En i Vivo -metode for å studere musen blod-testikkel barriere integritet

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å vurdere blod-testikkel barriere integritet ved å injisere inulin-FITC inn testiklene. Dette er en effektiv i vivo -metode for å studere blod-testikkel barriere integritet som kan kompromitteres av genetiske og miljømessige elementer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liu, M., Zhu, C., Bai, S., Li, X., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity. J. Vis. Exp. (142), e58512, doi:10.3791/58512 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spermatogenesis er utvikling av spermatogonia i eldre spermatozoa i seminiferous tubules av testikkel. Denne prosessen er støttet av Sertoli celle veikryss på blod-testikkel barrieren (BTB), som er strammeste vev barrieren i pattedyr kroppen og segregerer seminiferous epitel i to avdelinger, en basal og en adluminal. BTB skaper en unik microenvironment for bakterie celler i meiose jeg / II og for utvikling av postmeiotic spermatids i spermatozoa via spermiogenesis. Her beskriver vi en pålitelig analysen for å overvåke BTB integriteten til mus testikkel i vivo. En intakt BTB blokkerer spredningen av FITC-konjugerte inulin fra de basale apikale rommet av seminiferous tubules. Denne teknikken er egnet for å studere genet kandidater, virus eller miljømessige giftstoffer som kan påvirke BTB funksjonen eller integritet, med en enkel prosedyre og et minimalt krav av kirurgiske ferdigheter sammenlignet med alternative metoder.

Introduction

Pattedyr spermatogenesis regnes som en svært strukturerte prosessen som omfatter spermatogonial selvtillit fornyelse og differensiering gjennom spermatocytes i haploid spermatozoa via mitose, meiose og spermiogenesis, som dramatisk biokjemiske og morfologiske endringer skje. Utvikle bakterie celler transporteres gradvis fra bunnen av seminiferous tubule mot lumen. Denne prosessen er regulert av celle-celle kontakter mellom bakterie celler og Sertoli celler1,2. Tilstøtende Sertoli cellene danner BTB som ligger nær bunnen av seminiferous tubule. BTB deler fysisk epitel i en basal og en adluminal rom. I fasen VIII - IX av epitelial syklusen, migrere preleptotene/leptotene spermatocytes fra de basale avdelinger over BTB, inn i adluminal rom3. Derfor er funksjonen av BTB å gi en immunoprivileged microenvironment for meiose og spermiogenesis4,5,6er fullført. I motsetning til andre blod-vev-barrierer (f.eks, blod - hjerne barrieren) som bare består av tett veikryss (TJs), er BTB dannet av fire forskjellige veikryss (TJs ectoplasmic spesialisering, gap veikryss og mellomliggende filament-basert desmosomes) mellom Sertoli celler1,7.

Mange studier har brukt genetisk endret mus, virusinfeksjoner og miljømessige giftstoffer for å undersøke mekanismer for BTB integritet7,8,9. BTB avbrudd induserer svekket spermatogenesis og subfertility eller infertilitet. Siden BTB dannelse og integriteten er bekreftet for kontakter mellom Sertoli celler8, en i vitro modell basert på primære kulturen i isolerte Sertoli celler har blitt brukt for BTB studie. Men kan ikke denne modellen nøyaktig etterligne BTB dynamics i vivo. Videre har ingen slike co kultur av bakterie celler med Sertoli celler blitt etablert som kan reflektere alle aktuelle strukturelle og funksjonelle komponenter BTB10,11.

Generelt, er i vivo BTB integritet analyser vanligvis basert på små molekyler, som EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin og FITC-konjugerte inulin (inulin-FITC). Normalt er spredningen av biotin eller inulin-FITC fra basale rommet blokkert av BTB struktur. Vi er derfor bruke denne metoden til å vurdere omfanget av BTB skade sammenlignet med kontroll grupper. Mens BTB kan bli svekket med visse typer stimuli, som behandling med kadmium klorid (CdCl2)12, blir BTB tilgjengelig for små molekyler, som til slutt angir adluminal rommet som indikatorer.

Tidlig i vivo BTB integritet analysen innebærer injisere biotin eller inulin-FITC i vena jugularis, som medfører kirurgi, og er invasiv, komplisert og tidkrevende. Dessuten som reporter stoffene diffus gjennom hele kroppen via sirkulasjon, er lokale konsentrasjonen av biotin eller inulin-FITC i de seminiferous tubules begrenset. Videre kan systemisk eksponering forårsake immunreaksjoner. Her presenterer vi en enkel og effektiv i vivo BTB integritet analysen muliggjør direkte injeksjon av en liten aliquot av inulin-FITC i interstitium av en testikkel. Bruke lysstoffrør merking metoden, er som om det praktisk, som sekundær antistoffer ikke er nødvendig. Her er prosessen med fluorescerende fargestoff inn testikkel visualisert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle utført dyreforsøk er godkjent av Nanjing medisinske universitet. Mannlige C57BL/6 mus ble holdt under kontrollerte fotoperiode forhold og ble levert med mat og vann.

1. forberedelser

  1. Microinjection kapillærene
    1. Bruk microinjection kapillærene med ytre diameter, indre dimeter, og lengden på 1.0 mm, 0,8 mm og 10,0 cm, henholdsvis.
    2. Trekk glass kapillærene med en kapillær avtrekker (figur 1A). Test og Juster innstillingene avhengig av kapillær avtrekker maskinen som brukes.
    3. Bryte pipette-spisser med tang å bruke å få kapillærene med 50-µm diameter på spissen.
      Merk: Tips kan være for lang til å trenge testikkel.
    4. Skjerpe tipset i en 30° vinkel ved hjelp av en brønnene beveler (figur 1 c).
  2. Reagenser
    1. Forberede 1% pentobarbital natrium: oppløse pentobarbital natrium 100 mg i 10 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) (trinn 2.3.3).
    2. Forberede 10 mg/mL inulin-FITC: oppløse inulin-FITC 1 mg i 100 μL PBS (trinn 2.1.6).
    3. Forberede 4% paraformaldehyde: løs opp paraformaldehyde (PFA) 4 g i 100 mL PBS (trinn 2.3.3).
    4. Forberede 30% sukrose: oppløse sukrose 3 g i 10 mL PBS (trinn 2.3.4).
    5. Forberede 0,1% kadmium klorid: oppløse kadmium klorid 10 mg i 10 mL PBS (trinn 2.1.1).

2. metoder

  1. Anestesi og presurgery forberedelse
    1. Veie 8-uke-gamle C57BL/6 mannlige mus og beregne den ønskede dosen av CdCl2. Behandle en gruppe mus (n = 3) med CdCl2 (5 mg/kg b.w., IP) for 3 d før operasjonen. Behandle en annen gruppe av 8-uke-gamle C57BL/6 mannlige mus (n = 3) med PBS som kontroll.
    2. Utføre kirurgi aseptiske vilkår ved hjelp av sterile sprøyter, nål, saks og tang.
    3. Forberede anestesi fungerende løsning fersk. Den nødvendige dosen av anestesi er 70 mg pentobarbital natrium/kg av kroppsvekt. I gjennomsnitt veier en voksen C57BL/6 mus 8 uker gamle ~ 25 g, som tilsvarer 175 μL 1% pentobarbital natrium (1,75 mg per musen).
      Merk: Pentobarbital natrium oppløses i sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS). Løsningen er filtrert etter 0.22 um filter enhet før den brukes.
    4. Rense området for kirurgi med 75% etanol og dekker området med et rent vev håndkle.
    5. Aktivere Termostatiske varmeapparatet og justere temperaturen å 37 ° C.
    6. Forberede inulin-FITC fungerende løsning (10 mg/mL) på dagen for kirurgi.
  2. Kirurgisk prosedyre
    1. Veie 8-uke-gamle C57BL/6 mannlige mus og beregne den nødvendige dosen av anestesi.
    2. Utføre en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital natrium bruker 1 mL steril sprøyten. Hold musen i en ren bur.
    3. Observere øye refleks svar og pustemønster på å bekrefte at det er under full narkose.
      Merk: Vanligvis 10-15 min er nødvendig til musen er dypt anesthetized, med en total mangel på tå knipe svar og vedlikehold av langsom, jevn pusting.
    4. Flytte musen til drift og dekke sine øynene med en fuktig papir å unngå tørrhet under anesthesia (figur 2A).
    5. Barbere den abdominal håret med en barbermaskin og desinfisere kirurgi området med 75% etanol.
    6. Med skarp saks, lage en 1 cm huden snitt over preputial kjertel å avsløre bukveggen. Løft bukveggen med liten tang og gjøre en 0,5 cm snitt å avsløre bukhulen (figur 2B).
    7. Bruk tang til å søke etter fett pads rundt bitestikkel og testikkel. Trekk forsiktig i fett pads for å utsette den tilknyttede testikkel klart (figur 2C og 2D). Vanligvis, Operer på én testikkel samtidig.
      Merk: Unngå å berøre fett pads og testikkel med hendene.
    8. Plass en papir (9 cm i diameter) under fett pads og testikkel (figur 2C).
    9. Injisere inulin-FITC i en microinjection pipette, og koble den til micromanipulator enhet (figur 1 d). Forsiktig sett microinjection pipette under tunica albuginea og laste inn totalt 20 μL inulin-FITC i interstitium av testikkel (figur 2E og 2F).
      Merk: Trykke forsiktig ned microinjection pipette for å unngå å flytte den.
    10. Overvåke bevegelsen av inulin-FITC i testikkel (figur 2 g).
    11. Umiddelbart sett testikkel tilbake i bukhulen etter ferdigstillelse av injeksjon.
    12. Gjenta på kontralateral testikkel. Denne testikkel injiseres med 20 μL PBS som en kontroll.
    13. Lukk huden med en kirurgisk Sutur og flytte musen til en heten pute med en termostatstyrt ovn (figur 1B). Administrere en dose av 1 mg av smertestillende (buprenorfin) per 1 kg kroppsvekt via injeksjon.
  3. Høsting av testiklene og frosne snitt forberedelse
    1. 40 min etter injeksjon, euthanize musen mottakerens av cervical forvridning ifølge dyr omsorg og bruk retningslinjer.
    2. Bruk en skarp saks for å samle testiklene. Plass testiklene i 1 mL av iskalde PBS fjerne alle blod forurensning.
    3. Fastsette testiklene i 4% paraformaldehyde (PFA) på 4 ° C for 12-24 h. Forkast 4% PFA og vask vevet 3 x med 1,5 mL 1% PBS ved romtemperatur.
    4. Tørke vevet i 30% sukrose over natten. Testikkel innlegge innebygging rammen og dekker vevet med optimal kutte temperatur sammensatte (OCT). Når Tilpasningsverktøy frosset, fylle innebygging rammen med OCT slik at hele testikkel kan dekkes med OCT.
    5. Kutte 5 μm-tykke, frosne tverrsnitt av testiklene i en kryostaten på 20 ° C og la dem overholder objektglass.
      Merk: Refreezing innebygde vev i tørris kan øke stivhet for skjæring.
  4. Bildet rekvisisjon
    1. Plass lysbildene i en fuktet. Varm lysbildene ved romtemperatur for 10 min.
    2. Vask delene 3 x med Tris-bufret saltvann (SS) i romtemperatur.
    3. Air-Dry for 5 min i mørket. Tørke av eventuelle gjenværende TBS støvfritt papir.
    4. Dekk tverrsnitt med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Plass den omvendte dekkglassvæske på et mikroskop lysbilde.
    5. Hente bilder ved hjelp av en AC confocal mikroskop. Totalt 20 X forstørrelse er vanligvis tilstrekkelig for registrerer lys fluorescerende signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det eksperimentelle oppsettet for å utføre BTB integritet analysen er vist i figur 1. Trekk og skjerpe microinjection kapillærene kapillær avtrekker og brønnene beveler, henholdsvis (figur 1A og 1 C). Termostatiske varmeapparatet og utstyr for microinjection er illustrert i figur 1B og 1 D.

Figur 2 viser noen av de viktigste trinnene for injeksjon av inulin-FITC. Bruk saks for å gjøre et lite innsnitt etter musen har gjennomgått full narkose (figur 2A og 2B). Mus testikkel er utsatt og injisert med fluorescerende farge ved hjelp av en microinjection pipette (figur 2C - 2 G).

Figur 3 viser typisk bilder av en studie for å vurdere BTB integritet basert på analysen i vivo . Mus i CdCl2-behandlingsgruppe er injisert med en akutt dose av CdCl2 (5 mg/kg b.w., IP) for 3 dager. Spredningen av inulin-FITC fra basale batterirommet blokkeres av BTB strukturen i kontrollgruppen, mens BTB bygging er skadet og inulin (grønn fluorescens) passasjer i den apikale kupé av seminiferous epitel i CdCl2 -behandlingsgruppe. Hvit linjesegmenter angir avstanden reist av inulin fra kjelleren membranen (figur 3A). Omfanget av BTB skade bestemmes av avstanden. For en elliptisk lumen er radius gjennomsnittet av den korteste og lengste avstanden fra basale rommet til midten av tubule. Vi bruker slik en ratio som en indeks over omfanget av skaden BTB:
Equation
Her DInulin er avstanden reist av inulin fra basale kupé og DRadius er radius av den samme seminiferous tubule (figur 3B). Den intakte BTB i Rictorfl / + mus blokkerer spredningen av inulin over barrieren for å angi apikale batterirommet. Derimot har Rictorcko mus en utsatt BTB tillater inulin diffusjon (Figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: utstyr for musen testicular interstitiell microinjection. (A) trekk glass kapillærene med en loddrett kapillær avtrekker. (B) dette panelet viser Termostatiske varmeapparatet. (C) tips er skjerpet bruker brønnene beveler. (D) enheten for microinjection inneholder en microinjection pumpe og stereo mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representant bilder av et i vivo testicular interstitiell microinjection fortsetter i en mus. (A) dette panelet viser fjerning av abdominal hår av en barbermaskin. (B) dette panelet viser 0,5 cm bukveggen innsnitt å avsløre bukhulen. (C) trekk fett pads for å utsette den tilknyttede testikkel klart. (D) dette panelet viser plasseringen av det testikkel og bitestikkel. (E) dette panelet viser plasseringen av microinjection pipette. (F) sett inn microinjection Pipetter i interstitium av testikkel. (G) dette panelet viser en testikkel med en vellykket injeksjon i interstitium av testikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: En studie for å vurdere BTB integritet basert på i vivo funksjonelle analysen. Voksne mannlige mus (n = 3 både behandling gruppen og kontrollgruppen) er behandlet med CdCl2 (5 mg/kg b.w., IP) for 3 dager (behandlingsgruppe) eller behandlet med PBS for 3 dager (kontrollgruppen). Inulin-FITC (grønn fluorescens) ligger nær bunnen av seminiferous tubule i kontrollgruppen, mens inulin-FITC starter en passasje over BTB i gruppen CdCl2-behandling. (A) i dette panelet, hvit linjesegmenter Angi avstand inulin-FITC invaderer. Skala barer er 20 μm. (B) Data fra BTB integritet analyser er vist i dette histogrammet som viser avstanden reist av inulin (DInulin) vs radius av den samme tubule (DRadius). Åtti tubuli er tilfeldig valgt. P < 0,001 (Student t-test). (C) BTB integritet er kompromittert i testiklene Rictorcko mus. I Rictorcko mus tubuli penetrerer inulin dypt inne seminiferous epitel, nå tubule lumen. Skala barer er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spermatogenesis foregår i seminiferous epitel og er en svært organisert og dynamisk prosess som styres av bakterie celler og somatiske celler (f.eks Sertoli celler)13. Den BTB strukturen, som er konstruert av Sertoli celler, deler seminiferous epitel i en basal og en apikale rom. Utviklingen av meiotic og haploid bakterie celler oppstår i apikale rommet som danner en immunologiske barriere14.

Funksjonen BTB kan kompromitteres av giftstoffer eller defekter i gener involvert i dannelsen av cellen veikryss, fører til mannlig infertilitet. Undersøke BTB integritet, etterligner en i vitro Sertoli celle kultur-systemet har blitt etablert som kan danner funksjonelle epitel at tett de BTB i vivo15. I vitro systemet gir en enkel modell for å studere struktur og funksjon av Sertoli celle veikryss. Men Sertoli celler isolert fra testikkel og kultivert i vitro er begrenset med hensyn til dyr alder og celle tetthet15,16. I tillegg overvåket renheten av Sertoli celler og tilstedeværelsen av ultrastructures etterligne BTB funksjoner må være17. Viktigere, BTB strukturen og integriteten krever også interaksjoner mellom bakterie celler og Sertoli celler, som tydelig fra studier av bakterie-celle-spesifikk null mutant mus med BTB mangler10,18,19. Dermed celler skape en co kultur for bakterie celler med Sertoli i vitro for formålet med recapitulating alle avgjørende i vivo funksjon av BTB fortsatt utfordrende11,20.

Denne protokollen beskriver en metode for å vurdere BTB integritet i vivo ved å injisere inulin-FITC, som ble endret fra en prosedyre av Chen et al. 21. protokollen beskriver anestesi mannlige mus, eksponering av bukhulen, microinjection av fargestoff inn i interstitium av testikkel, høsting testiklene og klippe dem i frosne inndelinger og oppkjøpet av bilder. For en vellykket gjennomføring, bør flere trinn bemerkes. Først er det viktig å bruke en passende dose anestesi, fordi sterkt dyp anestesi kan føre til døden. Også bør lengden på spissen av injeksjon kapillær ikke være for langt. ellers trenge pipette ikke testikkel.

Prosedyren presenteres her kan benyttes for å analysere rollen virus, kjemiske giftstoffer eller kandidat proteiner involvert i regulering av BTB. Denne analysen er sensitiv, pålitelig og tilgjengelig til å overvåke BTB integritet i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National nøkkel R & D Program i Kina (2016YFA0500902), National Natural Science Foundation av Kina (31471228, 31771653), Jiangsu Science Foundation fremragende unge forskere (BK20150047), naturfag Jiangsu provinsen (BK20140897, 14KJA180005) og nyskapende og entreprenør programmet Jiangsu provinsen til K.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary puller  SUTTER INSTRUMENT (USA) P-97
10x PBS Hyclone (USA) SH30258.01 dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma (USA) F6057
Adhesion microscope slides CITOGLAS (China) 80312-3161
Cadmium chloride Sigma (USA) 655198-5G
Confocal microscope Zeiss (Germany) LSM700
Dust-free paper Kimberly-Clark (USA) 34120
Inulin-FITC Sigma (USA) F3272
Microinjection capillaries Zhengtianyi (China) BJ-40 1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler NARISHIGE (JAPAN) EG-400
OCT SAKURA (JAPAN) 4583
Paraformaldehyde Sigma (USA) P6148
Pentobarbital sodium Merck (Germany) P11011
Shaver  Yashen (China)
Stereo microscope Nikon (JAPAN) SMZ1000
Sucrose  Sangon Biotech (China) A610498
Surgical instruments Stronger (China) scissors, forceps, needle holder
Syringe KDL (China) 20163150518 0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater KELL (Nanjing, China) KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris Sangon Biotech (China) A600194
1.37 M Nacl Sangon Biotech (China) A610476

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25, (5), 747-806 (2004).
  2. Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4, (4), e1265042 (2016).
  3. Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178, (4), 549-556 (2007).
  4. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
  5. O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
  6. Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
  7. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36, (5), 564-591 (2015).
  8. Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540, (7633), 438-442 (2016).
  9. Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30, (18), 2777-2786 (2016).
  10. Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204, (7), 1173-1190 (2014).
  11. Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31, (16), 4492-4505 (2010).
  12. Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47, (1), 81-86 (1970).
  13. Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9, (4), 411-416 (1998).
  14. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64, (1), 16-64 (2012).
  15. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
  16. Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203, (4), 485-492 (1982).
  17. Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68, (2), 489-508 (2003).
  18. Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24, (5), 244-259 (2018).
  19. Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93, (6), 139 (2015).
  20. Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24, (2), 151-169 (1989).
  21. Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics