ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Samrat, S. K., Gu, H. Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58504, doi:10.3791/58504 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) של נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) הוא חלבון מוקדם מיידי המכיל ליגאז אוביקוויטין טבעת-סוג E3. הוא אחראי על השפלה proteasomal ושל גורמים מגבילים מארח את הפעלת גנים ויראליים עוקבות. ICP0 מכיל רצף הקנוני לוקליזציה גרעינית (שקל). הוא נכנס לגרעין מיד לאחר הסינתזה דה נובו , ביצוע תפקידיה הגנה אנטי-מארח בעיקר בגרעין. עם זאת, בהמשך זיהום, ICP0 נמצא אך ורק בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. יש להניח ICP0 רוברטסונית מאפשר ICP0 לווסת את תפקידיה לפי מיקומים subcellular שלה-שלבים שונים זיהום. על מנת ניסחו את תפקוד ביולוגי ואת מנגנון רגולטורי של טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic ICP0, לשנות את שיטת מיקרוסקופ immunofluorescent לעקוב אחר ICP0 סחר במהלך זיהום HSV-1. פרוטוקול זה כרוך immunofluorescent מכתים, מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה, גרעיני לעומת התפלגות cytoplasmic וניתוח. המטרה של פרוטוקול זה היא להתאים את מצב יציב קונאפוקלית מתמונות שצולמו מסלול הזמן לתוך תיעוד כמותית של התנועה ICP0 הזיהום lytic. אנו מציעים כי בשיטה זו ניתן להכליל לנתח באופן כמותי את גרעיני לעומת cytoplasmic לוקליזציה של חלבונים ויראלי או סלולר אחרים מבלי לערב את טכנולוגיית הדמיה בשידור חי.

Introduction

נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) גורם מגוון רחב של מתון למחלות מהרפס קשות, כולל הרפס labialis, הרפס, keratitis סטרומה של אנצפליטיס. לאחר נגוע, הווירוס יוצר דלקת סמויה לכל החיים בנוירונים הגרעינים. לעיתים, הווירוס ניתן להפעיל מחדש על ידי מסיבות שונות כגון חום, מתח, דיכוי המערכת החיסונית1, שמוביל הרפס חוזרים ונשנים. התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) הוא מווסת ויראלי מפתח קריטי עבור זיהום HSV-1 lytic והן סמויה. זה transactivates וירוס במורד הגנים באמצעות עצירת מארח הגנות אנטי ויראליים מהותי/מולדת2,3. ICP0 יש פעילות ליגאז אוביקוויטין E3, אשר מטרות מספר גורמים תא פרוטאוזום תלוית השפלה3. זה גם אינטראקציה עם מסלולים שונים תא להסדיר את פעילותם ובעקבות כך להסטת מארח הגבלות אנטי-ויראלי3. ICP0 ידוע כדי לאתר תאים subcellular שונים כמו הזיהום ממשיך3,4,5. החלבון יש אות לוקליזציה גרעיני ליזין/ארגינין-עשיר (שקל) ממוקם ב שאריות 500 כדי 5066. על סינתזת דה נובו -זיהום HSV-1 מוקדם, ICP0 מיובא באופן מיידי הגרעין. הוא קודם זוהה-דינאמי גרעיני מבנה הנקרא תחום גרעיני 10 (ND10)7. אוביקוויטין E3 ליגאז פעילות ICP0 מפעיל את ההשפלה של ND10 מארגן חלבונים, חלבונים (PML) לוקמיה פרומיאלוציטית חלבון מנומר 100 kDa (Sp100)8,9,10. לאחר ההפסד של חלבונים המארגן, ND10 גרעיני גופות מפוזרים, ICP0 עובר פיזור כדי למלא את גרעין כל4,11.

מעניין, לאחר תחילתה של שכפול ה-DNA ויראלי, ICP0 נעלמת מהגרעין. הוא אך ורק נמצא בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic בשלהי HSV-1 זיהום4,12. הדרישה של שכפול ה-DNA מרמז על מעורבות אפשרית protein(s) ויראלי מאוחר בקידום רוברטסונית cytoplasmic של HSV-1 ICP04,12. מסתבר ICP0 סחר בין תאים שונים במהלך זיהום מסמיכה ICP0 כדי לווסת את האינטראקציות שלה כדי מסלולים סלולריים שונים בצורה מרחבית-טמפורלית, לכן הקואורדינטות שלה פונקציות מרובות משובח לכוון את האיזון בין lytic, החבויים HSV-1 זיהום13. כדי להבין טוב יותר את ICP0 multifunctionality ואת התיאום של תחומים פונקציונליים ICP0 לאורך כל הזיהום lytic, ניתחנו בקפידה הבסיס המולקולרי של טרנסלוקציה ICP0 דינמי12. לערוך מחקרים מכניסטית שדווחה בעבר12, אנחנו החלת שיטת צביעת immunofluorescent להמחיש לוקליזציה subcellular ICP0 על מצב זיהום שונים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. גם פיתחנו פרוטוקול כמותיים כדי לנתח גרעיני לעומת cytoplasmic חלוקת ICP0 שימוש בתוכנה קונפוקלי. אוכלוסיית תאים נגועים HSV-1 היה ייערכו לאורך כל שלבי הזיהום, המגמות של התנועה ICP0 נותחו, תחת טיפולים ביוכימיים שונים12. כאן נתאר פרוטוקול מפורט את המסמכים ICP0 רוברטסונית ב זיהום HSV-1. אנו מציעים כי שיטה זו יכולה להיות מאומץ כשיטה כללית ללמוד גרעיני לעומת cytoplasmic רוברטסונית אחרים חלבונים ויראלי או סלולרי, אשר יכול לשמש אלטרנטיבה הדמיה בשידור חי טכניקת דימות בשידור חי הוא לא מתאים בשל בעיות כגון תיוג שיטה, עוצמת אות או חלבון שפע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא זריעה, זיהום בנגיף

  1. ב- 20 – 24 שעות לפני זיהום בנגיף, זרע 5 x 104 תאי פיברובלסט עובריים אמבריולוגיה (הל) או תאים אחרים להיבדק בשקופית מעד. ובכן 4 11 מ"מ במדיום הגידול (של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% שור עוברית סרום (FBS)). דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2).
    הערה: כל טוב צריך 70-80% תא confluency בזמנו של זיהום.
  2. ביום הבא, להסיר את מדיום הגידול, להדביק את התאים עם וירוסים בינוני-199 בטווח של 4 – 10 pfu תא. דגירה תאים הנגועים בנגיף עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. תנערו את השקופית במהלך תקופת הדגירה.
  3. לאחר הדגירה 1 h, הסר בינוני-199, להשלים עם מדיום הגידול.
    הערה: תרופות שמפריעות שלבים שונים זיהום ניתן להוסיף בשלב זה או לפני הקליטה ויראלי.
  4. דגירה של תאים הנגועים בנגיף ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור אורכים שונים של התקופה זיהום.

2. קיבוע ו- Permeabilization

  1. בזמן זיהום נכונה, לשטוף את התאים הנגועים בתמיסת באגירה פוספט (PBS) 3 פעמים ובמהירות להוסיף 200 μL של 4% paraformaldehyde להתמחויות ב- PBS. דגירה התאים עם paraformaldehyde למשך 8-10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לתקן את התאים היטב בכל.
  2. האחות paraformaldehyde ולשטוף את הבארות עם μL 200 ל- PBS במשך 3 פעמים. לגמרי מחוק לגמרי PBS לאחר לשטוף את 3rd .
  3. להוסיף 100 μL של 0.2% ללא יונית חומרים פעילי שטח בכל טוב כדי permeabilize את התאים למשך 5 – 10 דקות.
  4. האחות של חומרים פעילי שטח ללא יונית ולשטוף הבארות עם μL 200 ל- PBS במשך 3 פעמים.

