Fabricação do estágio do microscópio para a observação vertical com função de controle da temperatura

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Summary

É apresentado aqui um protocolo usando um estágio temperatura-controlado do microscópio que permita que um recipiente da amostra seja montado em um microscópio vertical.

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Matsukawa, Y., Ide, Y., Umemura, K. Fabrication of Microscope Stage for Vertical Observation with Temperature Control Function. J. Vis. Exp. (149), e59799, doi:10.3791/59799 (2019).

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Abstract

As amostras são coloc geralmente em um estágio horizontal do microscópio para a observação microscópica. No entanto, para observar a influência da gravidade em uma amostra ou no comportamento do estudo à tona, é necessário fazer o estágio do microscópio vertical. Para fazer isso, um microscópio invertido lateralmente inclinado por 90 ° foi planejado. Para observar amostras com este microscópio, os recipientes da amostra tais como placas de Petri ou as corrediças de vidro devem ser fixados ao estágio verticalmente. Um dispositivo que possa fixar recipientes da amostra no lugar em um estágio vertical do microscópio foi desenvolvido e é descrito aqui. O acessório deste dispositivo ao estágio permite a observação da dinâmica da amostra no plano vertical. A capacidade de regular a temperatura usando um aquecedor de borracha de silicone também permite a observação de comportamentos de amostra dependentes da temperatura. Além disso, os dados de temperatura são transferidos para um servidor de Internet. As configurações de temperatura e o monitoramento de logs podem ser controlados remotamente a partir de um PC ou smartphone.

Introduction

A microscopia óptica é uma técnica empregada para aumentar os detalhes observáveis através da ampliação de uma amostra com lentes e luz visível. Na microscopia óptica, a luz é direcionada para uma amostra, então transmitida, refletida, ou a luz fluorescente é capturada por lentes de ampliação para observação. Vários tipos de microscópio estão disponíveis que diferem no projeto para acomodar diferentes usos e métodos de observação. Os projetos diferentes incluem um microscópio ereto, que seja estruturado para iluminar uma amostra de abaixo para a observação de acima, e um microscópio invertido, que ilumine a amostra de acima para a observação de abaixo. Os microscópios eretos são o projeto o mais comum e o mais amplamente utilizado. Microscópios invertidos são freqüentemente usados para observar as amostras que não podem permitir uma lente perto da distância de cima, tais como células cultivadas aderente à parte inferior de um recipiente. Muitos grupos de pesquisa relataram observações em uma ampla gama de campos usando microscópios invertidos1,2,3,4,5,6,7. Muitos dispositivos adicionais também foram desenvolvidos que aproveitam as características dos microscópios invertidos8,9,10,11,12,13 .

Atualmente, em todos os projetos convencionais do microscópio, o estágio do microscópio é horizontal e é conseqüentemente inadequado para a observação das amostras produzindo o movimento no plano vertical, (devido à gravidade, à flutuabilidade, ao movimento, etc.). Para fazer estas observações possíveis, o estágio do microscópio e o trajeto claro devem ser girados para vertical. O estágio vertical é exigido para montar verticalmente corrediças de vidro ou recipientes da amostra tais como pratos de Petri ao estágio. Para abordar isso, um microscópio invertido lateralmente inclinado por 90 ° já foi planejado. No entanto, a fixação de amostras com fita adesiva ou outros adesivos não produz a imobilidade de longo prazo necessária. Descrito aqui é um dispositivo que pode alcançar a estabilidade necessária. Este dispositivo permite a observação sobre o tempo do movimento da amostra no plano vertical. A montagem de um calefator de borracha do silicone igualmente fêz possível observar a influência da variação da temperatura no comportamento da amostra. Os dados de temperatura são transferidos para um servidor de Internet por Wi-Fi, e as configurações de temperatura e monitoramento de log podem ser controlados remotamente a partir de um PC ou smartphone. A nosso conhecimento, o estágio Unido a um microscópio inclinado lateralmente inclinado por 90 ° não foi relatado ainda em estudos precedentes.

O estágio do microscópio é compor de três placas de alumínio. A placa de alumínio médio é montada à placa de alumínio mais baixa que atribui ao estágio. A borracha de silicone que contem o sensor de temperatura é unida entre as placas de alumínio médias e superiores. As bandas de borracha são usadas para afixar a amostra. As garras são anexadas na esquerda e direita quatro pontos da placa de alumínio superior para fixar as bandas de borracha. O circuito de controle do regulador de temperatura recebe um sinal do sensor de temperatura incorporado na borracha de silicone e modula a energia elétrica pelo método da modulação da largura de pulso (PWM). A temperatura pode gradualmente ser aumentada a 50 ° c em incrementos de 1 ° c. Este dispositivo é útil para as aplicações em que os movimentos verticais da amostra podem ser temperatura-dependentes.

Este relatório fornece exemplos de efeitos de temperatura sobre o fenômeno flutuante de diatomáceas. Como exemplos de estudos de observação de diatomáceas, medidas de velocidade de sedimentação de aglomerados celulares, análises de movimento, estudos de estrutura Ultrafina, etc. foram relatados14,15,16,17 , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , a gravidade 23. The específica dos diatomáceas que flutuam na água com organismos fotossintética é ligeiramente mais elevada do que aquela da água, assim que tendem a afundar-se; Entretanto, levantarão se mesmo a convecção ligeira está ocorrendo. Para estudar este fenômeno, uma corrediça de vidro é afixada verticalmente a um estágio do microscópio, e os efeitos da temperatura crescente no movimento vertical do diatomáceas são observados.

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Protocol

1. projeto

  1. Fabricação de chapas de alumínio
    1. Corte um furo de 101 mm no centro de uma placa de alumínio de dimensões 150 mm x 200 mm x 2 mm para ser usado como a placa de vanguarda com uma máquina de processamento a laser. Garras da máquina em oito pontos para afixar duas faixas de borracha através do comprimento, ou dois através da largura desta placa (veja Figura suplementar 1a e Figura suplementar 2a).
    2. Corte um furo de 130 milímetros no centro de uma outra placa de alumínio de 150 milímetros x de 200 milímetros x de 5 milímetros a ser usada como a placa superior média com uma máquina de processamento do laser. Máquina oito entalhes para prender as faixas de borracha em dois pontos através do comprimento, ou dois através da largura desta placa (veja Figura suplementar 1B e Figura suplementar 2B).
    3. Corte um furo de 130 mm no centro de uma placa de alumínio de 150 mm x 200 mm x 4 mm para ser usada como a placa inferior média com uma máquina de processamento a laser (consulte a Figura 1C suplementar e a Figura suplementar 2C).
    4. Corte um furo de 30 mm no centro de uma placa de alumínio de 150 mm x 200 mm x 1,5 mm para ser usada como a placa de base (veja a Figura 1D suplementar e a Figura complementar 2D).
  2. Fabricação de dois pedestal de alumínio
    1. Corte um furo de 30 mm no centro da chapa de alumínio (100 mm de diâmetro, 3 mm de espessura) e faça um entalhe de um lado com as dimensões 42 mm de largura x 30 mm de profundidade (ver Figura 3a suplementar).
    2. Corte um furo de 30 mm no centro da placa em uma placa de alumínio (100 mm de diâmetro, 4 mm de espessura) e perfure três furos de 3 mm localizados a 25 mm do centro, espaçados 120 ° uns dos outros (ver Figura complementar 3B).
  3. Fabricação de três discos de cortiça prensados
    1. Corte um furo de 20 mm no centro do disco de cortiça prensado (100 mm de diâmetro, 2 mm de espessura) com uma máquina de corte a jacto de água. Faça um corte 42 mm em x 30 mm de profundidade, depois um corte de 4 mm de largura x 5 mm de profundidade (ver figura 4a suplementar).
    2. Corte um furo de 20 mm no centro do disco de cortiça prensado de dimensões de 100 mm de diâmetro, 1 mm de espessura com uma máquina de corte a jato de água. Faça um corte 42 mm em x 30 mm de profundidade, um corte de 4 mm de largura x 40 mm de profundidade (ver Figura suplementar 4B).
    3. Corte uma placa de cortiça prensada a partir de um disco de 100 mm de diâmetro com uma largura de 42 mm e 30 mm de profundidade. Duas folhas de 1 mm de espessura e uma folha de 2 mm de espessura são necessárias (ver Figura suplementar 4C).
  4. Fabricação de aquecedor de borracha de silicone
    1. Fabricar um aquecedor usando um disco de 100 mm de diâmetro de borracha de silício de 2,5 mm de espessura com fio de Nichrome embutido e corte um furo de 20 mm no centro do disco (consulte a Figura 5 suplementar).
  5. Monte as peças descritas nas etapas 1.1 – 1.4 empilhando-as como mostrado na Figura 6 suplementar.
  6. Para construir um estágio do microscópio, refira a Figura suplementar 6, seção transversal do estágio do microscópio. Fixar Equation 1 e Equation 2 , em Equation 3 seguida Equation 4 , e com parafusos. Fixar Equation 4 e Equation 5 com parafusos. Fix Equation 2 e Equation 3 Equation 6 Equation 5 Equation 9 , e Equation 8 , e, e e com adesivo. Equation 6 Equation 7 Equation 7 Equation 5

2. Design de hardware contornos

  1. Prepare uma "fonte de alimentação e circuito de programação", como mostrado na Figura 7 suplementar. Forneça a C.C. de 12 V ao controlador do calefator do terminal J4 conectado ao adaptador da C.A.. Diminua a tensão de 12 V DC para 3,3 V DC para a fonte de alimentação do circuito usando um regulador porque a tensão de alimentação da CPU é 3,3 V DC.
    Nota: USB 1 é um terminal para 5 V DC e sinal de série do PC de desenvolvimento. Embora 5 V DC não é essencial, ele é usado como a fonte de energia para programar a CPU. Isso também é convertido em 3,3 V DC pelo regulador. J1 é um terminal de sinal de controle no momento da programação. Este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  2. Prepare um "circuito de controle de aquecedor", como mostrado na Figura 7 suplementar. Mudar para 12 V DC com Q5 (P canal MOS FET) e fornecê-lo para o aquecedor. Q5 é um elemento de comutação que controla 12 V DC com PWM para ajustar a quantidade de energia fornecida ao aquecedor.
    Nota: o circuito inclui um LED para confirmar visualmente que a voltagem está a ser fornecida ao aquecedor. Este sinal de unidade (HEATER_C) é um sinal PWM da CPU. Quando um sinal de superaquecimento é detectado pelo circuito de proteção, o sinal BREAKER muda para baixo, e a operação do MOS-FET pára. Este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  3. Prepare um "circuito do conector para a unidade do calefator" como mostrado em complementar Figura 7. Instale um conector USB para conexão com a seção de aquecedor.
    Nota: este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  4. Prepare um "circuito conector para sensor de temperatura", como mostrado na Figura 7 suplementar. Monte o conector (receptáculo 2P do Euroblock) para ligar o sensor de temperatura.
    Nota: este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  5. Para um "conversor A/D", como mostrado na Figura 7 suplementar, use ADS 1015 como um dispositivo de conversão AD.
    Nota: o dispositivo de conversão AD converte os valores do sensor de temperatura e do sensor de detecção de superaquecimento da voltagem para os valores digitais. Este é um dispositivo de conversão de AD de Multiplexador de 12 bits e está conectado à CPU com a interface I2C. Este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  6. Faça um "circuito de proteção" como mostrado na Figura 7 suplementar conectando o sinal do sensor de detecção de superaquecimento (OHS) à entrada de inversão do amp op. Compare este sinal com a voltagem do resistor do aparador ligado à entrada de entrada.
    1. Assegure-se de que quando a tensão se torna mais baixa do que a tensão do resistor do ajustador, a saída do amplificador OP vai altamente, o transistor conectado NPN Q2 gira sobre e o sinal do disjuntor vai baixo.
    2. Certifique-se de que ao mesmo tempo, Q4 liga e o indicador de superaquecimento ligado LED D6 acende.
      Nota: este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  7. Para uma "seção de exibição", como mostrado na Figura 7 suplementar, use 192 x 64 pontos para OLED. Conecte com o processador central através da relação de I2C.
    1. Restaure o OLED separando o GND do OLED pelo sinal de CPU IO0 usando um transistor NPN Q1 conectado ao GND do OLED.
      Nota: este OLED apresenta vários tipos de informação. Este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  8. Para um "LED & codificador rotativo com interruptor de pressão" na Figura 7 suplementar, montar um codificador rotativo por solda que funciona como um interruptor de pressão e incorpora dois LEDs.
    1. Conecte um diodo emissor de luz a VCC para o uso como um diodo emissor de luz. O outro é conectado ao processador central para o uso como um indicador durante a operação do calefator.
    2. Use um contato do interruptor de impulso para o começo/batente do calefator que é conectado ao processador central. Conecte as saídas a e B do codificador rotativo ao conjunto de entrada de e/s na interrupção da CPU.
      Nota: este circuito está alojado na caixa do controlador mostrada na Figura 8 suplementar.
  9. Para a CPU na Figura 7 suplementar, use a CPU do wroom-02d.
    1. Saída de IO12, IO13 à "unidade de exposição" porque a relação da exposição é padrão de I2C. Conecte IO0 à "unidade de exposição" e restaure o OLED.
    2. Conecte IO15 à "unidade de controle do calefator" e controle a potência fornecida ao calefator pela saída de PWM.
    3. Conecte IO2 a "LED & codificador rotativo com interruptor de pressão" e acender o LED START. Conecte IO4 e IO14 ao "diodo emissor de luz & Codificador giratório com interruptor de impulso" e receba os sinais (REA e REB) do codificador giratório para determinar a temperatura ajustada. Conecte IO5 ao "diodo emissor de luz & Codificador giratório com interruptor de impulso" e comece/pare o calefator.

3. esboço do projeto de software

  1. Use o núcleo de Arduino para WROOM-02D para o processador central como o controlador para este sistema.
    Nota: como dispositivos de entrada, o interruptor de arranque/paragem, codificador rotativo, sensor de temperatura (termistor) são utilizados. Como dispositivos de saída, um LED, exibição de caracteres (OLED) e aquecedor são usados. O dispositivo de comunicação usa Wi-Fi.
  2. Esboço da operação
    1. Detecte o funcionamento do codificador rotativo como mostrado no LED & codificador rotativo com o interruptor de pressão na Figura 7 suplementar, guarde-o como a temperatura definida, e exibi-lo no OLED. Defina o terminal de entrada da CPU à qual os terminais de fase REA e REB estão conectados como um terminal de entrada de interrupção e processe a rotação (frente e verso) do codificador rotativo por interrupção. Defina-o como + 1 para rotação para a frente e-1 para rotação inversa. Escreva a temperatura ajustada à variável global e use-a para o controle de temperatura do calefator. Ao mesmo tempo, atualize a exibição da temperatura definida do OLED.
    2. Identifique o começo e a parada pelo CPU IO 5 pelo interruptor do começo/batente (SW-S) como mostrado no CPU da Figura suplementar 7. O estado do interruptor do começo/batente é um processo da interrupção do temporizador cada 50 ms.
      Nota: desde que o interruptor é um interruptor momentâneo, inverte o estado do começo/batente quando é empurrado e liberado. Esse estado é armazenado na variável global.
    3. Use um termistor para o sensor de temperatura. Leia os valores medidos do sensor da amostra (refira o "circuito do conector para a conexão do calefator" na Figura complementar 7) no processador central após o conversor de a/d (refira o "conversor a/d" na Figura complementar 7). Forneça a corrente ao calefator girando sobre a porta IO15 no "processador central" da Figura suplementar 7.
      Nota: existem dois tipos de sensores de temperatura. Um é usado para medir a temperatura da amostra e controlar o aquecedor sobre a temperatura definida, e o outro é anexado a um aquecedor e usado para a prevenção de calor. Conecte o termistor a 3,3 V através de um resistor e registre a mudança na resistência como uma mudança na tensão. Remova um ruído pelo método da média móvel.
    4. Use um termistor para o sensor de temperatura da prevenção de temperatura. A deteção do superaquecimento é executada usando um termistor (R2) ("circuito do conector para a conexão do calefator" na Figura complementar 7), e quando o valor ajustado é excedido, a corrente do calefator é desligada ("Proteja o circuito" na Figura 7 suplementar).
      Nota: este sensor é incorporado num circuito e não através da CPU. Este sensor é independente do processador central e comparado com o valor da resistência ajustado pelo ajustador do resistor por um amplificador diferencial em uma maneira análoga. Quando detecta que a temperatura excedeu o valor ajustado, intervem no interruptor do FET, que controla a corrente ao calefator e pára forçosamente a fonte atual. A finalidade é impedir que a temperatura do calefator exceda um determinado nível mesmo em uma situação onde o processador central não funcione corretamente.
    5. Ligue o LED no "LED & codificador rotativo com interruptor de pressão" da Figura complementar 7 pela CPU (na "CPU" da Figura complementar 7), quando o equipamento está em operação.
    6. Exiba a temperatura definida e o valor medido para OLED na "seção de exibição" da Figura complementar 7 pela CPU (na "CPU" da Figura complementar 7).
    7. Conduza o interruptor do FET no "circuito de controle do calefator" da Figura 7 suplementar com o PWM do processador central para controlar o calefator.
    8. Controle o aquecedor por PID, com base nas temperaturas medidas adquiridas pelo sensor de temperatura. Use a biblioteca pid_v1. h do Arduino para processamento PID.
      Nota: a CPU Calibra o tempo, comunica com o servidor, transmite dados e recebe instruções do servidor. Quando a temperatura do sensor excede a temperatura ajustada, a corrente ao calefator é ajustada a 0, e o overshoot é suprimido.
    9. Use a função de conexão Wi-Fi integrada da CPU e conecte-se à Internet. Transmita o ajuste a temperatura, a temperatura do calefator, etc. ao Server designado por Wi-Fi.

4. configuração do sistema

  1. Construa o sistema de acordo com a Figura 9 suplementar.
  2. Equipar um Wi-Fi com o controlador.
  3. Use um termistor como um sensor para medição de temperatura. Conecte o fio do termistor ao terminal "SENSOR" na caixa do controlador. Receba o sinal de temperatura medido pelo termistor.
  4. Conecte um estágio do microscópio que incorpora o calefator de borracha e o "calefator" da caixa do controlador com um cabo dedicado. Controle a corrente para o aquecedor de borracha.
  5. Mude a temperatura ajustada com o botão no controlador.
    Nota: a monitoração do registro da temperatura, ajuste da temperatura pode ser operada remotamente de um PC ou de um smartphone.
  6. Transfira a temperatura medida, ajuste a temperatura, e a informação do tempo na medida do controlador ao Server através do Internet. O tempo de ciclo de medição de dados é 5 s e tempo de ciclo para transferência de dados para o servidor é de 1 min.
  7. Acesse o servidor a partir do lado do controlador em intervalos regulares e transfira os dados de medição armazenados na CPU do controlador para o servidor para análise e gráficos.
  8. Consulte o material complementar para saber como operar o servidor.

5. projeto do microscópio invertido lateralmente

  1. Fixar duas placas de alumínio de 15 mm de espessura verticalmente com parafusos para criar uma montagem básica.
  2. Prenda um gabarito (um lugar) à parte horizontal da montagem baixa.
  3. Coloc a parte do estágio do microscópio verticalmente, prenda os gabaritos (dois lugares) à parte vertical do carrinho baixo e fixe a parte inferior do microscópio ao carrinho baixo.
  4. Fixe o estágio do microscópio com parafusos.

6. método de operação

Nota: aqui, a amostra utilizada é uma mistura de Bold modificado basal de água doce solução nutriente líquido meio de cultura, metasilicato de sódio, vitaminas, e água estéril. 800 μL desta amostra é diluído em 10 mL de meio de água fresca.

  1. Método de observação
    1. Injete 1.000 μL da amostra preparada numa câmara de vidro autofeita.
      Nota: a câmara de vidro self-made arranja dois vidros da corrediça paralelamente e repara-os com um adesivo. Um prato de Petri normal tem uma grande espessura e as pilhas escapam no sentido da profundidade na câmara, fazendo a difícil observar com um microscópio. Para evitar isso, a câmara com uma pequena direção de profundidade é feita, o que torna possível impedir que as células escapem na direção da profundidade na câmara. Um adesivo curável da resina de cola Epoxy da baixa temperatura é usado para lig em torno do vidro para impedir a amostra que deixa cair da câmara.
    2. Fixe uma câmara de vídeo preparada separadamente ao microscópio. Conecte uma câmera de vídeo usando o adaptador de lente dedicada do microscópio e disparar a amostra.
    3. Use um microscópio com um ocular 10x e um objetivo 200x.
    4. Prenda o estágio vertical do microscópio a um microscópio em quatro posições com os parafusos de 4 milímetros.
      Nota: consulte a Figura 1a suplementar e a Figura 2a suplementar para desenhos de design de chapas de alumínio. Neste experimento, utilizou-se um microscópio invertido. Isto foi inclinado por 90 °, e o estágio fabricado do microscópio foi afixada com parafusos. Consulte a Figura 1.
    5. Fixe a amostra com duas bandas de borracha usando as quatro garras feitas longitudinalmente. Coloc uma amostra em um estágio do microscópio perpendicular à superfície à terra.
    6. Ajuste a temperatura a 40 ° c com o controlador mostrado na Figura 8 suplementar. Gire o botão do controlador para ajustar a temperatura. Verifique a temperatura definida no visor. Pressione o botão para iniciar o controle de temperatura, e o LED azul acende. Pressione o botão novamente para desligar o LED e parar o controle de temperatura.
      Nota: a temperatura medida é indicada em tempo real, e o aquecedor é controlado para atingir a temperatura definida. Quando o controle de temperatura começa, o LED azul acende-se e permanece assim enquanto o aquecedor está em operação. Quando o aquecedor aquece, o LED vermelho acende e o aquecedor pára automaticamente.
    7. Consulte "o manual de operação do servidor" nas informações complementares para a operação do servidor.
      Nota: é necessário um servidor para armazenamento de dados. O banco de dados do servidor usa My-SQL.

7. medida da distribuição de temperatura de superfície do calefator de borracha

  1. Meça a distribuição da temperatura de superfície do calefator de borracha pela Termografia para verific a uniformidade da temperatura.
  2. Prenda o estágio do microscópio que incorporou um calefator de borracha com um carrinho.
  3. Altere a temperatura de ajuste da superfície do aquecedor de borracha para 35 ° c, 45 ° c, 55 ° c e 65 ° c e meça pela Termografia da frente (consulte a Figura 10 suplementar).

8. teste da resposta da temperatura

  1. Comece o controle de temperatura ajustando a temperatura ajustada da amostra a 30 ° c. Aguarde até que o valor da medição atinja 30 ° c e estabilize. Aumente a temperatura predefinida Stepwise em 5 ° c de 30 ° c a 50 ° c e aguarde até que o valor medido estabilize seguindo a respectiva temperatura predefinida.
  2. Diminua a temperatura predefinida Stepwise por 5 ° c de 50 ° c a 30 ° c e detecte a habilidade de seguimento do valor medido.

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Representative Results

A Figura 2 mostra a distribuição da temperatura do aquecedor de borracha. A temperatura de superfície do calefator de borracha era uniforme em cada temperatura. A Figura 3 mostra a capacidade de resposta da temperatura medida para ajustar as mudanças de temperatura. A linha laranja mostra a temperatura definida e a linha azul mostra a mudança da temperatura da amostra. O overshoot do valor medido à mudança da configuração é pequeno e o seguimento é rápido.

As pilhas de diatom foram observadas para fornecer um exemplo específico do uso deste dispositivo. A análise da trajetória de células de diatomáceas móveis é uma abordagem útil para avaliar a motilidade das células diatomáceas. Entretanto, embora um microscópio invertido normal observa a amostra horizontalmente, não é apropriado para a observação da influência da gravidade ou do movimento de flutuação no sentido vertical.

Neste experimento, o estágio do microscópio com controlador de temperatura foi anexado a um microscópio invertido que tinha sido girado 90 °. O movimento vertical temperatura-dependente dos diatomáceas foi gravado com sucesso. Com esse método, detectou-se o locus de movimento vertical de diatomáceas, como mostrado na Figura 4. Como resultado da observação com 100 indivíduos de diatomáceas, a velocidade média foi de 7, 1 μm/s à temperatura ambiente e 470,1 μm/s a 40 ° c. Os efeitos da convecção térmica no fenômeno de flutuação vertical de pilhas do diatomáceas foram visualizados pela observação direta.

Figure 1
Figura 1: fotografia do dispositivo fixado na fase do microscópio. Aparência do dispositivo fixado ao estágio do microscópio. O dispositivo é fixado ao estágio do microscópio com quatro parafusos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: distribuição de temperatura do aquecedor de borracha. A distribuição do aquecedor de borracha medido pela termografia. A temperatura do aquecedor foi alterada Stepwise de temperatura ambiente para 35 ° c, 45 ° c, 55 ° c e 65 ° c. A temperatura foi uniformemente distribuída através do aquecedor a cada temperatura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: capacidade de resposta do sinal de temperatura. Isto mostra a resposta quando a temperatura ajustada é levantada de 30 ° c a 50 ° c e abaixada de 50 ° c a 30 ° c. A temperatura ajustada foi mudada em incrementos de 5 ° c. No estado estável, a temperatura medida está dentro de ± 1,5 ° c do valor ajustado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: o locus do movimento de diatomáceas. As trajetórias verticais de movimento de diatomáceas devido a mudanças de temperatura foram plotadas. As linhas azuis mostram trajetórias de células diatomáceas a 25 ° c para 27, 6 s e a 40 ° c para 0,2 s. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 1
Complementar Figura 1: desenho de placas de alumínio (com dimensões). (A) a placa tem 2 mm de espessura x 150 mm de largura x 200 mm de comprimento, com um furo centralizado de 101 mm de diâmetro para permitir a inserção do aquecedor de borracha. Cada borda da placa tem duas garras usinadas para as quais as bandas de borracha podem ser presas para fixar amostras no palco. Para fixar este estágio vertical a um microscópio com parafusos de 4 milímetros, os furos de parafuso de 4,2 milímetros são perfurados em quatro posições simetricamente que cercam o furo central. (B) a placa tem 5 mm de espessura x 150 mm de largura x 200 mm de comprimento, com um furo centralizado de 130 mm de diâmetro. Locais de entalhe da máquina para corresponder a locais de garra na placa do Forefront para permitir a fixação de bandas de borracha de proteção de amostra em todo o palco. Para o acessório do estágio a um microscópio, quatro furos de parafuso de 4,2 milímetros são perfurados em posições de harmonização àqueles na placa da vanguarda. (C) a placa é de 4 mm de espessura x 150 mm de largura x 200 mm de comprimento, com um furo centralizado de 130 mm de diâmetro. Uma extensão de 30 milímetros é cortada do centro da cara direita de 200 milímetros da placa, à profundidade do furo central. Esta finalidade do corte é permitir o acessório do conector do calefator no lado direito. Nas mesmas posições que na placa da vanguarda, quatro furos de parafuso de 4,2 milímetros são perfurados para a fixação do estágio a um microscópio. (D) a placa é de 1,5 mm de espessura x 150 mm de largura x 200 mm de comprimento, com um furo de 30 mm de diâmetro centralizado. Nas mesmas posições que na placa da vanguarda, quatro furos de parafuso de 4,2 milímetros são perfurados para a fixação do estágio a um microscópio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Complementar Figura 2: desenho de placas de alumínio (sem dimensões). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Complementar Figura 3: desenho de design de pedestais de alumínio. (A) a ser instalado no lado superior: o diâmetro é 100 milímetros, espessura é 3 milímetros. Um furo de 30 mm de diâmetro é perfurado no centro e um recorte de 42 mm de largura x 30 mm de profundidade é feito de um lado. (B) para ser instalado na parte inferior do lado: diâmetro é 100 mm, espessura é de 4 mm. Um furo do diâmetro de 30 milímetros é perfurado no centro, e três furos de 3 milímetros foram coloc em 120 ° uns aos outros em uma distância de 25 milímetros do centro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Complementar Figura 4: desenho de desenhos de discos prensados de cortiça. (A) a ser instalado no lado superior entre o calefator de borracha do silicone e o suporte de alumínio superior: o diâmetro é 100 milímetros, espessura é 2 milímetros. Um furo de 20 mm de diâmetro é perfurado no centro, e dois cortes (42 mm de largura x 30 mm de profundidade, 4 mm de largura x 40 mm) são feitos em ângulos retos entre si em lados do disco. (B) para ser instalado no lado inferior entre o calefator de borracha do silicone e o suporte de alumínio mais baixo: o diâmetro é 100 milímetros, espessura é 1 milímetro. Um furo do diâmetro de 20 milímetros é perfurado no centro. (C) este suporte é de 42 mm de largura × 30 mm de profundidade e cortado da circunferência de um disco de 100 mm de diâmetro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Suplementar Figura 5: especificação do aquecedor de borracha de silicone. O diâmetro é 100 milímetros e a espessura é 2,5 milímetros. Um furo do diâmetro de 20 milímetros é perfurado no centro. A fonte de alimentação é de 12 V, com capacidade de carga de 18 W. O aquecedor consiste em fio Nichrome, com um fio de chumbo conectado ao eletrodo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura suplementar 6: secção transversal da fase do microscópio. Esta é uma vista seccional do estágio do microscópio. O suporte de alumínio é anexado à placa de alumínio da parte traseira e o calefator de borracha é instalado na superfície ultraperiférica. A cortiça pressionada é instalada para a isolação entre o calefator de borracha e o suporte de alumínio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Complementar Figura 7: detalhes do diagrama de circuitos. Isto indica o circuito construído no controlador. O diagrama do circuito é dividido em nove porções de acordo com funções individuais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Complementar Figura 8: desenho de design de caixa de controlador de plástico. As dimensões são 143,9 mm de comprimento x 85,3 mm de profundidade x 25 mm de largura. O botão de ajuste da temperatura, a lâmpada de funcionamento/superaquecimento, e o indicador são situados na caixa plástica do controlador. A temperatura pode ser ajustada ao prestar atenção ao indicador girando o botão ajustado. Empurrar este botão inicia o controlador de temperatura. A temperatura medida é indicada no tempo real, e o calefator é controlado de modo que alcangue e prenda a temperatura ajustada. Quando o controlador de temperatura está ligado, o LED azul acende-se e permanece aceso enquanto o aquecedor está em funcionamento. Quando o aquecedor aquece, o LED vermelho surge e o aquecedor pára automaticamente. Pressionando o botão do controlador de temperatura novamente irá pará-lo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Complementar Figura 9: configuração do sistema. O estágio do microscópio com um controlador incorporado é conectado ao calefator de borracha com um cabo dedicado. Os sinais medidos da temperatura da amostra são recebidos, e a corrente ao calefator de borracha é transmitida pelo controlador. Os sinais medidos do controlador são enviados sem fio para o servidor através do roteador de Internet. O servidor compila dados de medição para análise e gráficos. A monitorização do registo de temperatura e as definições de temperatura podem ser controladas remotamente através de um PC ou smartphone. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Suplementar Figura 10: medição da distribuição de temperatura por termografia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A análise da trajetória de células de diatomáceas móveis é uma abordagem útil para avaliar a motilidade da diatomácea. Entretanto, quando um microscópio invertido normal observar amostras horizontalmente, não é apropriado para observações da influência da gravidade ou do movimento de flutuação na direção vertical. Desenvolvido e descrito aqui é um estágio de microscópio vertical com controle de temperatura e anexado a um microscópio invertido, que foi girado por 90 °. Este estágio do microscópio com controle de temperatura permite a observação do movimento vertical temperatura-dependente de pilhas do diatomáceas.

Uma etapa crítica dentro do protocolo é o projeto de circuito do controlador. Um circuito disjuntor foi implementado para garantir a segurança. Quando o sensor é desconectado da amostra ou o microcontrolador não funciona corretamente, a corrente para o aquecedor é cortada por um circuito diferente do microcontrolador.

Desde que o sistema de controle adotou o sistema do PID para controlar a corrente do calefator, uma técnica para encontrar o parâmetro o melhor do PID é exigida. Comparado com o método existente, a operação remota e a monitoração são possíveis pela função de Wi-Fi, pela coleção de dados em um Server, e pela função de ajuste da temperatura. Como a estrutura da parte do estágio anexada ao microscópio é complicada, a simplificação desta estrutura garante um estudo futuro.

Este equipamento usa um calefator para levantar a temperatura, mas refrigerar é unpowered; Consequentemente, a temperatura ajustada não pode estar abaixo da temperatura ambiente. As amostras refrigerando às temperaturas mais baixas do que a temperatura ambiente exigirão um dispositivo refrigerando complicado, que esteja sendo considerado para o trabalho futuro.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos para divulgar.

Acknowledgments

Os autores não têm agradecimentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC adapter 12V2A Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. AD-D120P200 Tokyo, Japan
ADS1015 Substrate Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. adafruit PRODUCT ID: 1083 Tokyo, Japan
Alminium Plate (Back Side Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 1.5mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Forefront Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 2mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Lower Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 4mm Gifu, Japan
Alminium Plate (Middle Upper Plate) Inoval Co., Ltd. W 150mm×L 200?×T 5mm Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Lower Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Aluminum Pedestal (Upper Plate) Inoval Co., Ltd. D 100mm×T 3mm (30Φ) Gifu, Japan
Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution Sigma-Aldrich Co. LLC B5282-500ML St. Louis, USA
Controller Case Marutsu Elec Co., Ltd. pff-13-3-9 Tokyo, Japan
CPU Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. ESP-WROOM-02D Tokyo, Japan
Inverted microscope Olympus Corporation CKX 53 Tokyo, Japan
Low temperature hardening epoxy resin adhesive ThreeBond Co., Ltd. TB2086M Tokyo, Japan
Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. 3296W-1-501LF Tokyo, Japan
OLED module Akihabara Inc. M096P4W Tokyo, Japan
Pressed Cork (For supporting electrode ) Tera Co., Ltd. W 42mm×L 30? Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Lower Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 0.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Pressed Cork (Upper Disk) Tera Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Ishikawa, Japan
Rotary encoder with switch with 2 color LED Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. P-05772 Tokyo, Japan
Silicone rubber heater Three High Co., Ltd. D 100mm×T 2.5mm (20Φ) Kanagawa, Japan
Substrate Seeed Technology Co., Ltd. mh5.0 Shenzhen, China
Temperature sensor Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. NXFT15XH103FA2B050 Tokyo, Japan
Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V Marutsu Elec Co., Ltd. BR301 Tokyo, Japan
Universal Flexible Arm Banggood Technology Co., Ltd. YP-003-2 Hong Kong, China
USB cable USB-A - MicroUSB Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. USB CABLE A-MICROB Tokyo, Japan
Video Canera Sony Corporation HDR-CX590 Tokyo, Japan

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