En ny bärbar In Vitro exponering kassett för Aerosol provtagning

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra bärbara cellulära aerosol exponeringar och mäta cellulära svar. Metoden använder celler, odlas på gränssnittet luft-vätska, härma i vivo fysiologi. Cellulär respons koppar nanopartiklar aerosoler observerades som oxidativ stress genom reaktivt syre arter generering och cytotoxicitet som laktatdehydrogenas release.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Secondo, L. E., Wygal, N. J., Lewinski, N. A. A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling. J. Vis. Exp. (144), e58916, doi:10.3791/58916 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Detta protokoll införs ett nytt in vitro- exponering system, kan bärs, inklusive dess karakterisering och prestanda. Luft-vätska gränssnitt (ALI) in vitro- exponering system är ofta stora och skrymmande, försvårar transport till fältet och drift vid källan av utsläpp eller inom andningszonen. Genom miniatyrisering av dessa system, kan labbet föras till fältet, påskynda handläggningstiden och att tillhandahålla en mer lämplig exponeringsmetod som inte ändrar Aerosolen innan du kontaktar cellerna. Bärbart In vitro exponering kassett (PIVEC) anpassar en 37 mm filter kassett för in vitro- toxicitetstester utanför traditionella laboratoriemiljö. PIVEC präglades använder tre storlekar av koppar nanopartiklar för att bestämma nedfall effektivitet utifrån gravimetrisk och partikelanalys nummer koncentration. Inledande cytotoxicitet experimenten utfördes med exponerade lungceller att bestämma systemets förmåga att sätta in partiklar samtidigt som cellernas viabilitet. PIVEC ger en liknande eller ökade nedfall effektivitet när jämförande till tillgängliga vinkelrätt flöde in vitro exponering-enheter. Trots den lägre provmängder ger den lilla storleken några fördelar till den nuvarande in vitro- ALI exponering system. Dessa inkluderar möjligheten att bäras under personlig övervakning, rörlighet från laboratoriet till källan till utsläpp och möjlighet att ställa upp flera system för rumslig upplösning samtidigt en lägre användare kostar. PIVEC är ett system som kan samla in aerosoler i fältet och inom andningszonen på en air-ihop, in vitro- modell.

Introduction

Personliga provtagning med in vitro- metoder kan ge omfattande information om de biologiska effekterna av aerosoler på arbetsplatsen. 1 exponeringar mot föroreningar i luften omfatta exponeringar mot kemiskt själv, att de insamlade luftprover, nedsänkt villkor där gasen introduceras till cellsuspension, intermittent exponering med hjälp av en enhet såsom en rocker, eller direkt exponeringar vid luft-vätska gränssnitt (ALI). 2 många av dessa tekniker utförs med celler odlas i suspension eller provtagning före exponering, som alla kan påverka toxikologiska studien på grund av potentiella förändringar i aerosoler. 3 för att undvika dessa förändringar, laboratoriet kan föras till fältet med hjälp av flera in vitro- ALI kultur exponering system som används i litteratur,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 dock få är kommersiellt tillgängliga. 8 , 9 , 12 dessa system är ofta skrymmande, särskilt när inklusive instrument för att reglera temperatur och luftfuktighet på den cellulära miljön och flödet klassar av provet aerosoler. Med hjälp av PIVEC, kan aerosol exponeringar utföras utanför en traditionell lab miljö eller inom andningszonen medan härma inandning villkor.

Bestämning av aerosol nedfall i vitro är viktigt att utredningen av hälsoeffekter på grund av inandning. Andningszonen, området inom 30 cm från munnen och näsan,14 är avgörande för att förstå exponering för nanopartiklar och för att länka till de biologiska effekterna i lungorna. 2 ofta, nedfall på celler definieras som ett nedfall effektivitet, partiklarna deponeras på och tas upp av cellerna dividerat med partiklarna administreras till systemet6,15 eller på en massa bas av samma belopp. 4 , 16 de nuvarande metoderna för mätning av aerosoler i andningszonen är filter baserat, fånga partiklar under en viss provtagning och använda filter för att utföra ytterligare tester. 17 personlig övervakning kräver ett litet system som kommer med nackdelen av färre prover.

Det finns många metoder att bestämma hälsoeffekter vid exponering för en aerosol. ALI modellen möjliggör aerosoler ska administreras direkt till cellerna genom luften som i en riktig exponeringsscenario, men det är mer kostnadseffektivt och mindre intensiv tid än in-vivo studier medan härma de luft-vätska hinder såsom ögon, hud och lungor. Lungceller som odlas på ALI har förmågan att generera en polariserad spärrskikt,18,19 som producerar fysiologiska egenskaper som liknar i vivo lung epitelet, inklusive slem och tensid produktion i specifika bronkial eller alveolära cellinjer, cilier slå,19 åtsittande föreningspunkter,19,20 och cell polarisering. 18 förändringar som dessa kan påverka cellulära svaret mätt i toxicitetsstudier. 21 dessutom ALI in vitro- modell resulterar är ofta mer känsliga än cellerna exponeras via fjädring modeller22 och kan modell akut i vivo inhalationstoxicitet. 23 , 24 därför en ALI exponering system som kan utföra mätningar inom andningszonen är ett naturligt nästa steg.

Genom att utsätta celler till aerosol direkt på källan till utsläpp, uppstår utredning av alla gaser, semi flyktiga ämnen och partiklar som är inblandade i blandningen effekter. När blandningen samlas på ett filter, gaser och flyktiga föreningar fångas inte och hela blandningen kan inte undersökas. Beredning av partiklar till ett pulver eller en flytande suspension kan dessutom leda till aggregering eller partikel-fluid interaktioner, till exempel upplösning, i flytande suspension. 25 , 26 när aerosolpartiklar läggs till vätskan, det finns en högre potential för tätbebyggelse,25,27 bildandet av ett protein corona,28 eller interaktion med föreningar i vätskan, vilket kan påverka nedfall och påverka biologiska svar. 29 , 30

Exponeringen vid ALI bygger på tre huvudsakliga aerosol profiler, cloud lösa, parallellt flöde och vinkelrät flöde. Moln avveckling, används av den luft-vätska gränssnitt Cell exponering (ALICE),4 är satsvis där partiklar insättning genom gravitationell och tröghetsseparation lösa som aerosoler behandlas som en enhet. Parallellt flöde, används av elektrostatiska Aerosol i vitro exponering System (TAKFOTEN)5 och Mångkulturåret exponering kammare (MEC) II,6 tillåter nedfall genom tillägg av Brownsk rörelse via flöde profilen. Vinkelrät flöde, används av en microsprayer,7 Nano Aerosol kammare för In Vitro-toxicitet (NACIVT),11 och kommersiella ALI system8,9,10,12, tillägger impaktion av partiklar inom regionen nedfall. Många av dessa exponering system är stor och skrymmande, som kräver överflödigt system för aerosol förkonditionering, pumpar för flöde, eller jämn uppvärmning kammare för inkubation av celler. Denna stora storlek minskar överförbarheten av systemet. I stället för provtagning direkt på källan till utsläpp har dessa system ofta prover inför de lab eller modell aerosoler som genereras för analys. Komplexiteten i de utsända Aerosolen kan vara förlorat i översättningen från fältet till labbet. PIVEC är mindre än nuvarande system, med en yttre yta på cirka 460 cm2 och väger endast 60 gram, med värme och luftfuktighet kontroll införlivas med de system som möjliggör en mycket portabel enhet. Minskad storlek och vikt att systemet ska bäras eller att källan till exponering, tillåter direkt provtagning.

Den stora storleken på nuvarande exponering system minskar även förmågan att utföra provtagning för att undersöka rumsliga övertoningar i koncentrationer. Denna resolution är nyckeln vid fastställandet av toxikologiska effekterna av många potentiella miljö- och yrkesrisker såsom vehicular avgaser partiklar materia eller arbetsplatsen aktiviteter där aerosolization uppstår. Omedelbart efter utsläpp, det blir en rumslig variansen i partikel koncentration. Detta växer med tiden när partiklarna skingra hela atmosfären och dessa effekter kan ändra beroende på omgivande förhållanden, såsom temperatur, tryck, vinden och solen. Partiklar kan börja åldras och oxidera samt en gång utsända31,32 och spridning priser påverkas av topografin; högre koncentrationer finns i canyons och tunnlar, där spridning effekter går långsammare och lägre koncentrationer kan hittas där det finns ett stort område för spridning. 33 dessa förändringar i dispersion priser kan ha betydande effekter på människors hälsa och kan ses när man jämför antalet astmatiska vuxna bor i urbana kontra i landsbygden inställningar. 34 medan många exponering system ger flera prover på en gång, flera system är det nödvändigt med ett överflöd av stora utrustning för att utföra rumsliga upplösningen.

Genom att labbet fältet, kan tidpunkten för analys minskas genom att använda hela cellen som en sensor. Följande kända biologiska mekanismer och slutpunkter kan stöd i fastställandet av aerosol sammansättning och storlek. På grund av långsamma clearance metoder, inklusive mukociliär clearance, fagocytos och flyttning, interagerar dessa partiklar ofta med celler för cirka dagar till veckor3 generera oxidativ stress, inflammation och även celldöd. Dessa biologiska endpoints kan vara utgångspunkterna för ogynnsamt utfall vägar för hjärt-kärlsjukdom eller kronisk obstruktiv lungsjukdom. Dessutom utförde Wiemenn et al. en array av in vitro- analyser att jämföra med litteratur värden för kort sikt i vivo inhalationstoxicitet. 35 In vivo svar förutspåddes med två av fyra positiva resultat från testning cytotoxicitet via laktatdehydrogenas release, oxidativ stress från glutation minskning och väteperoxid bildas och release, och inflammation potentiella från tumörnekrosfaktor alfa genen. Av tio nanosized metalloxider testade, testade sex som aktiv (titanoxid, zinkoxid och fyra olika cerium oxide) med exponering in vitro med bekräftelse i vivo

För att studera effekterna av aerosoler i en yrkesmässig miljö, utvecklat vårt labb i PIVEC för exponeringar i fältet. Dessutom PIVEC kan bäras för personliga provtagning att övervaka och undersöka som den 37 mm filter kassetten36 exponering genom inandning eller flera system kan användas för att uppnå rumslig upplösning inom ett visst område. I detta protokoll diskuteras karakterisering och användningen av PIVEC. Efter exponering observeras de biologiska effekterna genom cytotoxicitet analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Operatörerna måste bära skyddsutrustning (labbrock, handskar, goggles) när utför steg 1, 2, 3, 5 och 6.

1. beredning av material

  1. Förbereda material för Systemmontage och exponering för att säkerställa repeterbarheten.
    1. Se till att använda nya eller 70% etanol rengöras ¼ ”innerdiameter Konduktiv slang och ¼” ytterdiameter kontakter för församlingens system.
    2. Store testmaterial inklusive filter, PIVEC komponenter, pincett och partikel pulver i en väl kontrollerad miljö, med avseende på temperatur och luftfuktighet, för minst 24 h innan experimentet.
      Obs: Temperaturen bör vara nära rumstemperatur, ca 20 ° C, relativ luftfuktighet mindre än 35%. Detta är mycket viktigt att uppnå repeterbarhet mellan experiment.
    3. Förbereda partikelräknare med isopropanol för att rengöra delarna och möjliggör systemet uppvärmning enligt tillverkarens rekommendationer, inklusive scanning mobility particle sizer (SMPS) och optiska particle sizer (OPS) för mätning.

2. generering av torr Aerosol

Obs: Operatörer bör utföra aerosolbildning i dragskåp.

  1. Montera ett system för att generera torr aerosoler
    Obs: Upphävandet av partiklar i gas eller vätska bör vara lämpliga för den modellerade ansöka och cell-kulturen. Följande metod kan utföras med en vätskebaserade aerosol. Utformningen av torr aerosol systemet är från Tiwari et al. 37 en schematisk av torr spridning systemet visas i figur 1.
    1. Anslut kulventilen till båda ändarna av de 4 ”1/8 storlek gängad pipa, detta fungerar som partikel tratten. Ansluta 2 ”1/8 storlek pipa till en ventil.
    2. Väga koppar nanopartiklar, i denna studie av masskoncentrationen för varje partikelstorlek hölls konstant medan nedfall effektivitet. Använd cirka 7,5 mg 40 nm koppar nanopartiklar, 7 mg av 100 nm koppar nanopartiklar och 13 mg 800 nm koppar nanopartiklar per exponering. Placera koppar nanopartiklar i partikel uppsamlaren genom den öppna änden.
      Obs: Mängden koppar nanopartiklar vägde kommer att tjäna som massan baserat administrerat koncentration.
    3. Placera en 3 ”bit av ½” ytterdiameter (OD) slangar runt 2 ”röret och plats ett HEPA-filtret släpper denna korta slangar så att flödesriktningen är genom kulventilen.
    4. Anslut vakuumgeneratorn till andra kulventil med gängning. Anslut vakuumgeneratorn till lufttank genom att placera en 5/16 ”OD slangar till push-till-lås anslutningen. Använd ¼ ”OD slangar för att ansluta uttaget av vakuum generatorn till experimental set-up genom att placera slangen över utloppet av vakuum generatorn.
  2. Användning av torr aerosol system att generera torr aerosol
    1. Öppna luften behållaren genom att vrida huvudventilen och tillåter luftflödet i systemet. Öppna ventilen på flöde regulatorn på lufttank och ställa in så att flödet genom systemet motsvarar önskade inställningar på vakuumpumpen.
    2. Öppna kulventilen närmast HEPA filter sedan närmast vakuumgeneratorn kulventilen. Håll dessa öppna för cirka 3 s att tillåta partiklar att dras in i luftströmmen.
    3. Stäng kulventilen närmast vakuum generator sedan stänga kulventilen närmast HEPA-filter. Att luften från tanken att flyta för varaktigheten av experimentet som behövs.
    4. Nära main och regulator ventiler på lufttank att stoppa flödet. Ren kulventiler och vakuum generator med 70% etanol. Autoklav metallrör för sterilisering.

3. nedfall effektivitet mätning med PIVEC

Obs: Operatörer bör utföra aerosol exponeringar i dragskåp.

  1. Mäta nedfall genom att samla de koppar nanopartiklar aerosol genereras i steg 2.2 på en pre vägde filter. Använd den deponerade dosen, mätt med den samla massan på filtrera, och den administrerade dosen, mätt med mängden vägde koppar partiklar, för att bestämma nedfall effektivitet.
    1. Hålla 1.00 µm porstorlek glas fiber filter villkor låg luftfuktighet, beskrivs i 1.1.2, under minst 24 h innan pre-exponering mätningar. Väga ett oanvänt filter tre gånger och registrera filtervikter. Plats det oanvända filtret i en cellkultur infoga.
    2. Välj lämplig cell kultur infoga adapter (6 Tja eller 24 brunn) för PIVEC att stödja cell kultur skäret med filtret. Plats cellkulturen infoga adapter bit överst på basen av PIVEC, inställning på plats så att basen av adapter bit är bredare än toppen.
    3. Använd pincett att placera filtret laddas cellkultur infoga inom adapter bit. Placera den övre bit ovanpå adaptern stycke, lösa på plats så att basen av ovandelen är bredare än toppen. Linda PIVEC med ett lager silvertejp.
    4. Anslut 37 mm kassett stycken på toppen och botten av PIVEC genom att trycka på plats. Placera ¼ ”taggig adaptrar i kassett inlopp och utlopp.
    5. Wrap resistiv värmaren runt PIVEC så att ledningarna är vid basen. Tejp för att säkra.
    6. Linda PIVEC med ~ 8 rundor av aluminiumfolie för isolering. Säkra med tejp.
    7. Ansluta 2 ”lång bit 1/2” yttre diameter slangar till adaptern ovanpå PIVEC. Ta bort porös slang från sterilt vatten och plats i slangen ovanpå PIVEC.
    8. Plats PIVEC inom klämma på ringen stå och säkra. Komplett uppsättning med vakuumpump, partikelräknare och aerosol set-up.
      Obs: Nummer-baserade deponerade dosen kan bestämmas endast om partikelräknare placeras före PIVEC och efter PIVEC på separata körningar.
    9. Exponera filter med steg 2.2 i protokollet och önskad exponering tid och flöde priser, i denna studie användes en exponeringstid på 10 min vid 0,5 LPM. Ta bort PIVEC från set-up. Ta ut cell kultur skäret och placera exponerade filtret i filterhållaren låg luftfuktighet villkor under minst 24 h innan mätningar.
    10. Ren PIVEC med 70% etanol. Sterilisera med ultraviolett ljus för minst 30 min innan nästa experiment.
    11. Väger det exponerade filtret tre gånger och registrera filtervikter. Placera filtret exponerade i en märkt filterhållare för lagring.

4. beräkning av deponerade dosen och nedfall effektivitet

Obs: Kunskap om nedfallet är viktigt för aerosol administration och tolkning av cellulära svar.

  1. Beräkna nedfall från massa-baserade mätningar
    1. Beräkna den deponerade massan på filter som skillnaden mellan pre-exponering medelvikt och efter exponering medelvikt. Detta värde är massa-baserade deponerade dosen för experimentet.
    2. Användning administreras massa, madmin, och massa-baserade deponerade dosen bestäms i 4.1.1, mdep, att beräkna massan-baserade nedfall effektivitet, ηmför experimentet.
      Equation
    3. Genomsnittliga värden från 4.1.1 och 4.1.2 för minst 3 försök att bestämma nedfall och nedfall effektivitet för PIVEC för partikelstorlek.
  2. Beräkna nedfall från nummer-baserade mätningar
    1. Se till att mätningar med partikelräknare har utförts med räknare efter PIVEC och att bestämma partikel koncentration innan PIVEC. Integrera den partikel koncentrationen över tid för partikelräknare sedan integrera över partikeldiameter att bestämma totalen partiklar mätt.
    2. Beräkna antalet insatta partikel som skillnaden mellan partiklarna administreras och de partiklar mätt post-PIVEC. Detta värde är antalet-baserade deponerade dosen för experimentet.
    3. Användning administreras partiklar, nadmin, nummer-baserade deponerade dosen, ndep, volymflöde, V och tid, t, att beräkna det antal-baserade nedfall effektivitet, ηn, för experimentet.
      Equation
    4. Genomsnittliga värden från 4.2.2 och 4.2.3 för minst 3 försök att bestämma nedfall och nedfall effektivitet för PIVEC för partikelstorlek.

5. aerosol exponering av celler

Obs: För cellen kultur på gränssnittet luft-vätska läsaren hänvisas till Tom et al. 38 aktörer bör utföra cell kultur infoga lastning (steg 5.1.2-5.1.4) inom en biosäkerhet skåp. Operatörerna bör utföra aerosol exponeringar i dragskåp.

  1. Kultur celler på luft-vätska gränssnitt
    1. Lyft A549 celler från kultur kolven genom att lägga till trypsin-EDTA, 3 mL för en T75 kolv eller 1 mL för en T25 kolv och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C. Tillsätt 7 mL komplett media för en T75 kolv eller 4 mL komplett media för en T25 kolv till kolven och skölj kolven vägg med cellsuspension för att maximera den återvunna mobilnummer. Överföra cellsuspensionen till en steril 15 mL koniska rör och centrifugera celler vid 800 x g i 3 min sedan.
    2. Ta bort den supernatanten innehållande trypsin-EDTA och återsuspendera cellpelleten i 10 mL av komplett media. Ta bort 10 µL cellsuspension och lägga till hemocytometer. Räkna celler som använder en hemocytometer för att bestämma koncentrationen och det totala antalet celler.
    3. Placera 0,5 mL av komplett media till varje brunn inom en 24 väl platta. Placera oanvända cell kultur skär i brunnar. Utsäde cellkultur infogas på den apikala sidan vid en cell densiteten nära 1 x 105 celler/cm2 för celltyper som växer med en hastighet nära fördubbling per dag. Att frö A549 celler inom en 24 väl Infoga, utsäde celler vid en densitet av 1 x 105 celler/cm2 genom att lägga till 35.000 celler cellkulturen infoga.
      Obs: Celler med en långsammare tillväxt kan vara seedade på en ökad cell densiteten.
    4. Lägg till komplett media till apikala sidan av cell kultur infoga att nå den slutliga volymen (för 24 väl plattan slutlig volym är 0,25 mL).
    5. Kultur 7 dagar i nedsänkt tillstånd, ersätta media varje 1-2 dagar. Efter 7 dagar, ta bort den apikala media och kultur för minst 1 dag i ALI villkor, ersätter endast basolateral media.
  2. Montera PIVEC
    1. Tillåta celler temperera vid luft-vätska gränssnittet för minst 24 h före exponering.
    2. Välj lämplig cell kultur infoga adapter för PIVEC att stödja cell kultur skäret med filtret. Plats cellkultur infoga adaptern ovanpå PIVEC bas, inställning på plats så att basen av adapter bit är bredare än toppen. Tillsätt 4 mL cell kultur media till brunnen av basen av PIVEC.
    3. Använd pincett att placera cellkulturen infoga inom adapter bit placeras i steg 5.2.3. Placera ovandelen ovanpå adaptern stycke, lösa på plats så att basen av ovandelen är bredare än toppen. Noggrant, Linda PIVEC med ett lager silvertejp.
    4. Anslut 37 mm kassett stycken på toppen och botten av PIVEC, genom att trycka på plats. Placera ¼ ”taggig adaptrar i kassett inlopp och utlopp.
    5. Wrap resistiv värmare runt PIVEC så att ledningarna är vid basen. Tejp för att säkra.
    6. Linda PIVEC med ~ 8 rundor av aluminiumfolie för isolering. Säkra med tejp.
    7. Anslut kort bit 1/2 ”yttre diameter slangar till adaptern på toppen av PIVEC. Ta bort porös slang från sterilt vatten och plats i slangen ovanpå PIVEC.
    8. Plats PIVEC inom klämma på ringen stå och säkra. Slutföra inställningen med vakuumpump och aerosol set-up.
  3. Utsätta celler på ALI med hjälp av PIVEC
    1. Använd nedfall effektivitet bestäms i steg 2 för att beräkna massan av partiklar till vara sprids. Väg lämplig massa och tillsätt till aerosol systemet ställa in följande steg 2 inom spiskåpa.
    2. Exponera celler genom att följa steg 2.2, i denna studie av biologiska endpoints celler utsattes för cirka 3,5 mg koppar nanopartiklar med en flödeshastighet av 0,5 LPM och en exponeringstid av 10 min. kontrollstudier används fuktad luft för att bestämma påverkan av luften ensam. Ta bort PIVEC från set-up. Ta ut cell kultur skäret, placera i sterila väl plattan och återgå till CO2 inkubatorn (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).
    3. Aspirera media från PIVEC. Om utför ytterligare experiment, buffrad skölj botten av PIVEC med fosfat lösning sedan upprepa steg 5.1 och 5.2.
    4. Ren PIVEC med 70% etanol när du är klar. Sterilisera med ultraviolett ljus för minst 30 min innan nästa experiment.
  4. Biologiska test förfaranden
    Obs: Analyser utförs i denna studie var oxidativ stress generation via DCFH-DA analysen och cytotoxicitet via laktatdehydrogenas (LDH) release.
    1. Lös 24,4 mg DCFH-DA i 50 mL metanol att göra 1 mM DCFH-DA lösning. Denna lösning kan förvaras vid-20 ° C i upp till 4 månader. Späd 1 mM DCFH-DA lösning genom att blanda 0,1 mL av 1 mM DCFH-DA lösning med 9,9 mL HBSS att göra 10 mL 10 µM DCFH-DA.
    2. Ta bort cellen kultur media och tvätta cell kultur infoga med ca 1 mL PBS. Tillsätt 0,5 mL 10 µM DCFH-DA lösning till varje brunn, ersätter skären när du är klar. Täckplatta med aluminiumfolie att förhindra ljusaktivering av färgämnet och återgå till 37° C inkubator för 1 h.
    3. Ta bort celler från inkubatorn och aspirera DCFH-DA arbetslösning från brunnarna. Tillsätt 0,5 mL HBSS brunnar och ersätta cell kultur skär.
    4. Läsa in väl plattan i plattan läsare och mäta baslinjen fluorescens med excitation/utsläpp våglängder av 485/530 nm. Ta bort plattan från bottenplatta läsaren och ladda in i PIVEC för exponering.
    5. Utsätta celler för önskad exponeringens varaktighet. Ta bort infoga från PIVEC och återgå till väl plattan. Ta bort 50 µL av basolateral vätska från väl plattan och plats i white 96 väl plattan. Mäta fluorescensen av DCF med excitation/utsläpp våglängder av 485/530 nm varje 30 min efter exponering för 2 h.
    6. Låt basolateral vätska temperera vid rumstemperatur för 20-30 min. Tillsätt 50 µL av LDH analyslösningen, blandade följande tillverkare protokoll, till basolateral vätska från väl plattan och låt reagera för 10 min. Tillsätt 25 µL stopplösning till väl. Läs fluorescens för resorufin produkt använder excitation/utsläpp våglängder av 560/590 nm.
    7. Ta bort ytterligare basolateral vätska och upprepa steg 5.4.6 på 4 h och 24 h efter exponering.

6 statistiska metoder

  1. Analys av biologiska test Data
    1. Rapport ROS produktion som fluorescens intensitet ökar hos behandlade cellerna i förhållande till baslinjen mätningar. Rapport LDH aktivitet som fluorescens intensitet ökar hos behandlade cellerna i förhållande till obehandlade celler.
    2. Utför enstaka faktor ANOVA att fastställa statistiska skillnader mellan datauppsättningar. I förekommande fall, utföra student t-tester på en värdera av betydelsen av 0,05. Rapportera uppgifter som medelvärde ± standardavvikelsen för minst tre exponering mätningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yrkesmässig in vitro- toxikologi handlar om att upprätthålla cellulär lönsamhet medan du utför aerosol exponering. PIVEC systemet visas i figur 2, inklusive temperatur och luftfuktighet kontroll och den slitna PIVEC. Temperaturen var upprätthålls med hjälp av en batteridriven resistiv värmare och aerosoler fuktad med ökade naturliga befuktning genom ett poröst, fuktade rör. I en kontrollerad aerosol inställning inuti ett laboratorium, kan PIVEC vara set-up för exponering som visas i figur 1. Karakterisering av systemet möjliggör bestämning av deponerade dosen på de celler som sedan kan korreleras till cellulära svaret.

Nedfall effektivitet är beroende av storleken på partiklarna som läggs till systemet eftersom nedfall styrkor inkluderar impaktion, sedimentering och diffusion. Nedfallet är dessutom beroende av flöde, exponeringstid och egenskaperna hos det exponering systemet. Med denna information, kan nedfall förutsägas. Nedfall effektiviteten i PIVEC har bestämts genom två metoder, gravimetrisk analys och partikelräkning nummer. Ekvationerna 1 och 2 användes för att bestämma nedfall effektivitetsvinsterna i tabell 1 med filtret baserat, scanning mobility particle sizer (SMPS) och optiska particle sizer (OPS) mätningar, figur 3. Ökad avlagring observeras övergripande för 24 väl design än 6 väl design och något minskar för 100 nm jämfört med 40 nm och 800 nm koppar partiklar. Nedfall i 24 brunnarna är mycket enhetlig över skäret, dock nedfall i 6 väl designen saknas enhetlighet som de flesta av partiklar insättningen nära mitten av skäret. Efter exponering analys kan påskyndas genom att fastställa sambandet mellan dos och mellan 37 mm filtret och cell kultur skäret, minskar nödvändigheten att bestämma dosen efter cellulära exponering. Jämförelse av nedfall inom 37 mm filter kassetten och PIVEC visar en stark korrelation för alla storlekar och brunnar med en Pearson korrelation på ovan 0.7, emellertid endast för 800 nm är korrelationen signifikant med en p < 0,05, se figur 4. Jämfört med liknande system i hela litteratur, är11,12 nedfall effektiviteten i PIVEC över spänna av partikelstorlek som testats jämförbara eller ökad över rapporterade värden, som observerats i figur 5. Nedfall effektiviteten inom PIVEC kan förbättras genom att minimera förluster i systemet via elektrostatiskt dissipativa eller konduktiv plast eller liknande material för att utforma PIVEC.

Om filtren inte är väl torkat i en luftfuktighet-kontrollerad miljö före exponering, överflödigt vatten ökar initiala massan och kan producera icke-fysiska, negativ insatta doser. Variabla flöden kan också främja inkonsekvent insatta doser inom systemet. För att undvika dessa problem, Tillåt minst en dag före och efter exponering för filter torka i en luftfuktighet-kontrollerad miljö.

Cellulära svar kommer att påverkas av den deponerade dosen och kan påverkas av exponeringens varaktighet om cellerna inte underhålls ordentligt. A549 celler, en alveolar epithelial cancer cellinje, exponerades för 10 min till olika storlekar av koppar nanopartiklar med en flödeshastighet av 0,5 LPM. Alternativa vinkelrätt flöde exponering system använder mellan 0,005 LPM och 1,5 LPM under en ihållande exponering medan denna metod använder en måttlig flödeshastighet under en snabb exponering. Använda massa-baserade nedfall effektivitet mäts och administrerade dosen, 1.58 ± 0,04 mg/cm2 40 nm koppar, 0.30 ± 0.00 mg/cm2 100 nm koppar partiklar, och 0.32 ± 0,01 mg/cm2 800 nm koppar partiklar var deponeras på cellerna. Cytotoxicitet och oxidativ stress har observerats inom de första tjugofyra timmar efter exponeringen. Cytotoxicitet mättes med frigöraren av laktatdehydrogenas (LDH) från skadade celler omedelbart, 4 timmar och 24 timmar efter exponering. Det fanns ingen signifikant toxicitet från koppar nanopartiklar 1.62 mg/cm2 nedan inom 4 timmar efter exponering, figur 6b. Tjugofyra timmar efter exponering det var en statistiskt signifikant minskning av cellernas viabilitet på mindre än 20% lönsamhet för celler utsätts för koppar nanopartiklar. Den intracellulära oxidativ stressen undersöktes med DCFH-DA-analys via oxidation av DCFH av reaktiva syreradikaler inom de första två timmar efter exponeringen, figur 6a. Betydande halter av oxidativ stress mättes på trettio minuter efter exponering för celler utsätts för koppar nanopartiklar av alla storlekar. Nivån på oxidativ stress fortsatte att öka på liknande priser för alla storlekar testade inom två timmar observerades.

Framgång av exponeringar kan bestämmas genom repeterbarheten av cellulära svar. Två kriterier för godkännande som föreslås för cytotoxicitet analyser omfatta: 1) % totala LDH läckaget för den positiva kontrollen bör vara större än 50%, och 2) positiva och prov replikera friktionskoefficienten variationer bör inom 50%. 39 om dessa kriterier inte är uppfyllda, detta föreslå skillnader mellan experiment, till exempel förändrad nedfall belopp eller dålig fuktighet eller temperatur kontroll. Dessutom kan observerar cytotoxicitet mätningar leda till förståelse av de experimentella kontrollerna och stöd i att fastställa felet. När flödet är för hög, kan celler dör från höga mängder skjuvspänning. Genom att sänka flödet, kan stressen på cellerna från flödet minskas.

Figure 1
Figur 1. Schematisk av torr spridning System och experimentella Set-up. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. PIVEC Design. (A) full Design avbildas med 30 cm lång låda för jämförelse. (B) PIVEC med temperatur och luftfuktighet kontroll avbildas med 30 cm lång låda för jämförelse. (C) slitna PIVEC. (D) PIVEC överdel. (E) cell kultur Adapter för 24 väl (vänster) och 6 Tja (höger). (F) botten bit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Antal baserat nedfall effektivitet (%) Massa baserade nedfall effektivitet (%)
6 väl 40 nm 17.83 ± 32.13 5,85 ± 0,85
100 nm 0,47 ± 4,06 5.11 ± 0,94
800 nm 3.70 ± 35.00 6,39 ± 1,01
24 väl 40 nm 1,43 ± 2.43 12,61 ± 1,34
100 nm 1,37 ± 19.45 2,95 ± 0,75
800 nm 6,98 ± 3,93 15,95 ± 0,53

Tabell 1. PIVEC nedfall effektivitet.

Figure 3
Figur 3. Partikeln numrerar koncentration av koppar nanopartiklar aerosoler. (A) SMPS mätning. (B) OPS mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Förhållandet mellan nedfall på cell infoga och SKC 37 mm filter. Fel ± 0,002 mg. (A) 40 nm koppar partiklar. (B) 100 nm koppar partiklar. (C) 800 nm koppar partiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Nedfall effektivitet av PIVEC jämfört med vinkelräta flöde exponering system i litteraturen. Litteratur värden från vinkelrät Flow exponering system är ritade i Solid markörer och PIVEC värden är tomma markörer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Cellulära svar till koppar nanopartiklar efter exponering (PE). För alla mätningar, n = 3 och p < 0,05. (A) oxidativ Stress bestäms med DCFH-DA-analys. (B) Cytotoxiciteten bestäms med LDH-analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Filterkassetter ger en enkel och billig metod för att samla in aerosoler i andningszonen; dock aerosol prover ur filter inte representerar hela aerosoler (dvs gaser, flyktiga ämnen och partiklar) och därmed begränsa bedömningen av relaterade biologiska effekter. Använder den ursprungliga utformningen av 37 mm filter kassetten, är PIVEC utformad för att underhålla bärbarhet och härma i vivo avsättning av partiklar från inandning. PIVEC är betydligt mindre än nuvarande ALI exponering system, ungefär storleken av en vävnad box med temperatur och luftfuktighet kontroll ingår. Storleken är liknar personliga kaskad över samtidigt som den erbjuder data på cellulära svar på aerosoler i tillägg. Medan PIVEC innehåller utrymme för ett prov i jämförelse med andra nuvarande exponering system, tillåter den lilla storleken flera system för att användas på en gång, därför öka urvalets storlek och möjliggör rumsliga fördelning övervakas.

Det finns flera kritiska steg i protokollet. För att avgöra nedfall effektivitet, är det viktigt att korrekt skick filtren, som beskrivs i steg 1. Dessutom är det viktigt att ordentligt väga de koppar nanopartiklarna före exponering och filter post exponering att bestämma massa-baserade nedfall effektivitet. Antal nedfall effektivitet måste bestämmas med hjälp av skillnaden i nedfall mellan inledande aerosol koncentration och slutlig koncentration bestämmas med hjälp av partikelräknare. Om nedfallet effektivitet inte avgörs ordentligt, är det svårt att fastställa biologiska svar skillnaderna mellan aerosol typer. Ändringar till deposition inkluderar att ändra nedfall. Nedfall kan ökas genom att hela flödet klassar och exponering. Detta kan också påverka cellviabiliteten med potential att torka ut cellerna. Konditionering av aerosoler utförs ofta för att kompensera för fysiologiska attribut såsom kroppstemperatur och befuktning i luftvägarna. Ökad luftfuktighet, över 50%, härmar inandningsluften och minskar celldöd på grund av fordonets exponering. 43 när temperaturen och luftfuktigheten inte är väl kontrollerade, kommer den cellulära Svaren kan påverkas. Genom att minska flödet, kommer ytterligare partiklar av alla storlekar deponera öka nedfall. Exponeringens varaktighet är proportionell mot nedfall, så att fler partiklar att deponera en längre experimentell period. Konditionering av Aerosolen är viktigt när öka exponeringens varaktighet så att cellerna inte torkar ut vilket kan påverka biologiska svar.

PIVEC använder vinkelrätt flöde för att deponera partiklar via impaktion, sedimentering och diffusion på de celler som har potential att torka ut celler genom flödet och lagt stress på cellerna. Nedfall effektivitet är beroende av storleken på partikeln på grund av styrkorna av nedfall. Många av de nuvarande exponering system med vinkelräta flöde har ett nedfall verkningsgrad på under 10% och mycket närmare till 1%. PIVEC har en nedfall effektivitet bestäms av gravimetrisk analys av 3% till 16% för en 24 väl cell kultur infoga. Partikel nummer-baserade nedfall effektiviteten är cirka 1% till 7% för samma vändskär. När du använder en 6 väl cellkultur infogar, dessa siffror minska, med undantag för minsta partikelstorlek, på grund av rationalisering av Aerosolen som fler partiklar begränsas i cell kultur infoga utan utrymme för flödet till utveckla. 6 väl cell kultur skären tillåta aerosol strömmar till förbifartsleden nedfall. Andra vinkelräta flödessystem har präglats på en massa grundval 60 nm fluorescein partiklar40, 80 nm och 180 nm koppar partiklar16och 60 nm adipic syra partiklar41. De resulterande nedfall effektivitetsvinsterna är i allmänhet mellan 0,05% och 11%. På basis av nummer, har dessa system karaktäriserats med polystyren partiklar12,15, kol nanopartiklar12och kiseldioxid partiklar42, ger effektivitetsvinster mellan 0,2% och 11%. PIVEC ger, liknande eller ökad, nedfall i jämförelse med tillgängliga cellulära exponering enheter.

Cell exponeringar utfördes med koppar nanopartiklar av 40 nm, 100 nm och 800 nm. Cellernas viabilitet definierades med LDH-analys med ingen signifikant minskning av lönsamhet inom fyra timmar efter exponering. LDH analysen användes med en kommersiell exponering system för 74 ng cm2 efter 2 timmar och 148 ng cm2 efter 4 timmars 9,2 nm koppar oxid partiklar44 och 1 µg/cm2 deponerats efter en sekventiell exponering 4 timmar, inkubation för 2 timmar, sedan en annan exponering för 4 timmars 25 nm koppar oxid partiklar40, både mäta signifikanta minskningar i cellernas viabilitet. Cytotoxicitet observerades i ett annat system för 1,6-7,6 µg/cm2 180 nm partiklar koppar nanopartiklar16 mätt av trypan blått färgämne utslagning. Exponeringar på 15 minuter till 40-80 nm koppar oxid nanopartiklar minskad lönsamhet, mätt 24 timmar efter exponering. Lägre toxicitet observerats med hjälp av PIVEC var sannolikt på grund av den kortare exponeringstiden på 10 minuter och kortare inlägg exponering mätning gånger. Efter fyra timmar efter exponering minskade viabiliteten hos celler som exponeras i PIVEC. Celler utsätts för fuktig luft kontroller observerades ingen signifikant cytotoxicitet, i samförstånd med andra studier 9,40,44,45,46. Oxidativ stress bestämdes med DCFH-DA-analys. Produktionen av reaktiva syreradikaler, till exempel väteperoxid eller syreradikaler, genererat en mängd stress som kan leda till tillväxt gripandet eller cell döden. Efter cell exponeringar fanns det en minimal ökning i oxidativ stress för celler förvaras i inkubatorn som kontroll och celler utsätts för fuktig luft. Förhöjd oxidativ stress uppstod för alla partikelstorlek, ökar inom 30 minuter efter exponering. I en studie, 9,2 nm kopparoxid partiklar44 och 25 nm kopparoxid partiklar inducerad40 också oxidativ stress mätt via karboxi-DCFH-DA analysen. Ökad exponeringstid från 2 timmar till 4 timmar förhöjda oxidativ stress för 9,2 nm kopparoxid partiklar44. Efter fyra timmars exponering, 9,2 nm koppar oxid partiklarna produceras ett liknande oxidativ svar som sekventiella exponeringen av 25 nm koppar oxid partiklar40, vilket tyder på att exponering varaktighet har en högre inverkan på oxidativ stress svar än partikelstorlek. Celler utsätts inom PIVEC producerade förhöjda oxidativ stress jämfört med att studera, men de partiklar som exponeras i det alternativa systemet är kopparoxid och löser sig mindre snabbt än koppar utsätts inom PIVEC. Studier utförda på upplösningen av koppar baserat på sammansättning och storlek av partiklar godkänner att större partiklar och metalloxider släppa joner långsammare än metallpartiklar eller deras nanopartiklar motsvarigheter16,47 , 48 , 49 som kontrollerna fuktiga luft inte gjorde producerar betydande mängder oxidativ stress jämfört med kontrollen inkubator, påverkan av koppar partiklar att inducera oxidativ stress är konsekvent inom PIVEC till liknande exponering för in vitro- system. De biologiska svar som observerades med hjälp av PIVEC tyder på att PIVEC är ett lämpligt system för cellulära exponering.

Även om karakterisering och cellulära studier av PIVEC håller väl med litteratur, har9,16,40,44,46 enheten begränsningar. De små designen minskar antalet prover som kan exponeras samtidigt inom en enda enhet i jämförelse med andra exponering system. Andra system möjliggör minst tre cellulära exponeringar till samma aerosol9,12 underlätta replikera mätningar. Även om PIVEC tillåter endast en infoga per system, möjliggör den lilla storleken flera system för att enkelt användas, hjälper till att mildra problemet. Medan andra personliga övervakningssystem inte använder celler, måste PIVEC hållas nära vertikala att minska spill cell kulturmassmedia nödvändigt att bevara cellulära livskraft. Även om PIVEC inte har ännu optimerats för specifika partikel spänner (e.g. PM10, PM2.5, PM0,1), har PIVEC präglats för en rad olika partikelstorlek. Liknar andra vinkelräta flödessystem, PIVEC visar en minskad förmåga att sätta in partiklar nära 100 nm i diameter, medan 40 nm och 800 nm partiklarna deponeras med liknande effektivitet.

Analys av celler efter exponering kan påskyndas genom att utföra en parallell samling av aerosoler inom PIVEC och en SKC 37 mm filter kassetten. En hög korrelation av gravimetrisk baserat nedfall tillåter för skattning av partikel massan insamlade på cellerna från data som samlats in med hjälp av 37 mm filter. Jämförelse av skäret i filter kassetten minskar behovet av att samla in ytterligare prover och ytterligare mätningar för att bestämma vilken DOS. Pågående arbete inkluderar integration av ett realtid övervakningssystem för cytotoxicitet, oxidativ stress eller andra biologiska endpoints. Den lilla storleken på PIVEC gör att den kan användas i en mängd olika inställningar, såsom på kroppen som en personlig monitor, på en drönare över en kemisk fabrik, eller ute i miljön för rumslig upplösning. Denna metod har visat att PIVEC för insamling av aerosolpartiklar på cellkulturer som odlas på ALI. Av luftkonditionering Aerosolen 37 ± 1 ° C och > 80% relativ luftfuktighet, kan cellulära livskraft upprätthållas under akuta exponeringar. Denna metod är lämplig för både flytande droplet och fasta partikel-baserade aerosoler och har visat att deponera partiklar mellan 40 nm och 800 nm i cell kultur skär. Mångsidigheten hos PIVEC tillåter denna metod som ska användas i flera inställningar med en mängd biologiska endpoints.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Anslutningen av författarna är som visas på försättsbladet. Författarna stöds ekonomiskt av Virginia Commonwealth University, där arbetet slutfördes i Richmond, VA. Författarna har ensamt ansvar för writing och innehållet i detta dokument. Författarna förklarar att det finns inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Boris Solomonov och Virginia Commonwealth Innovation maskinverkstaden för hjälp med prototyper enheten. Författarna vill även tacka Cristian Romero-Fuentes i gruppen Lewinski, Dr Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov och Virginia Commonwealth nanomaterial Core karakterisering anläggningen för deras hjälp med partikel karakterisering. Detta arbete stöds av start medel till Dr Lewinski från College of Engineering vid Virginia Commonwealth University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS) TSI, Inc. 3910 NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS) TSI, Inc. 3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long McMaster-Carr 4830K116 Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle McMaster-Carr 4112T12 Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long McMaster-Carr 7753K121 Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter GE Healthcare 09-744-12 HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator PISCO USA VCH10-018C
PIVEC VCU For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors Zefon International, Inc. 459743
Porous tubing Scientific Commodities, Inc. BB2062-1814A Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert Fisherbrand 353095 24 well plate insert
Filter Forceps Fisherbrand 09-753-50
Transfer Pipette ThermoScientific 13-711-27
Glass Fiber Filters SKC 225-7 Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance A&D BM-22 Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette SKC 225-3250 Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump SKC 220-5000TC AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1090 40 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1088 100 nm
Copper Particles U.S. Research Materials, Inc. US1117M 800 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61, (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3, (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013, (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51, (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26, (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10, (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31 (2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8 (2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97, (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20, (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 20 (2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514 (2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8, (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9, (1), 33 (2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103, (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36, (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19, (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 16 (2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41, (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47, (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27, (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26, (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29, (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206, (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9, (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5, (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5, (3), 389-399 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics