החקירות האלקטאליות של הפונקציה Retinogeniculate ו Corticogeniculate סינפסה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להכנת פרוסות מוח חריפה המכילים את הגרעין הגנוקה לרוחב ואת החקירה אלקטרופיסיולוגית של הפונקציה retinogeniculate ותפקוד הסינפסות. פרוטוקול זה מספק דרך יעילה לחקר הסינפסות עם שחרור גבוה והסתברות נמוכה של שחרור באותן פרוסות מוח חדות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, X., Wang, D., Kegel, M., von Engelhardt, J. Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function. J. Vis. Exp. (150), e59680, doi:10.3791/59680 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

גרעין הג הצדדי הוא תחנת הממסר הראשונה למידע החזותי. ממסר נוירונים של הגרעין התלמי הזה לשלב קלט מתאי גנגליון רשתית ולהקרין אותו קליפת הראייה. בנוסף, ממסר הנוירונים לקבל עירור מלמעלה למטה מן הקליפה. שני תשומות ההתרגשות העיקריים לנוירונים בממסר שונים במספר היבטים. כל תא עצב ממסר מקבל קלט מתוך מספר סינפסות retinogeniculate בלבד, שהם מסופים גדולים עם אתרי שחרור רבים. זה משתקף על ידי עירור חזק זהובה, הנוירונים ממסר לקבל, מתאי גנגליון הרשתית. הסינפסות Corticogeniculate, לעומת זאת, הן פשוטות יותר עם כמה אתרי שחרור וחוזק סינפטית חלש יותר. שתי הסינפסות שונות גם בפלסטיות הסינפטית לטווח קצר. לסינפסות retinogeniculate יש הסתברות גבוהה לשחרר וכתוצאה מכך להציג דיכאון לטווח קצר. לעומת זאת, corticogeniculate הסינפסות יש הסתברות שחרור נמוך. סיבים Corticogeniculate לחצות את גרעיני התלתלמי לפני הכניסה לגרעין הגנוקה לרוחב. המיקומים השונים של הגרעין הטרתלמי הציקולאני (הרוסטרולי מתוך גרעין הג הצדדי) ומערכת האופטית (ונקטרו-מהצד מגרעין הג הצדדי) מאפשרים מגרה corticogeniculate או retinogeniculate בנפרד עם אלקטרודות של גירוי מסחטות. זה הופך את הגרעין לרוחב מצוי באזור המוח האידיאלי שבו שני סינפסות מרגש עם תכונות שונות מאוד גישו על אותו סוג תא, ניתן ללמוד בו זמנית. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את ההקלטה מהעברת נוירונים ולבצע ניתוח מפורט של הפונקציה retinogeniculate ואת corticogeniculate סינפציה בפרוסות מוח חריפה. המאמר מכיל פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הדור של פרוסות מוח חריפה של הגרעין הגניקה לרוחב ושלבים עבור ההקלטה פעילות מהעברת הנוירונים על ידי גירוי מערכת האופטית וסיבים corticogeniculate בנפרד.

Introduction

ממסר נוירונים של גרעין הג לרוחב לשלב ולהעביר מידע חזותי לקליפת הראייה. נוירונים אלה מקבלים קלט מרגש של התאים גנגליון באמצעות הסינפסות retinogeniculate, אשר מספקים את הכונן העיקרי ה, הכולל את הדחף המרכזי לנוירונים. בנוסף, ממסר הנוירונים מקבלים כניסות מהנוירוטית מנוירונים באמצעות corticogeniculate הסינפסות. יתר על כן, ממסר הנוירונים לקבל תשומות מעכבות של האינטרנוירונים מקומיים ו GABAergic נוירונים של הגרעין של רטיקולאריס thalami1. הגרעין ברטיקולריס thalami נמצא כמו מגן בין תלמוס לקליפת המוח, כך שסיבים מקרינים מקליפת התלמוס ובכיוון ההפוך, חייבים לעבור דרך הגרעין רטיקולאריס thalami2.

כניסות retinogeniculate ו corticogeniculate תשומות להציג תכונות סינפטית נפרדות3,4,5,6,7,8. כניסות retinogeniculate טופס מסופים גדולים עם מספר אתרי שחרור9,10. לעומת זאת, כניסות corticogeniculate מציגות מסופים קטנים עם אתרי שחרור בודדים7. בנוסף, הסינפסות retinogeniculate ביעילות כונן פוטנציאל הפעולה של הנוירונים ממסר למרות מהווה רק 5-10% של כל הסינפסות על ממסר נוירונים3,8,11. Corticogeniculate הסינפסות, לעומת זאת, משמש מאפטור של שידורי retinogeniculate על ידי שליטה על פוטנציאל הממברנה של ממסר נוירונים12,13.