3. immunofluorescent מכתים

  1. לגמרי מחוק לגמרי PBS להוסיף 200 μL מאגר חסימה (1% אלבומין שור (BSA) ו- 5% סרום סוס ב- PBS) מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. הוסף השפעול נקבע ריכוז נוגדן ראשוני (ארנב anti-ICP0 נוגדן polyclonal12) במאגר חסימה, דגירה נוגדן ראשוני בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. לשטוף עם מאגר חסימה 3 פעמים עם הדגירה 10 דקות. להוסיף עז מצומדת אלקסה 594 ארנב אנטי משני נוגדנים (1:400 מדולל במאגר חסימה), דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר מאובטח. ואז לשטוף את השקופיות 3 פעמים עם מאגר חסימה במרווח 10 דקות.
  4. סוף סוף לשטוף את השקופית פעם אחת עם PBS להסיר BSA שיורית ואת הסוס סרום.
  5. הוסף טיפה אחת של הרכבה antifade בינוני עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לטעון את השקופית לאטום אותו עם coverslip באמצעות לק שקוף.

4. קונאפוקלית הדמיה

  1. עם מיקרוסקופ קונפוקלי, להגדיר את אורך הגל-590 – 650 nm 594 אלקסה, 410 – 520 nm עבור דאפי. בחר תבנית תמונה על 1024 x 1024 קו ממוצע של 8 לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה.
  2. לנתח כל טוב על השקופית 4-ובכן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. לרכוש תמונות תא נציג תחת המטרה X 100, כפי שמוצג באיור 1 ו- 2 איור.
  3. ספירת מספר גדול של תאים, סעו תמונות של שדות ברציפות תחת המטרה X 40.
    הערה: זה דורש 5 – 10 תמונות לצבור יותר מ-200 תאים נגועים של כל נקודת הזמן של כל זיהום.
  4. ניסוי, לצלם תמונות עם פרמטרים קונאפוקלית קבוע עבור כל צורך דגימות לצורך השוואה.

5. ניתוח גרעיני לעומת התפלגות Cytoplasmic

  1. פרוייקט פתוח עם תוכנת היישום קונפוקלי. בחר תמונה שממנו תאים צריך להיות ייערכו להפצה גרעיני לעומת cytoplasmic של ICP0.
  2. לחץ על הכרטיסיה "כמות" בתפריט העליון ובחר "למיין ROIs" מתפריט כלים.
  3. לצייר קו האורך לרוחב התא כדי להיות מנותח על-ידי בחירה "לצייר קו" בתפריט העליון.
    הערה: היסטוגרמה יופיעו מציג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך הקו הן ICP0 והן דאפי. ההיסטוגרמה, הקו הכחול מייצג את דאפי פיקסלים, מסמן את הגבול של הגרעין ואילו הקו האדום מייצג ICP0 פיקסלים.
  4. בהתבסס על רקע מכתים, להגדיר את סף קבוע עבור ICP0 בעוצמה לנתח את התפלגות subcellular ICP0 ניסוי.
    1. כפי שהודגם ב איור 2, אם האדום אות בממוצע מתחת לסף באזור גרעיני אך מעל הסף מגבולות כחול, לסווג את האות אדום כמו ממוקם ברובו בציטופלסמה.
    2. אם האות האדום מעל הסף לאורך כל הגרעין ומעבר לגבול סימן כחול, לקבץ את האות אדום כמו גרעין בתוספת cytoplasmic לוקליזציה.
    3. אם האות האדום מעל הסף בגרעין, אך בממוצע נמצא מתחתיה מחוץ לגבול סימן כחול, לקבץ את האות אדום כמו גרעיני לוקליזציה.
  5. משיבים יותר מ-200 תאים נגועים מהדגימה כל זיהום שונים ושעה מגרש גרף עמודות כדי להדגים ICP0 תנועה על-פי זמן (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להבין את הבסיס המולקולרי של תפקודים ביולוגיים של ICP0 סחר במהלך זיהום HSV-1, אנו משתמשים בשיטת מיקרוסקופ immunofluorescent כדי לנתח את התפלגות subcellular ICP0-דלקת שונים שלבים. איור 1 מציג את התאים נציג עם לוקליזציה ייחודית ICP0 בהמשך זיהום. כדי לכמת את הגרעין-כדי-cytoplasmic טרנסלוקציה של ICP0, אנחנו מנתחים ICP0 הפצה יחסית הגרעין מאת לסיווג תאים נגועים לשלוש קבוצות: לוקליזציה גרעינית, לוקליזציה cytoplasmic ו (לוקליזציה גרעיני פלוס cytoplasmic איור 2). כדי להבין את המרכיבים הנדרשים על ICP0 סחר במהלך זיהום, לנו לעקוב אחר תנועות ICP0 פראי סוג או מוטציה HSV-1-שלבים שונים זיהום. איור 3 מראה דוגמה לטבלאות תוצאות להפצה subcellular של ICP0 בנקודת זמן שונות של זיהום.

Figure 1
איור 1: סחר דינמי ICP0 במהלך זיהום HSV-1- הל תאים גדל בשקופיות 4-ובכן נדבקו עם אב טיפוס HSV-1 (זן F) בתא/10 pfu. ב 1, 5 ו- 9 h פוסט זיהום. מדד מחירי הבתים (. של), התאים היו קבוע, permeabilized, הגיבו ארנב anti-ICP0 ועכבר אנטי-PML העיקרי נוגדנים ואני הגיב אז אלקסה 594-מצומדת ארנב אנטי, אלקסה 488-cojugated העכבר נגד נוגדנים משניים עבור הדמיה תחת 100 X מטרות. חלבון (PML) לוקמיה פרומיאלוציטית משמש סמן חלבון לגופים גרעיני ND10, הנעלמת-5 ו- 9 מדד מחירי הבתים של עקב השפלה PML זיהום. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח של התפלגות subcellular ICP0. פאנל שמאלי: עם מיקרוסקופ קונפוקלי, תאים נציג הורחבו כדי להראות את קו האורך נמשכים על פני התא המגדיר את האזור של הריבית (ROI). לוח נכון: עוצמות קרינה פלואורסצנטית פיקסלים ב- ROI היו לכמת הן ICP0 והן דאפי בתאים בודדים, כמו היסטוגרמות שממחישים את תוכנת היישום קונפוקלי. סף שרירותי (הקו הירוק) נקבע כדי לשקף את ההכתמה רקע. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אחוז הפצה subcellular פראי-סוג ומסוף ג נחתך ICP0. הל תאים נדבקו על ידי וירוסים רקומביננטי המכיל פראי-סוג ICP0 (ICP0 WT) או C-מסוף נחתך ICP0 (ICP0 C-חיתוך) בתא/4 pfu. בנקודות זמן המצוין, התאים היו מוכתמים, ניתח כפי שתואר לעיל. למעלה מ-200 תאים היו ייערכו עבור מיקום ICP0. אחוז תאים המכילים גרעינית, cytoplasmic, או גרעיני + ICP0 cytoplasmic שורטטו עם תוכנת חישוב גיליון אלקטרוני. זהו ניסוי למופת להראות כי באמצעות שיטה זו, זיהינו ICP0 קצה קרבוקסילי כתחום הדרושות רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic ICP0. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה שימש ללמוד רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של HSV-1 ICP0. ICP0 עובר סחר subcellular במהלך זיהום HSV-1 (איור 1). סביר להניח, ICP0 מקיים אינטראקציה עם מסלולים שונים תא כדי לבצע פונקציות שונות במקומות שונים. פעולה זו מאפשרת ICP0 לחידוד שלה פונקציות מרובות משיכת עם הפונדקאי. האנושי13. עם זאת, איך ICP0 מרכזת את פונקציות מרובות בצורה מרחבית-טמפורלית לא טוב נחקרה. עם פרוטוקול מיקרוסקופ פלואורסצנטי שתוארו לעיל, התחלנו לנתח את הבסיס המולקולרי של טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic ICP0. נכון לעכשיו, זיהינו C-הטרמינל ICP0 35 חומצות אמינו כמו רכיב נדרש חשוב רוברטסונית זה. בהיעדר קרבוקסילי, ICP0 מרוסנת בתוך הגרעין במהלך זיהום (איור 3). גם מצאנו את זה של טרנסלוקציה עיכובים הגרעין-כדי-cytoplasmic ICP0 E3 כוח שמירה גרעיני ליגאז תלוית תאים U2OS12. יתר על כן, גילינו כי ICP0 קצה קרבוקסילי וביטוי חלבונים ויראלי מאוחר פעולה כדי להתגבר על השמירה גרעיני וכדי להקל על טרנסלוקציה cytoplasmic12. כיום, אנו משתמשים בפרוטוקול זה למסך של החלבונים ויראלי מאוחר מעורב רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic ICP0.

הפרוטוקול פותחה בתחילה ללמוד את דינמי סחר בבני אדם של ICP0 זיהום HSV-1. כפי שמוצג באיור 1, בשלב מוקדם של זיהום HSV-1, ICP0 colocalized עם ND10, שבו מספר רכיבים מרכזיים של גורמים מגבילים הסלולר ורכיבים ND10 כמו PML, Sp1008, מושפל. לאחר משפילה מרכיבי מפתח ND10, ICP0 מפזרת ברחבי הגרעין, בשלהי זיהום, ICP0 הוא translocated אל הציטופלסמה. כי ICP0 עובר סינתזה דה נובו על זיהום, abundancy הראשוני חלבון נמוכה מאוד, אז סינתזה ויראלי חזקים במהירות מטשטש את התנועה של כל מולקולות בודדות, אשר מקשה על מעקב אחר של מולקולה בודדת באמצעות טכנולוגיית הדמיה בשידור חי. לכן, בחרנו בכוונה לא להשתמש הדמיה בשידור חי. במקום זאת, אימצנו את הפרוטוקול הנ ל ללמוד לוקליזציה מצב יציב ICP0 בנקודות זיהום שונים, אשר שימש אותנו גם מעקב אחר תנועה טמפורלית ICP0 בקרב אוכלוסיה של זיהום HSV-1 תאים...

יחס גבוה האות--לרקע בניתוח קונאפוקלית, שני צעדים קריטיים הם ראויים לציון בחלקו רטוב-הספסל של פרוטוקול זה. ראשית, השקופיות רציף 4-ובכן לאפשר מספר דוגמאות להיות מטופלים על שקופית בודדת אחת. הוא שומר במידה רבה את השימוש של ריאגנטים יקר כמו וירוסים ותוכנות נוגדנים. עם זאת, מכיוון שאמצעי האחסון מוחזק היטב כל כך קטן, מאגר שיורית לא לגמרי מנוקה במהלך שינויי מאגר יכולים להפריע הכימית עוקבות. לכן, ב כל מתג מאגר, השאיפה יסודית נדרשת לפני הוספת המאגר החדש. שנית, מבוסס על החוויות שלנו, מידת חדירות crosslinking ואת קרום התא הוא חשוב עבור הבהירות של קרינה פלואורסצנטית אותות. קבענו מספר אמפירי של 10 דקות paraformaldehyde וטיפולי nonionic חומרים פעילי שטח. מצאנו זמן יותר ארוכים או קצרים יותר 10 דקות יכול להקטין את יחס אות-כדי-ברקע. כפי שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, כמו גם המחקר הקודם12, התמונות שהתקבלו בניסויים שלנו הם צלולים. האות כחול בולט בבירור מתווה את הגבול גרעינית היא המפתח לקביעת התפלגות subcellular של ICP0. החלק חישובית של פרוטוקול זה, הוא צעד חיוני לקבוע סף קבוע כדי לחסל את הרקע. צביעת מוצלח עם יחס גבוה של האות--לרקע היא המפתח קו סף נמוך יותר וחדות אות טוב יותר. שמירה על סף קבוע עבור כל דוגמאות אותו ניסוי, עם זאת, הוא הבסיס עבור התיעוד כמותית של ICP0 (איור 2 , איור 3).

הפרוטוקול יכול לשמש גם ככלי כללי ללמוד subcellular סחר חלבונים ויראלי או סלולר אחרים כאשר שיטת הדמיה חיה מתאימים חסר. בטכניקת דימות בשידור חי, תאים נשמרים סביבת פיזיולוגיים האופטימלית כדי לשמור על התא מצב מטבולי14,15. דרישה בסיסית עבור הדמיה תא חי fluorescently לסמן את חלבון המטרה, אשר יכולה להיות מושגת על ידי מיזוג את חלבון המטרה עם תגית פלורסנט16, או למסור fluorophore מצומדת המולקולה הספציפית עבור החלבון היעד17 . בכל מקרה, בעיות עלולות לנבוע אם הפיוז'ן תגית פלורסנט משתנה המאפיין target חלבון או מולקולה מצומדת fluorophore יש קושי לחצות את קרום התא. Photobleaching הגורמת נזק לתאים בתהליך זה הדאגה נוספים הדמיה חיה18 לכן, אסטרטגיות חדשות כדי להתגבר על המגבלה של הדמיה חיה ממשיכות להיות החזית האלקטרונית של פיתוח טכנולוגיה. פרוטוקול שאנו המתואר כאן מספק ניתוח הטמפורלי של תמונות קונאפוקלית מצב יציב, אשר יכול לשמש ככלי חלופי בעת שיטה נכונה הדמיה חיה אינה זמינה. השיטה זו קלה ואמינה. הוא מספק זיהוי ברור של חלבון לוקליזציה subcellular עם רקע מינימלי. שימוש בתוכנה קונאפוקלית, אנחנו יכולים לנתח את אחוז תאים עם הפצות שונות של החלבון היעד של אוכלוסיה תא ולתעד באופן כמותי התנועה של חלבון המטרה-תא אחר שלבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים תמיכה כספית מ גרנט NIH (RO1AI118992) מוענק גו Haidong. אנו מודים המתקן הדמיה, מיקרוסקופיה הליבה Cytometry משאבים (MICR) באוניברסיטת וויין לקבלת תמיכה טכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells and viruses
Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS
HSV-1 viral Stock (Strain F) Dr. Bernard Roizman Lab
Medium
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Invitrogen  11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-500ml
Medium-199 (10x) Gibco 11825-015
Reagents
4- well 11 mm staggered slide Cel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Fisher reagents BP151-1C0
Bovine Serum Abumin (BSA) Calbiochem CAS 9048-46-8
Horse Serum Sigma H1270
Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) Dr. Haidong Gu lab
NaCl       Fisher Bioreagent BP358-212
KH2PO4             Fisher Bioreagent BP362-500
KCl              Fisher Scientific  BP366-500
Na2HPO4              Fisher Bioreagent BP332-500
Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 antibody Dr. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG santa Cruz Biotechnology SC-966
Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG invitrogen A11012
Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG invitrogen A11001
Vectashield Mouting medium with DAPI Vector laboratories H-1200
Pasteur pipette Fisher Brand 13-678-20D
Nail Polish Sally Hansen
Equipment
Confocal Microscope Leica SP8
Confocal Software Leica LAS X Application suite
Excel software Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 incubator Thermo Scientific Order code 51026282

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5, (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75, (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71, (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68, (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75, (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18, (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90, (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3, (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89, (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92, (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13, (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122, (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23, (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300, (5616), 82-86 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics