チョウザメフィンと顎骨マトリックスからのコルチゾール抽出

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Summary

本研究では、チョウザメ種のフィンと顎骨からのコルチゾール抽出のためのプロトコルを提示する。フィンと顎骨コルチゾールレベルは、ELISAアッセイに続く2つの洗浄溶媒を比較することによってさらに調べた。本研究は、新しいストレス指標として顎骨コルチゾールの実現可能性を試験的に実施した。

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Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Salmanzadeh, M. H., Park, K. T., Lee, H. G., Shoae, A., Rahimi, A., Sung, K. I., Park, K. H. Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices. J. Vis. Exp. (151), e59961, doi:10.3791/59961 (2019).

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Abstract

本研究の目的は、2つの洗浄溶媒(水とイソプロパノール)を用いてチョウザメのひれからコルチゾールを抽出する技術を開発し、3つの主要チョウザメ種間のフィンコルチゾールレベルの違いを定量化することを目的とした。フィンは、7匹のベルーガ(フーソ)、7シベリア(アシペンサー・バエリ)、5匹のセブルガ(A.ステラタス)を含む19匹の犠牲チョウザメから収穫された。チョウザメはイランの農場で2年間(2017~2018年)飼育され、韓国(2019年1月~2月)でコルチゾール抽出分析を行いました。5 H. husoからの顎骨もコルチゾール抽出に使用された。データは、SAS 環境の一般的な線形モデル (GLM) 手順を使用して分析されました。変動のアッセイ内係数とアッセイ間係数はそれぞれ14.15と7.70であった。簡単に言えば、コルチゾール抽出技術は、サンプル(300±10mg)を3mLの溶媒(超純水およびイソプロパノール)で2回洗浄し、80rpmで2.5分間回転させ、洗浄したサンプルを室温(22-28°C)で7日間空気乾燥し、さらに乾燥させた。50Hzでビーズビーターを32分間使用し、粉末に粉砕し、乾燥粉末(75±5mg)に1.5mLメタノールを塗布し、連続混合で室温で18時間のスロー回転(40rpm)を行います。抽出後、サンプルを遠心分離(9,500 x g 10分)、1mL上清を新しいマイクロ遠心管(1.5mL)に移し、38°Cでインキュベートしてメタノールを蒸発させ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を介して分析した。.種間のフィンコルチゾールレベル、または洗浄溶媒間のフィンおよび顎骨コルチゾールレベルに差は認められなかった。本研究の結果は、チョウザメの顎骨マトリックスが固体行列に対する有望な代替応力指標であることを示している。

Introduction

コルチゾールは、動物のストレスの信頼性の高い指標.コルチゾール抽出は、ストレスレベルとストレスの一般的なパターンを監視する研究者のための有効なフレームワークを提供します。例えば、これまでの研究では、ヒト1、2、サル3、4、牛5、羊6、および様々な方法を用いて毛髪コルチゾール測定の方法論的検証を行った。金魚7,8.魚種では、スケール、皮膚粘液、feces、血液9などのマトリックスにおけるコルチゾール測定が、魚の健康に関する情報を提供することが示されている。血液サンプリングが問題がある場合、またはスケールが不足している場合は、コルチゾール抽出のための代替行列が必要です。魚類において、代替行列は顎骨、ヒト歯10に類似した硬い組織を含むことができる。

魚のストレスレベルを決定するための新しい行列と検証された技術の開発は、チョウザメが環境ストレス因子11への長期暴露を経験することができるキャビア業界に特に関心があります。チョウザメの性別は2歳までには特定できず、チョウザメはスケールを持っていません。コルチゾールは成長段階2、7、12の間に固体マトリックスに徐々に蓄積するので、フィンや顎骨などの硬いマトリックスからの長期コルチゾール蓄積データは、ストレスに関する洞察を提供することができます異なる成長段階でレベル。対照的に、血液コルチゾールレベルは、死亡時のストレスレベルのスナップショットを提供し、長期的な飼育条件13,14の間にストレスを正確に表すことができない。キャビア市場での競争の激化に伴い、長期飼育(8~12年以上)のチョウザメ種間で健康な卵を生産するためのストレス条件を改善する新しいアプローチは、ますます重要な研究分野となっています。チョウザメのコストが高いため、収穫されたサンプルは非常に高価です(種や成長段階に応じて成熟した魚1匹につき$8,000-15,000)、研究プロジェクトの制限要因です。しかし、チョウザメのひれと顎骨からのコルチゾール抽出のための適切な技術の開発は、魚の養殖システムと野生の魚の両方に有用に適用することができ、消費のためのチョウザメの卵の品質と収穫を改善し、保全。

信頼性の高い結果6を提供するだけでなく、適切なコルチゾール抽出技術の選択は、サンプル調製中にマトリックス内に存在する他の化合物が出力を混同しないことを確実にするために非常に重要であり、一貫性のない結果です。フィンと顎骨コルチゾールレベルが周囲の水中のホルモンレベルの影響を受けるかどうかを決定することは同様に重要です.Heimbürge etal.15は、年齢、性別、妊娠、季節、色12、およびコルチゾールが抽出された身体領域を含む多くの因子がコルチゾールレベルに影響を与える可能性があることを示唆した。しかし、魚体マトリックス8におけるコルチゾール抽出に対する洗浄溶媒の影響に関する情報はほとんどなく、チョウザメの卵17を除くチョウザメにおけるこれらの効果に関する情報はほとんどない。

チョウザメのひれと顎骨からベースラインコルチゾールレベルを分析するには、魚を安楽死させる必要がありますが、このアプローチは生チョウザメの血液採取に必要な侵襲的な技術を伴いません。フィンおよび顎骨のサンプルは容易に集められ、これらのティッシュからの抽出は速く行うことができる。同様に、ホルモンの抽出と分析は簡単で、少し専門的な機器を必要とします。

本研究では、魚のひれや顎骨からのコルチゾールの抽出、洗浄、判定に関する新しい簡単に適用された技術を提示し、これらのマトリックスから測定されたコルチゾールレベルをストレスとして確実に使用できるかどうかを決定する目的で、指標。この技術の利点は、簡単で非侵襲的な8アプローチ、より少ないデータバリエーション、および信頼性の高い出力1、6、8、17が含まれます。この技術は、チョウザメのようなスケールのない魚種に適用可能である。この技術は、魚の屠殺、適切な洗浄溶媒の選択2、4、サンプル3、5、専門の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の適切な粉砕を必要とするアプリケーション5、7、および固体行列6へのコルチゾール源の組み込みに関する広範な知識。

ベルーガ(フーソ)、シベリア(アシペンサー・バエリ)、セブルガ(A.ステラタス)の3種からフィンの基礎コルチゾールレベルを得るために、2種類の洗浄溶剤(超純水とイソプロパノール)を塗布しました。)、各種の標準的な環境条件の下で。H.husoの顎骨はまた、チョウザメのストレスを評価するために使用されました。これはチョウザメの顎骨のコルチゾールレベルを測定する最初の研究です。本研究の結果は、性決定前の早期成長段階(~1年)におけるチョウザメ種の比較コルチゾールデータを提供する。

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Protocol

以下の実験手順と方法は、韓国・春川大学の動物福祉倫理局によって承認された。

1. フィンコレクション

  1. 傷やストレスを最小限に抑えるために、ネットを使用してチョウザメを穏やかに捕獲します。
  2. 魚を淡水で注意深くすすいでから、安楽死の前に吸収性タオルで体表面を拭きます。
  3. 魚が驚いたり、意識を失ったりするようなプラスチックハンマーを使用して魚の頭を打つ。ナイフで頭を取り除きます。
  4. 体重 (g) と長さ (cm) を測定します。
  5. 安楽死後、殺菌された外科はさみを使用して、できるだけ体を近くに切断することによってフィンサンプルを収集します。
    注:個々の、非リサイクル吸収性タオルは、各魚に使用する必要があります。この研究で使用される種の記述統計は次の通りでした: ベルーガチョウザメ(H. huso):年齢 = 18 ± 2.1 ヶ月, 体重 = 2,700 ± 300 g, 体長 = 55 ± 5 cm;シベリアチョウザメ(A. baerii):年齢 = 9.6 ± 2.4 ヶ月、 体重 = 1,750 ± 250 g, 体の長さ = 45 ± 5 cm;セブルガチョウザメ(A.ステラタス):年齢=14±1.3ヶ月、体重=1,000±100g、体長=65±5cm。

2. コルチゾール抽出用フィン製剤

  1. フィンサンプル(組織1個につき1サンプル:~3g)を実験室の計量紙(107mm×210mm)に置き、乾燥するまで数日間室温で乾燥させます。
  2. アルミ箔のシートにサンプルをラップし、ラベル付きビニール袋に入れ、実験室に移します。
  3. 洗浄、コルチゾール抽出、乾燥、ELISA分析など、さらなる使用のために冷蔵庫にサンプルを保存します(図2)。

3. フィンコルチゾール分析

  1. デジタル分析スケール(精度:0.0001)を校正し、スケールパンに計量紙で300±10mgのサンプルを計量します。
  2. サンプルを洗います。
    1. 各サンプルを15L円錐ポリプロピレンチューブに移します。5,000 μL シングルチャネルピペットを使用して、各チューブに3 mLのイソプロパノールを追加します。
    2. 80 rpmでチューブを回転させて2.5分間回転させてコルチゾールを洗い流し、潜在的な外部汚染を除去します。この手順を 2 回繰り返します。
    3. 洗浄したサンプルを室温(22~28°C)で7日間エアドライ。
    4. 洗浄剤として超純水を用いて洗浄手順を繰り返す。
  3. 骨切断鉗子を使用して体組織から顎骨を抽出します。ステップ 1.5-3.2.4 を顎骨サンプルに適用します。
  4. 乾燥フィンまたは顎骨サンプル(75±5mg)を計量し、50 Hzでビーズビーターを使用して32分間粉砕します。
    1. 1000 μLピペットを使用して粉末フィンまたは顎骨を含む各チューブに1.5 mLのメタノールを届けます。サンプルをチューブローターに室温で18時間の遅い回転(40rpm)で置き、連続混合でコルチゾールを抽出します。
  5. コルチゾール抽出に続いて、室温で10分間9,500 x gでサンプルを遠心分離します。遠心分離後、各サンプルからコルチゾール(1mL)を含む上部有機層を収集し、別の1.5mLマイクロ遠心管に入れます。
    1. 38°Cでインキュベーションしてサンプルを乾燥させ、メタノールを蒸発させます。抽出したコルチゾールサンプルを一晩ヒュームフードの下に保管し、メタノールが消散できるようにします。
      注:コルチゾール含有層は、通常、色が黄色がかった。

4. フィンコルチゾール検出

  1. ELISAキットを使用する前に、乾燥したフィンまたは顎骨サンプルを室温で1.5時間解凍します。
  2. リン酸バッファー、渦、遠心分離機の 400 μL を 1,500 x gで 15 分間追加します。
  3. 各サンプル(25 μL)を複製して実行し、アッセイの精度と信頼性を向上させます。標準カーブの外側のデータを外れ値として削除します。
  4. マイクロプレートリーダーを450nmに設定し、μg dL-1に設定し、プレートの光学密度を読み取ります。
    1. 4 パラメータ非線形回帰曲線フィットのマイクロプレート ソフトウェアを使用します。ソフトウェアから得られたサンプルのコルチゾールレベルを、次の式を使用してpgmg-1に変換します。
      F = 10,000E (A/B) (C/D)
      ここで、F=(pgmg-1)におけるフィンコルチゾールレベルの最終値、E=乾燥抽出物を再構成するために使用されるアッセイバッファーの体積(mL)、アッセイ出力によって提供される濃度(μgdL-1)、B=余分に供されたフィンの重量(mg)。c=粉末フィンに添加されたメタノールの体積(mL)と、抽出物から回収したメタノールの体積(mL)をD=3に乾燥させた。

5.統計分析

  1. 各サンプルを洗浄手順の前に2つのサブサンプルに分割し、ELISAキットアッセイ(サンプルあたり2×2=4個の観測値)で複製して実行し、結果の試験力と信頼性を向上させます。
  2. SASソフトウェア環境における一般的な線形モデル(GLM)手順を測定データ18に適用することにより、2つの洗浄溶媒の効果とその相互作用を比較する。
  3. P < 0.05 の有意レベルで Tukey のテストを使用する平均間のテストの違い。0.05 < p < 0.10 を有意な差としてではなく傾向の証拠として受け入れます。

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Representative Results

提示されたフィンコルチゾール抽出技術は、3つのチョウザメ種を用いて本研究で開発され、確認された。洗浄溶媒として超純水とイソプロパノールを用いて得られたコルチゾールレベルを比較した(図2)。H.huso顎骨からのコルチゾールを調べ、チョウザメの顎骨がフィンの代替マトリックスとして使用されるかどうかを決定した。洗浄溶媒、チョウザメ種、およびその相互作用の影響を表1に示す。コルチゾールレベルは、イソプロパノールで洗浄されたフィンサンプルにおいて、水で洗浄したものよりも高い傾向があった(p= 0.089)。チョウザメ種間のフィンコルチゾールレベル(p=0.525)に有意な差はなかった。洗浄溶媒とチョウザメ種との間に有意な相互作用はなかった(p= 0.947)。洗浄溶媒は、H.husoチョウザメ(p= 0.45)におけるコルチゾールレベルに有意な影響を及ぼさなかった(表2)。変動のアッセイ内係数とアッセイ間係数はそれぞれ14.15と7.70であった。このデータは、3つのチョウザメ種(表1)とH.huso顎骨(表2)のフィン間で高い類似性を示した。我々はH.husoからのみ顎骨サンプルを得たので、顎骨のコルチゾールレベルと異なるチョウザメ種のフィンの間の相関関係を調査しなかった。これらの関係は、将来の研究で探求されるべきです。

Figure 1
図 1.(A)フソチョウザメ(10歳)の写真。(B)チョウザメの形態学的特徴。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.フィンコルチゾール分析のインフォグラフィック5,6を実験室で行った。インフォグラフィックの要約で提示されたすべての写真は、研究室で撮影されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

チョウザメ種(SS) 洗浄溶剤(WS) P値
フソ・フソ アシペンサー・バエリ アシペンサーステラタス Sem イソプロパノール Sem Ss Ws SS×WS
コルチゾール (pg mg-1)
3.46 2.85 3.34 0.41 2.86 3.69 0.33 0.52 0.08 0.95

表 1.2つの異なる洗浄溶媒を用いて得られた3つのチョウザメ種におけるフィンコルチゾールレベル。

洗浄溶剤(WS) Sem P値
イソプロパノール
コルチゾール (pg mg-1) 1.11 1.43 0.31 0.45

表 2.2つの異なる洗浄溶媒を使用してベルーガチョウザメ(Huso huso)の顎骨コルチゾールレベル。

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Discussion

チョウザメは、過去数千年を通じてほとんど適応を示していないので、「生きた化石」と呼ばれることがあります。チョウザメ属アシペンサーは、キャビアを生産する27種が含まれています。しかし、3種(ベルーガ、バエリ、セブルガ)は、世界的なキャビア供給のほとんどを生産します。チョウザメは、自然の生息地で過剰漁業や干渉に対して脆弱であり、したがって、他のどの種のグループよりも危機的に絶滅の危機に瀕しています。チョウザメは、1億5000万年前から存在していた生きている脊椎動物の最古のグループに属しています。アシペンサー種は成熟し、ゆっくりと成長します。一部(例えば、H.huso)は100年生きることができ、体重は2,000kgを超える。チョウザメは、スケールのない軟骨魚であり、口の前部に位置するスキュートと触覚バーベルと呼ばれる大きな骨板の5列によって特徴付けられています(図1)。これらの種と他の魚との生理学的な違いは、環境ストレスに対する減少した血漿(コルチコステロイド)応答を含む。私たちのフィンコルチゾール測定は、チョウザメの顎骨が循環濃度に比例してコルチゾールを蓄積するという証拠を提供します。

魚は、物理的、化学的、および知覚されたストレスに対する多数の応答を表示します。これらの反応は、魚が環境障害に対処し、恒位状態を維持することを可能にする適応機構としてよく知られています。ストレッサーが十分に長引くか、魚がその自然な応答を使用して恒常性を取り戻すことができない場合、魚は、その全体的な健康および/または生命を危険にさらす、悪影響を経験する可能性があります19。チョウザメの性別は2歳頃から判定できます。したがって、コルチゾールレベルとチョウザメの性別が相関しているかどうかを判断するには、チョウザメのフィンおよび顎骨における長期コルチゾール蓄積(新しいアプローチおよび代替マトリックスとして)を文書化する必要がある。この研究は、チョウザメのフィンと顎骨コルチゾールレベルを報告する最初の.

コルチゾール洗浄溶媒の役割は、皮膚粘液9から外部コルチゾール源を除去することです。Aerts et al.14は、魚の皮膚から外部コルチゾール汚染を除去するために蒸留水を使用しました。以前の研究2、5、12、17では、イソプロパノールと水を溶媒として使用した効果を比較し、毛髪コルチゾール含有量を調べた。洗浄溶媒の効果は、チョウザメの卵13、皮膚15、フィン、および顎骨の特性の違いにより、サンプル間で変化する可能性があります。Brossa7は、イソプロパノールを洗い流す回数にかかわらず溶媒として使用した場合、金魚(カラシウス・オーラトゥス)のスケールのコルチゾールレベルは一定のままであったのに対し、コルチゾールレベルは水を使用した時に変化したと報告した。我々の結果は、洗浄溶媒が顎コルチゾールレベルに影響を及ぼさなかったことを示した。これらの研究の違いは、洗い流しの数、揺れ対渦、イソプロパノール純度、そして重要なことに、外部液体浸透に対するスケール/皮膚の感受性または抵抗を含む。Ghassemi Nejad et al.20は、RIAやELISAなどの異なるアッセイの適用が出力の違いにつながる可能性があることを実証した。ステロイドは、イソプロパノール4などの高分子量のアルコールよりも低分子量アルコール(例えば、メタノール)に溶解性が高い。メタノール抽出は、非共同結合を破ることによってタンパク質を変性させ、したがって、ヘアコルチゾール放出を可能にする。メタノールはまた、非共存在結合を破ることによってホルモン構造を変更します, 組織からのコルチゾールの放出をもたらす.メタノール抽出の前にチョウザメのひれと顎骨を効果的に均質化するために、ビーズビーターを使用して組織構造を効率的に分解することができます。この手順では、フィンと顎骨のサンプルを完全に粉砕する時間が必要です。したがって、コルチゾール抽出の前に完全な粉砕と均質化を確保するために、プロセスを繰り返す必要があります。18時間のゆっくりとした回転は洗浄によってコルチゾールの段階的な除去を可能にする。

哺乳動物の毛髪4、5、6、血液以外のフィンおよび顎のコルチゾール含有量の外部または内部供給源で示唆されているように、無視してはならない。この研究は、コルチゾールが血液からフィンや顎にどのように拡散するかを調査するために特別に設計されたものではありませんが、これらのマトリックスからコルチゾールの変動をよりよく解釈するために、このプロセスに関する知識を拡大する必要性を強調しています。フィンと顎骨の特性は、スケールや皮膚のものとは異なります。Bussy et al.17湖チョウザメのコルチゾールレベルを定量化し、母体の生理的状態と卵質に及ぼす環境影響を調べた。洗浄溶媒としてメチルテルトブチル(MTBE)、酢酸エチル(AcOEt)MTBE、ジエチルエーテル(Et2 O)を洗浄溶媒として使用し、酢酸エチルが回収効果とマトリックス効果の面で最良の抽出溶媒であると結論付けた。本研究では、イソプロパノールが洗浄中に皮膚粘液からより多くの外部コルチゾールを除去し、チョウザメのひれからコルチゾールをわずかに過大評価し、抽出結果を解釈する際に慎重に検討する必要がある。イソプロパノールは、以前の研究7で報告されているように、フィンの皮膚を洗い流すことができた可能性があります。イソプロパノールは、毛包および魚の鱗4、7を浸透することが知られている。本研究の結果は、溶媒の選択がコルチゾールレベルに有意な影響を及ぼさなかったことを示し、コルチゾール抽出は、超純水を使用して他の部分よりもフィンのいくつかの部分でより困難である可能性があることを示唆している。このような場合には、イソプロパノールを代替として用いてもよい。

本研究は、チョウザメのストレスの信頼性の高い指標のための新しいマトリックスとしての顎骨の適用性を実証した。H. huso顎骨コルチゾール値は、同じ種のフィンから抽出されたものに類似していた;今後の研究は、相関分析を通じて異なる種、年齢、性別の間でこの結果を確認する必要があります。チョウザメのコストが高いため、現在の研究では魚の数が少ない。我々は、各サンプルを2回テストし、ELISAのメタノール抽出を複製することによって、この制限を克服しようとしました。4 倍の乗算を使用すると、サンプル数が少ない場合にテストの出力が向上する可能性があります。

我々は、洗浄溶媒の種類がチョウザメのフィンからのコルチゾール抽出に適度に影響を与えたが、顎ではないと結論付ける。本研究の結論を一般化し、これらの結果を検証する前に、異なる種や溶媒を用いたさらなる研究を行うべきである。本研究は、チョウザメのストレスの指標としてコルチゾールを用いて、今後の研究でチョウザメの顎骨を代替マトリックスとして適用できることを示す証拠を提供する。本研究では、フィンおよび顎骨コルチゾール測定に対するELISAの適合性も実証した。今後の研究は、2つの側面に焦点を当てるべきである:1)顎骨のコルチゾールレベルとチョウザメのひれのコルチゾールレベルの間の相関関係を決定し、2)古い魚とそのキャビアからのコルチゾール測定のためのマトリックスサンプルを収穫し、長期的なストレスを決定する。寿命を超えて異なるチョウザメ種のレベル。

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Disclosures

著者は、開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgments

本研究は、農林水産技術開発協力研究プログラム(プロジェクトタイトル:気候変動に伴う家畜生産性変化分析、プロジェクトNo.PJ012771)、韓国農村開発局。また、この研究は助成金(いいえ)PJ01344604) 動物栄養生理学チーム、国立動物科学研究所、RDA、ソウル、韓国。著者らは、ペルシャのジェスチャーCEOモハマド・ハッサン・サルマンザデと彼のチームが、この研究で調べた3つのチョウザメ種から魚を提供したことを感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposal latex surgical gloves Ansell 63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg Baskoolnikoo 101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL Becton Dickinson Falcon 35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters BioTek 8041000
Reagent reservoirs BrandTech 703459
Zipper storage plastic bag  Cleanwrap 30cm x100m
Isopropyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5035-4400
Methyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro DLAB Scientific  824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL Eppendorf Research Plus M21518D
  Precision pipette to deliver 15 and 25 μL Eppendorf Research Plus R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm) Fisherbrand 09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A GeneReach Biotechnology Corp tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm Hangzhou Miu Instrument  MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL Hyundai Micro  H20050
Fume hood Kwang Dong Industrial KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g Labo Gene  9.900.900.729
Mini vortex mixer LMS VTX-3000L 
Lotte aluminum foil roll  Lotte Aluminum B0722X5FK5
Digital scale Mettler Toledo   ME204
Ultrapure water MDM MDM-0110
Pipette tips Neptune Scientific REF 2100.N
Large fish net Pond H2O Hoz135 
Salivary cortisol kit Salimetrics 1-3002-4
Bone cutting forceps Sankyo 26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL VITLAB 18A68756
Towel Yuhan Kimberly 1707921546
Tissue paper (107 × 210) Yuhan Kimberly 41117

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