अलगाव, शुद्धि, और चूहा अस्थि मज्जा से Osteoclast पूर्ववर्ती की भिंनता

Biology

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Summary

अस्थिकेलिस्ट्स ऊतक-विशिष्ट मैक्रोफेज पॉलीकार्यन्स होते हैं जो मोनोसाइट से व्युत्पन्न होते हैं-हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं की मैक्रोफेज वंशावली । यह प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को अलग करने के तरीके का वर्णन करता है, ताकि पारंपरिक पद्धतियों में पाए जाने वाले दुर्घटनाओं के जोखिम को कम करते हुए ऑस्टियोक्लैस्ट्स की बड़ी मात्रा प्राप्त की जा सके ।

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Wang, L., Zheng, S., Guo, Y., Pan, Y., Sun, J., Xu, W., Lu, J., Li, W., Ma, Y. Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow. J. Vis. Exp. (147), e58895, doi:10.3791/58895 (2019).

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Abstract

अस्थिक्लेस्ट, मोनोसाइट की बड़ी, बहुकेंद्रकी, और अस्थि-अवशोषण कोशिकाएं होती हैं-मैक्रोफेज वंश जो monocyte या मैक्रोफेज पूर्वगामी के संलयन से बनते हैं. अत्यधिक अस्थि अवशोषण एक सबसे महत्वपूर्ण सेलुलर तंत्र है जिसके कारण अस्थिमज्जा रोग होता है, जिसमें ऑस्टियोपोरोसिस, periodontitis, और पेरिस्थेटिक ऑस्टियोलिसिस शामिल हैं । अस्थिभंग का मुख्य शारीरिक कार्य हाइड्रोक्सीएपीटाइट खनिज घटक और अस्थि के कार्बनिक मैट्रिक्स दोनों को अवशोषित करना है, जो हड्डियों की सतह पर विशिष्ट अवशोषण दिखावट उत्पन्न करते हैं । शरीर में अन्य कोशिकाओं की तुलना में अपेक्षाकृत कुछ अस्थिक्लेस्ट्स होते हैं, विशेष रूप से वयस्क हड्डियों में । हाल के अध्ययनों से कैसे कम समय में अधिक परिपक्व अस्थिक्लेस्ट्स प्राप्त करने के लिए है, जो हमेशा एक समस्या रही है पर ध्यान केंद्रित किया है । अलगाव और संस्कृति तकनीकों में कई सुधार प्रयोगशालाओं में विकसित किया है ताकि अधिक परिपक्व अस्थिक्लेस्ट्स प्राप्त करने के लिए । यहां, हम एक तरीका है कि कम समय में और कम प्रयास के साथ पारंपरिक प्रक्रिया की तुलना में, एक विशेष और सरल उपकरण का उपयोग कर अस्थि मज्जा आइसोलेट्स परिचय । घनत्व ढाल अपकेंद्रण के उपयोग के साथ, हम चूहे की अस्थि मज्जा, जो शास्त्रीय तरीकों से पहचान कर रहे हैं से पूरी तरह से विभेदित अस्थिकाठियाँ की बड़ी मात्रा में प्राप्त करते हैं ।

Introduction

अस्थि समस्थिता एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है जिसे अस्थि-अवशोषण अस्थिप्रसू तथा अस्थि-निर्माण अस्थिविस्फोट1द्वारा विनियमित किया जाता है । अस्थिप्रसू और अस्थिप्रसू के माध्यम से मध्यस्थता के लिए अस्थिब्लास्टिक और अस्थिसंहारक गतिविधि के बीच संतुलन, अस्थि स्वास्थ्य और समस्थिति को बनाए रखने के लिए अत्यंत आवश्यक है, क्योंकि अस्थि समस्तरता में होने वाले रोग हड्डियों के रोगों का कारण बन सकते हैं, जैसे असामान्य अस्थि वृद्धि या अस्थि घनत्व की हानि के रूप में । अद्वितीय अस्थि-अवशोषण कोशिकाओं के रूप में, अस्थिक्लेस्ट्स असामान्य अस्थि विनाश से संबंधित रोगों में महत्वपूर्ण हैं, जिनमें ऑस्टियोपोरोसिस, periodontitis, और पेरिसेस्थेटिक ऑस्टियोलिसिस2,3शामिल हैं ।

अस्थिशोषक संस्कृति के विकास को मुख्यतः दो अवस्थाओं में बांटा गया है । Boyde एट अल.4 और मंडलों एट अल5 द्वारा स्थापित तरीकों 1980 के दशक में पहले चरण की रचना की । वे नवजात पशुओं की हड्डियों से अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में अस्थिक्लेस्ट्स प्राप्त किया, जो तेजी से remodeling अवधि है । अस्थिक्लेस्ट्स को खंडित करके और हड्डियों को विशेष माध्यम में हिलाते हुए ऑस्टियोक्लैस्ट छोड़े जाते हैं । हालांकि इस विधि से प्राप्त कोशिकाओं की मात्रा और शुद्धता कम होती है । दूसरे चरण अस्थिक्लेस्ट गठन की लंबी दूरी की संस्कृतियों का विकास था, अस्थि मज्जा6से व्युत्पंन hematopoietic वंश कोशिकाओं का उपयोग । साइटोकिन्स, जैसे 1α, 25-डाइहाइड्रोक्सीविटामिन डी3, प्रोस्टाग्लैनडिन E2 (पीजीएच-2), और पैराथिरॉइड हार्मोन (pge), जो संस्कृति माध्यम में जोड़े जाते हैं, अस्थिविस्फोटों/स्ट्रोमल कोशिकाओं की प्रणाली के माध्यम से अधिनियम . तथापि, इस विधि द्वारा प्राप्त अस्थिक्लेस्ट्स की शुद्धता और मात्रा आधुनिक आण्विक जीवविज्ञान अनुसंधान की आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकती । फिर, मैक्रोफेज कॉलोनी की खोज-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक के लिए रिसेप्टर उत्प्रेरक-κb लिगामेंट (रानीकेएल) osteoclastogenesis आसान बनाने9,10,11, और एम-सीएसएफ का उपयोग करने की विधि और Rankl सीधे अस्थिशोषक गठन को प्रोत्साहित करने के लिए व्यापक रूप से दुनिया भर में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, अभी भी पद्धति में कुछ विवरण है कि सुधार की जरूरत है ।

वर्तमान में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया अस्थिक्लेस्ट संस्कृति विधि, Marino एट अल12 और पी एट अल.13द्वारा वर्णित के रूप में, अक्सर हड्डी के आसपास के आसपास के ऊतकों को हटाने की आवश्यकता है और एक निष्फल सुई का उपयोग करता है के साथ मज्जा गुहा फ्लश मीडिया को पूरा किया । इस प्रक्रिया के लिए कुछ कमियां हैं, तथ्य यह है कि (1) हड्डी के आसपास के आसपास के ऊतकों को हटाने के लिए बहुत समय और महान शल्य चिकित्सा तकनीक की आवश्यकता है, (2) हड्डियों नाजुक है और अस्थि मज्जा बहिर्वाह करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, (3) अस्थि मज्जा गुहा हो सकता है बहुत छोटे फ्लश करने के लिए, और (4) वहां सुई छड़ी चोट का खतरा है । इन समस्याओं से बचने के लिए, हम सुई के बजाय अस्थि मज्जा के लिए हड्डियों से युक्त ट्यूब केंद्राग्र-अस्थि मज्जा फ्लशिंग । यहां, हम एक स्थिर और सुरक्षित तरीका है जो कम समय में अस्थि मज्जा और कम प्रयास के साथ पारंपरिक प्रक्रिया की तुलना में आइसोलेट्स परिचय । एक साथ घनत्व ढाल केंद्राभियन के उपयोग के साथ, हम विट्रो में पूरी तरह से विभेदित अस्थिकपर्त की बड़ी मात्रा में प्राप्त करतेहैं ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों में पशुओं को शामिल किया गया है, जो चीनी चिकित्सा के नानजिंग विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित हैं ।

1. सेटअप

  1. कई लंबाई में 1 मिलीलीटर पिपेट युक्तियां (1 सेमी) और कई १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूबों को काटने के लिए तैयार करें । १०३ केपीए और १२१ ° c पर पिपेट युक्तियां और microकेंद्रापज ट्यूबों रखो 20 मिनट के लिए और सुनिश्चित करें कि वे बाँझ हैं ।
  2. आइसोलेशन प्रक्रिया के दौरान अलग ऊतकों को संरक्षित करने के लिए बर्फ और कई बाँझ व्यंजन का एक बॉक्स तैयार करें ।

2. संस्कृति माध्यम की तैयारी

  1. पूरा कल्चर मीडियम तैयार करें । न्यूनतम आवश्यक मध्यम अल्फा (α-एमईएम) का उपयोग करें जिसमें पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) का 1% का अंतिम समाधान शामिल है ।
  2. एक ०.२२ μm फ़िल्टर का उपयोग करके चरण २.१ से मीडिया फ़िल्टर करें ।
  3. अस्थि मज्जा प्रेरण माध्यम तैयार करते हैं । समाधान के ५० मिलीलीटर के लिए, १०,००० एनजी/एमएल की एकाग्रता में एम-सीएसएफ के १२५ μL जोड़ें (सामग्री की तालिका) को पूरा संस्कृति माध्यम के ४९.८७५ मिलीलीटर (चरण २.२ से) 25 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ का अंतिम समाधान करने के लिए ।
  4. ऑस्टियोक्लेस्ट इंडक्शन मीडियम तैयार करें । समाधान के ५० मिलीलीटर के लिए, १०,००० एनजी/एमएल की एकाग्रता पर RANKL के ५०० μL जोड़ें (सामग्री की मेज) अस्थि मज्जा प्रेरण माध्यम (से कदम २.३) के ४९.५ मिलीलीटर को 25 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ और १०० एनजी/एमएल rankl का अंतिम समाधान करने के लिए ।

3. अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न कोशिकाओं का अलगाव

  1. इच्छामृत्यु
    1. चार Sprague Dawley चूहों द्वारा CO2 साँस लेना और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा, और उन्हें 1 मिनट के लिए ७५% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया ।
      नोट: यह सुनिश्चित करें कि पशु समान लिंग के हों और समान आयु के हों । 2 से 3 सप्ताह पुराने है कि जानवरों की सिफारिश कर रहे हैं । दो चूहों केन्द्रापसारक विधि के लिए तैयार कर रहे हैं, जबकि अन्य दो पारंपरिक विधि के लिए कर रहे हैं ।
  2. पारंपरिक विधि
    1. पशुओं को कीटाणुनाशक बोर्ड पर लापरवाह स्थिति में रखें । एक छोटा सा चीरा (लगभग 1 सेमी) समीपस्थ फीमर पर त्वचा छील करने के लिए, बाँझ कैंची का उपयोग कर ।
    2. फीमर और टिबियस को काटना । कूल्हे, घुटने, और टखने के जोड़ों के आसपास द्विपक्षीय कनेक्शन भागों में कटौती करने के लिए tibias और femurs ध्यान से और धीरे अलग । हड्डी के आसपास के ऊतकों का हिस्सा काट; पूरी तरह से हो । पूरी प्रक्रिया के दौरान टिबियस और फीमर को फ्रैक्चर न करें ।
    3. साफ की हुई हड्डियों को एक डिश में रखें जिसमें 5 एमएल की पूरी कल्चर मीडियम हो । बाँझ कैंची के साथ लंबी हड्डी काट और मज्जा गुहा सफेद बदल जाता है जब तक पूर्ण मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ सावधानी से मज्जा गुहा फ्लश करने के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज सुई का उपयोग करें ।
    4. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए कदम 3.2.3 से सेल निलंबन स्थानांतरण, और फिर, शेष ऊतक को दूर करने के लिए एक ७० μm छलनी के साथ यह फिल्टर ।
    5. सेल निलंबन के लिए लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 5 मिलीलीटर (सामग्री की मेज) जोड़ें । बर्फ पर 8 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते । फिर, २५० x g पर कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए केंद्राभ करने के लिए सेल गोली उपज ।
    6. मीडियम से महाप्राण और 10 मिलीलीटर पूर्ण मीडिया में कोशिकाओं को पुनः निलंबित करें । एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती और इस खंड (धारा ३.२) से चरणों पर खर्च समय की गणना ।
  3. सुधारित विधि
    1. पशुओं को कीटाणुनाशक बोर्ड पर लापरवाह स्थिति में रखें । त्वचा छील करने के लिए बंध्य कैंची के साथ समीपस्थ फीमर पर एक छोटा सा चीरा (लगभग 1 सेमी) बनाओ ।
    2. फीमर और टिबियस को काटना । ठीक से हड्डी के आसपास के ऊतकों के हिस्से को काट (कोई पूरी तरह से हटाने की जरूरत है) । पूरी प्रक्रिया के दौरान टिबियस और फीमर को फ्रैक्चर न करें ।
    3. 12 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफ़र्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ टिबियस और फीमर को धोकर आधे में काट लें । एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप (कदम १.१) है, जो तो एक microकेंद्राभिज ट्यूब में डाल दिया है और ४५ के लिए १,००० एक्स जी में 3x पर 4 डिग्री सेल्सियस केंद्रापित है में snipped tibias और femurs प्लेस ।
    4. अपकेंद्रण के बाद, हड्डी युक्त पिपेट टिप निकालें, और ट्यूब में अस्थि मज्जा छोड़ दें । माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूब में पूर्ण मीडिया के २०० μL जोड़ें और मज्जा को अच्छी तरह से विखंडित करने के लिए pipetting दोहराएं ।
    5. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए कदम 3.3.4 से सेल निलंबन स्थानांतरण, और फिर, शेष ऊतक को दूर करने के लिए एक ७० μm छलनी के साथ यह फिल्टर ।
    6. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती, और इस खंड (धारा ३.३) से चरणों पर खर्च समय की गणना ।

4. घनत्व ढाल अपकेंद्रण द्वारा शुद्धि

  1. चरण 3.2.6 या चरण 3.3.5 से 2 मिलीलीटर तक α-मेम के साथ कक्ष निलंबन समायोजित करें ।
  2. एक बाँझ silicified केंद्रापसारक ट्यूब तैयार करने और ट्यूब के लिए सेल जुदाई समाधान (सामग्री की मेज) के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. कक्ष निलंबन से चरण ४.१ कक्ष विभाजन समाधान करने के लिए जोड़ें । ट्यूब की भीतरी सतह के लिए पिपेट टिप का पालन करें और भीतरी सतह के लिए एक ४५ ° रखने के लिए । निलंबन जोड़ने के बाद, कोशिकाओं की परत और पृथक्करण समाधान के बीच एक स्पष्ट सीमा दिखाई देगी ।
    नोट: आपरेशन महान देखभाल की आवश्यकता है और धीरे से प्रदर्शन करने की जरूरत है ।
  4. ५०० x g पर एक क्षैतिज अपकेंद्रित्र में स्तरित समाधान 30 मिनट के लिए । अपकेंद्रण के बाद, ऊपर से नीचे तक, जो लक्ष्य कोशिकाओं को शामिल बादल दूसरी परत, से महाप्राण.
    नोट: अपकेंद्रण से पहले त्वरण और मंदी को रद्द करें । वहाँ छह परतों अपकेंद्रण के बाद कर रहे हैं; पहली परत है मंदक परत, दूसरी परत है monocytes परत, तीसरी परत mononuclear कोशिकाओं की परत है, चौथी परत पारदर्शी जुदाई तरल एक परत है, पांचवें दानेदार कोशिका परत है, और छठी परत है लाल कोशिका परत.
  5. लक्ष्य कक्षों को एक नई ट्यूब पर स्थानांतरित करें । 3x कोशिकाओं को धोने के लिए PBS के 5 मिलीलीटर जोड़ें । प्रत्येक धोने के बाद, 5 मिनट के लिए २५० एक्स जी में लक्ष्य कोशिकाओं केंद्राge को सेल गोली उपज ।
  6. अस्थि मज्जा प्रेरण माध्यम के साथ सेल गोली फिर से निलंबित और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । चरण २.३ से अस्थि मज्जा प्रेरण माध्यम के 5-8 मिलीलीटर जोड़ें ३००,००० कोशिकाओं का एक अंतिम सेल समाधान प्राप्त करने के लिए/ 24-कूप प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर डालें ।

5. संस्कृति और विभेदन

  1. 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं इंक्यूबेट के बाद, धीरे माध्यम से बाहर महाप्राण और प्रत्येक अच्छी तरह से अस्थिशोषक प्रेरण माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्लेट को धीरे से उत्तेजित करें और ३७ ° c पर इनक्यूबेटर में रखें ।
  2. अस्थिक्लेस्ट प्रेरण माध्यम हर ४८ एच बदलें । ऐसा करते समय कुएं में ०.८ एमएल मीडियम को बदल लें और प्लेट को धीरे से उत्तेजित करें ।
    नोट: एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत अच्छी तरह से बड़े, motile, और बहुकेंद्रकी अस्थिकसमांतक मनाया जाना चाहिए, आमतौर पर दिन के आसपास 4 – 6.

6. tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला

नोट: अगर इंडक्शन (सेक्शन 5) सफल रहता है तो मल्टीन्यूक्लिएट ऑस्टियोक्लेस्ट्स 4 – 6 दिनों के बाद मौजूद रहेंगे ।

  1. ३७% formaldehyde के 4 मिलीलीटर, एसीटोन के ३२.५ मिलीलीटर, और १२.५ मिलीलीटर एक सिट्रट समाधान के संयोजन के द्वारा फिक्टिव समाधान तैयार करें । स्थिरनात्मक विलयन को 4 ° ब् पर भंडारित करिए ।
  2. टार्ट्रेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (जाल) दाग समाधान (सामग्री की मेज) तैयार सोडियम नाइट्राइट की ५० Μl, तेजी से GARNET gbc आधार समाधान के ५०-एल, नैप्फोल के ५० ΜL के रूप में-द्वि फॉस्फेट समाधान, एक एसीटेट समाधान के २०० μl, और एक के १०० μl ४.५५ से ३७ ° c के लिए पहले से गरम है विआयनीकृत पानी के मिलीलीटर में टार्ट्रेट समाधान । फिर, 1 मिनट के लिए प्रतिलोमन द्वारा धीरे मिश्रण है, और यह 2 मिनट के लिए खड़े हो जाओ ।
  3. अस्थिक्लेस्ट्स के सफल प्रेरण के बाद, माध्यम से महाप्राण बाहर, और धीरे PBS के साथ 3x कुओं धोने ।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) के लिए फिक्टिव समाधान लाओ । 30 एस के लिए कुओं के लिए 2 मिलीलीटर फिक्टिव समाधान जोड़ें, और कोशिकाओं को सूखने की अनुमति नहीं है ।
  5. स्थिरीकृत विलयन को धीरे से धो लें, यह 3x को विआयनित जल से धोएं जो ३७ ° सेल्सियस से गरम है, और फिर पानी को महाप्राण दें ।
  6. ३७ ° c पर 1 ज के लिए जाल दाग समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और अंधेरे में नमूना रखने के लिए ।
  7. 1 ज के बाद, दाग महाप्राण, और धीरे से विआयनीकृत पानी है कि ३७ ° c करने के लिए गरम है के साथ नमूना धोने, और फिर, पानी महाप्राण ।
  8. एक hematoxylin समाधान में 1 मिनट के लिए कोशिकाओं को प्रतिदाग । धुंधला के बाद, hematoxylin समाधान महाप्राण और धीरे विआयनीकृत पानी के साथ कोशिकाओं 3x धोने ।
  9. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी, और तीन या अधिक नाभिक के साथ जाल+ कोशिकाओं का उपयोग कर छवि osteoclasts बैंगनी दिखाई देगा ।

7. अस्थि अवशोषण परख Toluidine ब्लू Staining का उपयोग

  1. अस्थि स्लाइस का पूर्वउपचार
    1. माइक्रोइलेक्ट्रिक आरी द्वारा अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ 2 सेमी मोटी स्लाइस में ताजा गोजातीय ऊरु अस्थि प्रांतस्था काटें । फिर, कट और ८० μm में कठोर ऊतक grinders के साथ स्लाइस पीस ।
    2. 1 एच के लिए विआयनीकृत पानी और १०० हर्ट्ज अल्ट्रासाउंड के साथ एक बीकर में स्लाइस धोने, और 3x दोहराएँ.
    3. 2 ज के लिए ७५% शराब में स्लाइस विसर्जित । फिर, शराब से बाहर महाप्राण और एक स्वच्छ मंच पर 1 ज के लिए पराबैंगनी प्रकाश को स्लाइस के प्रत्येक पक्ष का पर्दाफाश ।
    4. कोशिकाओं को लगाने से पहले, कम से 2 घंटे के लिए संस्कृति माध्यम में स्लाइस विसर्जित ।
  2. Toluidine ब्लू धुंधला
    1. 24-कूप प्लेट में पूर्वशोधित अस्थि स्लाइस रखें । संयंत्र के रूप में कदम ४.६ में उल्लेख किया और कोशिकाओं को प्रेरित के रूप में खंड 5 में उल्लेख किया ।
    2. अस्थिक्लेस्ट्स (4 – 6 दिनों के बाद) की उपस्थिति के बाद, स्लाइस को 1 मिलीलीटर ०.२५ मीटर अमोनियम हाइड्रॉक्साइड से धोएं, और 5 मिनट के लिए उन्हें 3x सोकेट करें ताकि जीवित कोशिकाओं को हटाने के लिए अस्थि स्लाइस पर अवशोषण गड्ढों के विश्लेषण की अनुमति दी जा सके । फिर, अमोनियम हाइड्रोक्साइड निकालें और स्लाइस 1% के 1 मिलीलीटर (wt/vol) toluidine नीले समाधान प्रति स्लाइस के लिए 2 मिनट के लिए दाग ।
    3. स्लाइस को पीबीएस से धोएं । रैंडम रूप से पाँच दृश्यों का चयन करें और एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अवशोषण क्षेत्र का एक अर्धमात्रात्मक विश्लेषण करने ।

8. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. चरण 7.2.1 से हड्डी के स्लाइस को 1 मिलीलीटर २.५% ग्लूटारऐल्डिहाइड प्रति स्लाइस के साथ 2 ज के लिए आरटी में उपसर्ग लगाएं, और फिर, कोशिकाओं को हटाने और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड को हटाने के लिए 1 मी अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 3 मिनट के लिए स्लाइस 3x sonicate ।
  2. 12 मिनट के लिए हड्डी स्लाइस 3x धोने PBS के साथ ।
  3. 2 ज के लिए 1% osmic एसिड के साथ हड्डी स्लाइस आरटी पर ठीक करें ।
  4. इथेनॉल ढाल निर्जलीकरण प्रदर्शन, ५०%, ७०%, ८०%, ९०%, और ९५% इथेनॉल के साथ, 15 मिनट के लिए हर ढाल के लिए, और फिर, 15 मिनट के लिए isoamyl एसीटेट के साथ इथेनॉल की जगह ।
  5. कोट सोने पैलेडियम के साथ स्लाइस, और फिर, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग से विश्लेषण ।

कैल्सीटोनिअन रिसेप्टर के 9. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

नोट: यदि इंडक्शन सफल (अनुभाग 5) हो तो बहुकेंद्रकी अस्थिकलिस्ट्स 4 – 6 दिनों के बाद उपस्थित होंगे ।

  1. माध्यम से महाप्राण बाहर और धीरे PBS के साथ अच्छी तरह से 3 एक्स धोने ।
  2. 4% पैराफॉर्मलेडिहाइड के साथ 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें, जो 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकूल्ड होता है ।
  3. ०.३% nonionic प्रति अच्छी तरह से बर्फ पर 30 मिनट के लिए surfactant के साथ PBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें । फिर, ०.३% nonionic surfactant के साथ बंद पीबीएस महाप्राण और 5% प्रति अच्छी तरह से बर्फ पर 30 मिनट के लिए fbs के साथ pbs के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. पीबीएस से बाहर महाप्राण और पीबीएस में 4 ° c रात में एक 1:100 कमजोर पड़ने पर विरोधी calcitonin रिसेप्टर (विरोधी सीटीआर) के साथ झिल्ली सेते ।
  5. समाधान से aspirate, और Alexa के साथ झिल्ली सेते-४८८-संयुग्मित विरोधी खरगोश IgG एंटीबॉडी पर एक 1:1000 PBS में 1 एच के लिए टीआरटी में
  6. समाधान से महाप्राण निकालना और धीरे PBS के साथ कोशिकाओं 3x धोने । Hoechst ३३३४२ दाग के साथ नाभिक पर प्रतिदाग 3 मिनट के लिए आर टी पर ।
  7. समाधान से महाप्राण निकालना, और धीरे PBS के साथ कोशिकाओं 3x धोने । प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शिकी द्वारा सीटीआर की तीव्रता का प्रेक्षण कीजिए ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बड़ी संख्या में अस्थिशोषक पूर्वगामी को आसानी से अलग करना और उन्हें शुद्ध करना था और अस्थिक्लेस्ट्स को सफलतापूर्वक प्रेरित करना था । एम-सीएसएफ और रानीकेएल के साथ सप्लीमेंट से, 5 – 6 दिनों में विशाल अस्थिक्लेस्ट्स देखे गए । अस्थिक्लोम के गठन को ट्रैप अभिरंजक द्वारा सफलतापूर्वक पहचाना गया (चित्र 1a) । बड़े और बैंगनी कोशिकाओं को कई नाभिक (आमतौर पर ≥ तीन नाभिक) के साथ जाल सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में माना जाता था । इस विधि के माध्यम से, यह एक 24-कूप प्लेट (चित्र 1b) में, अस्थिशोषक प्रति के रूप में कई के रूप में 30 नाभिक प्राप्त करने के लिए ८०० osteoclasts, की खासियत थी । पारंपरिक विधि की तुलना में, बेहतर विधि पूरे आइसोलेशन प्रगति में लगभग 20 मिनट बचाया (चित्रा 1 सी).

अस्थि स्लाइस का उपयोग करने के लिए अस्थि अवशोषण की गतिविधि का आकलन करने के लिए इन विट्रो विधि में विशिष्ट है । Toluidine ब्लू धुंधला के माध्यम से, अवशोषण क्षेत्र हल्के हरे रंग (चित्र 2a) के रूप में कल्पना की थी और गणना की गई थी । अस्थि गड्ढ़ों की संरचना और विशेषताओं को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा स्पष्ट रूप से देखा गया (चित्र 2बी) ।

अस्थिक्लेस्ट-विशिष्ट कोशिका मार्करों में से एक सीटीआर, अस्थिविक्लास्ट्स की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है और हड्डी में ऑस्टियोक्लैस्ट्स के गठन का अध्ययन । सीटीआर की सकारात्मक अभिव्यक्ति से ऑस्टियोक्लेस्ट्स की स्पष्ट पहचान होती है और मैक्रोफेज पॉलीकार्यन्स से उन्हें अलग किया जाता है । CTR का पता इम्यूनोफ्लोरेसेंस assays हैं. हरे रंग की सीटीआर की अभिव्यक्ति का संकेत दिया और नीले नाभिक का संकेत (चित्रा 3).

Figure 1
चित्र 1: अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं से अस्थिकोशिकाजनन. () ट्रैप धुंधला की प्रतिनिधि छवि । 10x आवर्धन पर ब्राइटफील्ड माइक्रोग्राफ, कई विशालकाय, बहुकेंद्रकी अस्थिकोशित को दर्शाता है जो ट्रैप-पॉजिटिव होते हैं और 20x आवर्धन पर पाए जाते हैं । एक बहुकेंद्रकी अस्थिविक्लास्ट के भीतर एक नाभिक का एक उदाहरण लाल तीर द्वारा दिखाया गया है । () 10x आवर्धन पर ब्राइटफील्ड माइक्रोग्राफ यह प्रमाणित करता है कि बड़ी संख्या में ट्रैप-पॉजिटिव अस्थिकंडे मौजूद थे । एक बड़े, बहुकेंद्रकी अस्थिशोषक का एक उदाहरण लाल डैश्ड लाइन द्वारा रेखांकित किया जाता है । () दो पृथक्करण पद्धतियों पर बिताए गए समय की तुलना । सभी संचालन प्रयोगकर्ताओं के इसी समूह ने किया । डेटा का अर्थ है ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करता है । * P < ०.०५, n = 3 । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अस्थि स्लाइस द्वारा हड्डी अवशोषण assays हैं । () 4x आवर्धन पर ब्राइटफील्ड माइक्रोग्राफ, अस्थि अवशोषण क्षेत्र को दर्शाता है, तोलायूडाइन नीले दाग द्वारा हल्का हरा होता है, और गोल, अंडाकार, या सॉसेज के आकार का होता है । अस्थि अवशोषण क्षेत्र का एक उदाहरण लाल तीर द्वारा दिखाया गया है । () 500x आवर्धन पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ अवशोषण गड्डे पाया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करके अस्थिक्लैस्ट में सीटीआर अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन । कक्ष कक्षों के आस-पास एक स्पष्ट CTR संकेत दिखाता है । () सीटीआर-पॉजिटिव सेल । () नाभिक । () का विलय हो गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्राप्त करने के लिए और इन विट्रो में अस्थिक्लेस्ट अध्ययन करने की क्षमता हड्डी चयापचय का अध्ययन करने के लिए इच्छुक शोधकर्ता के लिए एक महत्वपूर्ण और मौलिक कौशल है, जो हड्डी को अवशोषित रोगों के तंत्र को समझने में मदद और उपंयास चिकित्सीय एजेंटों का विकास हो सकता है । वर्तमान अध्ययन में पिछले तरीकों के आधार पर कुछ संशोधनों के साथ एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ।

अस्थि मज्जा को प्राप्त करने के लिए पिपेट युक्तियाँ और माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूबों का उपयोग करके, यह काफी हद तक अस्थि मज्जा और पारंपरिक तरीकों की तुलना में प्रयोगशाला कर्मियों के काम का बोझ प्राप्त करने के आपरेशन समय कम. इस बीच, विधि अस्थि मज्जा हानि या सुई छड़ी चोट के जोखिम से बचा जाता है । एक पिछले अध्ययन में, अस्थि मज्जा-व्युत्पंन कोशिकाओं को तुरंत अलगाव12,13के बाद चढ़ाया गया । घनत्व प्रवणता अपकेंद्रण का उपयोग सेटलमेंट गुणांक में अंतर के अनुसार अस्थि मज्जा monocytes का चयन करने के लिए किया जाता है । घनत्व ढाल अपकेंद्रण की प्रक्रिया में, सेल जुदाई मीडिया के अलावा दीवार के साथ धीरे और सावधानी से किया जाना चाहिए, ताकि सीमाओं को स्पष्ट करने के लिए. तथापि, यह तकनीक अपकेंद्रित्र के फलन द्वारा सीमित है और यह कि क्या यह त्वरण और मंदी के मापदंडों के साथ स्थापित है । बीजारोपण घनत्व अस्थिक्लैस्ट्स की खेती के लिए महत्वपूर्ण शर्त है । कई बार, प्रोटोकॉल एक अनुचित बोने की सघनता के कारण विफल जब कोशिकाओं चढ़ाना । इस प्रकार, लगभग ३००,००० कोशिकाओं के प्रति 24-कूप प्लेट अच्छी तरह से इस प्रोटोकॉल में सिफारिश की है । इस प्रोटोकॉल भी चूहों या अंय जानवरों (जैसे, माउस, खरगोश, और चिकन) में अस्थि मज्जा व्युत्पंन कोशिकाओं के विभिंन प्रकार प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है ।

सबसे क्लासिक विधि osteoclasts की गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए अवशोषण गड्ढे परख है । गोजातीय अस्थि प्रांतस्था सामान्यतः अवशोषण गर्त परख के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि इसके स्रोत व्यापक रूप से उपलब्ध हैं । एक आधुनिक परिच्छेदन प्रणाली की मदद के साथ, हम पतली हड्डी स्लाइस और अधिक आसानी से प्राप्त कर सकते हैं । अवशोषण पिट परख तीन कारक है । स्लाइस में सफलतापूर्वक एक अवशोषण गड्ढे उत्पन्न करने के लिए, स्लाइसें कड़ाई से प्रोटोकॉल में defatting के लिए वर्णित के रूप में इलाज किया जाना चाहिए । इसके अलावा, चूहा अस्थिक्लेस्ट्स एक थोड़ा अम्लीय वातावरण में अवशोषण गड्ढे फार्म के लिए सक्रिय कर रहे हैं, और अवशोषण समारोह अनिवार्य रूप से "बंद" जब पीएच ७.२14,15से ऊपर चला जाता है जाएगा । इस प्रकार, यह उल्लेखनीय है कि प्रयोग की प्रगति के दौरान अक्सर इंक्यूबेटर के दरवाजे खोलने पीएच और पीसीओ2 मूल्यों के perturbations करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यहां तक कि osteoclasts के अवशोषण समारोह को प्रभावित16. अंत में, अस्थि स्लाइसें कुओं के तल पर रहना चाहिए और स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए या ऊपर तैरने जब मध्यम बदलते हैं, क्रम में जलन से बचने के लिए ।

सीटीआर 7 के वर्ग द्वितीय उपपरिवार के एक सदस्य है-ट्रांसब्रान जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स कि भी पैरारायइड हार्मोन और स्राटिन रिसेप्टर्स17होते हैं । के रूप में अच्छी तरह से जाल धुंधला और अवशोषण गड्ढे परख के रूप में, अस्थिक्लेस्ट्स आकारिकी और समारोह द्वारा की पहचान कर रहे हैं, और सीटीआर-सकारात्मक प्रतिरक्षा विज्ञान में अस्थिक्लेस्ट्स की पहचान । अब, हम अस्थिक्लेस्ट्स की पहचान करने के लिए सुपरनेटंट में एक्टिन रिंग के फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाने और पिरिडिनोलिन क्रॉसलिंक को मापने का भी उपयोग कर सकते हैं ।

हालांकि विभिंन शोधकर्ताओं प्रयोगात्मक तकनीकों और अस्थि मज्जा में कोशिकाओं की कुल राशि के साथ अलग familiarities है निश्चित है, हम एक कम समय में अस्थि मज्जा कोशिकाओं प्राप्त, अपेक्षाकृत, और अंत में, पूरी तरह से बड़ी मात्रा में प्राप्त चूहा अस्थि मज्जा से विभेदित अस्थिक्लेस्ट्स ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन की नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (८१४७३६९२) ने योंग मा को सपोर्ट किया । लेखकों चीनी चिकित्सा के नानजिंग विश्वविद्यालय में नैदानिक चिकित्सा के पहले कॉलेज के चिकित्सा अनुसंधान केंद्र के सभी कर्मचारियों को धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Automatic Hard Tissue Slicer Lecia RM2265
Bovine femoral bone Purchased by ourselves
Cell Incubator Heraus BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum Sarana s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077
Hard Tissue Grinders Lecia SP-2600
Histopaque Kit TianJing Haoyang TBD2013DR Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342 Sigma-Aldrich B2261
Inverted Phase Contrast Microscope Olympus CKX31
Inverted Fluorescence Microscope Lecia DMI-3000
MEM, no Glutamine Gibco 11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid Gibco 15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor Bioss bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF PeproTech 400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand PeproTech 400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer Absin abs47014932
Scanning Electron Microscopy FEI Quanta 200
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89649

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References

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