אלה שני תשומות ההתרגשות העיקריים להעברת הנוירונים הם גם שונה מבחינה פונקציונלית. אחד ההבדל הבולט הוא דיכאון לטווח קצר של הסינפסות retinogeniculate ואת ההנחיה לטווח קצר של הסינפסות corticogeniculate3,5,8. הפלסטיות הקצרת-טווח מתייחס לתופעה שבה משתנה חוזק הסינפטית כאשר הסינפסה פעילה שוב ושוב תוך פרק זמן של מספר אלפיות-שניה ועד מספר שניות. ההסתברות לשחרור סינפטית היא גורם חשוב המשמש לפלסטיות לטווח קצר. סינפסות, עם הסתברות שחרור נמוך הראשונית, להציג הקלה לטווח קצר עקב הצטברות של Ca2 + ב preסינפסה ולכן עלייה בהסתברות השחרור נצפתה על פעילות חוזרת. לעומת זאת, הסינפסות עם הסתברות שחרור גבוה להציג בדרך כלל דיכאון לטווח קצר עקב דלדול של שלפוחיות מוכנות ושלפוחית14. בנוסף, הפחתת רגישות של קולטנים פוסט-סינפטית תורמת הפלסטיות לטווח הקצר בכמה סינפסות הסתברות גבוהה מהדורה8,15. הסתברות גבוהה לשחרור והפחתת הרגישות של α-אמינו-3-הידרוxy-5-מתיל-4-isoxazolepropionic חומצה (אמפא) קולטנים תורמים לדיכאון הבולט לטווח קצר של הסינפסות retinogeniculate. לעומת זאת, ההסתברות לשחרור נמוך מהווה את ההנחיה לטווח הקצר של הסינפסות הcorticogeniculate.

בעכברים, המערכת האופטית נכנסת לגרעין של הג הצדדי (dLGN) מהאתר של קודולצלעות, בעוד שסיבים corticogeniculate נכנסים לתוך ה-dLGN rostroventrally. המרחק בין שני הקלטים מאפשר לחקור את המאפיינים הפרטניים של שני כניסות מרגש שונות מאוד אל אותו תא. כאן, אנו בונים על ולשפר את שיטת הניתוח שתוארה בעבר, שבו סיבים retinogeniculate והוא נשמר בפרוסות מוח חריפה3. אנו, לאחר מכן, לתאר את החקירה אלקטרופיסיולוגית של העברת נוירונים וגירוי של retinogeniculate וסיבים corticogeniculate עם אלקטרודות לתוך הגירוי. לבסוף, אנו מספקים פרוטוקול למילוי של נוירונים ממסר עם ביוציטוטין וניתוח אנטומי הבאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי פאנל הפיקוח הממשלי על ניסויים בבעלי חיים של ריינלנד-פפאלץ.

1. פתרונות

  1. תמיסת חיתוך
    1. כדי להפחית את ההתרגשות, הכינו פתרון מבוסס כולין לשימוש במהלך הניתוח כפי שהוצג כאן (ב-mM): 87 נארל, 2.5 KCl, 37.5 כולין כלוריד, 25 נחקו3, 1.25 נה2פו4, 0.5 Cacl2, 7 mgcl2, ו 25 גלוקוז. הכינו את פתרון הניתוח פחות משבוע לפני הניסוי.
  2. פתרון הקלטה
    1. הכנת נוזל מלאכותי מוחין השדרה (ACSF) פתרון המכיל (ב mM): 125 הנאקל, 25 נחקו3, 1.25 נה2PO4, 2.5 Kcl, 2 קא2, 1 mgcl2, ו 25 גלוקוז. להוסיף 50 μM D-APV ו-10 μM SR 95531 הידרוברומיד כדי לחסום N-מתיל-D-aspartate (NMDA) ובהתאם לקולטנים,בהתאמה .
  3. פתרון תאיים
    1. להכין פתרון תאיים המכיל (ב מ): 35 Cs-gluconate, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, ו 0.1 D-600 (מתיונין הידרוכלוריד). להתאים את ה-pH ל 7.3 עם CsOH. סנן, משתמש ואחסן את פתרון המניה ב-20 ° c עד השימוש.

