Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Biochemistry

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Summary

Aqui, os protocolos para o isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e isolamento de seus exoproteomes são descritos. Ambos os procedimentos incorporam etapas-chave para obter polímeros ou proteínas com graus de alta pureza que podem ser usados para posterior análise ou aplicações. Eles também podem ser facilmente adaptados de acordo com as necessidades específicas do usuário.

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Flores, C., Tamagnini, P. Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins. J. Vis. Exp. (147), e59590, doi:10.3791/59590 (2019).

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Abstract

A cianobactéria pode secretar ativamente uma ampla gama de biomoléculas para o ambiente extracelular, como heteropolissacarídeos e proteínas. A identificação e caracterização dessas biomoléculas podem melhorar o conhecimento sobre suas vias de secreção e ajudar a manipulá-las. Além disso, algumas dessas biomoléculas também são interessantes em termos de aplicações biotecnológicas. Descritos aqui estão dois protocolos para o isolamento fácil e rápido de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas. O método de isolamento de polímeros de carboidratos liberados é baseado em técnicas convencionais de precipitação de polissacarídeos em soluções aquosas utilizando solventes orgânicos. Este método preserva as características do polímero e, simultaneamente, evita a presença de contaminantes de detritos celulares e meio de cultura. No final do processo, o polímero liofilizado está pronto para ser usado ou caracterizado ou pode ser submetido a novas rodadas de purificação, dependendo do uso final pretendido. Em relação ao isolamento do exoproteoma cianobactérias, a técnica baseia-se na concentração do meio livre de células após a remoção dos principais contaminantes por centrifugação e filtração. Essa estratégia permite o isolamento confiável de proteínas que atingem o meio extracelular através de transportadores de membrana ou vesículas de membrana externa. Essas proteínas podem ser posteriormente identificadas usando técnicas de espectrometria de massas padrão. Os protocolos aqui apresentados podem ser aplicados não apenas a uma ampla gama de cianobactérias, mas também a outras cepas bacterianas. Além disso, estes procedimentos podem facilmente ser costurados de acordo com o uso final dos produtos, o grau da pureza exigido, e a tensão bacteriana.

Introduction

As cianobactérias são amplamente reconhecidas como fontes prolíficas de produtos naturais com promissoras aplicações biotecnológicas/biomédicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos de secreção de cianobactérias e a otimização dos métodos de extração/recuperação são essenciais para implementar cianobactérias como eficientes fábricas de células microbianas.

Muitas cepas de cianobactérias são capazes de produzir substâncias poliméricos extracelulares (EPS), formadas principalmente por heteropolissacarídeos, que permanecem associadas à superfície celular ou são liberados para o meio1. Estes polímeros de carboidratos liberados têm características distintas em comparação com aqueles de outras bactérias, que os tornam adequados para uma ampla gama de aplicações (por exemplo, antivirais2, imunoterapia Imunoestimulador3, antioxidante4, metal-quelante5, emulsificante6, e agentes de entrega de fármacos7,8). A metodologia para o isolamento desses polímeros contribui, em grande parte, não só para a melhoria da produtividade, mas também para o aumento da pureza e as propriedades físicas específicas do polímero obtido9. A grande maioria destes métodos de isolamento dos polímeros dependem de estratégias de precipitação do meio de cultura que são facilmente realizadas devido à forte natureza aniônica do polímero9,10. Além disso, a remoção dos solventes utilizados na etapa de precipitação pode ser rapidamente alcançada por evaporação e/ou liofilização. Dependendo da aplicação prevista, podem ser acoplados diferentes passos, quer após ou antes da precipitação do polímero, a fim de adaptar o produto final, que incluem o tratamento com ácido tricloroacético (TCA), filtração ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) purificação de coluna10.

As cianobactérias também são capazes de secretar uma ampla gama de proteínas através de vias dependentes de transportadores de membrana (clássica)11 ou mediadas por vesículas (não-clássicas)12. Portanto, a análise do exoproteoma cianobactérias constitui uma ferramenta essencial, tanto para compreender/manipular os mecanismos de secreção de proteínas cianobactérias quanto para compreender a função extracelular específica dessas proteínas. A isolação e a análise confiáveis de exoproteomes exigem a concentração do Milieu extracelular, desde que a abundância de proteínas secretado é relativamente baixa. Além disso, outras etapas físicas ou químicas (por exemplo, centrifugação, filtração ou precipitação protéica) podem otimizar a qualidade do exoproteoma obtido, enriquecedora do conteúdo proteico13, e evitando a presença de contaminantes (por exemplo, pigmentos, hidratos de carbono, etc.) 14 anos de , 15 ou a predominância de proteínas intracelulares nas amostras. No entanto, algumas dessas etapas também podem restringir o conjunto de proteínas que podem ser detectadas, levando a uma análise tendenciosa.

Este trabalho descreve protocolos eficientes para o isolamento de polímeros de carboidratos liberados e exoproteomes de meios de cultura de cianobactérias. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados aos objetivos específicos do estudo e às necessidades dos usuários, mantendo as etapas básicas aqui apresentadas.

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Protocol

1. cianobactérias liberado isolamento de polímero de carboidratos

  1. Isolamento de polímeros e remoção de contaminantes
    1. Cultivar a estirpe de cianobactérias em condições padrão [por exemplo, 30 ° c uma luz de 12 h (50 μE m− 2s− 1)/12 h de regime escuro, com agitação orbital a 150 rpm]. Meça o crescimento usando protocolos padrão [por exemplo, densidade ótica em 730 nanômetro (OD730nm), clorofila a, seco-peso, etc.], a seguir mede a produção de polissacarídeos liberados de acordo com o método do ácido fenol-sulfúrico16.
    2. Transfira a cultura em membranas da diálise (12-14 kDa do corte do peso molecular) e Dialize de encontro a um mínimo de 10 volumes de água deionizada para 24 h com agitação contínua.
      Nota: dependendo do volume de cultura para Dialize e composição média, pode ser necessário mudar a água de diálise.
    3. Centrifugue a cultura em 15.000 x g por 15 min a 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um novo frasco para injetáveis e elimine o pellet (células).
    4. Centrifugue novamente a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° c para remover contaminantes como detritos de parede celular ou lipopolissacarídeos (LPs).
    5. Transfira o sobrenadante para uma taça de vidro e descarte o pellet.
  2. Precipitação do polímero
    1. Adicione 2 volumes de 96% de etanol ao sobrenadante.
    2. Incubar a suspensão a 4 ° c, pelo menos durante a noite.
    3. Recuperação de polímeros
      1. Para quantidades pequenas ou não visíveis de polímero precipitado: Centrifugue a suspensão a 13.000 x g durante 25 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e resuma a pelota em 1 mL ou 2 mL de água desionizada autoclavada. Transfira a suspensão aquosa para um frasco para injetáveis.
        Cuidado: o sobrenadante deve ser descartado suavemente, pois pode tornar-se facilmente ressuspender.
      2. Para quantidades visíveis/grandes de polímero precipitado: colete o polímero precipitado com pinça metálica estéril para um frasco para injetáveis. Esprema o polímero e descarte o excesso de etanol.
    4. Opcional: dependendo do grau de purificação do polímero necessário, repita o passo de precipitação com 96% de etanol após a ressuscitpensão dos polímeros em água desionizada.
  3. Liofilização do polímero
    1. Mantenha os frascos com o polímero precipitado a-80 ° c, pelo menos durante a noite.
    2. Congelar-secar (liofilização) o polímero para pelo menos 48 h (não deixe a suspensão degelo antes de congelar-secagem).
    3. Conservar o polímero seco à temperatura ambiente (RT) até à sua utilização.
      Nota: é aconselhável armazenar o polímero num dessecador, uma vez que pode absorver água ao longo do tempo.

2. isolamento de cianobactérias exoproteome

  1. Concentração média
    1. Cultivar cianobactérias em condições padrão [por exemplo, 30 ° c uma luz de 12 h (50 μE m− 2s− 1)/12 h de regime escuro, com agitação orbital a 150 rpm]. Monitore o crescimento do cianobactéria usando procedimentos padrão (por exemplo, OD730nm, clorofila a, seco-peso, etc.).
    2. Centrifugue as culturas em 4.000 x g, por 10 min em RT.
    3. Transfira o sobrenadante para um balão e descarte o pellet celular.
    4. Filtre o meio decantado através de um filtro de tamanho de poros de 0,2 μm.
      Nota: o protocolo pode ser pausado aqui por um curto período de tempo, se o meio é mantido a 4 ° c.
    5. Concentre o meio aproximadamente 500x (considerando o volume inicial de meio filtrado), usando concentradores centrífugos com um corte de peso molecular nominal de 3 kDa. A centrifugação deve ser operada a 4.000 x g (máximo de 1 h por rodada de centrifugação) a 15 ° c.
      Cuidado: para a maioria das marcas concentrador, o dispositivo de filtro precisa ser enxaguado por centrifugação com água ultrapura antes de usar. Uma vez que o filtro está molhado, não deixe secar. Deixe fluido suficiente no reservatório quando o dispositivo não estiver sendo usado.
      Nota: a redução da temperatura de centrifugação para 4 ° c pode ser útil se o objetivo é estudar a atividade proteica, embora aumente o tempo necessário para a concentração da amostra. O protocolo pode ser pausado entre as etapas de centrifugação por curtos períodos de tempo se o meio for mantido a 4 ° c.
    6. Enxague as paredes do reservatório da amostra do dispositivo filtrante com a amostra concentrada e transfira o conteúdo para um tubo de microcentrífuga.
    7. Realize uma etapa de lavagem adicional do reservatório de amostra do dispositivo de filtro com meio de cultura autoclavado para garantir a recuperação máxima do exoproteoma.
      Nota: para quantificar a percentagem de recuperação, siga as instruções específicas do fabricante.
    8. Armazene as amostras do exoproteome a-20 ° c até o uso mais adicional.
      Nota: a adição de inibidores de protease é recomendada para o armazenamento a longo prazo.
  2. Análise do exoproteome
    1. Quantificar o teor de proteínas pelo ensaio de proteína BCA em placa 96-well de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Separe as proteínas por eletroforese em gel de dodecilo sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), usando protocolos de coloração padrão (por exemplo, azul Coomassie, coloração de prata).
    3. Cortar as bandas/gel regiões de interesse e recolhê-los em diferentes tubos de microcentrífuga contendo volumes adequados de água ultra-pura.
    4. Proceder com a identificação e análise das proteínas por espectrometria de massas.

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Representative Results

Uma representação esquemática do método descrito para extrair polímeros de carboidratos liberados de culturas de cianobactérias é descrita na Figura 1. Os polímeros precipitados do moderado produtor de EPS cianobactéria synechocystis SP. PCC 6803 e o eficiente produtor de EPS cyanothece SP. CCY 0110 são mostrados na Figura 2. Na Figura 3, são mostrados polímeros liofilizados com diferentes graus de contaminação, destacando-se a importância das etapas de centrifugação para a pureza do produto final. A Figura 4 retrata o método de isolamento para o exoproteoma cianobactérias. Amostras concentradas em meio livre de células distintas (i.e., obtidas de culturas em diferentes fases de crescimento e de uma cepa de cianobactérias com menor produção de carotenóides) são mostradas na Figura 5. Amostras de exoproteoma de duas cepas de cianobactérias morfologicamente distintas, as cianobactérias unicelulares Synechocystis SP. PCC 6803 e as cianobactérias filamentosas Anabaena SP. PCC 7120, separadas por SDS-Page, são mostradas em Figura 6.

Figure 1
Figura 1 : Workflow para o isolamento de cianobactérias liberaram polímeros de carboidratos. Partindo da cultura de cianobactérias e remoção de contaminantes e terminando com isolamento de polímero e liofilização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Polímeros de cianobactérias após a precipitação. (A) polímero do produtor moderado de EPS Synechocystis sp. PCC 6803 na parede do frasco do centrifugador após a precipitação e a centrifugação (setas). B) aglomerados de polímeros do eficiente produtor de EPS cyanothece sp. CCY 0110 flutuando na taça de vidro após a precipitação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Polímeros de cianobactérias liofilizadas. (A) três lotes independentes de polímeros isolados de Synechocystis sp. PCC 6803: sem contaminação visível (ai), e com pigmentação indicativa de contaminação com carotenóides (AII) ou detritos celulares (Aiii) . (B) polímero liofilizado de cyanothece sp. CCY 0110. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Fluxo de trabalho para isolação do exoproteome de cianobactérias. Da cultura cianobactéria à separação e concentração médias, terminando com a análise de exoproteoma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Tubos de microcentrífuga com amostras médias livres de células concentradas. (A) amostras médias concentradas de Synechocystis sp. PCC 6803 Wild-Type, coletadas em diferentes OD730nm (0,5, 1 e 2). (B) amostra média concentrada de SynechocystisSIGF, mutante com comprometimento da produção de carotenóides15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Géis de SDS-PAGE com coloração azul Coomassie mostrando as proteínas acumuladas em meio concentrado livre de células cianobactérias. (A) exoproteome das cianobactérias unicelulares Synechocystis SP. PCC 6803 Wild-Type e ∆SIGF Mutant. (B) exoproteome de SynechocystisSIGF contaminado com altos níveis de polissacarídeos. (C) exoproteome do cianobactéria filamentosos Anabaena SP. PCC 7120. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Para compreender melhor os mecanismos de secreção bacteriana e estudar os produtos liberados, é de extrema importância demonstrar o isolamento e a análise eficientes das biomoléculas presentes no ambiente bacteriano extracelular (como o liberado polímeros e proteínas de carboidratos).

Os polímeros de carboidratos extracelulares de cianobactérias são extremamente complexos, principalmente devido ao número e proporção de diferentes monossacarídeos que constituem sua composição1. Os métodos convencionais utilizados para o isolamento dessas substâncias poliméricas dependem do conceito simples de que essas substâncias ricas em açúcar são solúveis em soluções aquosas e podem ser precipitadas pela adição de solventes orgânicos (como acetona ou etanol)9 ,17,18. Isso ocorre devido à extração de moléculas de água dos reservatórios de hidratação dos polímeros, e a eficiência do processo depende intrinsecamente do peso molecular do polímero (mais eficiente em frações de maior peso molecular), estrutura química e concentração9,18. Além da etapa de precipitação, o método descrito aqui inclui as etapas críticas de diálise e centrifugação. A diálise irá remover eficientemente sais e outros compostos do meio, que podem aparecer após a liofilização como estruturas semelhantes a pó, enquanto as etapas de centrifugação removerão os principais contaminantes e detritos celulares.

Falhas durante estas etapas podem levar a polímeros com altos níveis de contaminação e diferentes características, dependendo do lote de isolamento. Algumas contaminações podem ser facilmente detectadas macroscopicamente após a liofilização do polímero, uma vez que alterarão a pigmentação do polímero (geralmente branco ou castanho claro). Por exemplo, polímeros liofilizados que são verdes ou laranja são geralmente altamente contaminados com detritos celulares/clorofila ou carotenóides. Isso está relacionado a tempo insuficiente ou força g em etapas de centrifugação. No entanto, algumas cepas de cianobactérias podem liberar pigmentos e secretar proteínas que permanecem naturalmente associadas aos polímeros, e isso precisa ser considerado ao analisar o produto final19. Etapas adicionais podem ser adicionadas para purificar ainda mais os polímeros (por exemplo, tratamentos TCA)10. No entanto, essas etapas de purificação também podem ter um impacto negativo no produto final, pois a remoção de proteínas e outros componentes pode alterar as propriedades do polímero (por exemplo, viscosidade, hidrofobicidade, etc.) 1. º , 20. mesmo repetindo as etapas de precipitação/liofilização podem afetar negativamente os polímeros, principalmente devido aos ciclos de congelamento-thawing que modificam facilmente suas propriedades físico-químicas21. Para melhorar os rendimentos do polímero, os tratamentos de aquecimento podem ser aplicados a culturas inteiras antes da precipitação. Esta etapa extra libera o polímero associado com a superfície da célula, mas também pode levar à despolimerização18,20. Em síntese, é importante notar que a escolha do protocolo influenciará tanto a quantidade quanto a qualidade dos polímeros isolados9,20.

Em relação às proteínas cianobactérias identificadas no meio extracelular, elas exibem uma ampla gama de pesos moleculares e pontos isoelétricos e podem ser solúveis ou associadas à membrana. Essa diversidade de propriedades físico-químicas representa um problema para a seleção do método mais adequado para o isolamento do exoproteoma. O método aqui apresentado depende fortemente da concentração das biomoléculas no meio extracelular. Este método isola não somente as proteínas que são secretadas no meio mas igualmente as proteínas atuais nas vesículas exteriores da membrana (OMVs) e derivadas da lise da pilha. Conseqüentemente, as etapas da centrifugação devem ser executadas delicadamente a fim evitar o rompimento da pilha, mas ao mesmo tempo coletam OMVs. Em cepas de cianobactérias que são eficientes produtores de OMVS, as preparações de exoproteome são geralmente laranja devido à presença de carotenóides associados a essas estruturas lipídico14,15. No entanto, esta característica pode variar consideravelmente dependendo da estirpe de cianobactérias e da fase de crescimento. A fim de avaliar a contribuição das proteínas por OMVs, devem ser acrescentados passos de ultracentros ao procedimento22. Além disso, as proteínas que atingem o espaço extracelular devido à lise celular podem ser detectadas coletando-se amostras em diferentes fases de crescimento e aumentando o número de repetições.

Como mencionado anteriormente, uma vez que muitas cepas de cianobactérias produzem polímeros de carboidratos extracelulares (EPS), as preparações de exoproteoma também podem ter EPS em sua composição. A etapa de filtração deve reter EPS mais complexos e grandes, mas frações EPS mais simples podem eventualmente passar. Consequentemente, a contaminação com grandes quantidades de carboidratos pode interferir na análise do exoproteoma. Por exemplo, esta contaminação pode causar um atraso na separação de proteínas em géis de poliacrilamida, bem como mascarar proteínas menos abundantes. Protocolos alternativos têm sido propostos para o isolamento de exoproteoma com o objetivo de remover as biomoléculas contaminantes presentes no meio extracelular, mas mostraram-se muito seletivas, o que pode levar a perfis de exoproteoma tendenciosos13. Por outro lado, uma certa quantidade de proteínas pode ser presa em frações EPS mais complexas se elas estiverem presas no filtro. Neste caso, a análise de preparações de exoproteoma de diferentes fases de crescimento/condições experimentais, bem como análises das proteínas em frações EPS, pode ajudar a identificar as proteínas aprisionadas.

Globalmente, os protocolos aqui descritos incorporam as etapas cruciais para o isolamento eficiente de polímeros de carboidratos liberados cianobactérias e exoproteomes. Mais importante, eles podem ser facilmente adaptados de acordo com necessidades específicas do usuário e incluem outras cepas bacterianas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelos fundos do Fundo Europeu de desenvolvimento regional (FEDER) através do programa de competitividade e internacionalização da 2020 concorrência (POCI), Portugal 2020 e dos fundos portugueses através da FCT-Fundação para a ciência e a tecnologia/Ministério da ciência, tecnologia e ensino superior no âmbito do projecto POCI-01-0145-FEDER-028779 e a subvenção SFRH/BD/99715/2014 (CF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dialysis membranes Medicell Membranes Ltd  DTV.12000.07 Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll 
Ethanol 96% AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. 4.000.02.02.00 Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm Fisher Scientific, Lda 15206869 Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K Merck Millipore Ltd. UFC900324 Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Fisher Scientific, Lda 10741395 Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate  Sigma Aldrich Química SL B2025-1EA Coomassie blue 

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