مقايسة الفائق "التنبؤ بالسمية الكيميائية" "الآلي التنميط المظهرية" من ايليجانس كاينورهابديتيس

* These authors contributed equally
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

وقد وضعت أسلوب كمي لتحديد وتوقع السمية الحادة للمواد الكيميائية من خلال تحليل تلقائياً تحديد سمات المظهرية ايليجانس كاينورهابديتيس. ويصف هذا البروتوكول كيفية علاج الديدان مع المواد الكيميائية في صفيحة 384-جيدا، والتقاط الفيديو، والتحديد الكمي للسمية ذات الصلة تعمل.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. D., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تطبيق اختبار السمية للمواد الكيميائية في أعلى ترتيب الكائنات، مثل الفئران أو الجرذان، مضيعة للوقت وباهظة التكاليف، نظراً لعمر طويل ومسائل الصيانة. على العكس من ذلك، وديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) مزايا لجعله خياراً مثاليا لاختبار السمية: عمر قصيرة وزراعة السهل، وكفاءة الإنجاب. هنا، نحن وصف بروتوكول التلقائي التنميط المظهرية من C. ايليجانس في صفيحة 384-جيدا. تربى الديدان السلكية في صفيحة 384-جيدا مع معالجة متوسطة والكيميائية السائلة، وأخذت أشرطة الفيديو لكل بئر التحديد الكمي لتأثير المواد الكيميائية على ميزات دودة 33. وتبين النتائج التجريبية أن ميزات النمط الظاهري كمياً يمكن تصنيف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة أولويات لتقييم السمية الكيميائية التقليدية إجراء مزيد من الاختبارات في نموذج القوارض.

Introduction

جنبا إلى جنب مع التطور السريع للمركبات الكيميائية التي تطبق على الإنتاج الصناعي والحياة اليومية للناس، من المهم دراسة سمية اختبار نماذج للمواد الكيميائية. في كثير من الحالات، يستخدم نموذج الحيوان القوارض لتقييم السمية المحتملة لمختلف المواد الكيميائية على الصحة. بشكل عام، يستخدم تحديد التركيزات المميتة (أي أساييد 50% جرعة مميتة [LD50] للمواد الكيميائية المختلفة) كمعلمة التقليدية في نموذج القوارض (فأر/الماوس) الحية، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب تخفيض، صقل، أو استبدال مبدأ (3R) المركزي للرفق بالحيوان، والأخلاقيات، والأساليب الجديدة التي تسمح لاستبدال الحيوانات أعلى قيمة للبحث العلمي1،،من23 . C. ايليجانس هو ديدان أسطوانية الشرانق التي ظلت معزولة من التربة. قد استخدمت على نطاق واسع ككائن بحث في المختبر بسبب خصائصه المفيدة، مثل عمر قصيرة، وزراعة سهلة وكفاءة الإنجاب. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الممرات البيولوجية الأساسية، بما في ذلك العمليات الفسيولوجية الأساسية واستجابات الإجهاد في C. ايليجانس، هي المحافظة في أعلى الثدييات4،،،من56،7 , 8-يوجد في بضع مقارنات جعلت نحن وآخرون، توافق جيد بين C. ايليجانس السمية والسمية التي لوحظت في القوارض9. كل هذا يجعل C. ايليجانس نموذج جيد لاختبار آثار المجراة في المواد الكيميائية السمية.

في الآونة الأخيرة، بعض الدراسات الكمية السمات المظهرية من C. ايليجانس. يمكن استخدام الميزات لتحليل السمية للمواد الكيميائية2،،من310 وشيخوخة الديدان11. كما وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين دودة سائل استزراع النظام ونظام تحليل صورة، التي تربى الديدان في لوحة 384-البئر تحت علاجات كيميائية مختلفة12. وقد وضعت هذا الأسلوب الكمي لتحليل معلمات 33 C. ايليجانس تلقائياً بعد 12-24 ساعة علاج الكيميائي في صفيحة 384-جيدا مع السائلة المتوسطة. يتم استخدام مرحلة مجهر الآلي لاقتناء الفيديو التجريبية. أشرطة الفيديو يتم معالجتها بواسطة برنامج مصمم خصيصا، وكمياً 33 الميزات المتصلة بالسلوك الديدان المتحركة. الأسلوب يستخدم لقياس تعمل الدودة تحت العلاج 10 مركبات. وتبين النتائج أن السمية مختلفة يمكن أن يغير تعمل من C. ايليجانس. يمكن استخدام هذه الكمية تعمل التعرف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة. والهدف العام لهذا الأسلوب لتسهيل المراقبة والقياس الكمي المظهرية للتجارب مع C. ايليجانس في ثقافة سائل. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتطبيق C. ايليجانس في تقييمات السمية الكيميائية والنمط الظاهري كوانتيفيكيشنز، التي تساعد على التنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة بأولويات لمزيد التقليدية اختبارات تقييم السمية الكيميائية في نموذج القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لسمية الفحص والاختبار لمواد كيميائية جديدة أو المجمع التلوث عامل المضافات الغذائية ومركبات فارماكوتيكال، مجمع خارجية بيئية، وهلم جرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

البروتوكول المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية من "لجنة الأخلاقيات الحيوان" من مركز بكين للوقاية من المرض ومكافحته في الصين.

1-إعداد الأسلحة الكيميائية

  1. الحصول على المواد الكيميائية (الجدول 1 و الجدول للمواد).
  2. تحديد الجرعة أعلى وأدنى من المواد الكيميائية الإفرادية لتركيز الحد أدنى من الفتك 100% (LC100، 24 ساعة) وتركيز الحد أقصى من 100% نونليثاليتي (LC0، 24 ساعة) للديدان. استخدام تخفيف ستة على الأقل من أعلى تركيز (الجدول 1).
    ملاحظة: إجراء اختبار قوة فتك دودة أولية9 استكشاف LC100 و LC0 لمادة كيميائية جديدة، لتحديد الجرعة.
  3. تمييع كل مادة كيميائية مع كالمتوسطه (جدول المواد) إلى 2 × التركيز المطلوب. استخدام K-المتوسطة كعنصر تحكم لمقارنة النمط الظاهري التعديلات الناجمة عن المواد الكيميائية.
    1. على سبيل المثال، تعد 7 تركيزات متدرجة من كلوريد الكادميوم (كدكل2) (الجدول 1). إعداد 2 x حل 92.8 مغ كدكل مسحوق2 الصلبة في 8 مل كمتوسطه أعلى المحلول مركزة (4.64 مغ/مل)، وملء يصل إلى 10 مل بعد المسحوق قد حلت تماما. إعداد مستويات تركيز أخرى بإضعاف مع كالمتوسطه.
  4. إعداد ثمانية آبار موازية لكل تركيز في التدرج الكيميائية. كذلك يتضمن كل 50 ميليلتر من 2 × الحل الكيميائية. إعداد على الأقل ثلاث مجموعات من ثمانية آبار موازية من K والمتوسطة كعناصر تحكم (الجدول 2).
    ملاحظة: بإيجاز، حجم 500 ميليلتر من 2 × الحل العمل أمر ضروري لجرعة واحدة من كل مادة كيميائية.

2-دودة إعداد

  1. الحصول على البرية من نوع N2 الديدان وسلالات الإشريكيّة القولونية OP50 من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك).
  2. الحصول على متزامنة L4 الديدان.
    1. اختيار مستعمرة واحدة من OP50 كولاي من لوحة متواصلة. أسيبتيكالي تطعيم المستعمرة في 100 مل مرق رطل وأنها تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الحل OP50 كولاي جاهز الآن للبذر لنمو السلكية لوحات متوسطة (NGM، الجدول للمواد).
    2. صب NGM بلاستيك 90 مم طبق بيتري. البذور كل لوحة مع 300 ميليلتر لحل OP50 كولاي اليوم بعد سكب. احتضان الديدان N2 على لوحات NGM مع OP50 في 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى أكثر من الديدان قد وصل إلى مرحلة الكبار.
    3. الديدان جرابيد الحصاد في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 15 مل مع العقيمة H2o. واسمحوا الديدان تستقر لمدة 2 دقيقة على الأقل، ونضح ح2س، وإضافة 5 مل من المخزن المؤقت للتبييض (جدول المواد).
    4. دوامة الأنبوب لمدة 5 دقائق، تدور أنبوب لمدة 30 ثانية (في س 1,300 ز) بيليه البيض، وتجاهل المادة طافية.
    5. أغسل البيض مع 5 مل ح2س العقيمة ودوامه الأنبوب للطرد المركزي س. 5 الأنبوبة 30 s (في س 1,300 ز) وإزالة المادة طافية، والمياه والصرف الصحي مرة أخرى.
    6. "الماصة؛" البيض على صفيحة NGM جديدة مع OP50. احتضان لهم عند 20 درجة مئوية. رصد الديدان L1 مظلل في صباح اليوم التالي؛ الديدان وسوف تصل إلى مرحلة L4 في حوالي 40 ح.
  3. أغسل الديدان L4 قبالة لوحات بيتري 90 ملم مع كالمتوسطه في أنبوب 50 مل مخروطية عقيمة. ضبط تركيز الديدان للحيوانات ~ 40 الواحد 100 ميليلتر من K والمتوسطة تحت ستيريوميكروسكوبي. إضافة 50 ميليلتر (الديدان ~ 20) في كل من لوحة 384-جيدا جيدا. هذه الديدان متزامنة (مرحلة L4) على استعداد لمعالجة المواد الكيميائية التالية.

3-الأسلحة الكيميائية العلاج والتقاط الفيديو

ملاحظة: في لوحة 384، حسنا، تعامل الديدان (50 ميليلتر في كل بئر) إلى ستة إلى سبعة لجرعات من مادة كيميائية فردية (الجدول 1). إعداد ثمانية آبار موازية، كل منها يحتوي على 50 ميليلتر من 2 × الحل الكيميائية لكل جرعة (ثمانية آبار مليئة بنفس المادة الكيميائية وتركيز نفسه، الجدول 2). يتم جمع كل أشرطة الفيديو باستخدام كاميرا رقمية إرفاقه مجهر مقلوب (جدول المواد). تجربة العلاج الكيميائي يستمر لمدة 24 ساعة. لا تقم بإضافة الغذاء البكتيرية لكل بئر خلال التجربة العلاج الكيميائي ح 24.

  1. قبل إضافة المواد الكيميائية، تعيين لوحة 384-جيدا مع الديدان متزامنة في مرحلة التلقائية واتخاذ أشرطة الفيديو لكل بئر مع إجراءات اقتناء المبرمجة (7 إطارات في الثانية 2 s؛ فإنه يأخذ ~ 25 دقيقة لمسح كل لوحة).
  2. إضافة 50 ميليلتر من 2 × الكيميائية الأوراق المالية المعدة وفقا للمادة 1 لكل بئر (الجدول 2). تعيين الوقت كنقطة ح 0.
  3. احتضان لوحة 384-جيدا عند 20 درجة مئوية واهتز 80 لفة في الدقيقة في شاكر حاضنة.
  4. إزالة اللوحة من الحاضنة ونقلها إلى مرحلة تلقائية. أن أشرطة الفيديو لكل بئر من لوحة كاملة، في ح 12 وفي ح 24، للتحقق من تعمل الديدان لكل معاملة كيميائية محددة في كالمتوسطه. حوالي 25 دقيقة مطلوبة من أجل شاشة لوحة واحدة.

4-تجربة معالجة الفيديو

ملاحظة: كتابة برنامج لمعالجة الصور والفيديو التجريبية وتعبئتها. يمكن تحميلها بحرية (انظر الجدول للمواد). يتم تخزين الفيديو التجريبية في شكل تسلسل الإطار صورة، وتسلسل الإطار كل الفيديو المخزنة في دليل محدد. البرنامج يمكن الاعتراف بالديدان والتحديد الكمي لتعمل تلقائياً.

  1. في واجهة المستخدم الرسومية (واجهة المستخدم الرسومية، الشكل 1)، إضافة المعلمات، مثل الدليل تسلسل الإطار، دليل الإخراج، معلمة الحجم دودة، وحركة عتبة المعلمة. انقر فوق الزر تحليل لمعالجة الصور التجريبية.
    1. انقر فوق الزر تحديد اختيار الدليل الصور المصدر.
    2. إضافة الدليل نتيجة متوسطة في الواجهة.
      ملاحظة: النتائج المتوسطة التي تشمل الصور مجزأة. هذه النتائج المتوسطة مفيدة للمراقبة البصرية لمعالجة الصور.
    3. إضافة الدليل النتيجة النهائية في الواجهة.
    4. إضافة معلمة دودة متوسط الحجم في مربع نص حجم الدودة في الواجهة.
      ملاحظة: هو معلمة الحجم المستخدمة في التجارب 2,000.
    5. إضافة عتبة نسبة تم نقله في الواجهة.
      ملاحظة: هي النسبة المستخدمة في التجارب 0.93.
    6. انقر فوق الزر تحليل للبدء في معالجة الصور. انقر فوق الزر إعادة تعيين إلى مسح معلمات إضافية.
      ملاحظة: هناك ميزات 33 تعريفها وقياسها كمياً للديدان. يتم فرز جميع تعمل المعرفة حسب فئات (المدرجة في الجدول 3). هذه الميزات يمكن قياسها كمياً من الصور التجريبية. مقارنة كمية بين المواد الكيميائية المختلفة، التي لديها السمية مختلفة، يمكن أن يتم عن طريق مقارنة هذه الميزات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قد اختبرنا تعمل الديدان يتعرضون لتركيزات مختلفة من المواد الكيميائية أكثر من 1012. في الاختبار، وتم قياس كمية 33 سمات مميزة لكل مادة كيميائية مركبة في ثلاث نقاط زمنية (ح 0 وح 12 و 24 ساعة). سابقا، تم إجراء مقارنة بين دليل وتحليل تلقائي مقايسة عمر11،12. في هذا التحليل، وجدنا أن المواد الكيميائية وتركيزات يمكن أن تؤثر تعمل دودة. ويبين الشكل 2لمحة عامة عن هذا الأسلوب.

وأظهرت النتائج (رقم 3 و رقم 4،ج، د) أن الديدان قد توفي بسرعة كزيادة تركيز المواد الكيميائية. في تركيزات أعلى، وأصبحت الديدان استقامة ومنحني أقل مما في تركيزات أقل أو في مجموعات التحكم (الشكل 3 و الشكل 4ب). في البداية (في ح 0)، كان هناك لا يوجد فرق كبير بين مراقبة (كالمتوسطه) وعلاجات كيميائية لتعمل جميع. بعد 12 ساعة علاج بجرعة كيميائية معينة، أظهرت تعمل الديدان درجات مختلفة من الاختلافات بين التحكم وتركيز مختلف المجموعات. على سبيل المثال، زيادة طول محورها الرئيسي كوقت زيادة. وهناك أيضا اتجاه تدرج من أدنى إلى أعلى تركيزات المواد الكيميائية. اتجاه التدرج من تركيزات المواد الكيميائية المختلفة مهم أيضا في طول المحور طفيفة (الشكل 4أ، ب).

في هذا التحليل، حسبت حركية دودة طريقتين، استناداً إلى الدودة توغلت المنطقة، ونسبة حركية (الشكل 4ج، د). وأظهرت نتائج حركية من كلا الاتجاهين أنماط مماثلة. كانت هناك لا اختلافات كبيرة من حركية دودة بين تركيزات مختلفة ومجموعات التحكم في البداية (في النقطة الزمنية 0 ح). مع مرور الوقت، الديدان في مجموعات التحكم مستقرة وأظهرت انخفاضا في حركية. ح 12، أظهرت الديدان التي خضعت للعلاجات الكيماوية بتركيزات مختلفة اختلافات كبيرة في حركية مقارنة مع مجموعات المراقبة. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الديدان تحت أعلى تركيز العلاجات حركية ضعيفة مقارنة بالديدان تحت أدنى تركيز العلاج. يشير هذا إلى أن الديدان تحت أعلى تركيز العلاجات أصبح أقل متحركة وتوفيأسرع (الشكل 4ج، د). هذه النتائج تشير إلى أن المصممة بأسلوب مفيد لتقييم المواد الكيميائية السمية، وتعمل كمية من C. ايليجانس علامات مفيدة لتحديد المواد الكيميائية السمية.

Figure 1
الشكل 1 : واجهة البرنامج- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : خط الأنابيب من مقايسة الفائق للتنبؤ بالسمية الكيميائية بالتنميط المظهرية الآلي من ايليجانس كاينورهابديتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الصور التجريبية للديدان تحت 4.64 مغ/مل كدكل2 (اللوحة العلوية) و 0.464 مغ/مل كدكل2 (الفريق الأوسط) كالمتوسطه (أسفل اللوحة)، في نقاط زمنية مختلفة- الصور تظهر التغييرات حالة الديدان تحت العلاج الكيميائي أو في مجموعة مراقبة بشكل جيد ممثل واحد لصفيحة 384-جيدا طوال الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : ملامح كمياً من الديدان تحت تركيزات مختلفة من كدكل2- () طول محورها الرئيسي كمياً. (ب) طول المحور طفيفة كمياً. (ج) حركية الكمية التي تم نقله المنطقة. (د) حركية كمياً قبل انتقل حجم المنطقة/الدودة. الشريط إظهار قطع متوسط التقدير الكمي لكل ميزة في الديدان واحد. أشرطة الخطأ الدلالة ± الانحراف المعياري (SD). وحدة تركيز = mg/mL. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table 1
الجدول 1: تركيز التعرض للمواد الكيميائية 10 384-جيدا--لوحة C. ايليجانس test. السمية الحادة

Table 2
الجدول 2: تخطيطي لتخطيط اللوحة 384-جيدا.

Table 3
الجدول 3: تعريف تعمل ديدان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مزايا C. ايليجانس أدت إلى أن الاستخدام المتزايد في علم السموم9، سواء بالنسبة للدراسات الميكانيكية والنهج الفرز الفائق. زيادة دور C. ايليجانس في استكمال النظم النموذجية الأخرى في الأبحاث السمية كان ملحوظا في السنوات الأخيرة، خاصة بالنسبة للتقييم السريع سمية المواد الكيميائية الجديدة. توفر هذه المقالة مقايسة جديدة للفرز الفائق، وكمية من دودة تعمل في صفيحة 384-جيدا للتعرف التلقائي وتقييم المواد الكيميائية السمية. هذا التحليل مثالي لاختبار السمية الحادة للمواد الكيميائية خلال 24 ساعة، ويمكن تطبيقه لسمية تحت الحاد الاختبار، وكذلك عندما يتم جمع المزيد من النقاط الزمنية للبيانات ويتم توفير مصدر الغذاء (OP50) للديدان.

يمكن أن تختلف الوسيلة المستخدمة لإذابة المواد الكيميائية؛ أننا اخترنا كالمتوسطه في المقايسة بالإشارة إلى صوفيet al. 13-كانت الديدان المستزرعة في كالمتوسطه في مجموعات المعالجة الكيميائية والتحكم. يمكن أن يكون حلاً المياه العذبة مصطنعة أو محلول تربة مع انخفاض القوة الأيونية بدائل كالمتوسطه.

يمكن تغيير المواد الكيميائية ذات السمية مختلفة تعمل من C. ايليجانس في أنماط مختلفة. وقد اختيرت المواد الكيميائية المستخدمة في هذا الاختبار من الفئات الثالثة إلى السادسة من "النظام المنسق عالمياً لتصنيف" ووضع العلامات للمواد الكيميائية (GHS). C. ايليجانس تعرضوا لمواد كيميائية في ستة أو أكثر من مستويات الجرعة التي تغطي نطاق الجرعة وفيات 0% إلى 100%. لتلك المواد الكيميائية التي لها القابلية للذوبان في الماء منخفضة، ينصح [دمس] لتعزيز حل الكيميائية في المياه. كما قد يؤثر على تركيز عال من [دمس] تطوير دودة وعمر14، ينبغي أن تستخدم لا أكثر من 0.2% [دمس] للتجارب المائية.

الميزات تلقائياً كمياً تبين الفرق الكبير بين السمية مختلفة، مما يدل على أن تعمل هذه الكمية من الديدان مفيدة جداً في تحديد مدى سمية المواد الكيميائية. وأشار إلى أن التنميط المظهرية كشفت عن وظائف مصانة بتصنيف والتنبؤ بسمية المواد الكيميائية المختلفة باستخدام السلكية C. ايليجانس ككائن نموذج المجراة.

برنامج علم السموم الوطني الأمريكي (NTP) المنشأة في المجتمع Tox21 من خلال مذكرة تفاهم مع الولايات المتحدة وكالة الحماية البيئية (وكالة حماية البيئة) ومركز الجينوميات الكيميائية المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، الآن المركز الوطني النهوض بالعلوم متعدية الجنسيات (نكاتس). يستخدم Tox21 الفرز الفائق في المختبر ونموذج الحيوان بديل المجراة في اختبار لتحديد آليات للسمية، إلى إعطاء الأولوية للمواد الكيميائية لاختبار السمية المجراة في إضافية، ووضع نماذج تنبئية للردود السمية البشرية. وكجزء من هذا الجهد، استخدمت C. ايليجانس للشاشة توكسكاست المرحلة لوكالة حماية البيئة الأولى و "المرحلة الثانية من" المكتبات، والتي تحتوي على مواد كيميائية 292 و 676، على التوالي، للمواد الكيميائية مما يؤدي إلى تراجع التنمية ونمو اليرقات15. كما تم استخدام منصة COPAS (محلل حدودي كائن معقد وأرز) لفحص السمية دودة الدراسات2. ومع ذلك، يوضحها منصة COPAS فقط بعض الميزات، مثل دودة عرض وطول الدودة، وشدة الأسفار. هذا الأسلوب تحسين بالأساليب الحالية باستخدام الديدان إلى سرعة نقوم سمية المواد الكيميائية الجديدة.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول: ثقافة دودة في لوحة 384-جيدا والعلاج الكيميائي، والتقاط الصور التجريبية والقياس الكمي النمط الظاهري. مقارنة بأساليب تقييم السمية التقليدية، يمكن قياس هذا البروتوكول تعمل بعض الديدان التي صعبة لحساب يدوياً ومفيدة تعكس السمية لكل مادة كيميائية، مثل حركية دودة دودة، حجم الدودة والعرض واللون الرمادي كثافة. ومن الواضح أن هذا التحليل الفائق للتنبؤ بالسمية الكيميائية سيكون نهج نموذجي سمية قيمة ويمكن استخدامها لفرز المواد الكيميائية قبل القوارض التجارب على الحيوانات.

وباختصار، يمهد هذا الأسلوب طريقة تقييم سمية السريع في مجالات متعددة. الباحثين يمكن تطبيقها الأسلوب تحليل حالات الطوارئ سمية في التسمم المنقولة عن طريق الأغذية، وتقييم سلامة المركبات الصيدلانية، فضلا عن فحص السمية الحادة والكشف عن مواد كيميائية جديدة ومجمعات خارجية بيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون يرجى إرسال ايليجانس C. كجك. وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وبرنامج التنمية للصين (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية لمنح الصين (#31401025، #81273108 #81641184) والصحة الرأسمالية للبحث والتنمية للمشاريع الخاصة في بكين (#2011-1013-03)، الصندوق افتتاح مختبر بكين الرئيسية لعلم السموم البيئية (# 2015HJDL03)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة شاندونغ، الصين (ZR2017BF041).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23, (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245, (2), 153-159 (2010).
  3. Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22, (11), 2768-2774 (2003).
  4. Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50, (3), 209-214 (2004).
  5. Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28, (4), 791-799 (2009).
  6. Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47, (4), 722-728 (2009).
  7. Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20, (9), 1132-1137 (2008).
  8. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106, (1), 5-28 (2008).
  9. Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2, (6), 403-412 (2013).
  10. Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2, (12), 1259 (2007).
  11. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12, (3), 398-409 (2013).
  12. Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19, (1), 18 (2018).
  13. Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, (1), 145-159 (2018).
  14. Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400, (4), 613-618 (2010).
  15. Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124, (5), 586-593 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics