Dolaşım ölümünden sonra kardiyak bağış öncesi klinik model

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, yeni Klima ajanları veya dolaşım ölümünden sonra kardiyak bağış fizibilitesi artırmak için stratejiler değerlendirilmesi için basit ve esnek bir yaklaşım gösterir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Aceros, H., Joulali, L., Borie, M., Ribeiro, R. V., Badiwala, M. V., Der Sarkissian, S., Noiseux, N. Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death. J. Vis. Exp. (150), e59789, doi:10.3791/59789 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kardiyak transplantasyon talebi yükselişte; Yine de, organ mevcudiyeti uygun bağış nedeniyle sınırlıdır. Dolaşım ölümünden sonra organ bağış (DCD) bu sınırlı kullanılabilirliği gidermek için bir çözümdür, ancak uzun süreli sıcak iskemi ve doku yaralanması riski nedeniyle, kardiyak transplantasyon rutin kullanımı nadiren görülür. Bu yazıda, kalp fonksiyonunun sürekli izlenmesi ile DCD bağlamında mevcut klinik uygulamaları yakından taklit eden ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz, yeni kardiyokoruyucu stratejilerin değerlendirilmesine ve müdahalelerin azalmasına izin verme iskemi-reperfüzyon hasarı.

Bu modelde, DCD protokol dolaşım ölümü teşvik etmek için havalandırma durdurularak anestezi Lewis fareler başlatılır. Sistolik kan basıncı 30 mmHg 'ye düştüğünde sıcak iskemik zaman başlatılır. Önceden ayarlanan sıcak iskemik döneminden sonra, kalpler bir normothermic kardiyoplegik solüsyon ile boşaltılır, temin edilir ve bir Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemine monte edilir. İlk reperfüzyon ve stabilizasyonu 10 dk sonra, kalp yenileme intraventriküler basınç izleme kullanarak 60 dk için sürekli olarak değerlendirilir. Kalp hasarı, kardiyak troponin T ölçümüne göre değerlendirilir ve infarkıt büyüklüğü histolojik lekelenme ile ölçülebilir. Sıcak iskemik zaman modülasyonlu ve yapısal ve fonksiyonel hasar istenen miktarda geliştirmek için uyarlanmış olabilir. Bu basit protokol kardiyoplegia, ilk reperfüzyon ve/veya ex vivo perfüzyon sırasında sunulan farklı kardiyokoruyucu Klima stratejilerinin değerlendirilmesi için izin verir. Bu protokolden elde edilen bulgular büyük modellerde yeniden üretilerek klinik çeviriyi kolaylaştırabilir.

Introduction

Genel ve kalp transplantasyonunda katı organ nakli özellikle dünya çapında1,2' de yükselir. Organ alımı standart yöntemi beyin ölümünden sonra bağış (DBD). DBD katı dahil kriterleri göz önüne alındığında, sunulan kalplerin% 40 daha az kabul edilir3, böylece artan talep karşısında teklif sınırlandırmak ve organ bekleme listesini uzatmak. Bu sorunu gidermek için, dolaşım ölümü (DCD) sonrasında bağışlanan organların kullanımı potansiyel bir çözüm olarak kabul edilir4.

DCD bağış, ancak, bakım ve resüsitasyon önce korunmasız sıcak iskemi bir süre geri çekilmesi aşağıdaki bir agonal faz kaçınılmaz5. Dolaşım ölümünden sonra potansiyel organ hasarı organ fonksiyon bozukluğu neden olabilir, rutin DCD kalp nakli benimsemeye isteksizlik açıklayan. Bu sadece 4 merkezleri klinik olarak, çok kısa sıcak iskemi kez ve kronik patolojiler olmadan genç bağış içeren sıkı kriterler ile DCD Hearts kullanmak bildirilmiştir5/6. Etik ve yasal nedenlerden dolayı, dolaşım ölümü5,8,9öncesinde bağışçılardan sınırlı veya hiçbir kardiyokoruyucu müdahaleler uygulanabilir. Böylece, iskemi-reperfüzyon (IR) yaralanmasını hafifletmek için herhangi bir azaltma kardiyoplegik çözümler ile erken reperfüzyon sırasında başlatılan kardiyokoruyucu tedaviler ile sınırlıdır ve uygun fonksiyonel değerlendirme için izin vermez. Ex vivo kalp perfüzyon (evhp) ve özel platformlar kullanarak DCD kalp yenileme alternatif bir çözüm olarak önerilen ve çeşitli akademisyenler tarafından okudu10,11,12,13 . EVHP fonksiyonel kurtarma geliştirmek için DCD kalpleri sonrası Klima ajanlar sunmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Ancak, verimli klinik çeviri için, birçok teknik ve pratik sorunlar ele alınması için, ve bu daha fazla perfüzyon ve fonksiyonel kriterler bir dizi üzerinde uzlaşma eksikliği tarafından transplantability belirlemek için bileşik6, 8' den itibaren.

Burada, ilk reperfüzyon sırasında, satın alma sırasında başlatılan organ sonrası Klima araştırması için kullanılabilecek bir ex vivo kalp perfüzyon sistemi ile birlikte tekrarlanabilir öncesi klinik küçük hayvan DCD protokolünün gelişmesini bildiriyoruz ve /veya EVHP boyunca.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzu 'na uygun tüm hayvan bakımı ve deneysel protokoller, Centre Hospitalier de l 'Université de Montréal araştırma merkezi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. ön preparatlar

  1. Kardiyoplegia teslimat sistemini (Şekil 1a) ve Langendorff ex vivo perfüzyon sistemini (Şekil 1B) ısıtmak için su banyosunu açın. 37 °C çözüm sıcaklığı için su sıcaklığını 38,5 °C ' ye ayarlayın. Kurulum fotoğrafları ek Şekil 1a, B'de görülebilir.
  2. 1 L kardiyoplegik solüsyon hazırlayın. 1 ml% 2 lidokain hidroklorür ve 10 ml 2 mm KCL (son konsantrasyon 20 mm) ile 1 L plazma-Lyte A (140 mm na, 5 mm K, 1,5 mm mg, 98 mm CL, 27 mm asetat, 23 mm glukonat) ekleyin. 6 N HCl kullanarak 7,4 için doğru pH.
    Dikkat: Bu model pH 'ye son derece duyarlıdır. Yanlış pH düzeltmesi (7.3-7.4 fizyolojik aralığı dışında) veya pH kararsız çözümler deneyden ödün verebilir veya güvenilir olmayan veriler sağlayabilir.
  3. Hazırlamak 4 L Krebs çözeltisi (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH2Po4, 1,25 mm CAcl2, 1 mm MgCl2∙ 6h2O, 5,5 mm D-glikoz, 25 mm NaHCO3). 1 L çözüm başına substrat kütleleri aşağıdaki gibi olmalıdır: 6,1 g NaCl, 0,3355 g KCl, 0,2035 g MgCl2∙ 6h2O, 0,192 g Nah2Po4, 0,1387 g CAcl2, 0,99 g D-glikoz, 2,1 g NaHCO3 , ultra saf deiyonized suda 1 L son hacmi. NaHCO ekleyin 3 ' ü yağış önlemek için son. Solüsyonu bir 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin ve bir gecede saklayın. Çözelti 37 °C ' de ve% 5 CO2/95% O2Ile kabarcık 7,4 için pH düzeltin.
  4. Krebs çözeltisi ile Langendorff devresi doldurun ve sistem pompası başlatın. Tüpün içinde hiçbir kabarcıkların bırakıltığınızdan emin olun. Peristaltik pompa hızını 80 RPM 'ye ayarlayın (1 L/dak 'ye eşdeğerdir). İki yönlü durdurma horoz kullanarak, kalp bağlı olana kadar aort kanül aracılığıyla yavaş bir damla korumak için akışını ayarlamak (Şekil 1B). Kalp taşımacılığı için buzda 50 mL konik tüpte Krebs çözeltisi (15 mL) örneği tutun.
  5. Kardiyoplegia teslimat sistemini kardiyoplegik çözelti ile doldurun. Kabarcıklar kaldırıldıktan sonra, 3 yol durdurma horoz kullanarak devre tuzlu geçiş (Şekil 1a). Damla hızını ayarlayın. Tuz, hiçbir kardiyoplegik çözümün hayvanın ölümünden önce enjekte edilmesini sağlamak için kateterin ucundan yavaşça damlatılması gerekir.

2. hayvan hazırlama

  1. Bir inhalasyon odası kullanarak,% 3 Isoflurane ile anestezi neden. Hayvan yanıt vermemeye başladıktan sonra, prosedürün geri kalanı için anestezi korumak için, yerel yönetmeliklere göre, ketamin (75 mg/kg) ve xylazine (5 mg/kg) veya benzer şekilde uygun anestezik bir intraperitoneal enjeksiyon gerçekleştirin. Ayak tutam ve palpebral refleks hiçbir reaksiyon ile anestezi derinliği emin olun.
  2. Hayvanı 14 G, 2 inçlik bir IV kateter kullanarak entüat. Hava yolu basıncı 20 cmH2O ile sınırlı olan dk başına 50 nefes at havalandırma başlayın.
  3. "Orta" olarak ayarlanan bir ısıtma yastığı üzerine hayvan yerleştirin ve vücut sıcaklığını korumak için bir emici Pad ile kapak. Bir rektal sıcaklık sondasını takın ve ayaklarından birine transdermal Nabız oksimetre sensörü takın. Prosedür boyunca 37 °C ' de rektal sıcaklığını koruyun.
  4. Vasküler erişim
    1. Makas kullanarak boynunda 3 ila 4 cm orta çizgi cilt kesi yapın. Künt ucu kavisli makas kullanarak, künt subkutan doku incelemek ve sağ sternohyoid kas maruz. Olmayan travmatik forseps kullanarak, sağ karotis arter kadar yanal kas hareket (titreşimli), juguler ven (non-titreşimli) ve Vagus sinir (beyaz) görsel olarak tanımlanır (Tamamlayıcı Şekil 2a). Dikkatle karotis arter künt uçlu eğri makas kullanarak Vagus sinir ayırın.
    2. Sağ juguler ven yoluyla heparin (2.000 ıU/kg) enjekte. Kan kaçağı önlemek için iğne retraksiyon sonra enjeksiyon site basıncı uygulayın.
    3. Kavisli forseps kullanarak, karotis arter etrafında iki 5-0 ipek sütürler geçirin. Maruz arter üstün açıdan karotis arter okclude için bir distal sütür sıkıca takın. Proksimal sütür çözülmüş tutun. Bir sonraki adımda kanama kontrolü için proksimal sütür çekme kullanılır (Tamamlayıcı şekil 2B). Dikişler arasındaki mesafe yaklaşık 2 cmolmalıdır.
    4. Daha iyi görselleştirme için mikroskoptan kullanarak, dikkatle karotis arter ön duvarı üzerinde mikrocerrahi makas ile 1 mm kesi yapmak. Aort kemerine doğru 22 G, 1 inç kapalı bir IV kateter takın. Kateter, kardiyoplegia teslimat sistemi yoluyla tuz veya kardiyoplegia enjekte etme olasılığı ile, sürekli izleme için bir basınç dönüştürücü bağlantısına izin veren 2 yönlü stop penisine bağlanır (Şekil 1a).

3. dolaşım ölümü (DCD) protokolünden sonra kardiyak bağış başlatılması

Not: Tam bir protokol zaman çizelgesi Şekil 2' de görülebilir.

  1. Bir ayak tutam yaparak ve palpebral refleks değerlendirerek anestezik derinliği Re-asses. Reaksiyon gözlenirse, ketamin (37,5 mg/kg) ve xylazine (2,5 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyon gerçekleştirin. 5 dakika sonra yeniden değerlendir. Hiçbir yanıt gözlemlenirse, prosedüre devam edin. Trakeal kelepçe sadece yeterli anestezileşen hayvanlarayapılmalıdır.
  2. Vantilatörü kapatın ve hayvanı uzatın. Sivrisinek forseps kullanarak, trakea kelepçe. Bu an, agonal fazın başlangıcı olarak kabul edilir. En yüksek sistolik kan basıncı 30 mmHg 'ye düştüğünde veya asistanda veya ventriküler fibrilasyon görünüyorsa, öncelikle ne olursa olsun (Şekil 3) fonksiyonel sıcak iskemik zamanı (WIT) saymaya başlayın.
    Not: Hasar kapsamı, WıT ile orantılı olmalıdır. Deneyler kullanılan anestezik, hayvan gerinim, cinsiyet ve ağırlık seçilen göre WıN zaman optimize etmek için gereklidir. Kontrol hayvanlarında, karotis vasküler erişim güvenli olduktan hemen sonra, kardiyoplegia enjekte edilir ve kalp bir sonraki adımda açıklandığı gibi temin edilir (Şekil 2). Kardiyoplegia ile perfüzyon başlangıcı WıN sonu olarak kabul edilir.
  3. WıT sonunda, bir medial sternotomy gerçekleştirin. Bir ALM Retraktörü kullanarak toraks açık tutun. Makası kullanarak, inferior vena cava ve her iki Atria miyokard distansiyonu veya kardiyoplegia devridaim önlemek için açık (tamamlayıcı şekil 3). Aort diyaframın üzerine kelepçe. Daha önce kateterize karotis arter aracılığıyla, kardiyoplegik solüsyonu 60 mmHg 'nin sürekli basıncında, kardiyopilgia teslimat sistemini kullanarak 5 dakika boyunca infeksiyonla kullanın. Infüzyon basıncı su sütununun yüksekliğini değiştirerek değiştirilebilir.
  4. Kardiyoplegik infüzyon sonunda, kavisli forseps kullanarak pulmoner arter artan proksimal aort incelemek (Tamamlayıcı Şekil 4A). Sol subklavian arter distal aort kes. Langendorff aparatı için kanülasyon için en az 0,5 cm aort uzunluğuna sahip olun.
  5. Kalp aort tutarak, pulmoner venler ve diğer torasik yapılardan kalp ayırarak kardiyektomi tamamlayın (Tamamlayıcı Şekil 4b). Hızla, ex vivo sisteme hızlı ulaşım için buzdan soğuk Krebs çözümü için kalp batıyor. Diseksiyon ve taşıma sürelerini mümkün olduğunca kısa tutun (5 dakika).

4. ex vivo kalp perfüzyon sistemi (EVHP) ve kardiyak fonksiyonel değerlendirme

  1. Forseps kullanarak aort lümeni açın. Koroner damarlara kabarcıklar zorlamaktan kaçınmak için damlama Krebs çözeltisi ile lümeni doldurarak aort deair. Aort içine aşağı kanül, aortu kök veya zarar aort kapak broşürler geçmek için dikkat alarak. Küçük bir kelepçe ile kurulumu düzeltin.
  2. 2 yol stopcock kullanarak, aort olası sızıntıları aramak için akışını artırın. Hiçbiri algılanmazsa, 2-0 ipek sütür kullanarak aort 'u kanula sıkıca sabitleyin. Tam olarak kanül akışını açın. 60-70 mmHg 'nin fizyolojik basıncında aort basıncını koruyun (sistemin yüksekliğini değiştirerek ayarlanır). Şu anda ilk reperfüzyon ve istikrar süresi başlatılır. Aort basıncı, müfettişin deneysel planına göre değiştirilebilir.
  3. Kalp (Atria) tabanı basınç sensörü karşı karşıya böylece kalp döndürün. Pulmoner damarları keserek sol ventrikül atriyal açılışını genişletin. Bir basınç sensörüne bağlı lateks balonu takın. Balon tamamen görsel muayene ile ventrikül içinde konumlandırılmış olduğundan emin olun. Son Diyastolik basınç (EDP) 15 mmHg 'ye ayarlanıncaya kadar balonu tuz ile yavaşça doldurun. EDP sabiti (önceden belirlenmiş FIZYOLOJIK EDP) tutmak için gerektiği şekilde ayarlayın. EDP, her müfettişlerin deneysel hedeflerine göre ayarlanabilir.
  4. Kalp (sağ ventrikül çıkış yolu) ön yüzüne pacing elektrot takın. Koroner damarları delmemek. Spontan dayak gözlendikten sonra, dk başına 300 Beats at pacing başlatın. gerekli voltaj deneyler ve sıçan suşları arasında farklılık gösterebilir .
  5. 10 dakika stabilizasyon işleminden sonra, sürekli intraventriküler basınç ölçüm kaydını başlatın. Bu an, 1 h (Şekil 2) için son verecek olan yenileme ve değerlendirme aşamasının (saat 0) başlangıcı olarak kabul edilir. Yenileme süresi uzun olabilir, ancak tüm kalplerinde zaman bağımlı bir kontrazlık düşüşü bekleniyor.
  6. Reconditioning başlangıcında, kalp damarlarından kalp damarları, temel koroner akış değerlendirmesi ve biyokimyasal analizler için 5 dakika bırakarak toplayın. Troponin T için tekrar her 15 dakika (kez 0, 15, 30, 45 ve 60 dk). Diğer analizler için toplama süreleri bireyselleştirme gereklidir (Şekil 2).

5. deneyim sonu

  1. Langendorff cihazının kalbini çıkarın.
  2. Düz yüksek karbon çelik bıçak (Microtome Blade veya benzeri) kullanarak, kalbin tabanı (aort ve pulmoner arter dahil) çıkarın.
  3. Sağ ventrikül aşağı bakacak şekilde, 1-2 mm kalınlığında transvers ventriküler slaytlar kesti. Bir temsilcilik bölümünde (normalde üçüncü) sağ ventrikül tüketim ve Snap sol ventrikül dondurmak. Bu örnek, biyokimyasal analizler için kullanılabilir.
  4. Kalan bölümleri yeni hazırlanmış 5% 2, 3, 5-Triphenyl-tetrazolium klorür ticari fosfat tampon tuz pH 7,4 için 10 dk 37 °C ' de altbirleştirme. Uygulanabilir dokular kırmızı tuğla renkli.
  5. Fosfat tampon tuzlu pH 7,4 ile iki kez yıkayın ve 4 °C gecede% 10 formalin ile düzeltin. İki kez fosfat tamponlu tuz pH 7,4 ile yıkayın ve her dilim daldırma tutun.
  6. Her slayt aşırı sıvı ve ağırlık çekin. Her iki tarafın dijital renk görüntülerini alın. Yüzde infarkt boyutunu hesaplamak ve dilim ve Total ventriküler ağırlık için doğru planimetrik analizler kullanın. Coloration zaman ile kaybolur. Fotoğraflar mümkün olduğunca çabuk alınmalıdır.

6. veri analizleri

  1. Tüm basınç verilerini hayvan başına yeni bir dosyada kaydedin.
  2. Basınç analizleri için zaman noktaları başına en az 200 basınç döngüsü seçin. Analizler, özel yazılım (örn., LabChart) kullanılarak off-line (denemenin tamamlandıktan sonra) yapılabilir. Mevcut ortak kardiyovasküler parametreler şunlardır: maksimal üretilen basınç, end diyastolik basınç, + dP/DT (basınç eğrisinin yükseliş sırasında en yüksek eğim, ventriküler kontril yetenek göstergesi),-dP/DT ( basınç eğrisinin çalıştırılmaktadır, ventriküler gevşeme kapasitesi bir göstergesi) diğerleri arasında.
    Not: Troponin analizleri Için, reperfüzyon sırasında troponin salınımı artışı bekleniyor. EVHP sistemindeki reperfüzyon 1 h sonra, troponin seviyeleri taban çizgisine düşebilir, bu numunelerin toplanması ve işlenmesi konusunda dikkatli zamanlama ihtiyacını vurguladı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uzama sonrasında kan basıncı öngörülebilir bir desenle hızla düşer (Şekil 3). Beklenen ölüm süresi 5 dakikadan az.

Şekil 4 , 0, 10 ve 15 dk. WIN sonrasında yeniden yenileme başlangıcında ortalama bir basınç/zaman eğrisi gösterir. Kontril fonksiyonu zamanla gelişecektir. WıN kısa sürelerinin kullanımı kontrazlığın normale dönmesini sağlar ve morfolojik hasar algılanamaz (Şekil 5 ve Şekil 6).

Bir iklimlendirme ajanının kardiyoplegia ile eklendiği ve stabilizasyon aşamasındaki Proof-Of-Concept kullanımı, bu modelde 15 dakika WıT tarafından oluşturulan hasarın kardiyokoruyucu ajanlar tarafından modülasyona izin verdiğini göstermektedir (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6).

Figure 1
Şekil 1: gerekli ekipman şemaları. Bir (a) kardiyoplegia teslimat sistemi ve (B) langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi için minimal gereksinimler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: protokol zaman çizelgesi. Protokol sonuna kadar ekstübasyon andan itibaren zaman çizelgesi. Kontrol hayvanlarında, kardiyopleji DCD veya sıcak iskemik zaman olmadan başlatılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Intracarotis kan basıncı/zaman arsa. Extubation aşağıdaki intracarotis kan basıncı tipik evrim. Sıcak iskemi zaman yıldızlar en yüksek sistolik kan basıncı 30 mmHg altında düştüğünde, ya da asistanda veya ventriküler fibrilasyon görünüyorsa, ne olursa olsun ilk gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: ex vivo ortalama Beat-to-yendi ventriküler basınç zaman eğrisi. Deneysel farmakolojik kardiyokoruyucu Klima ajanı kullanmadan veya kullanmadan 10 dk stabilizasyon ve perfüzyon (Şekil 2 ' de 0 zaman) sonrasında alınan verilerin analizinden elde edilen görüntü. İskemik zaman sıcak iskemik kez (WıT) anlamına gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: ex vivo kurtarma ve fonksiyonel analizler. (A) deneysel farmakolojik kardiyokoruyucu Klima ajanı kullanmadan veya kullanmadan 10 dk stabilizasyon ve perfüzyon sonrasında sürekli ventriküler basınç-zaman eğrisi. Oklar EDP manuel modifikasyon nedeniyle eserler gösterir. (B) maksimum (+ DP/DT) ve minimum (-DP/DT) basınç DEĞIŞIM oranı LV vs zaman Plot türetilen (a) tedavi olmadan kontraksiyonda bir zaman bağımlı iyileşme gösteren (yeşil hat). Kısa WıT (kırmızı çizgi) veya tedavi (sarı) kalpler kontrol grubuna benzer bir desen gösterir (mavi çizgi). Veri noktaları en az 200 bireysel Beats ortalaması vardır. Çubuklar, her veri noktasının ortalama standart hatasını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6:2, 3, 5-deney sonunda Triphenyl-tetrazolium klorür renklendirmesi. Infarct alanı çeşitli sıcak iskemik kez (WıT) ve farmakolojik kardiyokoruyucu Klima ajanı kullanımı takip gözlenen. Tuğla kırmızı: uygulanabilir doku. Açık sarı: uygun olmayan doku. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: Kurulum fotoğrafı. (A) kardiyoplegia teslimat sisteminin kurulumunu gösteren fotoğraf. Sayılı ekipman karşılık gelir: kardiyoplegia konteyner (1), kabarcık tuzağı (2), basınç sensörü ve kateter (3), peristaltik pompa (4), basınç sensörü (5) ve küçük hayvan vantilatörü (6) bağlı çokgrafi. (B) Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sisteminin kurulumunu gösteren fotoğraf. Sayılı ekipman karşılık gelir: Perfusate konteyner (1), Klima aracı konteyner (2) ve kalp odası (3). Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 2: boyun diseksiyonu. (A) heparin enjeksiyon öncesinde maruz juguler ven (ok) gösteren Fotoğrafçılık. (B) kanama kontrolü için yerleştirilen sütürler ile disseke karotis arter (ok) gösterir. Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı şekil 3: devridaim önlemek için Atria açılması. (A) sol atriyal uzantının açılışını gösteren Fotoğrafçılık (1). Arka planda aort (2) diyaframın üzerinde (3) yapışmış durumdadır. (B) sağ atriyal uzantının açılmasını gösterir (1). Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 4: kalp temini. (A) aort (ok) ve pulmoner arter ayırmak için kavisli forseps kullanımını gösteren Fotoğrafçılık. (B) kalp diseksiyonu ve tedariği gösteren Fotoğrafçılık. Kalp, forseps kullanarak aort tarafından tutun. Bu rakam indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan protokol kalp DCD basit, rahat ve çok yönlü bir model tanıttı, kalp fonksiyonel kurtarma değerlendirmek için fırsat sunan, doku hasarı ve donör kurtarma geliştirmek için sonrası Klima kardiyokoruyucu ajanlar kullanımı kalp nakli için aksi atılır. Ex vivo kalp perfüzyon sistemleri (EVHP) sistemleri, kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi için bir platform sağlamak üzere optimize edilmiştir ve post-Conditioning farmakolojik ajanlar ile tamamlayıcı olarak değiştirilmiş çözümleri sunmak ve test etmek için benzersiz bir fırsat sunar korumak ve küçük15 ve büyük hayvanlar DCD Hearts onarmak16,17 kardiyak DCD modelleri. Yine de protokoller genellikle yetersiz ayrıntılıdır ve her zaman klinik olarak alakalı değildir, klinikte tercüme zor hale gelir.

DCD modellerinin dünyasında, Sanz18tarafından açıklanan gibi EX VIVO DCD modelleri, bir agonal faz eksikliği. Mekanik ventilasyonu durdurarak kardiyak arrest indükleyerek, sempatik sinir sistemi overactivated, bir "katekolamin fırtına"19yol. Katekolaminlerin bu artışı donör organlarının özelliklerini değiştirir ve deneysel DCD organlarının azaltılmış fonksiyonel durumuna bağlı olmuştur19. Ayrıca, asistandan önce işlevdeki Progressive düşüş sağ ventrikül distensiyon ve sonuç yaralanmasına yol açar. Protokolünde, bu tepkiler tutan klinik olarak ilgili boğulma modeli kullanarak dolaşım ölümü indüklenen var.

İki ana in vivo kardiyak DCD modelleri literatürde açıklanmıştır: açık göğüs15 ve kapalı göğüs20 modelleri. Kardiyak Fizyoloji açık göğüs yaklaşımı ile mekanik akciğer/kalp etkileşimi ve önyükleme azaltarak değiştirilir. Ayrıca, açık göğüs prosedürlerinde, vücut ısı kaybı hızlandırılmış, fonksiyonel sonuçları daha da etkileyen21. Bu nedenle ısı kaybını engelleyen kapalı bir göğüs yaklaşımını korumak için tercih edilir. Başka bir arıtma zaman dolaşım ölümü için değişkenlik en aza indirmek için. Kearns ve ark. ölüm zamanı bildirdi (zaman olmayan pulsatil veya ortalama kan basıncı 30 mmHg 'den az) 3 ila 11 dakika arasındadır. 10 ve 20 dk WıT, 40% ve 60% kalpleri, sırasıyla, bir ex vivo çalışma kalp aparatı, veri yorumu daha zor15yapmak fonksiyonu kurtarmadı. Dolaşım ölümü için zaman azaltmak için bir alternatif paralitik ajanlar kullanmaktır20; Yine de, bazı kanıtlar vecuronyum doğrudan kardiyak etkileri yönünde işaret, sempatik ve Parasempatik innervasyon üzerindeki etkileri nedeniyle22. Yeniden üretilebilirliği artırmak için, hassas bir arter basıncı monitorizasyonu ile birlikte trakeal bağlama için seçilmiş, daha homojen bir agonal zaman için izin (< 5 dk). Organ hasarının dolaşım ölümü andan önce başladığı bilinmektedir; Bazı yazarlar altında bir cut-off sistolik kan basıncı 50 fonksiyonel WıT6başlangıcı olarak mmHg aşağıda göz önünde bulundurularak, uzun bir süre formu sonrası organ nakli için isteksizlik açıklayan yaşam önlemlerinin reperfüzyon kadar sürdürüyor. Bu protokolde, WıN tanımı kullanılan geçerli deneysel standart15, yine de, daha fazla ÇALıŞMALAR amacıyla WIN geliştirmek için organ hasarı indüksiyon işaretlemek hemodinamik parametrelerin tam kümesini açıklığa kavuşturmak için gereklidir Böylece klinik uygulama için daha iyi bilgi sunar.

Kardiyoplegik çözümün sürekli fizyolojik basınç ve sıcaklıkta infüzyon, kalp iklimlendirme ve doku korumasını herhangi bir farmakolojik ajanla veya diğer yollarla başlatmak için benzersiz bir fırsat sunar. Teknik iyileştirmeler, Torasik aort sıkma, kalp perfüzyon sınırlama ve böylece her kompozisyon için gerekli çözüm miktarını azaltarak içerir. Kalp EVHP sisteminde olduğunda, standartlaştırılmış fonksiyonel değerlendirme gereklidir. Bu bir evhp sisteminin kullanımı daha önce nakledilmez kabul kalpler resüsitasyon geliştirmek için potansiyele sahip gösterildi23,24. İlginçtir ki, klinik olarak mevcut evhp sistemi sadece seri lakdamak ölçümleri kullanarak kardiyak canlılığı değerlendirir8,23. Lakdamak ölçümleri DCD kalplerinin kardiyak performansı ile ilgili değildir24,25, böylece transplantability değerlendirmek için ek ölçümler gereklidir. Bu deneysel kurulum, oluşturulan baskılar ve + dP/dT ve – dP/dT dahil olmak üzere miyokard kontrazlığı ölçümleri de dahil olmak üzere tam bir fonksiyonel değerlendirme için izin verir, son nakli önce kalp fonksiyonunun daha ayrıntılı bir değerlendirme için izin karar verildi. Ayrıca, kardiyak troponin ölçümleri, doğrudan iskemik infarkt boyutu26ile ilişkili miyokard hasarı bir marker, ve serbest kinetik bir Langendorff iskemi/reperfüzyon sisteminde kardiyak iskemi ölçüde ilişkilidir. Özellikle, uzun iskemik kez (60 dk), troponin seviyeleri sonra korunur 1 h reperfüzyon, LDH ve kreatine kinaz önemli ölçüde azalırken, ve kalp hasarı ölçüde ilgili olmayan27,28, böylece seri troponin önlemlerinin kullanılması, organ nakli öncesinde organının tam olarak değerlendirilmesini sağlar. Kardiyak fonksiyonel değerlendirmede büyük bir karıştırıcı değişken kalp hızı. Spontan kalp hızı, iskemi29uzunluğuyla tersine ilişkilidir ve kalp hızı izole sıçan kalpleri30 ve hayvan modellerinde31+ dp/dt ile doğrudan ilişkilidir. İlginçtir, DCD kalpler ve evhp Klima kemirgen modelleri üzerinde son yayımlanan çalışma, pacing kullanılmaz ve kardiyak hızları değişken ve protokollerinde kaydedildi15,18,20. Fizyolojik kalp hızı korumak için, kalp ritmik kasılma kurtarıldı kez pacing kullanıldı. Seçilmiş 300 BPM frekansı, sağlıklı, non-stresli fareler32benzer.

Bu protokol sınırlamaları indüksiyon için uçucu anestezik kullanımını içerir. Bu ajanlar iskemik Önkoşullama33görüşmek gösterildi. Yine de, inhale anestezik kullanım kısa zaman bu protokol ve ilerici miyokard disfonksiyon hiçbir gözlemlenebilir etkisi vardı hala artan WIT ile kaydetti. Normothermic kardiyoplegia kullanımı da bir sınırlama olarak görülebilir. Normothermic kardiyoplegia kullanmak, hücreler genellikle 37 °C ' de korunduğundan, farmakolojik iklimlendirme ajanlarının geliştirilmesi için kullanılan in vitro koşullardan optimum çeviri sağlar. Yine de, bu kurulum kardiyoplegia sıcaklığı kolayca araştırmacı gereksinimlerine göre düzenlenebilir. Öte yandan, bir langendorff preparatın yenileme için çalışma kalp preparatın kullanımına karşı da bir sınırlama olarak görülebilir. Çalışma kalp hazırlama kontrollü pre ve afterload ile bir basınç/hacim döngüsü12,15, sürekli kayıt için izin verir, tam işlevsel değerlendirme için izin. Bir Langendorff hazırlık ana avantajı, sabit bir aort ve perfüzyon basıncı korur, özellikle ilk reperfüzyon sırasında, üretilen basınç minimal. Ayrıca, değerlendirme kurulumu, çalışma kalp hazırlığı ile karşılaştırıldığında Langendorff kalbi için daha basittir. Yine de, bu kurulum gerekli gördükleri takdirde çalışma kalp hazırlama dönüştürülebilir. Alternatif olarak, kardiyak Reanimasyon, Millar kateter34kullanımı ile doğrudan ölçülen kardiyak performans ile normothermic bölgesel perfüzyon kullanarak situ yapılabilir, kapsamlı hemodinamik ve miyokard fonksiyonel izin organ alımı öncesinde değerlendirme. İnsanlarda, hem situ hem de ex vivo yenileme stratejileri6tarif edilmiştir, böylece her iki modelin gelişimi klinik pratikte optimizasyonu için tercüme olabilir deneysel karşılaştırmalar için izin verir. Son olarak, bu hayvan modelinin küçük boyutu ve yüksek kalp hızı, bu deneyler sırasında gözlenen potansiyel teknik zorluklar ve sıçan ve insan kalpleri arasındaki kaçınılmaz fizyolojik farklar nedeniyle bir sınırlama olarak kabul edilebilir. EVHP değerlendirme zaten standartlaştırılmış ise, bir araştırmacı olarak az 3 deneyler yaparak bu tekniği ile aşina olabilir. Öte yandan, bu küçük hayvan modelinin kullanımı makul bir maliyetle uygun tarama sağlar, domuz modeli gibi büyük ve daha pahalı hayvan modelleri rezerve, yüksek insan translasyonel potansiyeli olan terapilere.

Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, DCD kalpleri araştıran çeşitli gruplardan kaynaklanan en iyi uygulamaları dikkate alır. Bu protokol, farelerde kardiyokoruyucu Klima tedavi stratejilerinin kapsamlı bir yapısal ve fonksiyonel değerlendirilmesi için izin, WıT tam kontrol verir. Bu protokol ölçeklenebilir ve büyük hayvan modelleri için, klinik gerçeklik araştırma bulguları çevirmek için izin ve en sonunda yeni terapilerin kalitesini ve yaşam kurtarıcı organların kullanılabilirliği artan geliştirme sağlayan transfer edilebilir tarafından çok gerekli Hasta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bu makalede tartışılan herhangi bir ürün veya kavram herhangi bir tescilli veya ticari ilgi rapor.

Acknowledgments

Bu çalışmanın bazı bölümleri, Fondation Marcel et Rolande Gosselin ve Fondation Bay stefane Foumy tarafından cömert bir katkı tarafından destekleniyor. Nicolas Noiseux FRQ-S bilim adamı.

Yazarlar veri toplama destek için Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi ve Catherine Scalabrini teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag Baxter Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter Jelco 4098 To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Milipore-Sigma T8877 Vital coloration
22 G 1" I.V catheter BD 383532 I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr Skalar 50-3147 Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4" Skalar 22-9027 Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp ADinstruments FE221 Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride Milipore-Sigma C1016 CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose Milipore-Sigma G8270 D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer ADinstruments MLAC06 Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock) ADinstruments MLT0670 Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS Gibco 14190-144 Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" Skalar 66-2740 Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10% Milipore-Sigma HT501128 Fixative solution
Heating Pad Sunbean 756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL Sandoz For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% Fisher scientific A144-500 Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine Bimeda Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart ADinstruments Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon Radnoti 170404 In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution AstraZeneca Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS ACP Chemicals M-0460 MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor Radnoti 159905 Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker Biotronik Reliaty Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter Fisher scientific AE150
Physiological monitor Kent Scientific Physiosuite For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A Baxter Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride Milipore-Sigma P4504 KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml Hospira Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph ADinstruments Electronic polygraph
Silk 2-0 Ethicon A305H Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0 Ethicon A302H Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation Hallowell EMC 000A2770 Small animal ventilator
Sodium bicarbonate Milipore-Sigma S5761 NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride Milipore-Sigma S7653 NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets ACP chemicals S3700 Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic Milipore-Sigma S0751 NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" Skalar 22-1240 Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades Thomas scientific 6727C18 Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8" CardinalHealth 8881511235 For heparin injection
Veterinary General Surgery Set Skalar 98-1275 Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set Skalar 98-1311 Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system Radnoti 120101BEZ Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine Bayer Sedative. 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gass, A. L., et al. Cardiac Transplantation in the New Era. Cardiology in Review. 23, (4), 182-188 (2015).
  2. von Dossow, V., Costa, J., D'Ovidio, F., Marczin, N. Worldwide trends in heart and lung transplantation: Guarding the most precious gift ever. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 31, (2), 141-152 (2017).
  3. Hornby, K., Ross, H., Keshavjee, S., Rao, V., Shemie, S. D. Non-utilization of hearts and lungs after consent for donation: a Canadian multicentre study. Canadian Journal Of Anaesthesia. 53, (8), 831-837 (2006).
  4. Manyalich, M., Nelson, H., Delmonico, F. L. The need and opportunity for donation after circulatory death worldwide. Current Opinion In Organ Transplantation. 23, (1), 136-141 (2018).
  5. Shemie, S. D., et al. National recommendations for donation after cardiocirculatory death in Canada: Donation after cardiocirculatory death in Canada. CMAJ : Canadian Medical Association Journal. 175, (8), S1 (2006).
  6. Page, A., Messer, S., Large, S. R. Heart transplantation from donation after circulatory determined death. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 75-81 (2018).
  7. Monteagudo Vela, M., Garcia Saez, D., Simon, A. R. Current approaches in retrieval and heart preservation. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7, (1), 67-74 (2018).
  8. Dhital, K. K., Chew, H. C., Macdonald, P. S. Donation after circulatory death heart transplantation. Current Opinion In Organ Transplantation. 22, (3), 189-197 (2017).
  9. McNally, S. J., Harrison, E. M., Wigmore, S. J. Ethical considerations in the application of preconditioning to solid organ transplantation. Journal of Medical Ethics. 31, (11), 631-634 (2005).
  10. Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 16, (6), 667-673 (1997).
  11. Ramzy, D., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24, (10), 1665-1672 (2005).
  12. Xin, L., et al. A New Multi-Mode Perfusion System for Ex vivo Heart Perfusion Study. Journal of Medical Systems. 42, (2), 25 (2017).
  13. Messer, S., Ardehali, A., Tsui, S. Normothermic donor heart perfusion: current clinical experience and the future. Transplant International. 28, (6), 634-642 (2015).
  14. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Academic Press. 77-108 (2016).
  15. Kearns, M. J., et al. A Rodent Model of Cardiac Donation After Circulatory Death and Novel Biomarkers of Cardiac Viability During Ex vivo Heart Perfusion. Transplantation. 101, (8), e231-e239 (2017).
  16. Sandha, J. K., et al. Steroids Limit Myocardial Edema During Ex vivo Perfusion of Hearts Donated After Circulatory Death. The Annals of Thoracic Surgery. 105, (6), 1763-1770 (2018).
  17. Iyer, A., et al. Increasing the tolerance of DCD hearts to warm ischemia by pharmacological postconditioning. American Journal of Transplantation. 14, (8), 1744-1752 (2014).
  18. Sanz, M. N., et al. Cardioprotective reperfusion strategies differentially affect mitochondria:studies in an isolated rat heart model of donation after circulatory death (DCD). American Journal of Transplantation. (2018).
  19. Van de Wauwer, C., et al. The mode of death in the non-heart-beating donor has an impact on lung graft quality. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 36, (5), 919-926 (2009).
  20. Quader, M., et al. Determination of Optimal Coronary Flow for the Preservation of "Donation after Circulatory Death" in Murine Heart Model. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs : 1992). 64, (2), 225-231 (2018).
  21. Priebe, H. J. The acute open-chest model. British Journal Of Anaesthesia. 60, (8 Suppl 1), 38-41 (1988).
  22. Narita, M., et al. Cardiac effects of vecuronium and its interaction with autonomic nervous system in isolated perfused canine hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 19, (6), 1000-1008 (1992).
  23. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet (London, England). 385, (9987), 2585-2591 (2015).
  24. Messer, S. J., et al. Functional assessment and transplantation of the donor heart after circulatory death. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (12), 1443-1452 (2016).
  25. White, C. W., et al. Assessment of donor heart viability during ex vivo heart perfusion. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, (10), 893-901 (2015).
  26. Mayr, A., et al. Cardiac troponin T and creatine kinase predict mid-term infarct size and left ventricular function after acute myocardial infarction: a cardiac MR study. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 33, (4), 847-854 (2011).
  27. Remppis, A., et al. Intracellular compartmentation of troponin T: release kinetics after global ischemia and calcium paradox in the isolated perfused rat heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27, (2), 793-803 (1995).
  28. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff Perfused Isolated Mouse Heart Model of Global Ischemia-Reperfusion Injury: Impact of Ischemia and Reperfusion Length on Infarct Size and LDH Release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21, (3), 286-295 (2016).
  29. Dornbierer, M., et al. Early reperfusion hemodynamics predict recovery in rat hearts: a potential approach towards evaluating cardiac grafts from non-heart-beating donors. PloS One. 7, (8), e43642 (2012).
  30. Henry, P. D. Positive staircase effect in the rat heart. The American Journal of Physiology. 228, (2), 360-364 (1975).
  31. Markert, M., et al. Evaluation of a method to correct the contractility index LVdP/dt(max) for changes in heart rate. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66, (2), 98-105 (2012).
  32. Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (2), 175-184 (2011).
  33. Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine. Current Pharmaceutical Design. 20, (36), 5690-5695 (2014).
  34. Ali, A. A., et al. Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Translational Medicine. 12, 37 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics