Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Kas iskelet farklılaşma özellikle nükleer konumlandırma üzerinde dayanır son derece dinamik bir süreçtir. Burada, yanında canlı hücre düşsel myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu sırasında çekirdeği hareketlerini takip ve otomatik izleme bilgileri ayıklanıyor tarafından çekirdek dynamics nicel bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Careccia, G., Colombo, F., Tirone, M., Agresti, A., Bianchi, M. E., Zambrano, S., Vénéreau, E. Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion. J. Vis. Exp. (146), e58888, doi:10.3791/58888 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nükleer içindeki hücreleri konumlandırma geliştirme ve yenileme içinde birden çok hücresel süreçler için önemlidir. Nükleer konumlandırma en ilginç örnek kas iskelet farklılaşma sırasında oluşur. Kas lifleri (myofibers) kas öncül hücreleri (myoblasts) kas kök bu yayılma ve farklılaşma geçmesi hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir. Doğru nükleer myofibers içinde konumlandırma uygun kas rejenerasyon ve işlevi için gereklidir. Sabit hücreleri tarafından incelendi nükleer hareketi ve hücre davranış çalışmanın zaman içinde engellemektedir ayirt myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu değerlendirmek için genel yordamı kullanır. Burada, canlı hücre görüntüleme tarafından myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bir yüksek-den geçerek nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış (yani, yörünge) sırasında farklılaşma ve füzyon elde etmek nükleer otomatik izleme için bir yazılım sağlar.

Introduction

Kas iskelet % 35-40 beden kitle%1toplam insan vücudundaki en büyük dokudur. Uydu hücrelerdir kas kök hücre, anatomik olarak karakterize Proliferasyona myoblasts (myogenic progenitör hücre) ortaya çıkmasına, (kas liflerinin Bazal lamina altından plazma zarı için bitişik), onların konuma göre hangi sonunda ayırt etmek ve varolan myofibers entegre ve/veya sigorta formu yeni myofibers2,3,4' e. Onların keşif ve biyolojilerinin çalışma sürüyor kas geliştirme ve yenileme önemli anlayışlar için açmıştır.

Protokolleri yalıtmak ve myoblasts myotubes ayırt etmek için yıllar önce geliştirilmiş ve hala yaygın olarak kas iskelet farklılaşma5,6,7incelemek için kullanılır. Ancak, bu yöntemlerin çoğu sabit hücreleri analizine dayanan ve sonuç olarak, bilim adamları tam olarak myoblast fusion ve myofiber olgunlaşma gibi son derece dinamik süreçler keşfetmek izin vermez statik yordamlar temsil eder. En çarpıcı örnek nükleer konumlandırma, hangi sıkıca başlangıçta myofiber merkezinde çekirdek ile düzenlenir ve, sonra sonra myofiber olgunlaşma8,9çevre bulunan olmasıdır. Canlı görüntüleme daha da kendine özgü bir fenomen anlayışlar elde etmek için en uygun bir tekniktir.

Burada, bilim adamları tarafından hızlandırılmış mikroskopi myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu kaydetmek için ve kantitatif analizleri myoblast çekirdeği otomatik izleme üzerinden gerçekleştirmek için sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem yüksek üretilen iş bir nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast davranış sırasında farklılaşma ve füzyon sağlar. Protokol dört farklı parçalar, yani kas fareler, (2) hindlimbs üzerinden (1 topluluğu mekanik ve Enzimatik sindirim, (3) myoblast yayılması ve farklılaşma ve (4) oluşan birincil myoblasts yalıtım ayrılmıştır çekirdeği ilk 16 h myoblast farklılaşma içinde izlemek için görüntüleme yaşıyor.

Aşağıdaki yordamda, myoblasts H2B GFP fareler izole ve 1 µg/mL olarak yukarıda açıklanan10H2B GFP ifade ikna etmek için Doksisiklin ile tedavi. Alternatif olarak, myoblasts çekirdeği floresan bir protein hızlı diğer transgenik fareler gelen izole veya çekirdek, floresan bir protein hızlı farelerde vahşi-tip üzerinden Pimentel ve ark tarafından açıklandığı gibi izole hücreler transfect mümkündür. 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan konular içeren tüm yordamları San Raffaele kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. fare hindlimb kasları diseksiyon

  1. Cımbız ve makas (düz ve eğri) tarafından ısıyla sterilize.
  2. Hazırlamak ve deney başlamadan önce tüm medya (engelleme orta, sindirim orta, orta Proliferasyona ve orta ayırt) (0,22 µm) filtre ( Tablo malzemelerigörmek).
  3. Fosfat tamponlu tuz (PBS) 5 mL 35 mm kas koleksiyonu için Petri kabına koyun.
  4. Servikal yerinden çıkması veya CO2 kullanarak fare kurban ve cilt etanol ile sterilize. Deri hindlimbs ve üst ekstremite kasları yalıtım kolaylaştırmak için makas ve cımbız kullanarak çıkarın.
    Not: Kas yenidoğan veya yetişkin fareler ayrılmış olabilir. Yenidoğan fareler uydu yetişkin fareler için karşılaştırıldığında hücreleri artan sayıda var. Ancak, tek bir yetişkin fare ayrılmış olabilir uydu hücrelerin toplam sayısı aşağıda açıklanan deney gerçekleştirmek için yeterli.
  5. Tibialis, soleus, ekstansiyon digitorum longus (EDL), gastroknemius, kuadriseps ve triceps izole etmek ve PBS içeren kabında koydu. Yemeğin buz üzerinde bırakın. Tendon ve fat sterilize makas ve cımbız ile dikkatli bir şekilde çıkarın.

2. birincil myoblasts yalıtım

Not: Hücre kültürü için tüm yordamları steril koşullarda yapılır.

  1. Kasları PBS kaldırın. Kesin ve tek tip bir kitle elde edilir kadar steril eğri makas kullanarak kasları, bin dereden su getirmek. Kas adet 50 mL tüp içine koyun.
  2. Sindirim orta 10 mL kas parçaları ekleyin ve altında güçlü ajitasyon (250 dk-1) kasları enzimatik sindirimi bir su banyosunda 30 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. Dulbecco'nın 10 mL % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 glutamin, % 1 penisilin/streptomisin ve hazım durdurmak için % 1 gentamisin (engelleme orta) içeren kartal orta (DMEM) değiştiren ekleyin.
  4. 40 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant 50 mL tüp içinde toplamak. Pelet buza kaydedin.
    Not: Pelet sindirilmemiş kas ve bağ dokusu parçalar içerirken Santrifüjü sonra süpernatant bazı uydu hücreler, kan hücreleri, endotel hücreleri ve fibroblastlar, içerir. İzole hücre sayısını artırmak için Pelet ek adımlar aşağıda açıklandığı gibi sindirim tabi gerekir.
  5. Süpernatant 650 x g 5 dk. atmak için de süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet 1 mL % 10 içeren DMEM resuspend FBS. Resuspended Pelet buz üzerinde tutun.
  6. 2,2-2,5 Pelet kalanı için 2 x 2.4. adımda elde adımları yineleyin ve daha sonra resuspended granül buzda korunmuş ilk resuspended Pelet ekleyin.
  7. Resuspended granül 70 µm filtre ve daha sonra 40 µm filtre üzerinden geçmek. DMEM 15 mL %10 FBS ve santrifüj ile 650 x g 5 min için ekleyin.
  8. Hücre Pelet 3 mL kırmızı kan hücreleri tüketmek için kırmızı kan hücre lizis tampon resuspend. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Kırmızı kan hücrelerinin lizis durdurmak ve 650 x g 5 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve DMEM 5 ml % 10 ile Pelet resuspend PBS 40 mL ekleyin FBS.
  9. Preplating adım olarak, 20 mL 150 mm kaplamasız Petri kabına yayılması orta hücrelerde plaka. (37 ° C, % 5 CO2) bir hücre kültür kuluçka kuluçka 1 saat sonra orta toplamak.
    Not: uydu hücre süspansiyon kalırken fibroblastlar plaka, bağlama, sonra atılır.
  10. Adım 2.9 3 x ve son preplating adımda tekrar, süspansiyon uydu hücreleri içeren orta toplamak.
  11. 5 min için 650 x g , santrifüj.
  12. Hücreleri centrifuging iken, kollajen (10 mL 0.1 M Asetik asit % 0,1 çözeltilerine) ile 150 mm Petri tabağı kat. Bunu yapmak için kollajen tabağa koy, 5 min için kuluçkaya ve çıkarmak o. 30 dk için Kuru plaka izin.
  13. 2.11. adımda elde süpernatant atın ve hücre Pelet yayılması orta (Tablo reçetesi) 40 mL resuspend. 150 mm kolajen kaplı Petri tabağı (çanak başına 20 mL) hücrelerdeyse plaka ve hücreler bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, %5 O2) 1 µg/mL Doksisiklin H2B GFP ifade ikna etmek için 2-3 gün boyunca yayılması orta tutmak.
    Not: Bu adımı hücreleri daha fazla deneyleri için daha yüksek bir dizi elde etmek için myoblasts yayılması izin verir. Hücre yoğunluğu myoblasts spontan bir farklılaşma myotubes içine önlemek için çok düşük tutulur.

3. Myoblast yayılması ve farklılaşma deneyleri

Not: myoblast yoğunluğu yüksek olduğunda, bazı hücreler uzama başlatmak ve sonra hücreleri bölmek gereklidir. Genel olarak, onların fenotip etkilemeden hücreleri 2 x-3 x bölmek mümkündür.

  1. Orta atmak, 5 mL de PBS hücrelerle yıkama, tripsin (1 x), 2 mL ekleyin ve mikroskop altında 5 dk. onay için bir hücre kuluçka 37 ° C'de plaka kuluçkaya ve, yuvarlak hücre ayırdığınızda, DMEM 5 mL % 10 ile ekleyin FBS tripsin devre dışı bırakabilirsiniz. Hücre sayısını (genellikle 1 x 106 hücreler/fare elde etmek mümkündür).
    Not: Kuluçka 5 min için tripsin ile zaman öyledir Proliferasyona myoblasts ayırmak yeterli.
  2. Hücreleri aşağıda açıklanan deneyleri biri tabi.
    1. Nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
      1. 50.000 hücreleri/iyi 1 mL/de yayılması orta bir kolajen kaplı 12-şey plaka, plaka ve bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) kaplama hücreleri kuluçkaya. Fix ve 24, 48 veya 72 h hücreleri saymak.
        Not: Orta besin tükenme önlemek için her 48 h yerini alır.
    2. Farklılaşma tahlil
      1. 12-şey plaka ile 350 µL farklılaşma orta içeren membran Matrix (1: 100) kat. Plaka için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya ve orta kaldırın.
      2. 200.000 hücreler/kuyuda farklılaşma orta matris kaplı plaka plaka. Bir hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, %5 O2) hücreleri kuluçkaya kadar onlar için plaka uygun (2 h hücreler genellikle yeterince için uygun ve farklılaşma başlatmak için).
      3. Farklılaşma değerlendirmek için myosin ağır zincir ve çekirdekler için yukarıda açıklanan11boyama gerçekleştirin. Alternatif olarak, aşağıda açıklandığı gibi canlı görüntüleme analizi gerçekleştirin.

4. myoblast farklılaşma ve nükleer izleme Live-görüntüleme

  1. Imaging canlı hücre için hücreleri 3.2.2 bölümünde elde edilen ve % 5 CO237 ° C'de hücreleri korumak için bir kuluçka sistemi ile donatılmış bir confocal mikroskop altında bir 12-şey plaka kaplama koymak.
  2. Bir 20 x kuru hedefi (0.7 NA) hücreleri, yeterince myofiber oluşumu izlemek için yüzlerce ile görüş alanları almak için kullanın. H2B GFP hücreleri düşük yoğunluktaki 488 nm Argon lazer ile yansıması.
    Not: Açık bir iğne deliği hücreleri odak deneme boyunca tutulur Resim derinliğini (~ 10 µm) hücre kalınlığı içeren sağlar. Sinyal-gürültü oranı, görüntülerin geliştirir beri confocal bir mikroskop kullanarak, geniş alanlı mikroskobu de kullanılabilir, ancak avantajlıdır. Myofiber oluşumu iletim kanalı ile izlenebilir.
  3. 16-bit ve 1024 x 1024 piksel kare 16 h için her 6 min başına görüntülerini elde etmek. Alınan her pozisyon için bir multiframe.tif dosyası oluşturma ( Ek dosyalarıörneğe bakın).
    Not: mevcut protokolünde, mikroskop (Malzemeler tablo) ile ilişkili ticari yazılım kullanılan; diğer mikroskoplar kullanırken aynı hedefe ulaşmak için uygun yazılımı kullanın.
  4. Bir .zip ek dosyaolarak sağlanan yazılımı indirin.
    Not: Rutinleri MATLAB'de çalıştırılması gereken komut dosyalarıdır. Yazılım çekirdek izleme myotube oluşumu sırasında en iyi duruma getirilmiş bir yayımlanmış yazılım12 bir uyarlamasıdır. Bu yazılım iki bölüme ayrılmıştır: ilk çekirdeği her çerçeve içinde ikinci bir "parça" (yörüngeleri) çekirdeği hareketinin oluşturur iken onlara göre bölümleme tanımlar. Nükleer segmentasyon ve izleme ve başlangıç bir adım adım kılavuzu için tam kod Ek dosyalarıtemin edilmektedir.
  5. Hulâsa belgili tanımlık fermuar eğe ve istenen bir yoldaki kullanımda kişisel bilgisayar (PC) kaydedin. Tüm yerine pasajlar gerekli yazılımı zaten yüklü olan bir bilgisayarda aşağıda. Not aşağıda belirtildiği gibi .zip dosyası üç klasör oluşmaktadır.
    Not: İşlevleri bölümleme için çalıştırılması için segment oluşturma yordamları içerir. İzleme rutinleri, bunun yerine, izleme için gereken işlevler içerir. Örnek bölümleme izleme dosya sistemi ile daha yakından tanımak için ve temel komut dosyaları sağlar. Bölümleme için kullanılan yazılım ve çekirdek izleme düzgün MATLAB, R2015a veya sonraki sürümlerinde çalışır.
  6. Çekirdeklerin .tif dosya segmentlere ayırmak için örneğin, NameFile.tifdosya adı.
    1. Örnek bölümleme izleme klasörü açın ve DoSegmentation.müzerinde'yi tıklatın. Bu MATLAB komut penceresi açılacaktır.
    2. Segmentasyon, örnek izleme klasöründeki tüm öğeleri görmek için soldaki Geçerli klasör penceresini denetleyin. DoSegmentation.müzerinde çift tıklatın.
      Not: Komut dosyasında yapılması gereken değişiklikler hakkında ayrıntılı bilgi StepbyStep.txt dosyasında bulunabilir. Komut dosyası değişkeni filenameinput NameFile.tif ve folderinput .tif dosyası bulunduğu klasörü değiştirmek için zorunludur.
    3. Komut dosyasını çalıştırmak (yeşil tıklayarak Çalıştır düğmesini). Çekirdeklerin ayrılmasını çıktı resimde görüntülenmeyecektir ise ayrılmasını sonucu bir file.mat (SegmentedNameFile.mat) kaydedilir.
      Not: Gerekirse komut dosyasında açıklanan ayrılmasını için parametreler değiştirilebilir. Ayrılmasını kalitesini CheckSegmentation.m komut dosyası kullanarak kontrol edilebilir (StepbyStep.txt dosyasına bakın). Ayrılmasını kalitesini zavallı ise bu, temel (tespit sadece birkaç çekirdeği), segmentasyon, açıkça DoSegmentation.m komut dosyasında belirtilen parametreleri ayarlamak ve yordamı yineleyin.
  7. (Yani, her zaman çekirdek yörüngeleri) parça üretmek için nükleer pozisyonlar kullanılarak ayrılmasını, elde edilen komut çalıştırmak GenerateTracks.m aynı çalışma klasörü içinde. Uygun segmentasyon dosya bir giriş olarak eklemek emin olun (bkz: daha fazla bilgi için StepbyStep.txt dosyasına) önce elde edilen.
    Not: bir çıktı, kullanıcı bir dosya TrackedNameFile.mat, bir matris x koordinatları için ve başka bir matris için oluşturulan parça y koordinatlarını elde edecek.
  8. CheckTracking.m kullanarak izler kalitesini değerlendirmek (daha fazla bilgi için StepbyStep.txt dosyasına bakın). Bu son geçiş çıktı rakam her zaman çekirdek bulunduğu görselleştirmek yardımcı olması için kullanın. Soldaki her kesimli çekirdeği gösteren yeşil Haç için kontrol edin. Belirli bir çekirdek seçmek için alt kaydırma çubuğunu kullanın. Seçili çekirdeği circled Not kırmızıyla, sağda ise, seçili hücre yörüngesini zamanında (üst kaydırma çubuğunu kullanarak) izlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Otomatik olarak myoblast farklılaşma canlı görüntüleme sırasında nükleer hareketi takip etmek, çekirdeklerin tercihen fluorescently biçiminde etiketlenmiş olmalıdır. Bu moleküller nükleer silahların yayılmasına karşı birincil myoblasts13farklılaşma ile müdahale çünkü DNA enterkalasyon molekülleri kullanarak mümkün olmadığını unutmamak gerekir. Örnek olarak, yayılmasını önleme ve farklılaşma birincil myoblasts ile ya da ezelî Höchst (şekil 1) kültürlü analiz. Yayılması (şekil 1A, B) ve farklılaşma (şekil 1 c, orta panel) kuvvetle Höchst ile 33342 kültürlü myoblasts içinde engelliler ki belirgindir. Tersine, H2B GFP fareler izole ve Doksisiklin ile kültürlü myoblasts çekirdeği ile yeşil Floresans var ve benzer şekilde (şekil 1 c, sağ ve sol, sırasıyla panelleri) vahşi-o farelerde tip--dan izole myoblasts ayırt etmek.