2. חיתוך והרכבה

  1. הכינו שני תאי פרוסה, שמהם הוא מלא 100 mL של פתרון החיתוך והשני עם 100 mL של פתרון ההקלטה. מניחים את שני הספלים לתוך אמבט מים (37 ° c) ובועה את הפתרונות עם קרבוסג'ן לפחות 15 דקות לפני הקרע.
  2. למלא גביע פלסטיק עם 250 mL של כמעט קרח קר (אך לא קפוא) פתרון חיתוך. בועה עם קרבוגן לפחות 15 דקות לפני השימוש.
  3. ממלאים צלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ x 20 מ"מ), שבה יבוצע ניתוח המוח, עם פתרון החיתוך הקר. מניחים פיסת נייר סינון לתוך המכסה של צלחת פטרי.
  4. . תירגע בחדר הניתוח של הרטט
  5. הכשלי עכבר עם 2.5% isofלבנה, למשל, בכלוב העכבר. ברגע העכבר אינו מגיב צביטה זנב, לערוף את העכבר ליד לשד צוואר הרחם ולטבול את הראש לתוך הפתרון לקרע קר קרח בבסיס של צלחת פטרי.
  6. חותכים את העור של הראש מקאואל אפי ולשמור אותו לצד האצבעות כדי לחשוף את הגולגולת. כדי להוציא את המוח הקדמי, לחתוך תחילה את הגולגולת יחד עם האמצע האחורי הקדמי, ולאחר מכן לחתוך שתי פעמים יותר דרך תפר המונונאליות ואת התפר כבשה (איור 1A).
  7. הסירו את הגולגולת בין תפר העור ותפר העור כגון המוח נחשף. חותכים את נורת הריח ומפרידים את המוח הקדמי מהמוח עם להב דק (איור 1B). מסירים את המוח מהגולגולת עם מרית דקה ומניחים אותו על נייר הסינון במכסה של צלחת פטרי.
    הערה: שלבים 2.6 ו 2.7 יש לבצע מהר ככל האפשר כדי להפחית את מוות התאים.
  8. כדי לשמור על שלמות החושים הסנסוריים והחושיים לרכיב ה-dLGN בפרוסת המוח, הפרידו בין שתי האונות בעזרת זווית של 3/5 ° (איור 1C,D). מייבשים את המישורים המנייביים של שתי ההמיספרות על ידי הצבת אותם על נייר הסינון ולאחר מכן הדבק אותם אל השלב החותך בזווית של 10-25 ° מהמטוס האופקי (איור 1E).
  9. הניחו את הבמה במרכז מגש המתכת, ושופכים בעדינות את שאר הפתרון לחיתוך קר הקרח לתוך מגש המאגר. בצע צעד זה בזהירות מכיוון שזרימה חזקה עשויה להסיר את המוח המודבק (איור 1F).
  10. מניחים את מגש המאגר לתוך מגש מלא קרח, אשר מסייע לשמור על טמפרטורה נמוכה במהלך הניתוח. גזור 250 יקרומטר פרוסות עם להב תער במהירות של 0.1 מ"מ/s ומשרעת של 1 מ"מ.
  11. שמרו פרוסות בתא המעצר מלאות בתמיסה לחיתוך חמצן ב-34 ° c לערך 30 דקות ולאחר מכן הניחו לפרוסות להתאושש בפתרון ההקלטה ב-34 ° c לעוד 30 דקות.
  12. לאחר ההחלמה, להסיר את התא המחזיק את הפרוסה מאמבט מים ולשמור פרוסות בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש בניסויים.

3. אלקטרופיזיולוגיה

  1. משוך את הפיפטות באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט ולאחר מכן לפולר. שמרו על עמידות ההקלטה ב-3-4 MΩ. משוך את הפיפטות הגירוי באותו פרוטוקול, אך שבור מעט את הקצה לאחר שהוא מושך להגדיל את הקוטר. ממלאים את ההקלטה בעזרת התמיסה התאיים והביולוציטין, תוך כדי מילוי הרטט עם פתרון ההקלטה.
  2. מניחים את הפרוסות בתוך חדר ההקלטה ומאפשרות באופן רציף את הפרוסות בעזרת פתרון הקלטה מחמצן ב-RT. בדוק את כל הפרוסות ובחר את אלה שמציגים מערכת אופטית ללא שינוי.
  3. המחש את הפרוסה והתאים במיקרוסקופ זקוף המצויד בניגוד הפרעות אינפרא-אדום (IR-DIC) וידאו מיקרוסקופ.
    הערה: ממסר הנוירונים הם הבדיל בין interneurons על ידי גודל הסומה הגדול שלהם יותר הדנדריטים העיקרי (סניפים המתעוררים מן הסומה). אינטרנוירונים להציג מורפולוגיה דו-קוטבית עם הסומה קטן.
  4. הניחו את הפיפטה הגירוי על הפרוסה לפני שאתם מקליטים את התא עם הפיפטה המוקלט. כדי לחקור את הסינפסות retinogeniculate למקם את הצינורות הגירוי ישירות על מערכת האופטית, שם סיבי אקסון מתאים גנגליון הרשתית הם ארוזות (איור 2a). כדי לנתח את הסינפסות corticogeniculate, הציבו את האלקטרודה המעוררת על הגרעין של ראקולאריס thalami, שהוא בצמוד ל-dLGN (איור 2B).
  5. לאחר שפיפטה ההקלטה שקוע לתוך פתרון ההקלטה, להחיל 5 וולט הצעד מתח כדי לפקח על ההתנגדות הפיפטה. הגדר את הפוטנציאל המחזיק ב-0 mV ובטל את הפוטנציאל הנגדי כך שהזרם המחזיק הוא 0 pA.
  6. גש לתא עם הפיפטה המוקלט. בזמן הפעלת לחץ חיובי כאשר הפיפטה נמצא במגע ישיר עם קרום התא, לשחרר את הלחץ החיובי, ולהגדיר את הפוטנציאל המחזיק-70 mV. החלת לחץ שלילי קל כדי לאפשר את קרום התא להצמיד את הזכוכית לצינורות כגון החותמות של ג'יגה אוהם (עמידות > 1 GΩ). לפצות את הקיבולת של הצנרת ולפתוח את התא על ידי יישום של פולסים בלחץ שלילי.
  7. כדי לחקור את הפונקציה סינפטית, להחיל 0.1 ms הפולסים הנוכחיים (ca. 30 μA) דרך הפיפטה גירוי. אם לא נצפו תגובות סינפטית, ייתכן שיהיה צריך להחליף את הפיפטות הגירוי. היזהרו בזמן הצבת הפיפטות הגירוי לתנוחה אחרת, כך שהתא המוקלט לא יאבד.
    הערה: בהקלטות לדוגמה המוצגות באיור 2, הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר, נחקר על-ידי עירור הסיבים האופטיים או סיבי הcorticogeniculate פעמיים עם 30 אלפיות השנייה של מרווחי הגירוי. היחס מזווג הדופק (PPR) חישב על ידי חלוקת משרעת של הזרם השני מרגש פוסט-סינפטית (EPSC) על ידי זה של EPSC הראשון (EPSC2/epsc1). כל פרוטוקול גירוי חזר 20 פעמים. משרעת EPSC נמדדו מתוך הזרמים הממוצעים של 20 מטאטא. מרווח הזמן בין כל חזרה היה לפחות 5 s כדי למנוע הפלסטיות לטווח קצר הנגרמת על ידי חזרות.
  8. עקוב אחר התנגדות הסדרה ברציפות על-ידי החלת צעד מתח 5-mV. רק להשתמש בתאים עם התנגדות הסדרה קטן יותר 20 MΩ לניתוח.

4. תיוג ביולוציטין

  1. שמור על תצורת התאים השלמה לפחות 5 דקות כדי לאפשר דיפוזיה של ביוציטוטין לתוך הדנדריטים הדידיטים.
  2. לאחר ההקלטה, להסיר בעדינות את הפיפטה מתא כך הסומה לא נהרס.
    הערה: אם יותר מתא אחד נרשם בפרוסה אחת, יש להתרחק ממנו בצורה מספקת מהתאים השכנים שלהם. ודא שהדנדריטים מתאים שונים אינם מפריעים זה לזה במהלך ההדמיה.
  3. הכינו לוחית של תרבית תאים באורך 24 שעות. ממלאים כל טוב עם 300 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית). הקפד לא לזהם שום דבר עם הב, כי יהיה במגע עם הפרוסות להיות מוקלט.
  4. העבירו את הפרוסות מתא ההקלטה ללוח הכולל את המשטח עם פיפטה גומי ותקנו את הפרוסות בלילה. ודא שהפיפטה תמיד מנועה מהזיהום בה,
    התראה: תמיד לבש כפפות והשתמש במכסה כימי כשאתה מתמרן את השימוש בלגון.
  5. לאחר שהוא מתקן פרוסות לילה בתוך המטה, החליפו את הכדורגלן עם תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS). אחסן את הפרוסות ב-PBS ב-4 ° צ' לעיבוד עתידי (פחות מ 2 שבועות).
  6. שטוף את הפרוסות באמצעות הערוץ החדש 3 פעמים (10 דקות כל כביסה).
  7. חסימת אתרי קשירה לא ספציפיים על-ידי הדיסת הפרוסות בפתרון החסימה (0.2% שאינו מוגדר על-ידי החלפת שקעים ו-5% סרום בקר בערוץ PBS) עבור 2 h ב-RT על שייקר מסלולית.
  8. מחק את פתרון החסימה. מודלת את הפרוסות עם streptavidin-אלקסה 568 מדולל לתוך פתרון חסימת (1:1000) ב 4 ° c לילה על שייקר מסלולית.
  9. להיפטר פתרון נוגדן ולשטוף פרוסות 3 פעמים עם PBS עבור 10 דקות ב RT על שייקר מסלולית. שטוף את הפרוסות בעזרת מי ברז לפני ההרכבה.
  10. שימו את הפרוסות מעכבר אחד על מגלשת זכוכית אחת. ודא שהתאים המוכתמים נמצאים על המשטח העליון של הפרוסות. לספוג את המים סביב פרוסות עם רקמות ולאחר מכן להשאיר את הפרוסות להתייבש במשך כ 15 דקות.
  11. החל שתי טיפות של מדיום הרכבה בכל פרוסה. הר שמיכות בשקופית מבלי לייצר בועות אוויר.
  12. אחסנו את הפרוסות המסומנות ב-4 ° c לאחר הדמיה בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד.

5. הדמיה סלולרית ושיחזור

  1. סרוק פרוסות בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד והשתמש בתוכנה המשויכת לניתוח.
  2. להלהיב את הזריחה ב 561 ננומטר.
  3. תמונה הפרוסות עם 0.7 מפתח נומרי (NA), המטרה טבילה בשמן.
  4. התאימו את התא המיועד באמצע התצוגה והחילו הגדלה של 2.5 פעמים.
  5. רינדור הנתונים של מחסנית Z כדי לסרוק את תא העצב כולו עם הפרמטרים הבאים: פורמט = 2,550 x 2,550 פיקסלים, תדר סריקה = 400 Hz, Z מספר = 40. Voxel גודל היה סביב 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 μm3.
  6. Semi-באופן אוטומטי לעקוב אחר הנוירונים באמצעות תוכנת שחזור עצבי (למשל, NeuronStudio). דוגמה לעצב-על של ממסר מעקב תלת-ממדי מוצג באיור 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנת הפרוסה של dLGN המכיל את המסלולים retinogeniculate מוצג תחת מטרה 4x (איור 2). Axons של תאים גנגליון ברשתית צרור יחד במערכת האופטית (איור 2). הפיפטה המעוררת הונחה על מערכת האופטית כדי לגרום retinogeniculate סינפקה-תיווך הנוכחי (איור 2A) ועל הגרעין רטיקולריס thalami כדי לגרום corticogeniculate סינפסות-מתווכת הנוכחי (איור 2a), בהתאמה. של הערה, אקסונים מנוירונים בקליפת המוח לפרויקטים נוירונים lgn מן הקליפה לתלמוס לחצות את הגרעין רטיקולאריס thalami. הסינפסות Corticogenicluate יכול, לכן, להיות מופעל על ידי גירוי של הגרעין רטיקולאריס thalami.

היחס לזווג הדופק של הקולטן אמפא-תיווך EPSCs הוא מתחת 1 כאשר מגרה את המערכת האופטית עם 30 ms באמצעות מרווח בין גירוי, אבל מעל 1 כאשר מגרה סיבים corticogeniculate עם אותו מרווח בין גירוי (איור 2C,D) . הדיכאון לזווג הדופק של סינפסות retinogeniculate הוא בשל הסתברות גבוהה שלפוחית האור ואת הפחתת הרגישות של קולטני הפוסט-סינפטיות. הקלה לזווג הדופק של הסינפסות corticogeniculate הוא עקבי עם שחרור שלפוחית נמוכה הסתברות16.

איור 3A מציג תמונה IR-DIC המציגה את הסומה של תא ממסר dlgn יחד עם קצה הצנרת טלאי. הצביעת הביולוציטין מאפשרת לנו לקבל תצוגה של תא העצב המוקלט. שונה מ interneurons, אשר יש דו קוטבית מורפולוגיה, ממסר הנוירונים יש סוכת דנדריטים הקוטב (איור 3b) המכיל יותר מ 3 דנדטים הראשי8,17. שחזור תלת מימדי (3D) של תא עצב ממסר ביוציטוטין נוצר לאחר מכן אשר מראה ארכיטקטורה הדנדריטים סימטרי ברדירית (איור 3D).

Figure 1
איור 1 : תוכניות המייצגות את פרוטוקול הניתוח. (א) מבט אופקי של גולגולת העכבר, מראה את המיקום של חתכים הראשונית. החתך הראשון בוצע יחד עם תפר המשונן, ואחריו שני חתכים אחרים יחד עם תפר הקורונאליות ואת התפר כבשה, בהתאמה. קווים מקווקווים מייצגים את החתכים. (ב) משונן מבט של המוח כולו. קווים מקווקווים מצביעים על כך שהמוח מבודד מנורת הריח ומהמוח האמצע. (C-D) פאנלים אלה מראים את זווית החיתוך הראשונה כדי להפריד בין שתי האונות מאופקי (C) ו ילתית (D) תצוגה, בהתאמה. (ה) השקפה מקורלית של כחצי הכדור בשלב החיתוך. קווים מקווקווים מציינים את כיוון החיתוך. l, m, d, ו-v מייצגים את ההיבטים הצדדיים, המדיריים, הגריים והגריים, בהתאמה, עבור החצי הכדור בפאנלים D ו-E. (F) דיאגרמה של חדר הניתוח עם שתי האונות על הבמה חיתוך. החץ המקווקו מציין את כיוון ההזזה של להב החיתוך. a, p, ו-d מייצגים את ההיבטים הקדמי, האחורי, ואת האחוריים של האונה השמאלית, בהתאמה. (ז) ערכה המייצגת פרוסה שנחתכה כהלכה עם חלק גדול יחסית של ה-dlgn ושימור שלם של מערכת הראייה. הגרעין הרוחבי של הגנום האנכי; הגרעין הרוחבי הגחוני; OT, נורת ריח; . בסדר. פאנלים C, D ו-G שונו מתוך איור 1 של טרנר ומלח3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : הכנת פרוסה של dLGN המכיל את מסלולים retinogeniculate ואת ההקלטות למשל. (א-ב) לוחות אלה להראות פרוסה dLGN עם שימור של retinogeniculate וכניסות. האלקטרודה גירוי הונחה על מערכת האופטית כדי להפעיל את הסינפסות retinogeniculate (A) ועל הגרעין ברטיקולאריס thalami להפעיל corticogeniculate סינפסות (ב). (ג) הקולטן אמפא-תיווך EPSCs בתגובה לגירוי של מערכת האופטית פעמיים עם 30 ms מרווח בין גירוי. (ד) Corticogeniculate סינפסה-זרמים בתיווך עם 30 ms באמצעות מרווח בין גירוי. חפצי הגירוי הוסרו למען הבהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : ניתוח מורפולוגי של תא ממסר. (א) תמונה-DIC המציגה את הסומה של תא העצב של ממסר dlgn עם קצה הצנרת של המדבקה. (ב) מוקד של תא עצב של ממסר המסומן בביולוציטין ודמיינו עם Streptavidin-אלקסה 568. (ג) שחזור תלת מימדי (3d) של אותו תא העצב, מראה ארכיטקטורה הדנדריטים סימטרי ברדירית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים פרוטוקול משופר המבוסס על שיטה שפורסמה בעבר3, אשר מאפשר את החקירה של ההסתברות הגבוהה של הסינפסות retinogeniculate הסתברות נמוכה של שחרור corticogeniculate הסינפסות מאותה פרוסה. זה חשוב מאוד מאז שני כניסות אלה אינטראקציה אחד עם השני כדי לווסת את שידור האות החזותי: כניסות retinogeniculate הם הכונן העיקרי של ממסר הנוירונים, בעוד corticothalamic תשומות פונקציה כמו מאפטור, אשר משפיע על הרווח של שידור retinogeniculate על ידי השפעה על מצב של ממסר נוירונים. כצפוי, הבחנו כי הסינפסות retinogeniculate להציג הפלסטיות שונים לטווח קצר עקב ההבדל בשחרור הסבירות שלהם. בנוסף, הפחתת הרגישות של אמפא תורמת גם לדיכאון החזק בסינפסות retinogeniculate9,15,16. לאחרונה הראינו כי דיכאון לטווח קצר הוא מאופנן על ידי CKAMP4416, חלבון העזר של לקולטן אמפא של משפחת ckamp כי מאט את ההחלמה מן הפחתת הרגישות של הקולטנים של אמפא18,19, 20. יתר על כן, retinogeniculate סינפקה-בתיווך ההגברה הנוכחית גבוהים יותר מאשר אלה של corticogeniculate סינפסה בתיווך תחת כוח מגרה אותו, עקבי עם הסינפסות retinogeniculate גדול עם מספר שחרור אתרים, והסינפסות corticogeniculate קטנות יחסית7,21.

פרוטוקול החיתוך הוא ביסודו זהה לזה שפותח על ידי טרנר ומלח3. כמה שינויים שהיו מבוססים על הניסיון שלנו שיפור איכות הפרוסה. בדומה ל-האוזר ואח '22, השתמשנו בכלי מבוסס על כולין במקום בפתרון לחיתוך מבוסס-שושנים. שחזור לאחר הניתוח נעשה ב 34 ° c בפתרון חיתוך עבור 30 דקות ולאחר מכן בפתרון ההקלטה עבור 30 דקות נוספות ולא בטמפרטורת החדר. פרוסות היו מעט דליל יותר (250 יקרומטר במקום 400 יקרומטר). אנו לגזור מוחות באמצעות טריז עם זווית של 10-25 °, אשר מקל ומגביר את האמינות של הליך הפרוסות.

תנאי הקלטה וגירוי לחקירת התפקוד של תא העצב ממסר הפונקציה הם בעצם אותו דבר כפי שמתואר בעבר על ידי חן ו Regehr8. הפעלה של סיבי מערכת האופטית בדרך כלל מעורר זרמים גדולים שלה יכול להיות בטווח של מספר nA כאשר כל הסינפסות retinogeniculate על הנוירונים ממסר אחד מופעלים23. כדי למנוע שגיאות התנגדות סדרה, במיוחד כאשר בחקירת הזרם המקסימלי על ידי הפעלת כל הסינפסות retinogeniculate על הנוירונים ממסר אחד, צ'ן ו Regehr בשימוש הקלטה התנגדות נמוכה פיפטות (< 2 MΩ). עם זאת, כדי לחקור את הפלסטיות לטווח קצר סינפטית, זה מספיק כדי להפעיל את אחד או כמה מספר האקסון של תא גנגליון הרשתית, אשר מעורר את הזרמים הנמצאים בטווח של 34 ל579 pA (תוצאות שלא פורסמו, חן ואח '). פיפטות קטנות יותר עם התנגדות בין 3 ל 4 MΩ יכול, לפיכך, לשמש כאשר חקירת הפונקציה retinogeniculate באמצעות גירוי חלש של מערכת האופטית. הפעלת הסינפסות הcorticogeniculate מעוררת את הזרמים הקטנים היחסית שלה16. שגיאות עמידות בסדרה הן, לכן, בעיה קטנה יותר בעת חקירת פונקציית corticogeniculate סינפסה.

אנחנו כאן מראים כי גירוי של retinogeniculate ו הסינפסות ניתן להשתמש כדי לחקור את הפלסטיות לטווח קצר של מתווכת קולטן של אמפא. ניתן להחיל את אותו הפרוטוקול על מנת להקליט את הNMDA של קולטן בתיווך24. למעשה, אחד הסימנים הראשונים שקולטן אמפא הפחתת הרגישות תורמת הפלסטיות לטווח קצר בסינפסות retinogeniculate הגיע מניסויים שבהם יחס מזווג הדופק של הזרם מתווך קולטן של אמפא השוו עם לזווג הדופק יחס של זרמים NMDA-בתיווך. הסינפסות Corticogeniculate היו מגורה על ידי מיצוב את הפיפטה גירוי של הגרעין ברטיקולריס thalami משום אקסונים של נוירונים בקליפת המין כי להלהיב dlgn הממסר לנסוע ברחבי הגרעין התלמי הזה. ניתן להשתמש באותה תנוחה גירוי כדי ללמוד זרמים סינפטיים מעכבות ב dLGN כפי שמוצג למשל על ידי גובינא ו קוקס25.

העברת נוירונים לבטא את נגבהA ו נגבהב קולטנים. שחרורו של נגבה מפעיל את הסינפטיות בקולטנים. קולטנינגבה , שהם extrasynaptically המותאמות לשפות אחרות, מופעלים כאשר הגרעין רטיקולאריס thalami מופעל בחוזקה למשל במהלך ירי בפרץ26,27,28. גולש של נגבה, אשר מוגבל בדרך כלל בשל הספיגה של נגבה על ידי astrocytes, יכול להפעיל במהלך הפעלת סינפסה אינטנסיביבקולטנים מחוץ לסינפטיות27,28. לא הצלחנו לחסום את קולטני נגבהB מכיוון שעוצמת הגירוי והתדר היו זהובה בשפל. עם זאת, כאשר בחקירת פונקציה corticogeniculate סינפציה באמצעות פרוטוקולים גירוי אינטנסיבי זה עשוי להיות עדיף להוסיף קולטני נגבהB .

הקלטות של הנוירונים ממסר dlgn יכול בקלות להתבצע בעת שימוש בפרוסות כי הם כ 2 מ"מ המדילי מהמשטח הרוחבי של המוח (להתחיל לאסוףכ 8 של 250 יקרומטר פרוסות במהלך ההליך חיתוך). בפרוסות מסוימות, לא שני התשומות לעצב ממסר נתון ניתן להבחין כי אחד משני מסלולים מנותקים קרוב לעצב הממסר. במקרה זה, זה בדרך כלל אפשרי עדיין לחקור retinogeniculate ו הסינפסות בפרוסה זהה על ידי בחירת נוירונים ממסר שונים עבור כל קלט. כדי להקליט retinogeniculate סינפקה בתיווך הנוכחי, ventrally הממוקם ממסר נוירונים נבחרו מאז סיבי במערכת האופטית לתאים אלה נוטים יותר להישמר מאשר בתאי הממסר ממוקם דורסלי. לעומת זאת, תשומות corticogeniculate נוטים יותר להישמר על הנוירונים ממסר כי הם ממוקמים בתוך dLGN.

איכות הפרוסה קובעת את מהימנות הנתונים. בהתבסס על הניסיון שלנו, הפרמטרים הבאים חיוניים כדי להבטיח איכות פרוסה טובה. צינון וחמצן הם גורמים חשובים במהלך תהליך הניתוח. יש לשמור על ראש העכבר בתמיסה קרה מיד לאחר עריפת הראש של העכבר. כאשר לוקחים את המוח מתוך הגולגולת, זה צריך להיות שקוע בתמיסת קרח קר כל 3 כדי 4 כדי להפחית את מוות התאים. כמו כן, יש לבצע את תהליך הפריסה בסביבות 4 ° c. יתר על כן, פתרון ניתוח והקלטה צריך להיות חמצן לפחות 15 דקות לפני השימוש כדי לשמור על ריכוז מספיק חמצן. בנוסף, חסימת ערוצי נתרן יכולה להפחית ביעילות את פעילות תא העצב. לפיכך, נעשה שימוש בפתרון לחיתוך המכיל 37.5 ממול כולין.

ממסר נוירונים להציג קוצים סף נמוך, אשר מופקים על ידי Ca הארעי2 + נוכחי29. כדי לחסום מתח מגודרת Ca2 +ערוצים, הוספנו D-600 (methoxyverapamil) לפתרון תאיים. D-600 לא צריך להיות בשימוש אם המטרה של המחקר היא לחקור קוצים הסף נמוך בממסר נוירונים. הדיוק של ההקלטות של מהדק המתח של התא השלם מושפע משגיאות קלאמפ של החלל. בעיה טכנית זו היא רלוונטית יותר עבור תשומות הרחק מהאלקטרודות ההקלטה (ובכך עבור הסינפסות)30,31. כדי למזער את ההשפעה של שגיאת הצבת החלל,השתמשנו מבוסס Cs במקום פתרון מבוסס-K+מבוססי. הערוצים K+ חדירות (למשל, ערוצי דליפה) הם בדרך כלל Cs+ בלתי חדיר32. כך, השימוש בפתרון מבוססי Cs+מבוסס-תאיים מגביר את העכבה של התא.

יציבה הקלטת הדק הקלטה תלוי בבחירת תאים בריאים. נוירונים עם צורת סומה עגול, צבע כהה או בסומה נפוחות יש להימנע. יתר על כן, ממסר הנוירונים נבדלים מן האינטרנוירונים המקומי על ידי גודל הסומה הגדול שלהם מורכבים יותר arbors הדנדריטי הראשי. לכן, בחרנו תאים בעלי גודל סומה גדול יותר (גדול יותר 15 יקרומטר בקוטר) ומורפולוגיה שאינה דו-קוטבית. התא לדוגמה המוצג באיור 3B יש ארכיטקטורה דנדריטים סימטרית והוא יכול, לפיכך, להיות מסווג כמו תא הממסר דמוי-Y-נוירונים כי הם למשל למצוא את החתול lgn17.

התנגדות סדרה צריך להיות קטן ככל האפשר ומתוחזק קבוע. כמו-כן, מאחר שהתשומות משני כיוונים נשמרים בפרוסה אחת, חשוב להיפטר מההפרעות בין שתי הכניסות. כדי להימנע מהפעלת סיבי corticogeniculate בעת הקלטת סינפאוג'איפיקלקה מתווכת-זרמים בתיווך או להיפך, אין להכניס את הפיפטה המעורר לתוך ה-dLGN והמרחק בין הפיפטה המעורר וההקלטה צריך להיות עד אפשרי. בנוסף, המרחק הארוך בין הגירוי וההקלטה מחייב שימור האקסון באופן יחסי. לכן, יש לבחור זווית חיתוך נכונה עבור הניתוח. באופן כללי, ניתן להשיג רק אחת או שתיים פרוסות עם שימור של שני כניסות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) בתוך מרכז מחקר שיתופי (SFB) 1134 "הרכבים פונקציונליים" (J.v.E. ו X.C.) ואת המענק מחקר EN948/1-2 (J.v.E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier  HEKA Elektronik EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin Sigma-Aldrich B4261-250MG
CaCl2 EMSURE 1.02382.1000
choline chloride Sigma-Aldrich C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope Leica Microsystems TCS SP5
CsCl EMSURE 1.02038.0100
Cs-gluconate Self-prepared Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves 
D-600  Sigma-Aldrich M5644-50MG methoxyverapamil hydrochloride
D-APV  Biotrend  BN0085-100 NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope Olympus XM10
EGTA SERVA 11290.02
Forene Abbvie 2594.00.00 isoflurane
Glucose Sigma-Aldrich 49159-1KG
HEPES ROTH 9105.2
High Current Stimulus Isolator World Precision Instruments A385
KCl EMSURE 1.04936.1000
MgCl2 EMSURE 1.05833.0250
Micromanipulators Luigs & Neumann SM7
Miroscope Olympus BX51
mounting medium  ThermoFisher Scientific P36930 Prolong Gold Invitrogen
NaCl ROTH 3957.1
NaH2PO4 EMSURE 1.06346.1000
NaHCO3 EMSURE 1.06329.1000
Pipette Hilgenberg 1807502
Puller Sutter  P-1000
razor blade  Personna  60-0138
Semiautomatic Vibratome Leica  Biosystems VT1200S
SR 95531 hydrobromide  Biotrend  AOB5680-10 GABAA-receptor antagonist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
  2. Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
  3. Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510, (3), 829-843 (1998).
  4. Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
  5. Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
  6. Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
  7. Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
  8. Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28, 955-966 (2000).
  9. Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
  10. Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
  11. Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
  12. Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. (1997).
  13. Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
  14. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).
  15. Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
  16. Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
  17. Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
  18. von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
  19. Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
  20. Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
  21. Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
  22. Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
  23. Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
  24. Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
  25. Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
  26. Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
  27. Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
  28. Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
  29. Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
  30. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  31. White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
  32. Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics