Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt

Immunology and Infection

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Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der Lunge Ausdruck von MiRNAs, die vorausgesagt werden, entzündlichen Gene regulieren mit Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus.

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Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

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Abstract

MicroRNA (MiRNA) Profilerstellung ist von Interesse für Forscher arbeiten in verschiedenen Forschungsgebieten der Biologie und der Medizin geworden. Aktuelle Studien zeigen eine viel versprechende Zukunft der Verwendung von MiRNAs bei der Diagnose und Betreuung von Lungenerkrankungen. Hier definieren wir ein Protokoll für MiRNA profiling um die relative Häufigkeit einer Gruppe von MiRNAs voraussichtlich im Lungengewebe von von einem Mausmodell Ozon-induzierte Atemwege Entzündung entzündlichen Gene regulieren zu messen. Weil sich gezeigt hat, dass zirkulierenden Sexualhormone die Regulierung der angeborenen Immunität Lungenkrebs bei Frauen beeinflussen kann, ist der Zweck dieser Methode zu beschreiben, eine entzündliche MiRNA profiling Protokoll bei weiblichen Mäusen, unter Berücksichtigung des Estrous Zyklus Bühne der einzelnen Tiere zum Zeitpunkt der Ozonbelastung. Wir befassen uns auch geltenden Bioinformatik Ansätze zur MiRNA-Entdeckung und Ziel Identifizierungsmethoden mit Limma, ein R/Bioconductor-Software, und Funktionsanalyse Software zu verstehen, die biologischen Kontext und Wege zugeordnet differenzielle MiRNA Ausdruck.

Introduction

Micro-RNAs (MiRNAs) sind kurze (19 bis 25 Nukleotide), natürlich vorkommende, nicht-kodierende RNA-Moleküle. Sequenzen von MiRNAs sind evolutionär konserviert über Artgrenzen, was auf die Bedeutung der MiRNAs bei der Regulierung der physiologischen Funktionen1. MicroRNA Expression profiling ist nachgewiesen worden, zur Identifizierung von MiRNAs, die wichtig sind bei der Regulierung der eine Vielzahl von Prozessen, einschließlich der Immunantwort, Zelldifferenzierung, Entwicklungsprozesse und Apoptose2hilfreich sein. Vor kurzem wurden MiRNAs für ihre mögliche Verwendung in der Krankheit Diagnostik und Therapie anerkannt. Für Forscher, die Mechanismen der Genregulation kann messen MiRNA Ausdruck aufklären Systemebene Modelle der regulatorischen Prozesse, vor allem beim MiRNA Informationen mit mRNA profiling und andere Genom angelegten Daten3. Auf der anderen Seite MiRNAs haben auch gezeigt, dass stabiler als mRNAs in verschiedensten Probenarten und auch sensibler als Proteine4messbar sind. Dies führte zu erheblichen Interesse an der Entwicklung von MiRNAs als Biomarker für unterschiedliche molekulare diagnostische Anwendungen, einschließlich Lungenerkrankungen.

In der Lunge MiRNAs eine wichtige Rolle in den Entwicklungsprozessen und die Aufrechterhaltung der Homöostase. Darüber hinaus wurde ihre abnormen Ausdruck der Entstehung und Progression von verschiedenen Lungenkrankheiten5zugeordnet. Entzündliche Lungenerkrankungen induziert durch Luftverschmutzung hat gezeigt, mehr schwere und schlechtere Prognose bei Frauen, die darauf hinweist, dass Hormone und den Estrous Zyklus Lunge angeborene Immunität und MiRNA Ausdruck als Reaktion auf ökologische Herausforderungen regulieren können 6. in diesem Protokoll verwenden wir Ozonbelastung, das ist ein wichtiger Bestandteil der Luftverschmutzung, um eine Form der Lungenentzündung bei weiblichen Mäusen zu induzieren, das auftritt, in Ermangelung der adaptiven Immunität. Durch die Verwendung von Ozon, sind wir die Entwicklung der Atemwege Hyperreaktivität induziert, die Atemwege Epithelzelle Schaden und eine Erhöhung der Neutrophilen und Entzündungsmediatoren im proximalen Airways7zugeordnet ist. Derzeit gibt es keine gut beschriebenen Protokolle zu charakterisieren und zu analysieren MiRNAs über den Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt.

Im folgenden beschreiben wir eine einfache Methode zur Ermittlung Estrous Zyklus Phasen und MiRNA Ausdruck im Lungengewebe von weiblichen Mäusen Ozon ausgesetzt. Wir sprechen auch effektive Bioinformatik Ansätze zur MiRNA Entdeckung und Target Identifizierung mit dem Schwerpunkt Bioinformatik. Wir analysieren die Microarray-Daten mithilfe von Limma, eine R/Bioconductor-Software, die eine integrierte Lösung bietet für die Analyse von Daten aus gen Ausdruck Experimente8. Analyse von PCR-Arraydaten aus Limma hat einen Vorteil in Bezug auf Leistung gegenüber t-basierte Testverfahren bei der geringen Anzahl von Arrays/Proben Verwendung Ausdruck zu vergleichen. Um biologische Zusammenhang mit MiRNA Ausdrucksergebnisse zu verstehen, haben wir dann die funktionale Analyse-Software verwendet. Um die Mechanismen zur Regulierung transcriptional Änderungen zu verstehen und wahrscheinlich Ergebnisse vorherzusagen, kombiniert die Software MiRNA-Ausdruck Datasets und wissen aus der Literatur-9. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zu Software, die für die statistische Anreicherung in überlappenden Gruppen von MiRNAs schauen.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Penn State University genehmigt.

1. Beurteilung des Estrous Zyklus-Phase

  1. Zurückhalten Sie richtig ein Weibchen C57BL/6 die einhändige Maus Zurückhaltung Technik in Machholz Et Al.10beschriebenen Maus (8 – 9 Wochen alt) zu verwenden.
  2. Füllen Sie die sterile Pipette aus Kunststoff mit 10 μL ultrareines Wasser.
  3. Kunststoff Pipettenspitze in die Vagina einführen.
  4. Sanft spülen die Flüssigkeit 4 – 5 Mal auf die Probe zu sammeln.
  5. Legen Sie die letzte Spülung mit Scheidenflüssigkeit auf einen Objektträger.
  6. Die ungefärbte vaginale Spülung unter einem Lichtmikroskop mit einem 20 X Objektiv zu beobachten.
    Hinweis: Tiere, die nicht in regelmäßigen Zyklen durch Scheinträchtigkeit oder andere Ursachen-show aus dem Experiment ausgeschlossen werden müssen. Es wird empfohlen, täglich Vaginalsekret für mindestens drei aufeinander folgenden Zyklen Zyklizität bestätigen durchführen.

2. Belastung durch Ozon

  1. Legen Sie maximal 4 Mäuse in zwei 1,2 L Glasbehälter mit Wire Mesh Deckel und Wasser ad libitum.
  2. Setzen Sie einen Glasbehälter in der Ozon-Kammer und der andere in der gefilterten Luftkammer Exposition.
  3. Die Ozonkonzentration um 2 ppm und Monitor Ozonwerte regelmäßig anzupassen.
    Hinweis: Das Ozon-Gerät liefert einen geregelten Luftstrom (> 30 Luft Änderungen/h) mit kontrollierten Temperatur (25 ° C) und Luftfeuchtigkeit (50 %). Das System erzeugt Ozon durch eine elektrische Entladung Ozonisators, die überwacht und gesteuert durch ein UV-Ozon-Analysator und Massendurchflussregler, wie oben beschrieben11.
  4. Entfernen Sie Glasbehälter nach 3 h Ozon/gefilterte Luft ausgesetzt. Tiere, mit Bettwäsche, Nahrung und Wasser ad libitum Käfig zurück.

(3) Lunge Sammlung

  1. 4 h nach der Belichtung zu betäuben Tiere mit einer intraperitonealen Injektion eine Ketamin/Xylazin cocktail (90 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin).
    Hinweis: Um einen angemessenen Grad an Anästhesie zu bestätigen, überprüfen Sie die Maus für ein Pedal reflex (feste Zehe Prise) und die Narkose nach Bedarf anpassen.
  2. Die Maus Haut mit 70 % Ethanol zu dämpfen.
  3. Machen Sie einen 2 cm Mittellinie Schnitt mit einem operativen Scheren und chirurgische Pinzetten, um die untere Hohlvene verfügbar zu machen.
  4. Opfern Sie Mäuse durch Durchtrennung der Vena Cava und Aorta. Bei Bedarf legen Sie 21 G-Gauge-Nadel in der Vena Cava oberhalb der renale Adern Blut vor dem Entbluten zu sammeln. Alternativ sammeln Sie Blut über Herz durchbohren nach standard-Protokolle.
  5. Verwenden Sie eine chirurgische Schere aufschneiden der Bauchhöhle und Haut/obere Muskel, verschieben nach oben in Richtung der Rippen entfernen.
  6. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Membran zu durchbohren.
    Hinweis: Lungen werden von der Membran zusammenbrechen.
  7. Schneiden Sie den Brustkorb mit einer chirurgischen Schere, um Herz und Lunge verfügbar zu machen.
  8. Mit Pinzette, nehmen Sie eine 1,5 mL RNase-freie Microcentrifuge Schlauch und Tauchen Sie es in flüssigem Stickstoff, das Rohr zu füllen.
    Hinweis: Verwenden Sie Schutzbrille und Schutzhandschuhe, flüssigen Stickstoff behandeln.
  9. Entfernen Sie der Lunge zu, legen Sie sie in die RNase-freie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gefüllt mit flüssigem Stickstoff zu Snap-das Gewebe Einfrieren, und warten Sie einige Sekunden, bis die Flüssigkeit verdampft.
  10. Schließen Sie den Schlauch Deckel und speichern Sie das Gewebe bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu.

(4) RNA-Vorbereitung

  1. Ganze Lunge mit einer Edelstahl-Gewebe Pulverisator zu pulverisieren.
    Hinweis: Das Gewebe Pulverisator muss in flüssigem Stickstoff vor der Anwendung platziert werden. Reinigen Sie den Zerstäuber nach jedem Gebrauch mit RNAse-Lösung.
  2. Die pulverisierten Lungen aufgeteilt und legen Sie in zwei 1,5 mL Röhrchen (halbe Lunge).
  3. 500 µL Guanidinium-Thiocyanat pro Probenröhrchen und verrühren.  Jede Probe mit 18 G, 21 G und 23 G Nadeln bzw. zu homogenisieren.
    Hinweis: Proben können mit 5,6 x 108 Kopien (von einer anderen Spezies) bevor mit der Extraktion ein kleines RNA Spike-im Steuerelement versetzt werden.
  4. Jede Probe und Vortex für 15 500 µL Ethanol hinzufügen s.
  5. Last die Mischung in einer Spin-Spalte in einem Sammelrohr und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. verwerfen der durchströmten.
  6. Für DNase ich Behandlung (in Spalten);
    1. 400 µL RNA Wash Buffer und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min hinzufügen.
    2. Fügen Sie in eine RNase-freies Rohr 5 µL der DNase I und 75 µL 1 x DNA Verdauung Puffern und mischen. Fügen Sie die Mischung direkt in die Spalte Matrix.
    3. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
  7. Die Spalte und die Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. verwerfen der durchströmten 400 µL RNA eingespült Lösung hinzu, und wiederholen Sie diesen Schritt.
  8. Hinzufügen der Spalte 700 µL Waschpuffer RNA und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1 min. Entsorgen der durchströmten.
  9. Zentrifugieren Sie bei 12.000 X g für 2 min, verbleibende Puffer zu entfernen. Übertragen Sie die Spalte in eine RNase-freies Rohr.
  10. Um RNA eluieren, 35 µL DNase/RNase-freies Wasser direkt hinzufügen der Spalte Matrix und Zentrifuge bei 12.000 X g für 1,5 min.
  11. Total RNA-Konzentration zu messen (260 nm) und Reinheit mit einem Spektralphotometer. Befolgen Sie die Anweisungen zum RNA Quantifizierung in einer 1,5 µL Probe aliquoten durchführen. Das Instrument mit DNase/RNase-freies Wasser zur Elution leer.
    Hinweis: ~2.0 260/280 Verhältnis gilt allgemein als "rein" für RNA. Typische RNA-Konzentration reicht in der Regel zwischen 750 und 2.500 ng/µL.
  12. Shop bei-80 ° C.

5. MiRNA Profiling

  1. Retro-kleine RNAs, Einsatz 200 ng von Gesamt-RNS transkribieren.
    1. Bereiten Sie die Reverse Transkription Reaktion Mischung auf Eis (Gesamtvolumen pro Reaktion beträgt 20 µL). Fügen Sie für jede Reaktion 4 µL 5 x Puffer, 2 µL 10 X Nukleotide-Mix, 2 µL Reverse Transkriptase und 2 µL RNase-freies Wasser. Mischen Sie die Komponenten und Aliquot in 600 µL RNAse-freie Kunststoff-Rohre (10 µL-Mix pro Reaktion).
      Hinweis: Die Reverse Transkription-master-Mix enthält alle Komponenten, die erforderlich für die erste-Strang cDNA Synthese außer Vorlage RNA.
      Hinweis: Berechnen Sie überschüssige Volumen (10 %), bei der Vorbereitung der master-Mix.
    2. Fügen Sie die Vorlage RNA (200 ng in 10 µL) auf jedes Röhrchen mit Reverse Transkription master-Mix. Mix, Zentrifuge für 15 s bei 1000 X g, und speichern sie auf Eis bis in Thermocycler oder trockene Block platzieren.
    3. 60 min bei 37 ° c inkubieren
    4. 5 min bei 95 ° C inkubieren Sie und die Rohre auf Eis.
    5. Verdünnen Sie die cDNA durch Zugabe von 200 µL RNase-freies Wasser zu jeweils 20 µL Reverse Transkription Reaktion.
  2. Durchführen Sie Real-Time PCR unter Verwendung der Maus Entzündungsreaktion und Autoimmunität MiRNA PCR Array.
    1. Bereiten Sie eine Reaktion Mischung (Gesamtvolumen 1100 µL): für jede Reaktion hinzufügen, 550 µL 2 X PCR-master-Mix, 110 µL 10 x universal Grundierung Mischung, 340 µL RNase-freies Wasser und 340 µL Vorlage cDNA (verdünnte Reaktion von Schritt 5.1.5).
    2. Jede Vertiefung des vorinstallierten MiRNA PCR-Array mit einem Mehrkanal-Pipette fügen Sie 10 µL Reaktion Mischung hinzu.
    3. Versiegeln Sie die MiRNA Array PCR Platte mit optischen Klebefolie.
    4. Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 1.000 X g bei Raumtemperatur um Luftblasen zu entfernen.
    5. Programmieren Sie die Echtzeit-Thermocycler, PCR Erstaktivierung Schritt für 15 min bei 95 ° C, 3-Stufen-Radsport enthaltenden Denaturierung für 15 s bei 94 ° C, Glühen für 30 s bei 55 ° C und Erweiterung für 30 s bei 70 ° C für 40 Zyklen Reihe.
      Hinweis: Folgen des Herstellers Radfahren Bedingungen Anweisungen zum Einrichten der Echtzeit-Cycler. Führen Sie die Dissoziation Kurve Schritt in die Echtzeit-Cycler-Software integriert.
    6. Datenanalyse.

(6) Datenanalyse

  1. Ct-Werte aus der Real-Time PCR Software für jede Probe in einer Analyse-Software zu extrahieren.
    Hinweis: Ein CT-Wert von 34 gilt als Cut-off. Wenn Proben Spike-Steuerelement (z. B., Cel-Mir-39) enthalten, normalisieren Sie Ct-Werte, die Spitze in der Steuerung für jede Probe. Grenzwerte müssen manuell eingestellt werden. Ausgangswerte werden automatisch eingestellt.
  2. Ct-Werte, die durchschnittliche Ct von sechs MiRNA-Housekeeping-Steuerelementen zu normalisieren: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, unter Verwendung der folgenden Gleichung:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. Für Falte ändern Sie Berechnungen, berechnen Sie ΔΔCt Werte mit einer bestimmten Probe als das Steuerelement, mit dem relativen Ausdruck Gleichung12:
    MiRNA relativen Ausdruck:
    2-∆∆Ct, wo - ∆∆Ct =-[∆Ct Test - ∆Ct Kontrolle]
    Hinweis: Eine Falte Änderung von 200 gilt als Cut-off.
  4. Export-Falte ändern Ausdruckswerte auf R mit dem Limma -Paket Bioconductor8statistische Analysen durchzuführen.
  5. Für multiple Vergleiche anhand der Benjamini-Hochberg Methode13zu korrigieren.
    Hinweis:  Eine Kopie der R-Skript ist abrufbar: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Datasets und analysierten Daten stehen auch an der Gene Expression Omnibus unter Nummer GSE111667 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. Analyse: Funktionelle Analysesoftware

  1. Ordnen Sie das Dataset. Enthalten Sie MiRNAs mit ihren jeweiligen Ausdruck Log Verhältnisse und p-Werte. Siehe Tabelle 1 für die Formatierung von bestimmten Dataset.
  2. Offenen Funktionsanalyse Software (Version 10/01).
  3. Laden Sie das Dataset mithilfe des folgenden Formats: Dateiformat: "Flexible Format", enthält Spaltenüberschrift: "Ja", wählen Sie Bezeichnertyp: "MiRBase (alt)" Array-Plattform für Experimente verwendet: Wählen Sie die Array-Plattform.
    Hinweis: Akzeptierte Dateiformate sind txt (Registerkarte "getrennte Textdateien), XLS (excel-Dateien), und .diff (Cuffdiff Dateien).
  4. Wählen Sie "Beobachtungen ableiten" und überprüfen Sie, ob die experimentelle Gruppe Beschriftung korrekt ist.
  5. Gehen Sie zu "Dataset Zusammenfassung", den Gesamtbetrag der zugeordneter und nicht zugeordneter MiRNAs zu überarbeiten.
  6. Klicken Sie auf die Schaltfläche "neu" am oberen linken Ecke des Programms. Wählen Sie "Neue MicroRNA Ziel Filter" und laden Sie ein MicroRNA-Dataset.
    1. Legen Sie Quelle: TarBase, Einfallsreichtum Experten Erkenntnisse, MiRecords.
    2. Vertrauen gesetzt: experimentell beobachteten oder hohe (vorausgesagt).
    3. Wählen Sie "Spalten hinzufügen", um eine Vielzahl von biologischen Informationen zu den Zielgruppen wie Arten, Krankheiten, Gewebe, Wege und mehr umfassen.
    4. Um Ziele zu konzentrieren, die Ausdruck im Experiment geändert haben, wählen Sie "hinzufügen / ersetzen mRNA Dataset". Verwenden Sie "Ausdruck Pairing", um Micro-RNAs mit dem gleichen oder einem anderen Ausdruck zu finden.
      Hinweis: Die Filter-Analyse liefern MicroRNA-Namen und Symbole, mRNA-Ziele, die Quelle, die Ziel-Beziehung und das Konfidenzniveau der vorhergesagten Beziehung (Abbildung 2) beschreibt.
  7. Klicken Sie auf "Hinzufügen zu mein Weg" zum Senden der gefilterten Datensatz auf einer Leinwand weg und mehr biologische Zusammenhänge zu erforschen.
  8. Verwenden Sie Weg Designer Publikation Qualitätsmodell MicroRNA-Effekte zu erstellen.
  9. Eine Alternative ist die Schaffung eine Kern-Analyse.
    1. Wählen Sie für Kern-Analyse "Expression Analysis".
    2. Wählen Sie für Messung "Expr Log Ratio".
    3. Analyse Filter Zusammenfassung: betrachten nur Moleküle bzw. Beziehungen wo: (Art = Maus) und (Vertrauen = experimentell beobachteten) AND (Datenquellen = "Einfallsreichtum Experte Ergebnisse", "Einfallsreichtum ExpertAssist Ergebnisse", "MiRecords", "TarBase", oder " Zielscan Mensch").
    4. Wählen Sie eine Abschaltung der p-Wert = 0,05.
    5. Führen Sie die Analyse.
      Hinweis: Der Bericht umfasst: kanonische Pfade, vorgelagerten Regulierungsbehörden Analyse, Krankheiten und Funktionen, Regler Effekte, Netzwerke und Moleküle.

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Representative Results

Die verschiedenen Zelltypen in Ausstrichen beobachtet werden verwendet, um die Maus Estrous Zyklus-Phase (Abbildung 1) zu identifizieren. Diese sind durch Zellmorphologie gekennzeichnet. Während Proestrus sind Zellen fast ausschließlich Trauben von runden, wohlgeformten kernhaltigen Epithelzellen (Abbildung 1A). Wenn die Maus in die Brunst ist, sind Zellen verhornten Plattenepithel Epithelzellen, in dichten Büscheln (Abbildung 1 b) vorhanden. Während Metestrus, verhornten Epithelzellen und polymorphkernige Leukozyten gesehen (Abbildung 1). Im Diestrus sind Leukozyten (kleine Zellen) in der Regel häufiger (Abbildung 1).

Wir extrahieren RNA aus vier Maus Lungen nach dem zuvor beschriebenen Protokoll. Die Nukleinsäure-Konzentration (ng / µL) lag zwischen 1197.9 und 2178.1 mit einem Durchschnitt von 1583.1 ± 215 (Tabelle 1). Die durchschnittliche A260/A280 Verhältnis schwankte von 2.010 2.020 mit einem Durchschnitt von 2.016 ± 0,002. Auf der anderen Seite die beobachteten A260/A230 Verhältnisse schwankte zwischen 2.139 und 2.223 mit einem Durchschnitt von 2.179 ± 0,018.

Tabelle 2 zeigt differentielle Expression-Ergebnisse mit Limma auf R. Wir berechnen Top differentiell exprimierten MiRNAs zwischen Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in Proestrus (mit dem Befehl Toptable)14. Die erste Spalte gibt den Wert der log2-Falte Falte Änderung in MiRNA Ausdruck zwischen Ozon und gefilterte Luft ausgesetzt Tiere. Die Spalte t stellt die moderate t-Statistik berechnet für jede MiRNA im Vergleich. Die Spalten p.value und adj.p.value stellen zugeordneten p-Werte für jeden Vergleich vor und nach mehreren Tests Anpassung bzw.. Anpassung für Mehrfachvergleiche erfolgte mit der Benjamini und Hochberg Methode false Discovery Rate15steuern. Spalte B stellt die Log-Chancen, die die MiRNA differentiell ausgedrückt8.

Wir führten die MiRNA soll Filter und Kern-Analyse, die der Anreicherung Pathway Analyse beinhaltet. Nach dem Hochladen einer Liste der 14 MiRNAswith der Ausdruck Log Verhältnis und p-Wert, wurden alle von ihnen vom MiRNA Ziel Filter (Tabelle 3) zugeordnet. Die Ergebnisse gefiltert und sortiert werden, um bestimmte Wege, in diesem Fall die "zelluläre Immunantwort" bekommen. Die Kern-Analyse lieferte Informationen über kanonische Pfade, Krankheiten und Funktion, Regulierungsbehörden und Netzwerke (Tabelle 4). Die funktionelle Analyse-Software produziert eine Netzwerk-Analyse, die zeigt, das Verhältnis zwischen der MiRNAs von Interesse und anderen Molekülen (Abbildung 3).

Figure 1
Abbildung 1: Identifizierung des Estrous Zyklus Phasen. (A) Proestrus (überwiegend kernhaltigen Epithelzellen); (B) Östrus (überwiegend Anucleated verhornten Zellen); (C) Metestrus (alle drei Arten von Zellen); und (D) Diestrus 2 (Mehrheit der Leukozyten). Maßstabsleiste = 100 µm. Vergrößerung = 20 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: funktionelle Analyse Software repräsentative Ergebnisse: MiRNA Ziel Filter. Umfassendes Profil von MiRNAs in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus. Nach der Durchführung MiRNA Filter, liefert die Software detaillierte Listen von Genen und Verbindungen verwickelt in Krankheiten und anderen Phänotypen, die Filter und Sortierung kommt man zu bestimmten Wege, in diesem Fall "Zelluläre Immunantwort" sein kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Funktionsanalyse Software repräsentative Ergebnisse: Netzwerke. Vergleich der Netze durch gefilterte Luft oder Ozon Exposition bei Frauen in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus betroffen. Schematische Darstellung biologischer Netzwerke MiRNAs in den Lungen von weiblichen Mäusen ausgesetzt gefilterte Luft gegen Ozon in Proestrus (A) oder nicht-Proestrus Phasen (B) zugeordnet. Diese Zahl wurde von Fuentes Et Al.6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

ID Nukleinsäure (ng/µL) A260/A280 A260/A230
Beispiel 1 1197.930 2.015 2.192
Beispiel 2 1355.703 2.018 2.223
Beispiel 3 2178.104 2.020 2.163
Probe 4 1600.837 2.010 2.139
Durchschnitt 1583.144 ± 215 2.016 ± 0,002 2.179 ± 0,018

Tabelle 1: Beispiel der RNA-Konzentrationen und Absorption bei 260, 230 und 280 nm von gereinigten Lunge Gewebeproben von vier Mäuse. Konzentrationen wurden mit einem Spektralfotometer gemessen.

logFC t P.Value adj. P.Val B
MMU-MiR-694 1.492 4.071 0.000153 0.009514 0.759
MMU-MiR-9-5 p 0.836 3.916 0.000254 0.009514 0.289
MMU-MiR-221-3 p 0.385 3,106 0.003014 0.075361 -1.982
MMU-MiR - 181d - 5p 0.597 2.891 0.005516 0.103424 -2.526
MMU-MiR-98-5 p 0.558 2.699 0.009243 0.138649 -2.987
MMU-MiR-712-5 p 0,667 2.563 0.013169 0.164609 -3.299
MMU-MiR-106a - 5P -0.528 -2.412 0.019278 0.206547 -3.632

Tabelle 2: Limma Analyse-Ergebnisse für differentiell exprimierten MiRNAs bei Frauen gegenüber Ozon ausgesetzt vs . gefilterte Luft in der Proestrus.

MiRNAs ID Beobachtung 1 Beobachtung 1 Beobachtung 2 Beobachtung 2
EXPR Log-Verhältnis P-Wert EXPR Log-Verhältnis P-Wert
MMU-MiR-694 1.492 0.000153 0.543319208 0.0021385
MMU-MiR-9-5 p 0.836 0.000254 0.677595421 0.004997439
MMU-MiR-221-3 p 0.385 0.003014
MMU-MiR - 181d - 5p 0.597 0.005516 0.342276659 0.106467657
MMU-MiR-98-5 p 0.558 0.009243 0.455392799 0.034724699
MMU-MiR-712-5 p 0,667 0.013169
MMU-MiR-106a - 5P -0.528 0.019278

Tabelle 3: Beispielformat für Multi-Beobachtung Upload von Datasets Funktionsanalyse Software. Mehrere experimentelle differenzielle Ausdrücke in einer einzigen Tabelle zusammengefasst und hochgeladen werden können, und so viele Beobachtungen nach Bedarf hinzugefügt werden können. Spalten: 1) MiRNAs ID; (2) Beobachtung 1: Expr Log-Verhältnis; (3) Beobachtung 1: P-Wert; (4) Beobachtung 2: Expr Log-Verhältnis; (5) Beobachtung 2: P-Wert.

Non-proestrus Proestrus
A. Gene durch gezielte differentiell exprimiert miRNAs
CAMK2N1 PAFAH1B2 SEC23A ABCB9 FGD4 SLC25A27
AUTOS PDE4B SNX5 APOO FRMD4B SLC38A1
CYP24A1 PDE7A SYT4 ARHGEF38 GPR137B TMCC1
DBF4 PGM3 THAP12 AVEN HMBS TRIM71
HMGN2 PLUG & PLAY TMED7 CASP3 METAP1 XKR8
KMT5A REV1 TNFAIP2 CCNJ MITF ZCCHC11
LRRC17 RPS19BP1 TNFRSF10C CMTR2 MYC ZIM3
MDH2 RRAD TP53 CNMD RGMB ZNF181
MIS18A SEC62 UBE2V2 DSCR8 SLC14A1
ZNF420
B. Unterschiede in der oberen Krankheiten und biofunctions
Krankheiten und Störungen P -Wert Krankheiten und Störungen P -Wert
Entzündliche Erkrankung 3.84E-02 - 3.84E-05 Organismal Verletzungen und Fehlbildungen 4.96E-02 - 2.77E-14
Entzündliche Reaktion 3.84E-02 - 3.84E-05 Reproduktive System Krankheit 2.15E-02 - 2.77E-14
Organismal Verletzungen und Fehlbildungen 4.17E-02 - 4.17E-05 Krebs 4.96E-02 - 1.27E-10
C. top molekulare und zelluläre Funktionen
Molekulare und zelluläre Funktionen P Wert Molekulare und zelluläre Funktionen P Wert
Zelluläre Entwicklung 2.05E-02 - 5.26E-07 Zelluläre Bewegung 3.77E-02 - 4.47E-07
Zelluläre Kompromiss 3.75E-04 - 3.75E-04 Zelltod und überleben 4.91E-02 - 5.61E-06
Zellzyklus 2.62E-03 - 2.62E-03 Zelluläre Entwicklung 4.97E-02 - 1.38E-06
D. top physiologisches Systementwicklung und Funktion
Entwicklung und Funktion P Wert Entwicklung und Funktion P Wert
Organismal Entwicklung 4.17E-02 - 1.31E-03 Embryonale Entwicklung 3.30E-02 - 2.12E-05
Embryonale Entwicklung 1.29E-02 - 1.29E-02 Bindegewebe-Entwicklung und Funktion 1.79E-02 - 6.10E-05
Bindegewebe-Entwicklung und Funktion 1.93E-02 - 1.93E-02 Gewebe-Morphologie 7.88E-05 - 7.88E-05
E. Top verbundenen Netzwerk-Funktionen
Verbundenen Netzwerk-Funktionen Partitur Verbundenen Netzwerk-Funktionen Partitur
Zelluläre Entwicklung, entzündliche Erkrankung, entzündliche Reaktion Organismal Verletzungen und Fehlbildungen, reproduktive System Krankheit Krebs
6 19

Tabelle 4: funktionelle Analyse-Software Zusammenfassung der Weibchen, Ozon in der nicht-Proestrus vs. Proestrus Stufen ausgesetzt. Die funktionelle Analyse-Software ermöglicht die Analyse der Top kanonische Pfade, vorgelagerten Regulatoren, Krankheiten & Funktionen, Top-Funktionen, Regler Effekt Netzwerke und mehr. Diese Tabelle wurde von Fuentes Et Al.6geändert.

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Discussion

MicroRNA profiling ist eine vorteilhafte Technik für Diagnose von Krankheiten und mechanistische Forschung. In dieser Handschrift haben wir definiert ein Protokoll zur Evaluierung des Ausdrucks von MiRNAs, die voraussichtlich entzündlichen Gene in den Lungen von weiblichen Mäusen ausgesetzt Ozon in verschiedenen Estrous Zyklus Stufen regulieren. Methoden zur Bestimmung des Estrous Zyklus, wie die visuelle Erkennungsmethode wurden beschrieben16. Aber diese verlassen sich auf einmalige Messungen und sind daher unzuverlässig. Um genau alle Phasen des Estrous Zyklus bei Frauen identifizieren, die regelmäßig fahren, empfiehlt sich die hier beschriebene Methode. Darüber hinaus kann dieses einfache Protokoll auch verwendet werden, indirekt täglichen Hormonschwankungen bei Mäusen abzuschätzen. Aktivierung von unerwünschten Entzündungsreaktionen durch vaginale Reizung, Probenahme muss nur einmal täglich durchgeführt werden, zu vermeiden. Aufgrund der Variabilität in der Zykluslänge und Gehäuse Einflüssen ist es wichtig, das Protokoll für zwei bis drei komplette Zyklen vor der Verwendung von Tieren in einem Experiment unter Berücksichtigung der Zyklus-Phase durchführen.

Für die erfolgreiche Gewinnung von RNA aus Lungengewebe ist ein genaueste Verfahren kritisch. Dieses Protokoll beschreibt eine ein-Tages-Methode, um RNA von Lungengewebe zu isolieren, die qualitativ hochwertige RNA ergibt. Änderungen des Herstellers Protokoll mussten effizient RNA aus Lungen extrahieren. Wir haben eine zusätzliche Zentrifugationsschritt nach Zugabe von Waschpuffer, soviel Puffer wie möglich zu entfernen. Wir eluiert auch RNA mit 35 µL DNase/RNase-freies Wasser Zentrifugieren der Spalte für 1,5 min zu hoher Konzentration zu gewährleisten. Spectrofluorometer die Ergebnisse bestätigten die Wirksamkeit unserer RNA-Extraktion-Protokoll. Das Verhältnis der Absorption bei 260 und 280 nm (A260/280 Verhältnis) wird häufig verwendet, um die Reinheit der RNA Vorbereitungen zu beurteilen. Die maximale Absorption für Nukleinsäuren ist 260 und 280 nm, beziehungsweise. Es wird als "rein" für RNA akzeptiert, wenn das Verhältnis etwa 2,017ist. Ebenso sind die Werte für Reinheit für das A260/A230 Kontamination Extinktion Verhältnis im Bereich von 2.0-2.2-18. In dieser Studie wurden die durchschnittlichen A260/A280 und A260/A230 Verhältnisse beobachtet 2.016 ± ± 0,002 und 2.179 0,018, bzw. (Tabelle 1). Daher war unsere RNA-Extraktion-Protokoll erfolgreich. Ein weiterer Vorteil des verwendeten Protokolls ist die Ergänzung der DNAse-Behandlung. Dies ist wichtig, genomische DNA-Verunreinigung19zu vermeiden. Eine Einschränkung dieses RNA-Isolierung-Protokolls ist die Verwendung von Reinigung Spalten, Abfall entsorgen durch Fällung mit Alkohol, da einige Lunge Trümmer die Membran ganz oder teilweise behindern kann, was zu niedrigen Erträgen. Auch wenn der Homogenisierung Schritt nicht sorgfältig durchgeführt wird, können große Mengen an Lungenkrebs RNA leicht verloren oder abgebaut werden. Wenn niedrige RNA Erträge erzielt werden, kann RNA erneut gereinigt und in ein kleineres Volumen eluiert. Alternativ kann die RNA ausgefällten Übernachtung folgende veröffentlichten Protokolle20.

Microarray Technologien für die MiRNA profiling sind viel versprechende Werkzeuge in vielen Forschungsbereichen. In unserer Studie haben wir PCR-Arrays, die den Vorteil der höheren Nachweisgrenze und Normalisierung Strategien zur Erkennung von differentiell exprimierten MiRNAs vs. andere Technologien zur Verfügung zu stellen, wie z. B. Testbasierte MiRNA21arrays verwendet. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass es ein Minimum erfordert an RNA Material und die Verfügbarkeit von bestimmten Sätze Zündkapseln für die MiRNAs von Interesse, im Gegensatz zu anderen verfügbaren Techniken wie RNAseq ab. Ein weiterer Vorteil von PCR-basierten Arrays ist die Möglichkeit der Verwendung nicht MiRNA Referenz Gene für qPCR Normalisierung (z. B. kleinen Nukleolus RNAs oder SNORDs), differentielle Expression der MiRNAs zu berechnen. Schließlich bietet die Verwendung von PCR-Arrays mehrere Optionen für die Datenanalyse, angefangen bei Online-Tools zur Verfügung gestellt von den Herstellern zu den herkömmlichen Methoden, differentielle Expression zu erkennen, aber Real-Time PCR. Statistische Analyse mit Limma eignet sich für Microarrays und PCR-basierten Arrays und nutzt die empirische Bayes moderiert f- Statisitcs22. Hier zeigen wir, dass p-Werte und Q-Werte (bereinigt um mehrere Tests) erhalten Sie mit dem Befehl Toptable Einstellung false Discovery Rate Schwelle und Identifizierung differentiell MiRNAs ausgedrückt.

Funktionelle Analysesoftware ist eine webbasierte Anwendung zur Datenanalyse in Zusammenhang mit Weg. Die Software bietet Forschern leistungsfähige Suchmöglichkeiten, die Frame-Datensätze oder spezifische Ziele im Rahmen ein größeres Bild von biologischer Bedeutung helfen können. Obwohl die Softwareumgebung flexibel sein, um verschiedene Arten der Analyse (z.B. Metabolomik, SNPs, Proteomik, MicroRNA, Toxikologie, etc.), unser Ziel ist es, Aspekte der MiRNA-Analyse. Nach dem Hochladen einer Liste von 14 MiRNAs mit signifikanten Ausdruck Log-Verhältnisse und p-Werte, wurden alle von der Software zugeordnet. Wir haben die MiRNA Filter und Kern Zielanalyse, umfasst die Anreicherung-Pfad-Analyse durchgeführt. Jedoch sollten solche Analysen Gene für die 14 MiRNAs zum Ziel und nicht die MiRNAs selbst vorhergesagt werden. Der Abschnitt "Ergebnisse" listet Ausgänge wie: kanonische Pfade, Krankheiten und Funktion, Gene gezielt durch differentiell exprimierten MiRNAs, physiologische Systementwicklung, Regulatoren und Netzwerke (Tabelle 4). Die Weg-Visualisierung wird unter der Registerkarte "Netzwerk" angezeigt wo MiRNAs und Moleküle als anklickbare Knoten gezeigt werden, die mit Informationen im Zusammenhang mit dem gen des Interesses (Abbildung 3) verknüpft sind. Ein Vorteil der funktionalen Analyse-Software ist die qualitativ hochwertige MiRNA-bezogene Erkenntnisse, einschließlich experimentell validierte und vorhergesagte Wechselwirkungen. Die funktionelle Analyse Software Datenbanken umfassen: experimentell validierter MicroRNA-mRNA Interaktionen Datenbanken23,24, prognostizierte MicroRNA-mRNA Interaktion Datenbank unzuverlässig Interaktionen (z. B. ausgeschlossen Ziel-Scan)25, experimentell validierter Mensch, Ratte, und Maus MicroRNA-mRNA Interaktionen Datenbanken (z. B. MiRecords)26, und Literatur Befunde (z. B., MicroRNA-bezogenen Ergebnisse manuell aus der veröffentlichten Literatur kuratiert von wissenschaftlichen Experten). Andere Studien zum Vergleich der Wirksamkeit und Nutzbarkeit der Bioinformatik-Tools zur Analyse Wege MiRNA Ausdruck zugeordnet bestätigen die Wirksamkeit dieser Software27. Insgesamt, rechnerische Methoden sind kostengünstiger, zeitsparender und können leicht durch molekularbiologische Methoden validiert werden. Mit der konstanten Wachstum und Akkumulation von biomedizinischen Daten werden Bioinformatikmethoden immer stärker bei der Entdeckung der MiRNA-vermittelten Mechanismen der biologischen und Krankheit Verfahren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse vom NIH K01HL133520 (PS) und K12HD055882 (PS) unterstützt. Die Autoren danken für die Unterstützung mit Ozon Belichtung Experimente Dr. Joanna Floros.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1 mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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