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인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

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Cancer Research

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Summary

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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Abstract

잘 알려진 포유류 P53 단백질이 효모 S. 세레비시아에서 전사 인자(TF)로서 작용할 수 있다는 사실은 1) 결합 부위의 영향을 연구하기 위해 상이한 기능성 검사의 개발을 허용하였다[즉, 반응 요소(RE)] P53 환동성 특이성 또는 2) TP53 돌연변이, 공동 발현 보조 인자, 또는 P53 환활성화 활성에 대한 소분자에 대한 서열 변이체. 다른 기본 및 번역 연구 응용 프로그램이 개발되었습니다. 실험적으로, 이러한 접근법은 효모 모델의 두 가지 주요 장점을 이용한다. 한편으로는, 게놈 편집의 용이성은 P53 의존의 서열 특이성을 조사하기 위하여 특정 P53-RE의 수준에서만 다른 이소제닉 긴장을 이용해서 정성적 또는 정량적인 리포터 시스템의 빠른 건설을 가능하게 합니다 트랜스 활성화. 한편, 이소성 P53 발현에 대한 조절 시스템의 가용성은 광범위한 단백질 발현에서 의 역활성화의 평가를 허용한다. 이 보고서에서 검토된 것은 컬러 리포터 유전자, luciferase 및 효모의 성장을 기반으로 하는 시스템을 광범위하게 사용하여 주요 방법론 단계를 설명하고 예측 능력을 비판적으로 평가합니다. 더욱이, 이러한 접근법의 극단적인 다양성은 TP53 유전자 가족의 다른 구성원인 P63 및 P73을 포함하여 다른 F를 연구하기 위하여 쉽게 이용될 수 있습니다.

Introduction

전사는 특정 자극에 응하여 염색질 지구에 RNA 중합효소의 모집 그리고 변조를 위한 전사 인자 (TFs) 및 공동 인자의 동적, 공간 및 시간적 조직을 관련시키는 매우 복잡한 프로세스입니다1 . 인간 P53 종양 억제제를 포함하는 대부분의 TFs는, 단일 (또는 다중) 독특한 모티브로 구성된 응답 요소 (REs)에게 불린 DNA 서열의 형태로 특정 시스 작용 요소를 인식합니다 ~6-10 뉴클레오티드 긴. 이러한 모티브 내에서, 개별 위치는 다양한정도의 가변성 2를 나타낼 수 있으며, 일반적으로 위치 중량 행렬(PWM) 또는 로고3,4로요약된다.

상기 효모 S. 세레비시아는 정형고효모 유전자가 존재하지 않는 경우에도 보완 성 검사, 자궁외 발현 및 기능성 관찰을 통해 인간 단백질의 다양한 측면을 연구하는 데 적합한 모델 시스템입니다5. 6개 , 7.전사 계통 8의 기저 성분의진화적 보존으로 인해 많은 인간 FFs(효모 세포에서 ectopically 발현시)는 프로모터를 통해 작용하여 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있습니다. 적절한 REs를 포함합니다. 인간 P53에 대해 여기에 제시된 전사 모델 시스템은 그 효과를 변조할 수 있는 세 가지 주요 변수를 특징으로 한다: 1) P53의 발현 및 유형의 양상, 2) P53 의존적 전사를 제어하는 RE 서열, 및 3) 리포터 유전자(그림1A).

P53 발현의 양상에 관하여, S. cerevisiae는 유도성, 억압적, 또는 구성적인프로모터의 선택을 허용한다 9,10,11. 특히, 유도성 GAL1 프로모터는 효모에서 TF의 기저(라피노스를 탄소원으로 사용) 또는 가변(매체 내의 갈락토의 양을 변화시킴으로써) 발현을 허용한다. 실제로, 미세조정가능한 발현은 P53 자체뿐만 아니라 다른 P53 패밀리 단백질12,13을연구하기 위한 중요한 발전을 나타낸다.

P53 의존식을 제어하는 R의 유형에 관해서는, S. cerevisiae그렇지 않으면 등소성 배경에 관심의 RE에 독특한 차이를 소유하는 다른 기자 균주의 건설을 할 수 있습니다. 이러한 목표는 델리토 페르페토12, 14, 15,16에서개발된 특히 다재다능한 게놈 편집 접근법의 적응을 이용하여 도달한다.

더욱이, 상이한 리포터 유전자(즉, URA3, HIS3 및 ADE2)는 S. cerevisiae에서인간 FF의 전사 활동을 질적 및 정량적으로 평가하는 데 사용될 수 있으며, 각각 특정 기능을 가지고 있을 수 있습니다. 실험적 필요에맞게 17,18,19,20,21. 이 리포터 유전자의 발현은 각각 우라실, 히스티딘 및 아데닌 프로토위트로피를 부여합니다. URA3 리포터는 5-FOA가 있는 세포의 성장을 허용하지 않으므로 역선택될 수 있습니다. ADE2 리포터 시스템은 영양 선택 외에도 야생형(즉, ADE2 발현에서 기능적) 또는 돌연변이(즉,ADE2에서 기능적이지 않음)를 발현하는 효모 세포를 식별할 수 있다는 장점이 있습니다. ) 식민지 색상에서 P53.

예를 들어, ADE2 유전자를 발현하는 효모 세포는 아데닌(2.5-5.0 mg/L)을 제한하는 플레이트에 보통 크기의 백색 식민지를 생성하는 반면, 제대로 또는 전사하지 않는 세포는 더 작은 빨간색(또는 분홍색)과 같은 플레이트에 나타납니다. 식민지. 이것은 아데닌 생합성 통로에 있는 중간의 축적 때문입니다 (즉, P-ribosylamino-imidazole, 이전에 는 아미노-이미다졸 리보티드 또는 AIR라고 불렸습니다), 이는 적색 안료를 형성하기 위하여 변환됩니다. 질적 색계 ADE2 리포터 유전자는 이후 양적 반딧불 Photinus pyralis (LUC1)12,22로대체되었다. 최근에는 ADE2 리포터가 lacZ 리포터와 결합하여 점수가 매편, 반정적, 이중 리포터 분석으로 P53 돌연변이체의 잔류 수준에 따라 하위 분류에 악용될 수 있습니다. 23.

EGFP (향상된 녹색 형광 단백질) 또는 DsRed (디스코소마 sp. 적색 형광 단백질)와 같은 형광 기자는 또한 가능한 모든 오센스 돌연변이와 관련된 트랜스 활성화 활성의 정량적 평가에 사용되어 왔다. TP53 코딩 시퀀스24. 마지막으로, RE 및/또는 리포터 유전자에 대해 다른 이소제닉 효모 균주와 P53 알레일 발현을 위한 튜닝 가능한 프로모터를 결합할 수 있는 기회는 암 관련 및 생식선의 정제된 분류를 생성하는 데이터 매트릭스의 발달로 이끌어 냈습니다. 돌연변이 P53 대두25,26,27.

전술한 접근법은 P53 단백질의 전사 활성을 측정하기 위해 사용된다. 그러나, 효모 S. 세레비시아28척수사카로마이스폼베(29)에서 야생형 P53의 발현은 세포주기 검거28,30 또는 세포주기와 연관된 성장 지연을 유발할 수 있다. 세포 죽음31. 두 경우 모두, 효모 성장 억제는 높은 P53 발현에 의해 유발되고 세포 성장에 관여하는 내인성 효모 유전자의 잠재적인 전사 변조와 상관관계가 있다. 이러한 가설을 뒷받침하는, 기능 상실 돌연변이P53 R273H는 야생형 P5332와유사한 수준으로 발현될 때 효모 세포 성장을 방해하지 않았다. 반대로, 독성 돌연변이P53 V122A(야생형 P53에 비해 전사 활성이 높은 것으로 공지)의 효모에서발현은 야생형 P5332보다더 강한 성장 억제 효과를 일으켰다.

부가적으로, 인간 MDM2는 효모에서 인간 P53 전사 활성을 억제할 수 있었고, 그 유비퀴틴화 및 후속 분해를 촉진할 수 있었다는 것을 입증하였다33. 이에 따라, 인간 MDM2 및 MDMX가 P53-유도 효모 성장억제를 억제하는 능력을 32,34로입증하였다. 추가 연구에서는, 효모32에있는 ACT1 유전자에 putative P53 RE 상류의 확인과 함께 P53 전사 활성 및 액틴 발현 수준 사이 상관관계가 확립되었다. 일관되게, 액틴 발현은 P53 V122A에 의해 야생형 P53 및 더욱 강화되었지만, 돌연변이 P53 R273H에 의해서는 아니었다. 반대로, P53에 의한 액틴 발현은 효모 성장 분석법에 기초한 결과와 일치하는 P53 억제제 MDM2, MDMX, 또는 피피테린 α(P53 전사 활성의 소분자 억제제)의 공존존재에서 감소하였다. 중요한 것은, 이러한 결과는 P53 유도 성장 억제와 효모에서의 활성 정도 사이의 상관 관계를 확립했으며, 이는 또한 P53 기능을 변조하는 소분자를 식별하고 연구하기 위해 악용되어 왔다28,34 , 35.

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Protocol

1. 특정 RE를 포함하는 ADE2 또는 LUC1 기자 효모 균주의 건설 (yAFM-RE 또는 yLFM-RE)

  1. 줄무늬 yAFM-ICORE 또는 yLFM-ICORE 균주12,14 (ICORE = I, GAL1 프로모터하에서 의 ISce-I 엔도너렐리스; CO = 카운터 선택 우라3; RE = 카나마이신 저항을 수여하는 KanMX4 리포터; 1) YPDA 한천 플레이트상에 -80°C에 보관된 15%글리세롤 스톡으로부터(표 2). 30 °C에서 2-3 일 동안 자랍니다.
  2. 신선한 접시에서 효모 콜로니 1개를 꺼내 (3주 이상 된 것) YPDA 5 mL을 함유한 작은 플라스크에 놓습니다(표 2). 밤새 30°C에서 배양하고, 150-200 rpm에서 흔들어.
  3. 다음 날, 덱스트로스의 모든 흔적을 제거하기 위해, 3,000 x g에서 2 분 동안 세포를 펠렛하고 튜브의 반전으로 상판을 버립니다.
    참고: 실온(RT)에서 이 프로토콜의 모든 원심분리를 수행합니다.
  4. 갈락토제(표 2)를 함유하는 30-50 mL의 미리 온난한 CM(complete media)에서 세포 펠릿을 재중단하고 30°C에서 4시간 동안 배양하고 150-200 rpm에서 흔들어 (I-SceI의 유도에 필요함).
  5. 3,000 x g에서 2 분 동안 세포를 원심 분리하고 튜브의 반전으로 상판을 버립니다.
  6. 30-50 mL의 멸균수에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 1.5단계를 반복합니다.
  7. 멸균수 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 1.5단계를 반복합니다.
  8. DNA 섭취를 선호하는 이온 용액인 멸균LiAcTE(표 3)의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 1.5단계를 반복합니다.
  9. 멸균 LiAcTE의 250 μL에 있는 세포 펠릿을 다시 중단하고 1.5 mL 관으로 세포를 전송합니다. 1.5단계를 반복하고 300-500 μL의 멸균 LiAcTE에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
  10. 세차하는 동안, 100 °C에서 10 분 동안 연어 정자 DNA 캐리어의 10 mg / mL 용액을 변성시키고 얼음에 즉시 식혀 단일 가닥 DNA로 유지하십시오.
  11. 별도의 1.5 mL 튜브에 원하는 올리고뉴클레오티드 500 피코몰을 첨가 (표3),삶은 연어 정자 DNA의 5 μL, 300 μL의 멸균 LiAcTE PEG (표3),및 효모 세포 현탁액의 50 μL (단계 1.9에서).
  12. 10s의 튜브를 30°C에서 30분 동안 혼합하고 배양하고, 150-200 rpm에서 흔들어. 1.5 mL 튜브를 옆으로 놓아 흔들림을 선호합니다.
  13. 가열 블록에서 42 °C에서 15 분 동안 효모 세포를 가열 한 다음 10,000 xg에서 20 s의 세포를 원심 분리합니다. 상급물을 제거하고 멸균수 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
  14. YPDA 한천 플레이트에 세포 현탁액의 100 μL을 퍼뜨리고 30°C에서 1일 동안 배양(거꾸로)한다. 잘 분리 된 식민지를 얻으려면 1 :10 희석의 100 μL을 퍼뜨리는 것입니다.
  15. 다음날, 덱스트로오스와 5-FOA를 함유한 CM 한천 플레이트에 멸균 벨벳을 사용한 복제판(표 2). 많은 세포가 옮겨지는 경우 새로운 플레이트상에 제2 복제판을 고려한다(즉, URA3 세포의 일부 성장).
  16. 3일 후, G418(카나마이신과 유사한 아미노글리코시드 항생제)을 함유하는 비선택적 YPDA 및 YPDA 상에 복제판(표 2)을 표시하여, 그들의 후속 비교를 용이하게 하기 위해 각 플레이트를 표시하였다. 플레이트를 30°C에서 밤새 배양합니다.
  17. 다음 날, G418 민감하지만 YPDA 플레이트(예: yLFM- 또는 yAFM-RE 콜로니)에서 성장하는 콜로니로부터 후보 리포터 균주를 식별한다. 확인된 콜로니(3-6 콜로니)를 새로운 YPDA 플레이트상에 연속하여 단일 콜로니 분리를 얻고 30°C에서 2일 동안 자랍니다.
  18. 추가 분석을 위해 식민지를 격리하기 위해 YPDA 플레이트에 단일 효모 식민지를 패치하십시오. 30°C에서 24시간 후, 몸집이 작은 돌연변이(즉, 호흡기결핍 돌연변이)의 성장을 방지하는 YPGA 한천 플레이트(표 2)에 복제도금으로 시험한다. 동시에, 새로운 YPDA 한천 접시에 복제 판.
  19. 콜로니 PCR에 의한 올바른 올리고뉴클레오티드 통합의 존재에 대해 1.18단계에서 올바른 패치(즉, YPDA 및 YPGA 한천 플레이트의 성장, 1-3콜로니)를 테스트합니다. 10x PCR 버퍼(1.5 mM MgCl2),2 μL 의 10 피코몰/μL 프라이머(표3),2.5 mM dNTP의 4 μL, 5 U/μL Taq 폴리머라제의 0.25μL, 50 μL의 최종 부피에 물을 추가하여 반응 혼합물을 조립한다. 각 PCR 튜브내로 50 μL의 양치질이 필요한 효모 콜로니의 수에 대한 반응 혼합을 곱한다. 파이펫을 사용하여, YPDA 한천 플레이트에서 아주 적은 양의 효모 세포를 단일 PCR 반응 혼합물에 첨가한다.
  20. 다음 프로그램과 함께 PCR 반응을 수행: 94°C 8분 동안 94°C, 94°C에서 1분 동안 35사이클의 변성, 55°C에서 1분 동안 어닐링, 72°C에서 2분 동안 연장.
  21. 반응이 완료된 후, 아가로즈 겔에 PCR 반응(부피의 약 1/10)을 적재하여 정확한 크기(~500 bp)를 확인합니다.
  22. PCR 생성물을 상용 키트로 정제한 후 동일한 단계 1.19를 사용하여 원하는 RE 서열의 통합을 확인한다.
  23. 올바른 서열의 유효성 검사 후, yAFM-RE 또는 yLFM-RE 균주 배양(YPDA)의 15% 글리세롤 스톡을 만들어 -80°C에 저장한다.

2. 질적 색계 ADE2 효모 분석기준을 이용한 P53 단백질 환활성화 능력 평가

  1. yAFM-RE 스트레인을 사용하여 1.1 단계및 1.2단계를 반복합니다(표 1).
  2. 다음날, 미리 온난한 YPDA의 30-50 mL에서 세포 배양물(1:10)을 희석하고 OD600nm가 0.8-1.0(~2시간)에 도달할 때까지 흔들어 30°C에서 계속 배양한다.
  3. 1.5-1.10 단계를 반복합니다.
  4. 별도의 1.5 mL 튜브에 효모 P53 (또는 제어) 발현 벡터 (표4), 삶은 연어 정자 DNA 담체의 5 μL, 멸균 LiAcTE PEG 300 μL, 효모 세포 현탁액 50 μL을 추가합니다.
  5. 1.12 단계 와 1.13 단계를 반복하지만 멸균 수의 300 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
  6. 덱스트로를 함유하는 합성 선택적(P53 발현 또는 대조벡터용) 플레이트상에 100 μL의 세포 현탁액을 탄소 공급원및 고량의 아데닌(표 2)으로 확산한 다음, 2-3일 동안 30°C에서 배양(거꾸로)한다.
  7. 새로운 선택적 플레이트에 단일 효모 형질전환 콜로니 (플레이트 당 2-6 줄무늬)를 연속하고 30 °C에서 하룻밤 자라게하십시오.
  8. 그 다음 날, 멸균 벨벳 복제판을 사용하여 색 표현형(즉, 덱스트로오스를 탄소원으로 함유하지만 아데닌의 양을 제한하는 플레이트)의 평가를 허용하는 새로운 선택적 플레이트에; 2). 플레이트를 30°C에서 3일 동안 거꾸로 배양합니다. 선택적으로, P53 단백질의 온도 민감도를 평가하기 위해, 3일 동안 3개의 상이한 온도에서 배양한다: 24°C, 30°C, 및 37°C.
    참고: 동일한 줄무늬를 여러 번 복제할 수 있습니다.
  9. P53 단백질 과분활성화 능력을 평가하기 위해 효모 콜로니의 색상 기반 표현형을 확인하고 P53 야생형 및 빈 벡터 표현형에 대하여 P53 단백질 표현형을 비교한다.

3. 정량발광기반 LUC1 효모 분석기를 이용한 P53 단백질 환동성 능력 평가

  1. 프로토콜 2에 기재된 LiAc 기반 방법을사용하여 P53(또는 대조군) 발현 벡터(표 4)로 효모 세포를 변형시킨다. yLFM-RE 스트레인을 사용하십시오(표1).
  2. 탄소 공급원으로서 포도당을 함유하는 다량의 아데닌을 가진 새로운 선택적 플레이트상에 단일 형질전환제를 패치하고 밤새 30°C에서 성장하게 하였다. 각 변환 유형에 대해 5-7개의 다른 패치를 만듭니다.
  3. 하룻밤 성장 후, 탄소 공급원으로서 덱스트로스 또는 라피노스를 함유하는 합성 선택적 배지에서 플레이트로부터 멸균 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 소량의 효모 세포를 재중단(투명한 96웰 플레이트에 최종 부피, 원형으로 또는 평평한 바닥). 실험에 유도가능한 P53 발현이 필요한 경우, 라피노스 배지에 갈락토스를 추가하여 유도수준을 조절한다(표 2).
    참고: 이러한 셀 현탁액은 약 0.4의 OD600nm를 가져야 하며 1보다 높지 않아야 합니다.
  4. 멀티 라벨 플레이트 리더를 사용하여 유도 가능한 P53 발현 후 OD600nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다(30°C에서 4-8시간 및 150-200 rpm 흔들림). 셀 현탁액이 각 웰을 멀티채널 파이펫과 혼합하여 균일한지 확인합니다.
  5. 투명한 96 웰 플레이트로부터 10-20 μL의 세포 현탁액을 백색 384(또는 96) 웰 플레이트로 옮기고 용해 완충액의 동일한 부피(10-20 μL)와 혼합한다. RT에서 10-15 분 동안 인큐베이션을 셰이커 (150-200 rpm)에 하여 루시퍼라아제 기판에 세포의 투과율을 달성합니다.
  6. 반딧불 루시퍼라아제 기판 10-20 μL을 추가하고 다중 라벨 플레이트 리더로 광 단위(LU)를 측정합니다.
  7. P53 단백질 환활성화 능력을 결정하기 위해, 각각의 LU를 상응하는 OD600nm(상대광 단위, RLU)로 정규화한다. 효모 변형 식민지의 3-4 패치에서 평균 RLU 및 표준 편차를 계산합니다.
  8. P53 야생형 및 빈 벡터에 대하여 P53 단백질 과역 데이터를 비교하거나, 빈 벡터로 얻어진 값을 빼거나 빈 벡터로 얻은 값으로 나누어(즉, 유도의 계산 폴드)로 나눈다.
    참고: P53 환활성화 활성은 또한 P53-상호 작용 단백질(즉, MDM2 및 MDMX) 및/또는 약물 치료를 포함하는 동일한 실험 적 설정을 사용하여 평가될 수 있다.

4. 효모 자형형 분석기준을 이용한 P53 단백질 성장 억제 평가

  1. 섹션 2에 기재된 LiAc 기반 방법을 사용하여 P53/MDM2/MDMX(또는 제어) 발현 벡터(표 4)로 효모 세포를 변형시킵니다. CG379 스트레인(표 1)을 사용하고 최소한의 선택플레이트에 효모 형질전환제를 퍼뜨리다(표2).
  2. 최소 선택적 배지(표 2)에서 형질전환된 세포를 약 1OD600nm로성장시킨다.
  3. 효모 세포를 선택적 유도 배지에서 0.05 OD600nm로 희석(표2)및 선택적으로, 선택된 소분자를 적절한 농도(또는 용매만)에 첨가하여 돌연변이 P53을 재활성화하거나 MDM2를 억제하는 데 그 효능을 시험한다. /MDMX-P53 상호 작용.
  4. 30°C에서 연속 궤도 흔들림(200 rpm)에서 약 42시간 동안 배양세포(음극 대조 효모가 중간 로그 상에 도달하는 데 필요한 시간, 약 0.45 OD600nm).
  5. 최소 선택플레이트 상에 효모 세포 배양물의 100μL aliquots를 발견한다(표 2).
  6. 30 °C에서 2 일 동안 배양하십시오.
  7. 100 μL 배양 방울(콜로니 형성 단위, CFU 카운트)에서 얻어진 콜로니의 수를 계수하여 효모 성장을 측정하였다. 예를 들어, 효모를 최대 가능한 효과로 표현하는 야생형 P53의 성장을 고려한 화합물의 돌연변이 재활성화 효과를 계산하는 한편, 돌연변이 P53을 발현하는 세포의 성장(그러나 용매 조절에 노출됨)을 나타낸다. 0 단계의 재활성화를 말합니다.

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Representative Results

의 건설 ADE2 또는 LUC1 리포터 효모 균주

델리토 퍼페토접근법12,14,15,16은 P53 리포터 효모 균주의 시공을 가능하게 하도록 적응되었다(도1B). 이 방법은 양단에, 적어도 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 선택된 통합 궤적에 동봉한다. 구체적으로, 상동성은 이전에 위치된 KlURA3kanMX4(유전학, G418에 대한 저항성을 제공하는 리포터 유전자)를 포함하는 이중 마커 카세트 ICORE의 통합 부위측면에 대응하는 서열에 해당한다. 원하는 대상 사이트15,16. 이러한 카세트는 또한 유도성 GAL1 프로모터 및 그의 동족 표적 부위 하에서 효모 I-SceI 엔도누슬리스 코딩 서열을 함유한다. 따라서, 원하는 서열을 가진 효모 세포의 형질전환 직전에 갈락토제 함유 배지의 스위치는 I-SceI 발현 및 ICORE 통합 부위에서 단일 이중 가닥 브레이크(DSB)의 생성을 초래한다. DSB의 존재는 단일 변환으로 1,000개 이상의 교체를 통해 타겟팅 이벤트의 빈도를 매우 자극합니다.

5-FOA에 대한 획득 저항과 G418에 대한 민감도에 기초한 타겟팅 및 선택 과정의 끝에서, 후보 클론은 변형된 궤적 및 Sanger 시퀀싱의 콜로니 PCR 기반 증폭에 의해 확인되어 정확한 통합을 검증합니다. 원하는 P53RE (그림 1C). 약 1주일 만에 완료될 수 있는 변형 시공 프로토콜의 끝에서, REs의 순서의 차이가 P53의 환활성화 용량에 미치는 영향을 평가하는데 사용될 수 있는 이소제닉 리포터 효모 균주의 패널이 얻어진다. 단백질.

기능적으로 이기종 돌연변이 P53s

인간 종양에서, TP53 유전자는 P53 단백질의 중앙 DNA 결합 도메인(DBD)에 위치한 6개의 주요 핫스팟 잔기(R175, G245, R248, R249, R273 및 R282)를 수반하는 단일 오센스 돌연변이에 의해 주로 영향을 받습니다. 그러나, 2,000개 이상의 단일 P53 아미노산 치환이 기록되었으며, 그 중일부는 드물게 관찰되는 27개이다. 돌연변이 P53s는 DNA-단백질 접촉(예를 들어, R273H) 또는 단백질 구조(예를 들어, R175H)에 대한 아미노산 치환의 영향에 따라 DNA 접촉 또는구조적 돌연변이체로서 분류될 수 있다(36). 단일 TP53 오센스 돌연변이는 P53 기능에 영향을 미치며, 종양 공격성, 화학 저항성 및 전이성 전위37과 같은 중요한 임상 적 특징에 영향을 미칠 수있는 광범위한 기능적 다양성을 생성합니다. 38세 , 39.

돌연변이 P53이 기능적으로 이질적이라는 개념은 TP53 돌연변이 데이터베이스(예를 들어, )에서 사용할 수 있는 대량의 실험 데이터를 통해지난 15년 동안 명백하게 나타났다. 효모 및/또는 포유류 리포터 시스템에 기초한 다른 기능분석제가 개발되어 돌연변이P53s의 상이한 성질(즉, 트랜스활성화, 온도 민감도, 지배적-음성 전위, 간섭과의 간섭)을 강조하고 있다. P53 가족 및 다른 TFS와의 상호 작용)13,24,40,41,42,43,44. 가장 포괄적인 기능적 연구는 8개의 다른 P53 REs24를향해 그들의 transactivation 활동을 특성화하여 효모 기지를 둔 분석에서 2,300개 이상의 돌연변이를 조사했습니다.

데이터는 핫스팟 잔류물을 포함하는 거의 모든 돌연변이 P53s가 기능 상실(즉, 완전히 환활성화 활성을 잃었다)임을 확인하였다. 반대로, P53 단백질의 다른 위치에 부딪히고 일반적으로 암45에서 중간 에서 낮은 주파수에서 발견되는 돌연변이 P53은 P53 REs13에서일정 수준의 트랜스 활성화 활성을 유지하는 부분 기능 돌연변이체입니다. 도 17.기재된 P53 단백질 기능적 이질성을 연구하기 위해 ADE2 분석기를 사용하는 예는 도 2A에제시되어 있다. 실제로, R175H는 테스트된 모든 조건에서 적색 콜로니를 생성하는 기능 상실 돌연변이체인 반면, R282W는 갈락토제 의존적 P53 발현(즉, P21-5'RE 균주에서 37°C에서 적색 섹터)을 사용하여 더 분명한 온도 민감도를 보였다. 더 높은 갈락토제 판에 분홍색이되는 낮은 갈락토스를 포함하는 플레이트). 도 2B는 P53 돌연변이체 및 리포터 균주의 확장된 패널에 대한 결과 요약을 제시한다.

이러한 P53 기능적 이질성의 존재는 TP53 생식선 돌연변이를 가진 피험자의 임상 수준에서 관찰된 이질성과 평행한지 의의 탐구를 촉발시켰다. TP53 생식선 돌연변이는 더 가혹한 Li-Fraumeni (LFS) 및 Li-Fraumeni 같이 (LFL) 증후군을 포함하여 암 소인 무질서의 단의 분자 기초를 기초로 하고, 및 (FH) 또는 (FH 없음) 가족 역사없이 46.

이 프로토콜은 모든 TP53 생식선 돌연변이 대문자의 효모 분석 기반 트랜스활성화 능력을 IARC 데이터베이스의 해당 임상 데이터와 일치시킴으로써 유전자형-표현형 상관관계를 강조했다.http://www-p53.iarc.fr/Germline.html>. 기능 상실 P53 돌연변이는 더 가혹한 암 경향 증후군에서 찾아냈습니다, 부분적인 기능 P53 돌연변이는 보다 적게 가혹한 암 경향 조건에서 찾아낸 동안. 이는 P53 잔류 성 전환 능력이 TP53 돌연변이를 상속하고 암25,26을개발한 환자에서 임상 표현형에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

REs 내의 뉴클레오티드 서열 변이는 P53을 지배합니다. 트랜스활성화 가능성

인간 P53은 테트라메릭(디머의 디머) TF이다. 각각의 P53 디머는 10개의 뉴클레오티드(RRRCWWGYYY, R=A 또는 G)로 구성된 RE를 인식한다; W = A 또는 T; Y = C 또는 T)47,48. 이러한 2개의 반-부위는 기능성 P53 RE를 구성하는 최대 13-20개의 뉴클레오티드에 의해 인접하거나 이격될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 스페이서를 가진 P53 REs는 스페이서49,50,다양한 시스템에서 상이한 기능성 세포에서 P53 REs보다 낮은 P53 선호도 및 트랜스활성화를 특징으로 한다.

그것은 최근에 반 사이트가 기능적인 분석실험 및 염색질 면역 침전 연구 결과와 더불어 hemi구체적으로결합되는P53 tetramers를 모집할 수 있다는 것을, 이 사실 인정은 P53가 또한 비 표준 적인 REs에서 작동할 수 있다는 것을 표시했습니다, 반 사이트 및 3 분기 사이트48,52로구성. 더욱이, 전체 컨센서스 P53 RE 모티프가 매우 퇴화(RRRCWWGYY)2라는 사실은 개별 REs가 서열및 결합 친화도에서 실질적으로 다를 수 있다는 가능성을 예시한다. 수백 개의 P53 표적 유전자가 인간 게놈41,48에서확인되었다는 것을 고려하면, 사실상 모든 P53 REs는 서로 비동일서열로 나타났다. 더욱이, 뚜렷한 DNA 결합 친화도를 가진 REs가 세포 주기 체포 또는 세포사멸53에관여하는 P53 표적 유전자의 프로모터에서 선택된다는 가설이 있다.

일정한 게놈 위치에서 P53 RE의 많은 변이체의 효모에서의 분석은 뉴클레오티드 변이체, 스페이서 및 RE 반부위의 조직에 대한 영향을 환활성화 용량49에확립했다. 그것은 심지어 P5314,54,55에관련 프로모터의 반응성이 현저하게 다른 두 개의 대두를 가진 다형성 P53 REs의 발견으로 이끌어 냈습니다. 최근, P53 RE 시퀀스 기능 및 효모 기반 의 트랜스 활성화 전위로부터 파생된 정보는 p53 리트리버에 코딩되어 있으며, 이들의 에 따라 표준 및 비표준 REs를 지역화하고 순위를 매길 수 있는 패턴 검색 알고리즘입니다. 전체 인간 게놈52에걸쳐 예측된 트랜스활성화 전위.

서열 특이적 P53 환활성화 전위를 연구하기 위해 분석기를 사용하는 예로서, 여기에 제시된 것은 인간 야생형 P53과 케노하브디티스 예쁜꼬마선충으로부터의 진화적 원거리 P53 단백질 간의 비교이다(도 3). 이러한 결과는 P53 단백질 중 의 일시 적 특이성의 진화적 발산이56을탐구한 최근 연구의 후속이다. 이소제닉 yLFM-RE 리포터 균주는 프로토콜에 기재된 바와 같이 개발되었다. 구체적으로, ced13 유전자57에서유래된 Cep-1 P53 RE를 비교하였고, 4개의 변이체(V1-V4)를 비교하였다(도3A). RE 변이체는 두 개의 decameric 모티프를 분리하는 스페이서의 길이의 변화 (ced13, 28 뉴클레오티드)의 변화를 검사하고 CWWG 코어 모티프 (ced13에서 A / T가 풍부함)를 측면에 있는 뉴클레오티드의 변화를 검사하기 위해 구성되었습니다. 가장 높은 친화력 인간 P53 REs에있는 동안, G / C 리치)58. 결과는 Cep1 및 인간 P53이 환활성화 특이성 측면에서 어떻게 발산되는지 명확하게 보여줍니다. 실제로, 인간 P53 매개 트랜스활성화는 스페이서의 존재에 의해 강하게 억제되는 반면(도3B),Cep-1 활성은 스페이서의 제거에 의해 억제된다(도3C). 또한 Cep-1 매개 환전환은 RE가 A/T-에서 G/C-리치로 수정될 때 폐지됩니다. 인간 P53이나 Cep-1은 ced13 RE로부터 유래된 단일 디메나로부터 트랜스활성화할 수 없다.

P53-MDM2/MDMX 상호 작용 및 돌연변이 P53 활성의 반응기의 소분자 파괴자 검색

인간 P53의 성장 억제 효과와 효모에서의 활성 정도 사이의 확립된 상관관계는 효모 세포 성장의 측정에 기초한 단순화된 스크리닝 분석으로 이끌려 P53 활성에 대한 간섭 인자의 영향을 분석하였다(그림4 ). 잠재적인 항암제에 대한 스크리핑하는 효모 자형시 분석법의 효과는 여러 작품에서 입증되었다. P53 및 그 억제제 MDM2 및/또는 MDMX를 공동 발현하는 효모 세포를 사용하여, 이러한 상호 작용의 새로운 파괴자는 P53에 대한 MDM의 부정적인 영향을 억제하는 능력에 의해 확인되었으며, 따라서 야생 형 P53 유도 효모 성장 억제를 재확립 ( 그림4A). 특히, 이러한 분석은 1) 피라녹산톤 1을 제1 P53-MDM2 상호작용 억제제로서 크산톤 스캐폴드(34) 및 2) P53-MDM2 상호작용(59)의 옥솔로이소인돌리온 억제제의 발견으로 이끌었다. 부가적으로, 이러한 분석으로, α-망고스틴 및 감보염은 P53-MDM2 상호작용30의잠재적 억제제로서 처음으로 기술되었다.

나중에, 동일한 분석은 chalcones의 prenylation가 P53-MDM2 상호 작용60을방해하는 그들의 능력을 향상했다는 것을 보여주었습니다. 흥미롭게도, 이 효모 분석또한 P53-MDM2/MDMX 상호작용의 2개의 억제제의 발견으로 이끌어 냈습니다: 트립토파놀 유래 옥사졸로피리돈 OXAZ-161 및 트립토파놀 유래 옥사졸로이소인돌리돈 DIMP53-162.

효모 세포 성장에 대한 기능 상실 돌연변이 P53의 감소된 영향은 또한 돌연변이 P53-반응성 약물을 위해 스크리닝하기 위해 탐구되었으며, 돌연변이 P53에 야생형성장 억제 활성을 회복시키는 능력을 특징으로 한다(도 4B). 이러한 효모 분석으로, 돌연변이P53 R280K의 반응기, 에난티오퓨어 트립토파놀 유래 옥사졸라이소인돌리노넨 SLMP53-163을확인하였습니다. 도 4C,D는 P53-MDM2 상호작용 Nutlin-3a의 억제제 또는 P53 돌연변이Y220C PhiKan083의 반응기와 함께 P53또는 치료제의 발현과 함께 효모에서 얻어진 대표적인 결과를 나타낸다.

인간 종양 세포주34,60,61,62,63에서 P53 활성화 제뿐만 아니라 항종양 활성으로 이들 화합물의 분자 작용 기전의 검증 및 동물 모델62,63,약물 발견에서 효모 phenotypic 분석의 큰 잠재력을 증명한다.

Figure 1
그림 1 : 효모 기반 P53 트랜스 활성화 어세 및 P53 리포터 효모 균주의 시공을 위한 워크플로우의 특징. (A) 게놈 조작의 용이성 및 통제된 이소성 유전자 발현은 P53 환활성화 기능을 검사하기 위하여 관련있는 몇몇 변수가 엄격하게 탐구되는 "생체 내 시험관"에 유사한 효모를 렌더링합니다. 이러한 변수는 야생형 또는 돌연변이 P53 단백질의 발현 수준, RE의 서열, 및 리포터 유전자의 유형 [정성적/반정적(예를 들어, ADE2LACZ)또는 정량적(예를 들어, LUC1)]을 포함한다. 컨센서스 RE 서열은 고도로 퇴화된다(RE = RRRCWWGYY-n-RRRCWWGYY; R = 퓨린; W = A/T; Y = 피리미딘; CWWG = 코어 시퀀스, n = 0-13 bps 스페이서). 합의, CORE 시퀀스 및 염기 쌍 스페이서의 수에 대한 불일치의 수는 트랜스 활성화 활동에 영향을 미칠 것이다. 이 패널은 이전 발행물64에서수정되었습니다. (b) 델리토 퍼페토 접근법의 계획은 ADE2 또는 LUC1 리포터 유전자 발현을 구동하는 최소한의 프로모터의 원하는 P53 RE 상류를 도입한다. 프로토콜은 이전 간행물12,15,16에서적응되었습니다. (c) 올리고 RE 통합 부위를 둘러싼 영역의 효모 콜로니 PCR 증폭의 결과의 예. 전기 영동의 이미지는 1 kb DNA 사다리 (Promega) 옆에 대응하는 PCR 음성 대조군과 함께 두 개의 가설 양성 콜로니 (URA3 마이너스 및 G418 민감성)의 증폭 결과를 제시합니다. 3에 기재된 프라이머를 사용하여 예상되는 ~500 nt 대역은 일렉트로로그램에 도시된 바와 같이 올바른 프로모터 편집을 확인하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : P53 단백질은 RE 특이적 및 온도 민감성 환활성화 전위를 보여줍니다. 야생형 P53 및 지시된 TP53 오센스 돌연변이는 ADE2 유전자 발현을 조절하는 상이한 P53 REs를 수용하는 효모 및 이용 리포터 균주를 이용한 정성적 색 기반 리포터 분석실험을 사용하여 시험하였다. (a) 30°C 및 37°C에서 PUMA(BBC3) 및 P21-5' REs를 가진 P53 야생형, R175H 및 R282W에 대한 콜로니 색상 표현형의 예가 도시된다. 보통(0.008% 갈락토제) 및 높은(0.12% 갈락토제) P53 발현을 비교한다. (B) P53 돌연변이체 및 효모 리포터 균주의 확장 세트를 3온도(24°C, 30°C 및 37°C)에서 P53 의존콜로니식 색 표현형을 검사한 결과. 결과는 돌연변이 P53 둘레의 기능적 이질성을 예시하고 테이블 형식으로 요약된다. 예를 들어, R175H는 기능 상실 돌연변이이며 G199H는 야생 형 P53과 유사합니다. K139E 및 R282W는 부분 기능을 유지하고 각각 냉간 감도와 열 민감도를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : 인간 P53 및 신용 직교 Cep-1 전시 매우 발산 된 환활성화 특이성. (a) 서열: 인간 P53 RE 컨센서스 서열, ced13 유전자로부터 유래된 Cep-1 P53 RE, 및 기능성 실험에서 시험된 4개의 변이체(V1-V4). (B) 트랜스활성화는 3개의 상이한 탄소원을 사용하여 8시간 동안 인간 P53 발현을 유도한 후 저, 중등도 및 고발현(0.008%, 0.032%, 0.12% 갈락토제 2% 라피노스를 함유하는 선택적 배지에 첨가)을 달성하도록 유도하였다. 결과는 평균 상대 광단위(RLU) 및 4개의 복제의 표준 오차로 표현됩니다. 빈 발현 벡터로 형질전환된 셀에 대한 리포터 활성을 빼냈다. (C) (B)에서 측정된 Cep1의 환활성화 특이성. 두 단백질의 경우, 환활성화 수준은 갈락토제의 양에 비례했다. 인간 P53이 발현될 때 측정된 더 높은 광 단위는 단백질 길이의 차이와 잠재적으로 코돈 사용의 차이로 인해 생성된 단백질 량의 상이한 수준에 의존할 수 있습니다. 두 단백질은 시험된 상이한 REs를 향한 상이한 트랜스활성화 특이성을 특징으로 하며, 이 성질은 상대단백질량의 가능한 차이에 의해 영향을 받지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : 효모 자노티픽 분석법을 사용하여 확인된 P53의 소분자 활성제. (a) 인간 야생형 P53 및 MDM2 또는 MDMX를 공동 발현하는 효모 세포는 P53-MDM2 및 P53-MDMX 상호작용의 억제제들을 검색하는데 사용되어 왔다. 이 시스템에서, 상호작용 억제제는 P53 및 MDM2 또는 MDMX를 공동 발현하는 효모 세포에서 P53 유도 효모 성장 억제를 복원한다. 이러한 접근법은 P53-MDM2 상호작용의 억제제의 식별 및 P53-MDM2 및 P53-MDMX 상호작용의 이중 억제제의 식별을 허용했다. (b) 인간 돌연변이P53을 발현하는 효모 세포는 돌연변이 P53 반응기를 검색하는데 사용되어 왔으며, 돌연변이 P53 발현 효모 세포에서 야생형 P53-유도 효모 성장 억제를 복원할 수 있다. (c) 플레이트 스팟 분석법의 대표적인 이미지는 빈 벡터에 비해 효모 콜로니 성장에 대한 야생형 P53 또는 돌연변이 Y220C의 영향을 나타낸다(단계 4.5 참조). (d) 성장 분석법의 정량적 결과: 10 μM Nutlin-3a는 MDM2를 공동 발현하는 세포에서 P53 유도 효모 성장 억제를 복원; 50 μM PhiKan083은 돌연변이 P53 Y220C에 야생형 P53 유도 효모 성장 억제를 회복시다. 두 효과 모두 야생형 P53의 효모 성장 억제 효과에 대하여 플롯되어, 이는 하나로 설정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

변형기 이름 및 유전자형 특정 용도 프로토콜 번호
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; 아이코어::pCyc1::ADE2 yAFM-RE 균주의 시공에 사용된다(MATaleu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1:ADE2)정성적, 색상 기반 ADE2 분석에서 악용됩니다. 프로토콜 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; 아이코어::pCyc1:LUC1 yLFM-RE 균주의 시공에 사용된다(MATaleu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1)정량발광 기반 LUC1 분석에서 악용된다. 프로토콜 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [킬-O] 그것은 자형성 성장 분석에 사용됩니다. 프로토콜 4

표 1: 효모 균주.

미디어 이름 및 레시피 특정 용도 프로토콜 번호
YPDA (2% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로스, 200 mg/L 아데닌) + 2% 한천 한천이 없는 YPDA는 여과에 의해 바람직하게는 살균된다. YPDA + 한천은 오토클레이브에 의해 멸균된다; 접시를 붓기 전에 조리법에서 덱스트로오스를 생략하고 20 % 필터 멸균 용액에서 덱스트로오스를 첨가 할 수 있습니다. 프로토콜 1-4
CM [0.17% 효모 질소 베이스 없이 AA 와 황산 암모늄, 0.5% 황산 암모늄, 5% (볼륨/볼륨, v/v) 비필수 아미노산 용액, 20 mg/L 히스티딘, 20 mg/L 트립토판, 20 mg/L 우라실, 30 mg/L 리신, 100 mg/L 류신, 200 mg/L 아데닌] 2% 갈락토제 미디어는 필터링에 의해 살균됩니다. 다음의 멸균 스톡 용액은 물(우라실 제외, 0.1M NaOH에 용해되는 경우 제외)을 여과하여 제조됩니다: 비필수 아미노산 용액(0.04% 아르기닌, 0.04% 메티오닌, 0.06% 이솔루신, 0.1% 페닐알라닌, 0.2% 글루도암 산, 0.2% 아스파르트산, 0.3% 발린, 0.4% 스레오닌, 0.8% 세린), 1% 히스티딘, 1% 트립토판, 1% 우라실, 1% 리신, 1% 류신, 0.5% 아데닌, 20% 갈락토오스. 아데닌 스톡 용액은 결정의 형성과 침전으로 인해 냉장고에 보관되어서는 안됩니다. 트립토판 재고 솔루션 어둠 속에서 저장 해야 합니다. 프로토콜 1
CM (위 참조) + 덱스트로스 2 % + 1g / L 5-FOA + 2 % 한천 매체 (AA와 황산 암모늄, 황산 암모늄 과 한천없이 효모 질소 염기 포함) 오토 클레이브에 의해 살균된다. 다른 구성 요소는 열 불안정 성분을 보존하기 위해 오토 클레이브 후 추가됩니다; 5-FOA 분말은 약 55°C로 냉각되면 미디어에 직접 첨가할 수 있습니다. 프로토콜 1
YPDA + 400 μg/mL G418 + 한천 2% 용지가 약 55°C로 냉각되면 오토클레이브 후 G418을 추가해야 합니다. 분말에서 시작하는 경우, 50 mg / mL G418 재고 용액은 물에 제조하고 여과에 의해 살균 될 수있다. 프로토콜 1
YPGA [2% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글리세롤 (v/v), 200 mg/L 아데닌] + 2% 한천 매체는 오토클레이브에 의해 살균됩니다. 프로토콜 1
합성 선택 플레이트: [0.17% AA와 황산 암모늄이 없는 효모 질소 염기, 0.5% 황산 암모늄, 5% (v/v) 비필수 아미노산 용액 (0.04% 아르기닌, 0.04% 메티오닌, 0.06% 이솔루신, 0.1% 페닐알라닌, 0.2% 글루타민산, 0.2% 아스파르트산, 0.3% 발린 threonine, 0.8% 세린), 20 mg/L 히스티딘, 20 mg/L 우라실, 20 mg/L 트립토판 (벡터 선택 마커에 따라), 30 mg/L 리신, 100 mg/mL 류신 (벡터 선택 마커에 따라), 5 mg/L 또는 200 mg/L 아데아닌 + 2% 매체 (AA와 황산 암모늄, 황산 암모늄 과 한천없이 효모 질소 염기 포함) 오토 클레이브에 의해 살균된다. 다른 구성 요소는 열 불안정 성분을 보존하기 위해 오토 클레이브 후 추가됩니다. pLS- 및 pLSG 기반 벡터를 사용하는 경우 류신 없이 플레이트를 준비한다. pTS-및 pTSG 기반 벡터를 사용하는 경우 트립토판 없이 플레이트를 준비한다. 프로토콜 2-3
합성 선택적 미디어: [0.17% AA와 황산 암모늄이 없는 효모 질소 염기, 0.5% 황산 암모늄, 5% (v/v) 비필수 아미노산 용액 (0.04% 아르기닌, 0.04% 메티오닌, 0.06% 이솔루신, 0.1% 페닐알라닌, 0.2% 글루타민산, 0.2% 아스파탐산, 0.3% 발린, 0.3% threonine, 0.8% 세린), 20 mg/L 히스티딘, 20 mg/L 우라실, 20 mg/L 트립토판 (벡터 선택 마커에 따라), 30 mg/L 리신, 100 mg/mL 류신 (벡터 선택 마커에 따라), 200 mg/L 아데닌] + 2% 덱스노스  매체는 여과에 의해 살균된다. 약물 치료에서 pLS- 또는 pTS 기반 벡터를 사용하는 경우 류신 또는 트립토판 없이 각각 2% 덱스트로오스를 함유하는 매체를 준비한다. 약물 치료 유무에 관계없이 유도성 P53 발현에서 pLSG- 또는 pTSG 기반 벡터를 사용하는 경우, 각각 2% 라피노스 및 가변량의 갈락토오스를 함유하고 있는 류신 또는 트립토판 없이 매체를 준비하지만, P53 발현을 조절하기 위해 2% 라피노스 및 가변양을 함유한다. P53 유도의 정도는 또한 배양 시간을 변화시킴으로써 변조될 수 있다. 프로토콜 3
최소 선택 플레이트: 2% 포도당, 0.7% 효모 질소 염기 (아미노산 및 황산 암모늄 제외), 50 mg/L 아데닌, 50 mg/L 우라실, 50 mg/L 히스티딘, 50 mg/L 트립토판 (벡터 선택 마커에 따라 다름), 50 mg/L 류신(에 따라 다름), 50 mg/L 류신(에 따라 다름), 50 mg/L 류신(에 따라 다름), 50 mg/L 류신 벡터 선택 마커), 2% 한천 매개체는 오토클레이브에 의해 멸균됩니다. pLS89 기반 벡터를 사용하는 경우 트립토판 없이 배지를 준비한다. pLS89-빈 벡터(단백질을 발현하지 않음)를 음성 대조군으로 사용하십시오. pLS89 기반 및 pGADT7-MDM2 벡터(P53 및 MDM2의 공동 발현)를 사용하는 경우, 류신 및 트립토판 없이 배지를 준비한다. pLS89-빈 및 pGADT7 (단백질을 표현 하지 않음)을 음성 대조군으로 사용 하십시오. pLS76 기반 벡터를 사용하는 경우 류신 없이 배지를 준비한다. pRS315 벡터(단백질을 발현하지 않음)를 음성 대조군으로 사용하십시오. 프로토콜 4
최소 선택 적 매체 : 최소한의 선택적 플레이트로 하지만 한천없이 배지는 여과에 의해 살균됩니다. 프로토콜 4
선택적 유도 매체: 최소한의 선택적 배지로 하지만 포도당 대신 2% 갈락토오스를 함유하고 있습니다. 배지는 여과에 의해 살균됩니다. 프로토콜 4

표 2: 효모 미디어.

솔루션 이름 및 레시피 또는 프라이머 이름 및 시퀀스 특정 기능 및 사용 프로토콜 번호
LiAc/TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA 및 0.1M 리튬 아세테이트 포함 물에서 다음 멸균 스톡 용액은 오토클레이브에 의해 제조된다: 1M 리튬 아세테이트 pH 7.5, 1 M Tris-HCl/ 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE 버퍼 10X). 프로토콜 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA 와 0.1 M 리튬 아세테이트 물에서 다음 멸균 스톡 용액은 오토클레이브에 의해 제조된다: 1 M 리튬 아세테이트 pH 7.5, 1 M 트리스-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE 버퍼 10X), 50% PEG (분자량 ~3350). 프로토콜 1-4
RE 올리고뉴클레오티드에 대한 상동성 꼬리:
5'-gcggaattgacttttttttgaattttgaatatatatacat-RE-gcagatccgagggtgtatatagtgg-3'
상동성 꼬리의 서열은, 통합된 ICORE 카세트를 측면으로 하는 염색체 서열에 대응하는 단계; RE = RE 시퀀스. 프로토콜 1
프라이머: Ade2 Fw: 5'-AAGTTGTTAGTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATTAACGTGTTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-카태그CTGCACCGAA-3'
yAFM-RE 스트레인(PCR 및 시퀀싱)의 경우 Ade2 Fw와 Ade2 Rv 프라이머를 결합합니다. yLFM-RE 스트레인(PCR 및 시퀀싱)의 경우 Ade2 Fw와 Luc1-Rv 프라이머를 결합합니다. 프로토콜 1

표 3: 해액 및 올리고뉴클레오티드.

벡터의 유형 긍정 및 부정 대조군 프로토콜 번호
P53(또는 제어) 벡터.
pLS- 또는 pLSG-기반: P53 단백질 발현은 각각 (LEU2 선택 마커로서) 구성ADH1 프로모터 또는 갈락토스 유도성 GAL1 프로모터하에 있다.
pTS- 또는 pTSG 기반: P53 단백질 발현을 구성하는 ADH1 프로모터 또는 갈락토제 유도성 GAL1 프로모터(TRP1 선택 마커로서 각각)
pLS-및 pLSG 기반: 각각 pLS76 및 pLSG-P53 벡터(발현 야생형 P53)를 포지티브 대조군으로 사용; 음성 대조군 pRS315 벡터로 사용하십시오 (단백질을 발현하지 않음).
pTS-및 pTSG 기반: 각각 pTS76 및 pTSG-P53 벡터(발현 야생형 P53)를 양성 대조군으로 사용; 음성 대조군 pRS314 벡터로 사용하십시오 (단백질을 발현하지 않음).
프로토콜 2,3
P53 및 MDM2(또는 제어) 벡터.
pLS89-기반: 갈락토스 유도성 GAL1 프로모터 하에서 야생형 P53 단백질 발현(TRP1 선택 마커로서).
pLS76-기반: 돌연변이 P53 단백질 발현하에 ADH1 프로모터(LEU2 선택 마커로서의).
pGADT7 기반: ADH1 프로모터하에서 MDM2 단백질 발현(선택 마커로서의 LEU2)
pLS89-기반: pLS89-P53 벡터를 양성 대조군으로 사용한다(야생형 P53 발현); 음성 대조군 pLS89-빈 (어떤 단백질을 표현하지 않음)으로 사용하십시오.
pLS76-기반: pLS76-돌연변이 P53 벡터(발현 돌연변이 P53)를 양성 대조군으로 사용; 음성 대조군 pRS315 벡터로 사용하십시오 (단백질을 발현하지 않음).
pGADT7 기반: pGADT7-MDM2 벡터(야생형 MDM2 발현)를 양성 대조군으로 사용한다; 음성 대조군 pGADT7 벡터로 사용하십시오 (단백질을 발현하지 않음).
프로토콜 4

표 4: 효모 발현 벡터.

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Discussion

효모 계 분석에 따르면 P53 단백질 기능의 다양한 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 해학은 기능적 다형성의 평가를 포함하여 RE 표적 부위의 변이체로 P53 환활성화 잠재력을 평가하는 데 특히 민감하다. 색상 리포터의 사용뿐만 아니라 루시퍼라아제 분석의 소형화는 비용 효율적이고 상대적으로 확장 가능한 분석결과를 낳습니다. 또한, 성장 억제 시험은 잠재적으로 흡수의 측정을 통해 효모 세포 생존의 정량화를 자동화, 화학 라이브러리 스크리닝에 사용되는 것이 가능하다. ABC 수송기의 세포벽 및 작용으로 인한 투과성이 제한적이지만 약물 스크리닝을 위한 효모 사용에 한계가있는 것으로 여겨지고 있지만, 유전자 변형은 22,65에성공적으로 개발되었다.

포유류 세포 기반 분석과 비교하여 효모 기반 P53 분석사는 P53이 더 높은 진핵생물에서 기능을 조절하는 보조 인자의 놀라운 복잡성과 신호 캐스케이드 경로로부터 분리된다는 점을 감안할 때 직접 적중의 식별을 향상시킬 수 있습니다. 효모 계 기능성 실험은 또한 단백질 보조 인자와의 P53의 상호 작용(즉, MDM2 및 MDMX22,32,33,34)과작은 영향의 상호 작용을 모니터링하는 데 부분적으로 성공했습니다. 분자 (예 : Nutlin-3a) 그 상호 작용에. 그러나, P53과 상호 작용 단백질 사이 크로스토크를 조사하는 효모 기지를 둔 검소의 감도 그리고 예측 힘은 생체내 그 상호 작용이 번역 후 수정에 의존하는 방법에 따라 다소 제한될 수 있습니다 및 종별 신호 캐스케이드.

여기에 설명된 시스템은 다른 FF에 쉽게 적용될 수 있습니다. 실제로, 효모 기능성 검사사는 P53 관련 P63 및 P73 단백질42,49뿐만 아니라 NF-θB 패밀리66,67 [또는 일부 동종 상자 및 기본 나선-루프 나선(bHLH)의 구성원을 위해 개발되었다. TFS68,69]. 인간 핵 수용체는 또한 효모에서 발현되고 리간드 의존성, 서열특이적 TFs(70)로서 작동하는 것으로 입증되었다. 효모 기저 전사 기계(8)와 상호 작용하는 일부 포유류 환활성화 도메인(TAD)의 약한 용량에서 하나의 제한 인자가 확인되었으며, 활성을 포함하는 키메라 구조를 사용하여 극복할 수 있는 단점이 있다. 이종 TAD68,69.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 유럽 연합 (FEDER 기금 POCI/01/0145/FEDER/007728 Programa 오페라 팩터드 드 경쟁) 및 국가 기금 (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia 및 Ministério da Educação e Ciência) 파트너십 계약 PT2020 UID/QUI/50006/2019 및 프로젝트(3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT 펠로우십: SFRH/BD/96189/2013 (S. 고메스). 이 작품은 Compagnia S. Paolo, 토리노, 이탈리아 (프로젝트 2017.0526)와 보건부 (프로젝트 5x1000, 2015 및 2016; 현재 연구 2016)에 의해 지원되었습니다. 테레사 로페즈-아리아스 몬테네그로 박사(트렌토 대학교, 실험 과학 교육 실험실)에게 비디오 녹화에 도움을 주신 것에 대해 깊이 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

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