金黄色葡萄球菌生物膜碱性磷酸酶活性的比色法分析

Bioengineering

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Summary

在这篇手稿中, 我们建立了一个高吞吐量的方法来量化碱性磷酸酶活性的金黄色葡萄球菌生物膜培养96孔组织培养板

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Danikowski, K. M., Cheng, T. Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm. J. Vis. Exp. (146), e59285, doi:10.3791/59285 (2019).

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Abstract

碱性磷酸酶 (ALP) 是一种常见的酶, 表达在原核细胞和真核细胞中。它催化了在碱性 ph 值下从许多分子中水解的一酯磷酸酯, 并在磷酸盐代谢中起着不可或缺的作用。在人类中, 真核 ALP 是诊断各种疾病 (如胆汁淤积和软骨病) 最常用的酶信号之一。在s.金黄色葡萄球菌, alp 是完全在细胞膜上检测到的;它也被表达为一个分泌形式, 以及。然而, 人们对它在生物膜形成中的作用了解甚少。

这份手稿的目的是开发一种快速可靠的检测方法, 以测量需要蛋白质分离的金黄色葡萄球菌生物膜中的 alp 活性。以对硝基苯磷 (pNPP) 为底物, 测定了96孔组织培养板中形成的金黄色葡萄球菌生物膜中的 alp 活性。活性是基于可溶性反应产物的形成测量 405 nm 吸收。96井组织培养板方法的高吞吐量特性为 ALP 活性检测提供了一种灵敏、可重复的方法。同样的实验设置也可以扩展到测量与生物膜形成有关的其他细胞外分子标记。

Introduction

碱性磷酸酶 (ALP) 在原核细胞和真核细胞1中普遍表达。它可以催化不同分子的单磷酸盐水解, 如核苷酸、蛋白质、生物碱、磷酸和酸酐。在人类中, 真核 ALP 存在于许多组织中, 包括肝脏、骨骼、肠道和胎盘2。它在蛋白质磷酸化、细胞生长、凋亡、干细胞过程以及正常的骨骼矿化中起着重要作用。真核 alp 也是骨、肝脏和其他组织器官升高时存在疾病的关键血清指标.

原核 alp 已在各种细菌细胞中检测到, 包括大肠杆菌 5金黄色葡萄球菌67和土壤中一些常见的瘤胃细菌8。细菌 ALP 活性已被用作检测农药、重金属9和细菌污染10的生物传感器。利用 ALP 的本构表达法鉴定葡萄球菌11 和区分沙雷菌和肠杆菌12。进一步指出,本构 alp 的产生与葡萄球菌13的致病性有关。虽然 alp 在不同的环境中已经被研究了3,4, 但很少报告其在生物膜培养中的活动和功能。

据记录, 与自由生活的细菌细胞对照14相比, 生物膜具有不同的细菌寿命.金黄色葡萄球菌中, 生物膜的形成已被确定在各种临床条件下, 并解释了抗生素耐药和慢性炎症 15,16。据报道, 许多分子在生物膜基质中被发现, 如多糖、蛋白质、核酸和脂类, 但生物膜的形成机制尚不完全清楚 14.为了了解 ALP 在生物膜形成中的作用, 我们在96个井组织培养板中培养了金黄色葡萄球菌生物膜, 并使用对硝基苯磷酸酯 (pNPP) 测定了 alp 活性。

分子 pNPP 是 alp 的现成基板, 已被广泛用于测量 alp 活性6,17, 18.这种比色测定的基础是将对硝基苯磷酸酯 (pNPP) 转化为对硝基酚, 使有色产品的含量达到405纳米。与其他传统的 ALP 检测方法相比, 如琼脂糖凝胶电泳19、小麦胚芽凝集素 (wga) 沉淀和 WGA-HPLC20, 该检测方法具有高度的特异性、敏感性、易于繁殖性, 最重要的是, 允许高吞吐量。

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Protocol

1. 中等准备

  1. 制备1升的胰蛋白酶大豆汤 (TSB): 进入1升的蒸馏水, 加入15克的酪蛋白胰腺消化, 5 克的豆粕纸质消化, 3 克氯化钠, 2.5 克的葡萄糖, 和2.5 克的磷酸二钾。使用前消毒。
  2. 对于胰蛋白酶大豆琼脂 (TSA), 在 TSB 的 1 L 中加入15克琼脂, 高压灭菌器。然后让它冷却到室温。接下来, 以每培养皿20毫升 (100 毫米 x15 毫米) 的比例倒入。
  3. 生物膜培养基: 将10克葡萄糖加入蒸压 TSB 1 升。使用0.2μm 过滤器进行过滤消毒。

2. 96 井组织培养板中金黄色葡萄球菌生物膜的形成

请注意:如前面所述的6, 21 所述,金黄色葡萄球菌生物膜是培养的。

  1. 在 TSB 的10毫升中, 从 TSA 中接种一个单独的金黄色葡萄球菌群体, 并在37°c 下过夜生长。
  2. 以 1:100 (v/v) 的比例将隔夜培养稀释为 Tsb/葡萄糖 (10gl) 的10毫升。涡旋轻轻混合, 以达到一致的浓度。
  3. 将200毫升稀释培养物从一个96井板转移到总共18口井 (实验组更多, 这种非生物膜控制表明与 ALP 活性6有关)。每个时间点使用三胞胎: 0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和75分钟。请参见步骤3.2。
  4. 在37°c 下将96井板在24小时内培养为生物膜形成6,21
  5. 用渴望来欺骗上清液。
  6. 用1x 磷酸盐缓冲溶液 (PBS, pH 7.4)、离心机在 15, 000 x 克处清洗每口井 5分钟, 并通过吸入将上清液切掉。

3.金黄色葡萄球菌生物膜中 Alp 活性的测量

请注意:按照的 6,18

  1. 从2.6 步开始, 在每口井中添加75毫升的缓冲 ALP 基板, 其中包括市售的 pNPP, 并开始记录时间。记录每个时间点一式三份。
  2. 孵育后的不同时间: 0分钟 (控制), 15分钟, 30分钟, 45分钟, 60分钟, 60分钟, 和 75分钟, 加入 75Μl 5m NaOH 停止反应。
  3. 以 15, 000 x g 的速度离心板材 5分钟
  4. 将100μl 上清液转移到新的96井板中, 用于比色测量。
  5. 使用96井板读取器测量405纳米的每口井的吸收率。使用0分钟时间点井控制 405 nm 背景噪声。
  6. 在三个单独的96井板上重复整个实验。

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Representative Results

图 1显示了96种井组织培养板中金黄色葡萄球菌生物膜培养的 alp 活性的代表性结果。在每口井中加入75μl 的商用 pNPP 溶液, 并在室温下孵育。孵育不同时间 (0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、、75分钟) 后, 分别加入 75μl 5M NaOH 以阻止反应。然后在 405 nm 的96井板读取器中测量了该产品。每个时间点都在一个96孔板的三胞胎中重复, 整个实验在3个单独的96孔板中重复。

Figure 1
图 1:us 生物膜培养物在不同时间 (0分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、60分钟和 75分钟) 用 pNPP 底物孵育, 在 405 nm 下测定其 alp 活性.误差线表示标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

在我们的检测中, 我们使用 pNPP 作为 ALP 底物。这是一个为 ELISA 设计的工作解决方案, 不需要稀释。在 ALP 水解后, 黄色产物会产生, 并可在405纳米处进行测量。在酶反应结束时, 我们对96井板进行了短暂的离心, 并将上清液转移到一个新的96井板上, 用板读取器测量吸收率。我们发现, 这种额外的离心步骤是至关重要的, 因为它增加了在 405 nm 的吸收浓度, 可能是通过消除酶反应过程中产生的任何可能的悬浮细胞。

对于生物膜的形成, 我们使用200μl 的 1:100 (v/v) 稀释过夜培养, 如报告 6,21。与其他稀释相比, 这是金黄色葡萄球菌形成生物膜的最佳稀释效果 (数据未显示)。由于本文的目的是测量生物膜中的 ALP 活性, 因此保持最佳生物膜培养条件至关重要。选择在 10 G/l 使用葡萄糖以获得最佳生物膜生长6进一步强调了这一点.如果不同的细菌细胞被用于生物膜的形成, 则需要优化稀释因子和葡萄糖浓度。

在用 pNPP 底物培养生物膜的过程中, 有色产物的开发需要时间。我们测量了 ALP 活动后15和30分钟的时间点, 这是当可见的黄色被观察到。在电流集中度的情况下, 我们注意到 ALP 活性增加了 75分钟, 如图 1所示。75分钟后, ALP 活性没有增加。

最后, 由于金黄色葡萄球菌中的 alp 是一种纯膜结合蛋白7, 因此在不裂解的情况下可以测试其活性。酶活性检测是有好处的, 不需要整个细胞破坏。值得注意的是, 蛋白质分离过程有时会产生较低的活性酶数量22。但是, 如果 ALP 不是其膜绑定形式, 则不能使用此协议。

如先前报告的 6, alp 活性在生物膜培养中高于其柏拉图式的对应物。本研究中使用的实验设置可以推广到研究影响牛骨膜中 alp 活性的因子/化合物。这些研究的结果将为如何控制细菌生物膜的形成提供更多的见解。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢威廉·雷尼·哈珀学院和伊利诺伊大学提供的进行这些实验的设施。我们还感谢麦格劳·希尔基金会的慷慨支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar VWR 9002-18-0
Eppendorf Centrifuge Thomas Scientific 5810
Gluose VWR 50-99-7
NaOH pellets VWR SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)  Sigma P7998-100ML Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10x PBS, pH7.4.
173 mM NaCl,
2.7 mM KCl,
8 mM Na2HPO4,
2 mM KH2PO4
Sigma P3288-1VL
Plate Reader Biotek ELx808
S. aureus ATCC ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15 g/L TSB VWR 9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L
Pancreatic Digest of Casein............ 15.0
Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00
Sodium chloride.............................. 3.00
Dextrose........................................  2.50
Dipotassium phosphate..................2.50
VWR 90006-098
96 well tissue culture plates BD 6902D09 U shaped bottom

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References

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