Birincil myoblasts H2B GFP protein ifade ile canlı hücre görüntülemede çekirdek izleme sırasında farklılaşma (Şekil 2 ve ek Video 1) sağlar. Görüntüleri iletim ve GFP salgılarını noktaları (şekil 2B) H2B GFP myoblasts farklılaşma sırasında bilim adamları myotubes ve sonuç olarak, sonuna kadar çekirdek belirlemek olanak sağlar (şekil 2A) ilk ve son kez birleşti bir myotube (örneğin, mavi daire çekirdeğinde) içine entegre veya bir myotube (örneğin, kırmızı daire çekirdeğinde) içine sigorta değil çekirdeği.

Çekirdek/hücre hareketleri hakkında bilgi canlı hücre görüntüleme verileri ayıklamak için çekirdeklerin yörüngeleri izlemek için sağlanan yazılım kullanmak mümkündür. H2B GFP kanal (çekirdeklerin; görüntü yazılımı kullanır Şekil 3A) bir maske oluşturmak için ve her çerçeve içinde çekirdek segmentlere ayırmak için. Bir çerçeve içinde nükleer bölümleme için bir "muhafazakar" eşik Otsu'nın yöntemiyle resmin üzerine14filtreleme Gauss sonra seçilir. Ardından, kabaca nesnelerdir bölümlenmiş; daha hassas bir bölümleme elde etmek için her nesneyi sınırlayıcı kutusunda ortalama dayalı bir eşik kullanarak yeniden maskeli. Bir dönüm noktası dönüşüm sonra nesneleri (3B rakam) ayırmak için kullanılır. Bizim elimizde bir dönüm noktası dönüşüm en yakındaki çekirdeği ayırmak başarılı olamadı (şekil 3B, * iç metin). Böylece, biz görüntü daha büyük nesneleri seçin ve yeni bir dönüm noktası dönüştürme uygulamak için alan kullanılır (şekil 3B, ** iç metin), çekirdek ek ayrı mümkün olduğu. Bu yaklaşım ile çekirdekleri çoğu görüntüde (şekil 3 c) tanımlanır.

Çekirdeklerin izlemek için biz Tinevez15tarafından Yayınlanan izleme rutinleri dahil ederek rutinleri geliştirilmiş. Kısacası, izleme algoritması her çekirdek bulunduğu bir çerçeve ve aynı çekirdeği konumda "Macar algoritması" ile bir sonraki, arasındaki mesafeleri toplamı en aza indirmek amacıyla ardışık kareyi tespit çekirdeği böyle bağlantılar minimizasyonu16. Adım uzağa kare bir belirli maksimum sayıya kadar olan bağlantısız çekirdeği bağlamak için yinelenir. Bir çerçeve içinde bir nesnenin konumu ve bir sonraki arasındaki maksimum mesafe için bir eşik de kuruldu. Burada sunulan veriler için bir en fazla beş kare ve 20 piksel adım başına maksimum mesafe doğru parça (şekil 3D) yüksek bir sayı vermek. Önemlisi, bu yordamlar izleme kalitesini kontrol etmek için kullanabilirsiniz. Örneğin (veya değil) oluşturan belirli bir davranış olan hücreleri bulmak için bu komut dosyasını kullanmak mümkündür myofiber, bir ve daha sonra ilgi hücre kümesi dinamik özelliklerini analiz.

Uygulanan yazılım parçaları ile x - ve y-koordinatlarının her hücre için çerçeve noluşturur Equation 1 , hücreleri (şekil 3D) yüzlerce. Çekirdek hareket hakkında bilgi ayıklamak için bu bilgileri kullanabilirsiniz. Örneğin, ilk çerçeve arasında toplam deplasman (n = 0) ve son karesine N aşağıdaki gibi tanımlanır.

Bir yörünge çıkarılması = || Equation 2 ||

Burada, "|| · ||" vektör (şekil 4A) norm için duruyor.

Çerçeve n her çekirdek hızı aşağıdaki gibidir.
Equation 3

Daha sonra aşağıdaki gibi bir yörünge için belirli bir hücrenin uzunluğu tanımlayabilirsiniz.

Yörünge uzunluğu =Equation 4

Ne kadar basit bu parametreler zaten ilgili bilgi vermek örnek olarak, çekirdek yörüngeleri ile ya da ezelî Höchst inkübe myoblasts, uzunluğu hesaplanan. Bu fark önemli (4B rakam) olmamasına rağmen yörüngeleri toplam uzunluğu Höchst ile lekeli hücreler için biraz daha yüksek olduğu ortaya çıkmaktadır. Ancak, ne zaman biz bir zaman atlamalı sırasında toplam deplasman hesaplanan toplam deplasman Höchst ile lekeli hücre bu günahı hücreleri (şekil 4 c) daha önemli ölçüde daha küçük görülmektedir. Bu hareketi lekeli hücrelerinin bir alt yön olduğunu gösterir. Daha fazla bu hipotez güçlendirmek için biz (şekil 4A) her çerçevede hız açısını hesaplayarak bir hücre hareket yön sayılabilir.

Equation 5

Çerçeveler arasındaki açı varyasyonu da sayılabilir.

Equation 6

Toplam açı varyasyon bir yörünge boyunca sonra aşağıdaki gibi tanımlanabilir.

Toplam açı değişim =Equation 7

Tahmin edilebileceği gibi toplam açı değişimi günahı hücreler için önemli ölçüde daha küçük hücrelere Höchst (şekil 4 d) ile lekeli karşılaştırılır. Bu nedenle, yön, basit bir hesaplama sonucu elde edilen bu basit ölçü Höchst ile lekeli myoblasts oluşturan Engelli yeteneklerini yansıtan onların deplasman yönünü korumak daha az eğilimli olduğunu gösterir myotubes (şekil 1).

Kısacası, burada açıklandığı şekilde oluşturulan canlı hücre görüntüleme veri nükleer dinamikleri ve form myotubes yeteneği arasında nicel bir bağlantı sağlamak ve bir yüksek-den geçerek nicel karakterizasyonu nükleer dinamikleri ve myoblast için giriş olarak kullanılabilir farklılaşma ve füzyon sırasındaki davranış biçimi.

Figure 1
Şekil 1: kuluçka Höchst ile müdahale myoblasts farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı. (A)temsilcisi görüntüleri ile Höchst yayılması orta (sol panelde) 24 saat sonra lekeli veya nükleer silahların yayılmasına karşı orta Höchst (doğru kapı aynası) ve (B) göreli miktar ile 24 h için kültürlü birincil myoblasts. Ortalama ± SEM verilerdir ve istatistiksel anlamlılık ile öğrencinin tdeğerlendirildi-test. P < 0,05. Orta (sol panel) olmadan ayırt içinde 24 h için kültürlü birincil vahşi tipi myoblasts (C) temsilcisi görüntülerini veya Höchst (orta Masası) ve orta (doğru kapı aynası) ayırt içinde 24 h için kültürlü ve lekeli H2B GFP myoblasts, Höchst (mavi) ve bir anti-myosin ağır zincir antikor (MyHC; kırmızı) ile. Ölçek çubukları 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: H2B GFP myoblasts görüntüleme sırasında farklılaşma yaşamak. İletim ve GFP birleştirilmiş görüntülerini kanal (A) ilk (t = 0 h) ve (B) son kez puan (t = 16 h) H2B GFP myoblasts (20 x amaç) farklılaşma sırasında. Myotubes bazı örnekler, Masası Bsiyah oklarla vurgulanır. Ölçek çubukları 50 µm. (C) noktalı Magnified alanlarda panelleri A ve B (Mavili) bir myotube içine entegre biter bir tek çekirdek tanımlamak mümkün olan = veya değil (kırmızı) t = 0 h, t = 8 h ve t < / C12 > = 16 h. Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: farklılaşma sırasında izleme H2B GFP myoblasts ayrılmasını. (A)yaklaşık 400 hücre çekirdekleri gösterilen zaman süresi geçerse bir çerçeve örneği. (B) çekirdeği maskeleme ve segmentasyon örneği. Hem genel hem de yerel bir eşik kullanarak parlak nesneleri parçalara ve çekirdeği ayırmak için bir dönüm noktası dönüştürme uygulanır. Yakındaki çekirdeği kesimine zor olabilir (* iç metin), bu ikinci bir dönüm noktası tabanlı segmentasyon çekirdeklerin sayısı yükseldikçe segmentlere ayırmak için geniş alanlar nesnelerindeki gerçekleştirilir (** iç metin). (C) daha sonra nükleer pozisyonlar (kırmızı haç), izleme algoritması kullanılan algıladı. (D) parçalar, her nesnenin konumu iki ardışık çerçeveler arasındaki mesafeleri toplamı en aza indirir izleme algoritması kullanılarak oluşturulan. Böyle mesafe her nesne için bir maksimum olası değeri çekirdeklerin birden fazla çerçeve tarafından ayrılmış bağlamak bilim adamları sağlayan bir giriş olarak sağlanır. Ölçek çubukları 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: çekirdeklerin dinamiklerinin kantitatif analizleri ortaya çıkarmak hücre yön korumak Höchst ile inkübe myoblasts Engelli yeteneğine. Parametre ölçümleri(a)açıklaması. İki ardışık kareyi bulunduğu göz önüne alınarak bir çekirdek hızı tanımlamak mümkündür. Yörünge açı ve açı varyasyon sonra kolayca pozisyonlardan düzeninde belirtildiği şekilde hesaplanır. Yörüngeler uzunluğu, (C) toplam deplasman ve myoblasts yörüngeleri açısını varyasyonu (D) (B) dağıtım Höchst (yeşil hat) olmadan veya Höchst (mavi çizgi) ile inkübe. İki dağıtımları toplam deplasman anlamlı olarak daha yüksek olduğunu ve açı çeşididir günahı hücreler için önemli ölçüde daha düşük süre önemli ölçüde farklı değildir (tek taraflı Kolmogorov-Smirnov sınaması, *p < 0,05 ve **p < 0.005). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek Video 1: H2B GFP myoblasts görüntüleme sırasında farklılaşma yaşamak. H2B GFP myoblasts ilk orta ayırt kültürlü, Imaging (t = 0 h) ile son kez puan (t = 16 h) iletim ve GFP kanalları (20 x amaç) kullanarak. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kas lifleri (myofibers) kas kök yayılması ve farklılaşma2,3tabi bu hücrelerden (uydu hücreleri) türetilmiş füzyon kas öncüleri hücre (myoblasts) tarafından kurulan multinucleated hücrelerdir, 4. Myoblast farklılaşma değerlendirmek için orta farklılaştırılması ve MyHC, bir işareti farklılaşma ve, boyama boyama ayirt gerçekleştirmek için farklı zaman noktalarda hücreleri tamir myoblasts Kültür genel yordamı oluşur çekirdek DNA enterkalasyon molekülleri (örneğin, Höchst)5. Bu yöntem myoblast farklılaşma farklılaşma dizin (sayı-in MyHC-pozitif hücreler/toplam hücre sayı) ya da füzyon dizin (myotubes sayısı en az iki çekirdek/toplam cep numarası ile) gibi farklı parametreleri ölçerek değerlendirmek yararlı olur . Ancak, myoblast fusion ve myotube oluşumu çekirdeği8hareketliliği üzerinde itimat son derece dinamik işlemlerdir. Gerçekten de, nükleer myofibers içinde konumlandırma uygun kas rejenerasyon ve işlev17için gereklidir. Hareketlilik myoblasts ve onların çekirdek myoblast farklılaşma değerlendirmek ve kas hastalıkları roman kusurları ortaya çıkarmak için kritik bir parametre olup çıkmak. Bu nedenle, bu hücre davranış ve nükleer hareket myoblast farklılaşma ve myofiber oluşumu sırasında çalışmaya yeni yordamlar geliştirmek için esastır.

Burada, bilim adamları tarafından canlı hücre görüntüleme myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu takip etmek ve çekirdekleri otomatik izleme üzerinden kantitatif analizleri gerçekleştirmek için sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemin avantajı herhangi bir hücre transfection veya ek boyama olmadan H2B GFP fareler gelen izole myoblasts, floresan çekirdekleri farklılaşma sırasında izlemek için imkanı vardır. H2B GFP fareler ticari mevcuttur ve sonuç olarak, kolayca erişilebilir. Alternatif olarak, myoblasts çekirdeği floresan bir protein hızlı diğer transgenik fareler gelen izole etmek mümkündür veya çekirdek, floresan bir protein yukarıda açıklanan9 ifade etmek için vahşi tipi fareler gelen hücreleri transfect için izole . Bu farklı seçenekler daha fazla potansiyel uygulamalar burada sunulan yöntem genişletmek.

Geçerli protokol birincil myoblasts kültür üzerinde dayanır ve sonuç olarak, yüksek bir değişkenlik nonmyogenic hücreleri kas18 izolasyonu sonra olası varlığı nedeniyle Ayrıca aşağıdaki deneysel yordamlar gözlenen . Bu sınırlamayı aşmak için myoblasts yukarıda açıklanan19sıralama hücre izole etmek mümkündür. Başka bir kritik nokta burada açıklanan yöntemde hücreleri birbirine yakın gibi myotube oluşumu sırasında olduğunda çekirdek mükemmel bir izleme oluşturmak için zor olmasıdır. Ancak, izin burada tartışılan yazılım yordamları bilim adamları izleme kalitesini kontrol edin ve gerekirse bir daha sonraki analiz için ilgi hücre alt grubunu seçin. Yazılımın daha fazla iyileşme tam karakterizasyonu nükleer dynamics myofiber oluşumu sırasında sağlamak için gerekli olabilir.

Sonuç olarak, bu yöntem biz Höchst kuluçka ile rapor çekirdeği dynamics nicel içgörü farklı koşullar, karşılaştırarak myoblast farklılaşma sırasında sağlamak kullanışlıdır. Bu örnek hızlandırılmış deneylerden anlamlı dinamik veri ayıklamak için yeteneği gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser AFM-Telethon E.V. (#21545) için ve Ospedale San Raffaele (OSR) tohum Grant için S.Z. (ZAMBRA5X1000) tarafından desteklenmiştir. Dr. Jean-Yves Tinevez Institut Pasteur görüntü analiz merkezden genel olarak onun "Basit izci" MATLAB rutinleri paylaşımı için kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chicken embryos extract Seralab CE-650-J
collagenase Sigma C9263-1G 125units/mg
collagen from calf skin Sigma C8919
dispase Gibco 17105-041 1.78 units/mg
doxyciclin Sigma D1515
DMEM Sigma D5671
fetal bovine serum Life technologies 10270106
gentamicin Sigma G1397
Horse serum Invitrogen 16050-098
Hoechst life technologies 33342
IMDM Sigma I3390
L-glutamine Sigma G7513
Matrigel Corning 356231
penicillin-streptomycin Sigma P0781
red blood cells lysis medium Biolegend 420301
Digestion medium
collagenase 40 mg
dispase 70 mg
PBS 20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum 10%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum 20%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum 2%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 1%
filtered 0.22um

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89, (1), 81-88 (2000).
  2. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224, (1), 7-16 (2010).
  3. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  4. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  5. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
  6. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  7. Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
  8. Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. (2017).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
  10. Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27, (1), 84-90 (2009).
  11. Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215, (1), 303-318 (2018).
  12. Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
  13. Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581, (16), 3076-3080 (2007).
  14. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  15. Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
  16. Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. SIAM. (2009).
  17. Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6, (11), 1455-1475 (2014).
  18. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3, (2), (2014).
  19. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10, (10), 1612-1624 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics