandling under graviditet. Søppel kan bli analysert for virkningene av råmelk feed i motsetning pre fôring signalering. Når du sammenligner signaler mellom hjernen områder med fattige versus rik protein avkastning, kan denne metoden i kapillær besluttsomhet totale protein polypeptid band i kapillærene går parallelt immun-kvantifisering av protein antigener. Denne metoden gjør det mulig for kvantitative sammenligningen med vilkårlig enheter, resultatene av samme antistoffer uten standard kvantitative kurver og referanse til totalt protein per kapillær. Sammenligne resultatene av ulike antistoffer er mulig bare ved hjelp av kvantitative standard kurver.

Denne metoden tillatt for vurdering av toveis signalering oppstår mellom tarmen og hjernen, og som kan påvirke funksjonen i begge organer26. Tilknytningen mellom oksytosin og mat inntak, som har vært grundig studert i årene27, støtter en sammenheng mellom økt oksytosin signalering og næringsstoffer tilgjengelighet. Disse studiene støtter også converse konseptet at energi underskudd er kombinert med reduksjon i hypothalamus oksytosin signalering.

Tidligere studier av effekten av OT på hjerneaktiviteten vist at indusert gut betennelse elicited cFos transkripsjon i hypothalamus PVN og amygdala piriform cortex som var ildfaste til vagotomy28. Imidlertid redusert systemisk infusjon av OT med secretin hjernen cFos reaksjon på provosert inflammatorisk reaksjon i tarmen28. Dette foreslo at effekten av eksogene OT ble utført av ruter enn vagal reléer, muligens via blodbårne signalnettverk molekylene båret gjennom området postrema6,29.

I denne studien ble de cellulære stress signalveier som har tidligere observert i tarmen vurdert i hjernen. Hypotesen var at melk komponenter kan beskytte eller utsette effekten av betennelse på gut permeabilitet til mikrobiell og andre metabolitter, og i sin tur effekter på hjernefunksjonen. De klart motsetninger i IkB versus BiP signalering funnet i villi før og etter grunning av råmelk13, foreslo at hjernen til nyfødte, fortsatt holder på å utvikle, føler disse råmelk-indusert gut-signaler.

Signalnettverk protein markører tidligere gut-forsøk som er tilordnet endoplasmatiske retikulum stress ble målt. De inkluderer ER Anstandsdame BiP, oversettelse initiering faktor eIF2a (som fungerer som en stress reaksjon integrator30), eIF2a kinase p-PKR, og to betennelse-signalisering proteiner (NF-kB og dens inhibitor, IkB).

Seks hjernen regioner basert på deres evne hos voksne skiller eller svare på OT ble valgt. NTS, i den øvre margen, er første relésending av visceral input og får direkte signalene fra vagal sensoriske neurons i tarmen31 og muligens blod-født cytokiner, giftstoffer og hormoner via de tilstøtende område-postrema32. PVN, supraoptic kjernen (sønn), striatum kjerner (STR), hjernebarken (CX) og mediale preoptic kjernen (MPO) motta signalene fra tarmen via NTS.

Resultatene viste at mobilnettet stressrespons i umiddelbar barseltiden før råmelk grunning og umiddelbart etter første mate er forskjellige i NTS sammenlignet med PVN og sønn. Signalering i CX, forskjellig STR, og MPO fra PVN og sønn, også. Forskjellige beskyttende funksjoner OT vist tidligere å modulere celle stress og betennelse i tarmen er sannsynligvis kjente av deler av hjernen. Samlet indikerer data at på cellenivå, under de første timene etter fødselen, hjernen reagerer på metabolske stress forbundet med næringsstoffer mangel. Dataene viser også at omfanget og retning av modulerende effektene av råmelk feed er regionen-avhengige, og at i enkelte regioner, de gjenspeiler OT effekter vises tidligere i tarmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer ved Columbia University og New York statens psykiatrisk Institutt.

1. vev forberedelse

  1. Bestill tidsbestemt gravid rotter fra leverandøren.
  2. Følg tidsbestemt gravid rotter ved å observere deres voksende sklerotisert i ukene etter deres ankomst og senere ute etter pups på forventet leveringsdato ved inspiserer byrået hver 2T til levering begynner.
  3. Fjern pups med en hansker hånd av halen før deres første feed for unprimed pups (ingen hvit melk magen er tydelig når magen) eller etter den første feeden for primet pups (da en hvit mage vil være synlig på sitt underliv) som beskrevet i timeli ne (Figur S1).
    Merk: Den første råmelk feeden er betegnet som grunning pup; Dermed er en pup unprimed til den første feeden, etter som de er råmelk-fylt.
  4. Raskt halshugge unanesthetized pup med skarpe, rene kirurgisk saks.
  5. Fjerne hjernen ved å kutte huden ned midtlinjen og toppen overflaten av skallen til nesen. Deretter bruker tang, forsiktig lirke unna benet for å avdekke hjernen (figur 1A) og lokalisere bregma, merke den med en penn som bein platene er fjernet (figur 1B).
  6. Raskt plassere hele hjernen i en polymetylmetakrylat methacrylate hjernen mold ved romtemperatur for Koronal kutting ved romtemperatur (figur 1 c).
  7. Uten forsinkelse, gjør 500 mm tykke skiver med en frisk barberblad. Legge skiver rostral til caudal i en Petriskål å vedlikeholde orientering av delene (figur 2).
  8. Raskt legge kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, 1.0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118.6 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 203.3 mM MgCl2-6 H2O), uten glukose og ruge sektorene for 60 min på 28-30 ° C, stadig stirring på en orbital shaker metabolically og ulikt utfordre den unprimed versus råmelk-primet vev.
  9. Identifisere hjernen kjerner som kreves for å slå med en hjerne atlas33 og anatomisk landemerker på delen vev. Plasser dette stykket med kjerner av interesse i en Petriskål og flytte den til dissecting mikroskopet.
  10. Når visualisert, raskt slå ut 4 av 6 forskjellige kjerner bruker et coring verktøy, velge størrelsen å slå beste kjernen i spørsmålet og konsekvent mellom eksempler (figur 2).
    Merk: Den gjenværende hjernen skive må nå et hull der hjernevev ble fjernet. I denne studien vi forbrukeravgift følgende kjerner bruker den under koordinater. Alle fremre/bakre (A / P) koordinater er fra Bregma (unntatt NTS, som er med i Calamus Scriptorius). Alle dorsal/ventrale (D/V) koordinater er fra overflaten av cortex (unntatt NTS, som er fra overflaten av forlengede). Følgende koordinater med A / P, mediale/lateral (M/L) og D/V i mm: 1) ensom tarmkanalen kjernen (NTS, A / P, 0,4 til 0,8; L, ± 0,2; D/V, 0,3 (fra overflaten av forlengede), 2) paraventricular kjernen (PVN,-0.8, ± 0,2; 0), 3) supra-optisk kjernen (sønn,-1.1, ± 1.4; 4.3), 4) cortex (CX, delvis cortex område 1,-2.8; ± 1,5; 0,6), 5) striatum kjerner (STR,-0.0, ± 1.6; 1.8), og 6) mediale preoptic kjernen (MPO,-0.6, ± 0,2; 4.2).
  11. Raskt fordype stemplet kjerner i 0,06 mL iskald, protein utvinning bufferen som inneholder proteasehemmere og fosfatase hemmere i 60 minutter (se trinn 2.3).

2. protein utvinning

  1. Forberede den protein utvinning løsningen ved hjelp av protein lysis kit (Tabell for materiale) dagen før forventet pup levering.
  2. Tine (på is) frosne (20 ° C) vandig løsning av protease og fosfatase hemmere av lysis buffer kit og plassere lyseringsbuffer og DMSO løsning av proteaser/phosphatases hemmere på is.
  3. Legge til 1,85 mL lyseringsbuffer i en ren, iskalde 15 mL tube. Legg deretter til 0,1 mL vannløsning av hemmere og 0,05 mL DMSO-oppløst hemmere. Til slutt, cap og kort vortex tube og holde det ved 20 ° C før bruk.
  4. Etiketten 24 ren microcentrifuge rør (0,5 mL hver) for lysis prosedyren. Angi 12 rør pr. hjernen for råmelk-unprimed gruppe (U) [6 venstre (L) og 6 høyre (R) hjernen kjerner] og etiketten ifølge kjerner akronym, side og tilstand (f.eks., NTS-L-U, NTS-R-U, osv). Merk den andre gruppen av 12 rør for råmelk-primet prøvene.
  5. Merk to ekstra sett av rør som gjort i trinn 2.4 lager protein ekstrakter (med 1,5 mL Eppendorf stil rør) og det første settet med eksempel forberedelse (med 0,5 mL rør). Holde disse rørene i to separate, merket frysing bokser (hver designet for 100 rør). En boks vil bli brukt til unprimed prøver, og den andre for primet prøvene.
  6. Tine lysis løsningen på isen på dagen som valpene leveres, og mens rugende hjernen sektorer i ACSF, aliquot 0,06 mL lysis løsning til lysis prosedyren rør (fra trinn 2.4) og legge til kjerner slag og ruge i isen for 60 min.
  7. Sentrifuge inkubert lysed kjerner for 30 min i et nedkjølt mini sentrifuge 14000 RPM (10 000 x g) og nøye Sug opp 0.055 mL av nedbryting med en riktig angi pipette. Overføre nedbryting til pre-avkjølt 1,5 mL lager rør (fra trinn 2.5) og sette dem på isen. Før frysing (ved 20 ° C) protein lager rør, overføre 0.012 mL av nedbryting til 0,5 mL pre-avkjølt rør for første eksempel utarbeidelsen (fra trinn 2.5) og la dem på isen.

3. eksempel forberedelse for i-kapillære Protein måling

  1. Bruk en kit og forberede reagensene separasjon i henhold til installasjonsinstruksjonene fra produsenten. Legg 0.003 mL av master-mix reagens til hver av 12 prøvene i 0,5 mL merket rør (fra trinn 2.5) på is som inneholder 0.012 mL av protein ekstrakter.
  2. Slå på oppvarming blokk til 95 ° C og legge 0.004 mL reagensen i trinn 3.1 på en biotinylated molekylvekt (MW) stige i et rør med 0.016 mL deionisert vann. Denature stige og prøver, plassere stigen røret og 12 prøvene av unprimed protein ekstrakter i varme blokken på 95 ° C i 5 min og lagre dem på 4 ° C før bruk.
  3. Gjenta trinn 2.0 til 3.2, fra protein utvinning å prøve forberedelse, for kjerner slo fra råmelk-primet rotter.

4. geleelektroforese forberedelse

  1. Tine biotin merking reagens (lagret i fryseboks på-80 oC) på benken og forberede proteinet oppdagelsen utstyr på is på 4 ° C følge retningslinjene fra produsenten.
  2. Bland 0,15 mL luminol med 0,15 mL av peroxide og laste 0,01 mL i 25 brønner (rad E, brønner 1-25) av platen for automatisert vestlige maskinen. Last 0.008 mL av Streptavidin-HRP fra kit i brønner D1 til D25
  3. Legg 0,01 mL av antistoff fortynningsmiddel løsningen i brønner C1 C25 og B1.
  4. Spinne 24 protein prøver og stige tuber kort (2-3 sekunder) i en minicentrifuge bassenget ned fordampet vannet fra rør caps.
  5. Legg 0.003 mL av 12 unprimed prøver i brønner A2 A13, 0.003 mL av 12 råmelk-primet prøver i brønner A14 til A25 og 0.005 mL biotinylated stigen til godt A1.
  6. La rad F tom og laste inn 0,45 mL vaskebuffer i hver av de 5 avdelinger i hver av de 3 radene under rad F. Cover platen med sine plast lokket å unngå fordampning under de resterende fremgangsmåtene.
  7. Kort vortex tinte biotin merking reagens og legge 0,15 mL reagensen til den angitte rør; deretter legger den 0,15 mL av totale protein rekonstituering agent og bland dem til homogenitet.
  8. Fjern dekselet fra platen og laste 0,01 mL agenter 1 og 2 i brønner B2 til B25. Dekk platen og sentrifuge det for 10 min 1000 x g fjerne eventuelle luftbobler fra ulike løsninger. Bruk en tom plate i sentrifugen for balanse.

5. geleelektroforese

  1. Mens platen er spinning, åpne en kjøre fil i automatiserte vestlige maskin-vedlagt datamaskinen ved angir siden dropdown fra "fil" å kjøre en total protein analysen og klikke det aktuelle stedet.
  2. Kommentere prøvene av godt i datamaskinen. Deretter fjerner platen fra sentrifuge fjerne dekselet og nøye skrelle av aluminium dekselet fra separasjon løsning seksjonene.
  3. Plasser platen i automatiserte vestlige instrumentet, løsner dekselet fra boksen kapillær patron, sette kassetten på utpekte plass og lukke døren.
  4. Klikk "Kjør"-knappen, og når spørsmål med typen analysen ("totale protein"), Skriv i prøvene (for eksempel "unprimed 2-13 og colostrum-primet 14-25"). Klikk "OK" og når spørsmål av aktivert dato og IDen for kjøre filen, noterer tidspunktet når Kjør ender.
  5. På slutten av kjøringen (170 min etter starten), åpne instrument, fjerne kapillær kassetten og kaste den inn sharps disposisjon. Kaste platen i biologiske saken salg.
  6. Klikk separasjon kurver-ikonet i siden av kjøre filen, og kontroller at alle prøvene har løpe riktig og viser flere protein kurver i alle kapillærer.

6. analyse signalnettverk proteiner

  1. I en merket 1,5 mL tube, Legg 0.003 mL av kanin anti phospho-eIF2a (p-eIF2a) antistoffer og avbryte det 0,3 mL (1: 100 fortynning) i antistoff fortynningsmiddel fra egnet oppdagelsen kit. Deretter holde den på is.
  2. Merke et luminol rør og legge 0,15 mL av luminol og 0,15 mL av peroxide fra denne oppdagelsen modul utstyr og dispensere 0,01 mL i brønner E1 til E25 av en frisk, automatisert vestlige plate.
  3. Dispensere 0,01 mL av sekundære anti kanin antistoff i brønner D2 til D25, og Legg til 0,01 mL av streptavidin-HRP fra kit godt D1.
  4. Dispensere 0,01 mL av av primære antistoff (fra trinn 6.1) i brønner C2 C25, og Legg til 0,01 mL av antistoff fortynningsmiddel 2 løsning brønner C1 og B1 til B25.
  5. La rad F brønnene tom og fylle 0,45 mL vaskebuffer i 5 seksjonene 3 rader nedenfor raden F.
  6. Kort spin nedkjølt prøvene for 3 s, og legge 0.003 mL av hvert utvalg A-raden i samme rekkefølge som de ble lagt for totalt protein analysen, fra A2 til A25. Legg 0.005 mL biotinylated MW stigen vel A1 og dekke platen.
  7. Sentrifuge platen som gjort i trinn 4.8. Mens platen er spinning, åpner (i automatisert Western-assosiert programvare og datamaskin) en ny kjøre fil og angi på siden dropdown fra "Fil" å kjøre en molekylær størrelse analysen ved å klikke det aktuelle stedet.
  8. Type utvalg navnene i hver kapillær analysen på siden, så skriver du navnet på det primære antistoffet tildelt stedet og sekundære anti-kanin antistoffer nedenfor.
  9. På slutten av sentrifugering, gjentar du trinnene 5.3-5.5, bortsett fra navnet gitt til filen kjøre denne gangen bør være "p-eIF2a på unprimed 2-13 og colostrum-primet 14-25".
  10. Etter geleelektroforese separasjon, sjekk kjøre filen for immun-reaktivitet topper antigener på størrelser av 40-43 kDa. Der MW topper denne størrelsen mangler, høyreklikk under kurven, og angi i rullegardinlisten legge MW til toppen, som sikrer at størrelsen og vilkårlig antall under kurven er registrert.

7. behandle resultatene

  1. Åpne en regnearkfil for totalt protein kjøre i den automatiserte vestlige kjøre filen og gi et ID-nummer.
  2. Åpne filen i kjøre totale protein analysen på analysesiden på kurven modus og merke alle toppene i individuelle kapillærer. Deretter kopiere og lime dem inn i regnearket for å summere områdene under kurven av alle topper i det hele kapillær.
  3. I en egen kolonne, kan du ordne den totale mengden protein for hver kolonne med kapillær tall, respektive hjernen kjerner og ID-numrene til kjøre filene.
  4. Åpne et regneark for p-eIF2a antigen, og i en enkelt kolonne, registrere området under kurven fra hver kapillær side ved side med respektive kapillær nummeret, navnet på hjernen kjernen og ID-nummeret til filen kjøres.
  5. Kopiere kolonnen total protein (parallell til p-eIF2a kurve antallene) til et tredje regneark og beregne p-eIF2a:total protein prosenter i en tredje kolonne.
  6. Samle resultater fra trinn 4 til 6 for hver hjernen kjernen, ordne dem i grupper på kjerner og generere et stolpediagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant bånd immunoreactivity i forhold til totalt protein viser at det er hjernen kjerner med svært lav høstet protein. Dette krever bruk av automatiserte Western blot teknikken, som er svært sensitive forhold til kanoniske Western blot. Denne tilnærmingen kan kjøres med fortyfold mindre protein per kapillær sammenlignet per kjørefelt i vestlige blots.

Differensial effekter av råmelk grunning på BiP nivåer i hjernen kjerner

Framskaffet rotte hjernen ble høstet før den første råmelken fôring (unprimed) og etter første fôring (fylt). Prøvene ble fraksjonert av kapillær geleelektroforese (på WES) og proteiner kvantifisert bruke kit for i-kapillære totale protein flekker (se Protocol). Ekstra immun kapillært fraksjoneres på den automatiserte vestlige gitt identifikasjon av respektive protein antigener. I figur 3Avises representant BiP protein uttrykk i øvre panelet med tilsvarende totale protein nedenfor. BiP er en ER Anstandsdame protein. I figur 3Bpresenteres quantitated immunoreactivities av søylediagrammer i forhold til tilsvarende totale protein.

I de unprimed vevsprøver, BiP nivåer i NTS var betydelig høyere enn alle andre regioner (p < 0,05, n = 4 kjerner). Fylling av tarmen tissue med råmelk hadde en motsatt effekt i NTS, sammenlignet med økt BiP i andre regioner i forhold til unprimed vev (figur 3B). Grunning redusert BiP i NTS (figur 3B) og hadde ingen effekt på PVN og Dataflytmottaker. Men grunning økt BiP CX, STR og MPO i forhold til unprimed vev. Disse dataene innebærer at BiP nivåer i ulike testet hjernen kjerner reagerer forskjellig på gut grunning og som det ikke ennå noen bevist kryss-snakk mellom forskjellige kjerner testet.

Differensial effekter av råmelk grunning på ElF2a og p-elF2a nivåer i hjernen kjerner

Hjernen vevsprøver var forberedt, analysert og kvantifisert som vist i figur 3A og 3B. Som med BiP nivåer (figur 3B), elF2a og p-elF2a ble nivåer i NTS hevet unprimed tilstanden i forhold til andre kjerner (figur 4B og 4 C). Som vist med BiP nivåer, var svaret i NTS grunning av tarmen tissue med råmelk omvendt i andre kjerner. Både elF2a og p-elF2a i NTS ble redusert i forhold til unprimed vev. I alle andre testet kjerner, grunning økte nivåer elF2a og p-elF2a i forhold til unprimed vev (figur 4B og 4 C).

Fosforylering av elF2a av kinase GCN2 NTS og PVN etter råmelk grunning

Hjernen vevsprøver var forberedt, analysert og kvantifisert som vist i Figur 3. Grunning avdøde p-PKR i PVN (χ2 p = 0.025), i motsetning til i alle andre områder hvor det ble økt. I motsetning til p-elF2a funn (figur 4C), nivåer av p-PKR var lav i unprimed prøver i forhold til primet prøver NTS (figur 5A). Fosforylering av elF2a er vanligvis katalysert av sin kinase PKR svar på virus34 og OT i tarmen, som tidligere viste11. Det faktum at p-PKR nivåer var svært lav i unprimed versus primet NTS (i forhold til andre kjerner, figur 5A) sterkt antyder imidlertid at en annen kinase må være involvert i phosphorylating elF2a (figur 4C). Følgelig ble GCN2 nivåer testet i NTS og PVN fordi det er også en kjent kinase elF2a35. Nivåer av p-GCN2 (aktiv form) var høyere i unprimed prøver i forhold til primet prøver i NTS PVN (figur 5B) og GCN2 (inaktiv form), sammenlignet med p-GCN2, ble omvendt uttrykt i PVN (figur 5C). pGCN2 i NTS (figur 5C) ble uttrykt omvendt til pPKR (figur 5A) i både unprimed og primet NTS. I primet vev, p-eIF2a var betydelig lavere i NTS enn i alle andre hjernen områder [PVN (p < 0,01), sønn (p < 0,01), CX (p < 0,01) og MPO (p = 0,02)]. Dette indikerer at pGCN2 stedet for pPKR, var ansvarlig for eIF2 hemming i NTS.

Råmelk grunning hemmer NF-kB i CX, STR og MPO

Figur 6A viser at IkB nivåer var betydelig høyere i SON unprimed prøver vs primet prøver. IkB nivåer i sønn, CX, STR og MPO tendert høyere i samme retning. I figur 6Cvar NF-kB nivåer i CX, STR og MPO betydelig høyere i primet versus unprimed vev. Men var NF-kB nivåer betydelig lavere i primet NTS vev, noe som antyder at råmelk hadde en tydelig anti-inflammatorisk effekt på denne hjernen regionen. Cytosolic NF-kB var høyere (vedvarende) i unprimed NTS prøver, mens hemmer IkB var lav og uendret i primet prøver. Dette tyder på at en tydelig anti-inflammatorisk mekanisme er å regulere NF-kB i NTS. Denne næringsstoffer insuffisiens stress effekten er konsekvent med gjeldende funn som stress markører BiP og p-eIF2a er begge regulert av tilstedeværelsen av råmelk grunning (tall 3 og 4, henholdsvis), også vist i forrige BiP og p-elF2a funn10. Årsaken til forskjellige svar IkB og NF-kB i NTS sammenlignet med CX, STR og MPO er ennå ikke fullt ut forstått. Men er det samsvar med observasjonen som NTS, som videresender signaler fra tarmen til hjernen, kan spille en avgjørende rolle i å svare unikt og motsatt kontra andre hjernen områder sammenlignet med eksterne betennelse36. Nivåer av IkB i CX, STR og MPO lav (figur 6A), sammenlignet med høye nivåer av NF-kB i samme områder (figur 6C). Mens dette finne contradicts tilsynelatende premisset om at IkB er bindende og beholde NFkB i stoffer ulike beregning av dataene som kombinerer og sammenligner alle primet prøver CX, STR og MPO bruker regresjon analyser viser at NF-kB svært samsvarer med IkB (p < 0,0001, n = 24)

Figure 1
Figur 1: dissekert neonatal rotte hjernen. (A) dissekert hjernen er vist med bein fjernet rostral å bregma. (B) hjernen vises etter en linje er trukket på bregma, hvoretter gjenværende benet platene ble fjernet. (C) hjernen vises i en polymetylmetakrylat methacrylate hjernen mold like før blir skiver med et barberblad. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: hjernen skiver arrangert fra rostral til caudal med slag (røde sirkler). Forkortelser: CX: cortex, parietal lobe; MPO: mediale preoptic området. NTS: kjernen løpet solitaries; PVN: paraventricular kjernen; SØNN: supraoptic kjernen; og STR: striatum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: BiP/GRP78 respons i NTS er invertert som for andre kjerner. (A) representant BiP protein uttrykk i øvre panelet i forhold til totalt protein presenteres nedenfor. Merk at den totale protein tettheten i ulike kapillærene er heterogene, og disse brukes til å jevne det respektive BiP uttrykket per protein i panelet B. (B) vist er det bety BiP i forhold til totalt protein i hjernen kjerner i unprimed prøver ( blå) versus råmelk-primet prøver (brun). Stjerner av respektive farger angi betydelige forskjeller (p < 0,05, n = 4 kjerner) mellom BiP i NTS versus BiP i andre kjerner. BiP uttrykk i unprimed versus primet prøver NTS er betydelig invertert til de i STR (χ2 p = 0.028, n = 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: aktive og inaktive eIF2a (p-eIF2a) respons på råmelk grunning versus unprimed prøver i NTS invertert som for andre kjerner. (A) representant eIF2a og p-eIF2a protein uttrykk vises i den øvre panelene. Totalt protein banene presenteres på nedre panel. (B) vist er det bety eIF2a av 4 prøver uttrykt i forhold til totalt protein (fra nedre panel A) i hjernen kjerner unprimed prøver (blå) versus råmelk-primet prøver (brun), og (C) det uvirksom blankett av eIF2a (p-eIF2a). Stjerner av respektive farger angi betydelige forskjeller (p < 0,05, n = 4 kjerner) mellom begge eIF2a former i NTS versus respektive nivåer i andre kjerner. Aktive eIF2a uttrykk i unprimed versus primet prøver NTS er betydelig invertert de CX, STR og MPO (χ2 p < 0,05 mot alle tre kjerner, n = 4). Feilfelt representerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: NTS uttrykker eIF2a kinase p-GCN2 i samsvar med p-eIF2 og omvendt til p-PKR nivå. (A) nivået av p-PKR (aktivert dsRNA kinase av eIF2a) er uttrykt i unprimed versus råmelk-primet NTS omvendt til 1) nivået av p-PKR i PVN (χ2 p = 0.025) og 2) forventes målrettet substrat eIF2a etter sin fosforylering (til p-eIF2a, figur 2C). Merk at mønsteret av p-PKR sønn, CX, STR og MPO av unprimed versus råmelk-primet prøver passer respektive mønstre av p-eIF2a fra figur 2C. (B) aktivert eIF2a kinase (p-GCN2) i unprimed versus primet NTS prøver følger et lignende mønster av p-eIF2a uttrykk figur 2C og en omvendt mønster av pPRK uttrykk figur 3A2 p = 0.028). C = gjennomsnittlig nivåer av inaktive GCN2. Feilfelt representerer standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: cytoplasmatiske uttrykk for NF-kB og IkB i hjernen kjerner fra unprimed og colostrum-fylt tarmen prøver. (A) mener cytoplasmatiske uttrykk for IkB i forhold til totalt protein (fra panelet C) på angitt hjernen kjerner. (B) representant cytoplasmatiske band IkB protein presenteres i øvre panel og totale protein tetthet i respektive baner i nedre panel. (C) mener cytoplasmatiske uttrykk for NF-kB i forhold til totalt proteiner (fra panelet D) til angitte hjernen kjerner. (D) representant cytoplasmatiske band av NF-kB band presenteres i øvre panel og totale cytoplasmatiske protein tetthet i respektive baner i nedre panel. Farget stjerner angi betydelige forskjeller mellom angitte eksempler (p < 0,05, n = 4). Merk at cytoplasmatiske NF-kB nivåer høyere i colostrum-primet CX, STR og MPO enn i hypothalamus kjerner NTS, PVN og sønn i uenighet med nivåene av NF-kB hemmer (IkB). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: skjematisk sammenligne hypotetiske OT signalering i colostrum-fylt tarmen og hjernen regioner. (A) Colostrum OT i enterocytes aktiverer sin reseptor via direkte interaksjon med OTR, reduserer betennelse via økt IkB nedstrøms signalering. Protein oversettelsen er hemmet av økende p-PKR, som reduserer elF2a aktivitet gjennom fosforylering. Homeostase gjenopprettes via økt BiP gene expression13,37. (B) Neuronal eller sirkulasjons OT aktiverer sin reseptor i CS og STR MPO regioner i hjernen, downregulating betennelse og protein oversettelse via de samme molekylene som tarmen (se panelet A). (C) den hypotetisk gjennomsnitt effektene av råmelk grunning i regionen NTS i hjernen er ulike og motsatte fra de paneler A og B. GCN2, som er følsomme for aminosyre forsyning, øker både eIF2a og protein oversettelsen. På samme tid tillater lave nivåer av IkB NF-kB å angi kjernen og indusere betennelse. Merk at BiP fungerer på samme måte for å gjenopprette homeostase i tarmen og NTS i hjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure
Supplerende figur 1: skjematisk viser protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En teknikk for microdissection av diskrete, OTR-rik hjernen kjerner i neonatal rotte hjernen presenteres i dette dokumentet. Det er også anerkjent at neurons er høyt spesialisert, selv innenfor godt karakterisert kjerner i hjernen. Dette svært reproduserbar isolere bestemte OTR-rik kjerner gir robust hypotesetesting. Bruke automatisert vestlige blotting, ble konsekvent og reproduserbarhet resultatene ytterligere forbedret. Mens en begrensning av denne teknikken er fortsatt beskjedne hjernen punch variasjon; Denne teknikken representerer et forskudd over én celle, hele hjernen eller hjernen sektor tilnærminger. Encellede tilnærminger er komplisert ved å gi svært begrenset knipse bilder. Bruker hele hjernen, kan noen funn bli utvannet Hvis effekten er begrenset til hjernen regionen eller neuronal undertype. Hjernen sektor tilnærminger uten microdissection kan innføre betydelig variasjon i resultatene innen bare mikron i en skive, som er spesielt problematisk for hypothalamus i denne studien, på grunn av stramme klyngene for forskjellige kjerner. Bruke en standardisert punch og hjelp av mikroskop, ble variasjon i protein målinger redusert.

Det er flere viktige skritt i denne protokollen. Disse inkluderer tilslutning til tidspunktet for vev med hensyn til den første feeden, bruke en minimal mengde protein utvinning buffer, inkubasjonstiden for hjernen sektorer i ACSF slik at molekylær hemmere eller sentralstimulerende midler kan brukes, og bruke en følsom uimottakelig-electrophoretic enhet. Endres inkluderer valg av reagensene inkubasjon og varigheten av inkubasjon og utvidelse av unprimed sult å sammenligne hjerner til tilsvarende tider. Viktige begrensninger omfatter noen ikke-neuronal celler (selv i denne tidlige neonatal perioden) og et begrenset antall eksempler som kan tilberedes fra en søppel av nyfødte på en dag. Videre er denne tilnærmingen helt avhengig av når valpene er født. Med hensyn til eksisterende metoder vurderes genuttrykk i hjernen i denne alderen vanligvis og mer praktisk på transcriptional nivå. Men for celle signalisering analyse, er proteomic tilnærming av core anlegg utstyr dyrere enn desktop automatisert instrumenter. Konvensjonelle Western blot metoden krever mye mer protein, tar flere dager å fullføre, og involverer flere manipulasjon trinn av tekniske arbeidskraft. Dette automatisk krever 0,8 µg protein per kapillær, når lastet inn i apparatet alle trinnene utføres uten menneskelige hender forstyrrelser og tar 2 h og 50 minutter å fullføre kjøre. Denne teknikken kan brukes for å studere umiddelbare postnatal hjernens utvikling i rotter og bredt spekter av genetisk manipulerte musen modeller.

Bruker denne teknikken, ble effekten av OT på cellenivå, spesielt i den svært kritiske perioden mellom fødsel og fôring, undersøkt når OTR er maksimalt uttrykt i epitel8. Modulerende effekten av OT celle signalnettverk molekyler i tarmen celler, både i en celle linje37 og i vivo13, ble tidligere vist. Studien, ble effektene i tarmen celler vurdert i områder av hjernen er rik på OTR. Uttrykket av BiP/GRP78 og p-eIF2a var upregulated i unprimed (forenlig med en forventet svar på stress) og downregulated i primet NTS vev (forenlig med en dempes svar på stress), mens NF-kB var høy og stabil i begge betingelsene 38. uttrykk av BiP og NF-kB var de samme i andre testet regionene i både unprimed og primet forhold. eIf2a var fosforylert av dsRNA avhengige kinase (pPKR) i sønn, CX, STR og MPO. I NTS, og i mindre grad i PVN, var imidlertid eIf2a fosforylert av en annen kinase, generalen nonderepressible-2 kinase (GCN2). En skjematisk viser hypotetiske forskjeller i signalering i hjernen og gut brakt frem av råmelk eksponering vises i figur 7.

Dette microdissection teknikken gjør det mulig å teste hypoteser knyttet til effekten av den første råmelken feed på stress-relaterte signalering i diskret OTR-rik kjerner i neonatal hjernen. Denne data tyder på at stress modulerende mekanismer tidligere observert i nyfødt gut enterocytes gjenspeiles i spesifikke hjernens områder rike på OTR, som vist av økt cytosolic oppbevaring av NFKB (PVN, sønn CX, STR og MPO). Resultatene tyder også på at NTS og PVN bruker en annen fosforylering mekanisme fra andre regioner som kanskje være gjenstridig å virkningen av næringsstoffer mangel. Samlet indikerer data at celle signalisering i hjernen forbundet med næringsstoffer og hormonal insuffisiens under de første timene følgende fødsel ligner celle signalisering i tarmen under like forhold. Disse dataene støtter betydningen av brystmelk på tidspunktet for fødselen for stress moduleringshjul i tarmen og hjernen. Disse resultatene underbygger behovet for videre utforskning av virkningen av colostrum på hjernefunksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Manon Ranger og Alexandra Schulz for deres hjelp i utarbeidelsen av denne protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2, (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123, (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327, (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32, (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307, (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512, (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636, (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23, (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19, (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432, (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487, (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69, (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119, (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33, (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5, (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3, (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10, (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55, (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104, (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4, (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300, (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14, (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22, (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85, (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283, (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234, (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81, (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284, (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1, (3), a001271 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics