Extracción de cortisol de las matrices de aleta de esturión y mandíbula

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Summary

En este estudio, presentamos un protocolo para la extracción de cortisol de la aleta y la mandíbula de las especies de esturión. Los niveles de cortisol de aleta y mandíbula se examinaron más adelante comparando dos disolventes de lavado seguidos de ensayos ELISA. Este estudio pilotó la viabilidad del cortisol maxilar como un indicador de estrés novedoso.

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Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Salmanzadeh, M. H., Park, K. T., Lee, H. G., Shoae, A., Rahimi, A., Sung, K. I., Park, K. H. Cortisol Extraction from Sturgeon Fin and Jawbone Matrices. J. Vis. Exp. (151), e59961, doi:10.3791/59961 (2019).

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Abstract

Los objetivos de este estudio fueron desarrollar una técnica para la extracción de cortisol a partir de aletas de esturión utilizando dos disolventes de lavado (agua e isopropanol) y cuantificar cualquier diferencia en los niveles de cortisol de aleta entre tres especies principales de esturión. Las aletas fueron cosechadas de 19 esturiones sacrificados, incluyendo siete beluga(Huso huso),siete siberianos(Acipenser baerii)y cinco sevruga (A. stellatus). Los esturiones se criaron en granjas iraníes durante 2 años (2017-2018), y el análisis de extracción de cortisol se llevó a cabo en Corea del Sur (enero-febrero de 2019). Los jawbones de cinco H. huso también se utilizaron para la extracción de cortisol. Los datos se analizaron mediante el procedimiento de modelo lineal general (GLM) en el entorno SAS. Los coeficientes de variación intra y entre ensayos fueron de 14,15 y 7,70, respectivamente. Brevemente, la técnica de extracción de cortisol implicó el lavado de las muestras (300 x 10 mg) con 3 ml de disolvente (agua ultrapura e isopropanol) dos veces, rotación a 80 rpm durante 2,5 min, secado al aire de las muestras lavadas a temperatura ambiente (22-28 oC) durante 7 días, secado posterior las muestras que utilizan un batidor de perlas a 50 Hz durante 32 minutos y la molienda en polvo, aplicando metanol de 1,5 ml al polvo seco (75 x 5 mg), y rotación lenta (40 rpm) durante 18 horas a temperatura ambiente con mezcla continua. Después de la extracción, las muestras se centrifugaron (9.500 x g durante 10 min) y se transfirieron un sobrenadante de 1 ml a un nuevo tubo de microcentrífuga (1,5 ml), se incubaron a 38 oC para evaporar el metanol y se analizaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) . No se observaron diferencias en los niveles de cortisol de aleta entre las especies o en los niveles de cortisol de aleta y mandíbula entre los disolventes de lavado. Los resultados de este estudio demuestran que la matriz jawbone de esturión es un indicador de tensión alternativo prometedor a matrices sólidas.

Introduction

El cortisol es un indicador fiable del estrés animal. La extracción de cortisol proporciona un marco válido para que los investigadores supervisen los niveles de estrés y los patrones generales en los factores de estrés. Por ejemplo, estudios previos han llevado a cabo la validación metodológica de mediciones de cortisol capilar utilizando diversos métodos en humanos1,2, monos3,4, bovino5, ovejas6, y pecesdorados 7,8. En las especies de peces, se ha demostrado que las mediciones de cortisol en matrices como escamas, moco de la piel, heces y sangre9 proporcionan información sobre la salud de los peces. Cuando el muestreo de sangre es problemático o faltan escamas, se necesitan matrices alternativas para la extracción de cortisol. En los peces, matrices alternativas pueden incluir la mandíbula, un tejido duro similar al diente humano10.

El desarrollo de nuevas matrices y técnicas validadas para determinar los niveles de estrés de los peces es de particular interés para la industria del caviar, donde el esturión puede experimentar una exposición prolongada a los factores de estrés ambiental11. El sexo del esturión no se puede determinar antes de los 2 años de edad, y el esturión no tiene escamas. Debido a que el cortisol se acumula gradualmente en matrices sólidas durante la etapa de crecimiento2,7,12, datos de acumulación de cortisol a largo plazo de matrices duras como aletas y mandíbulas podrían proporcionar información sobre el estrés niveles en diferentes etapas de crecimiento. Por el contrario, los niveles de cortisol en sangre proporcionan una instantánea de los niveles de estrés en el momento de la muerte y no pueden representar con precisión el estrés durante las condiciones de cría a largo plazo13,14. Con la creciente competencia en el mercado del caviar, los nuevos enfoques para mejorar las condiciones de estrés para la producción de huevos más saludables entre las especies de esturión durante la cría a largo plazo (8-12 años o más) son un área de investigación cada vez más importante. Debido al alto costo del esturión, las muestras cosechadas son extremadamente costosas ($8,000-15,000 por peces maduros dependiendo de la especie y la etapa de crecimiento), un factor limitante para los proyectos de investigación. Sin embargo, el desarrollo de una técnica adecuada para la extracción de cortisol a partir de aletas de esturión y mandíbulas podría aplicarse útilmente tanto a los sistemas de piscicultura como a los peces silvestres para mejorar la calidad y la cosecha de huevos de esturión tanto para el consumo como para Conservación.

Además de proporcionar resultados fiables6, la selección de una técnica de extracción de cortisol adecuada es de importancia crítica para garantizar que otros compuestos presentes en la matriz durante la preparación de la muestra no confundan la producción, lo que podría resultados incoherentes. Es igualmente importante determinar si los niveles de cortisol de aleta y mandíbula están influenciados por los niveles hormonales en el agua circundante. 15 sugirieron que una serie de factores pueden influir en los niveles de cortisol, incluyendo la edad, el sexo, el embarazo, la temporada, el color12y la región corporal de la que se extrae el cortisol16. Sin embargo, se dispone de poca información sobre los efectos de los disolventes de lavado en la extracción de cortisol en matrices de cuerpo de pescado8, y ninguno sobre estos efectos en el esturión, excepto para los huevos de esturión17.

Aunque el análisis de los niveles basales de cortisol a partir de las aletas y mandíbulas del esturión requiere que el pez sea eutanasiado, este enfoque no implica las técnicas invasivas necesarias para el muestreo de sangre en el esturión vivo. Las muestras de aleta y mandíbula se recogen fácilmente, y la extracción de estos tejidos se puede realizar rápidamente. Del mismo modo, la extracción y el análisis hormonales son sencillos y requieren poco equipo especializado.

En este estudio, presentamos una técnica nueva y fácil de aplicar para la extracción, lavado y determinación de cortisol a partir de aletas de pescado y mandíbulas, con el objetivo de determinar si los niveles de cortisol medidos a partir de estas matrices pueden utilizarse de forma fiable como estrés Indicadores. Las ventajas de esta técnica incluyen un enfoque8 fácil y no invasivo, menos variación de datos y una salida confiable1,6,8,17; la técnica es aplicable a especies de peces sin escamas como el esturión. La técnica requiere el sacrificio del pescado, la selección de los disolventes de lavado adecuados2,4, molienda adecuada de las muestras3,5, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas profesionales (ELISA) aplicación5,7, y un amplio conocimiento de la incorporación de fuentes de cortisol en matrices sólidas6.

Aplicamos dos disolventes de lavado diferentes (agua ultrapura e isopropanol) para obtener niveles basales de cortisol en aletas de tres especies de esturión: beluga (Huso huso), siberiano (Acipenser baerii) y sevruga (A. stellatus ), en condiciones ambientales estándar para cada especie. Mandíbulas de H. huso también se utilizaron para evaluar el estrés en el esturión. Este es el primer estudio para medir los niveles de cortisol en los maxilares de esturión. Los resultados de este estudio proporcionarán datos comparativos de cortisol para las especies de esturión en la etapa de crecimiento temprano (1 año) antes de la determinación del sexo.

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Protocol

Los siguientes procedimientos y métodos experimentales fueron aprobados por la Autoridad de Bienestar Animal y Etica de la Universidad Nacional de Kangwon, Chuncheon, República de Corea.

1. Colección de aletas

  1. Captura el esturión suavemente usando una red para minimizar las lesiones y el estrés.
  2. Enjuague el pescado cuidadosamente con agua dulce y luego limpie la superficie del cuerpo con una toalla absorbente antes de la eutanasia.
  3. Golpea la cabeza del pez usando un martillo de plástico de tal forma que el pez se aturda o pierde el conocimiento. Retire la cabeza con un cuchillo.
  4. Mida el peso corporal (g) y la longitud (cm).
  5. Después de la eutanasia, recoger muestras de aleta cortando lo más cerca posible del cuerpo utilizando tijeras quirúrgicas esterilizadas.
    NOTA: Se deben utilizar toallas absorbentes individuales y no recicladas para cada pescado. Las estadísticas descriptivas de las especies utilizadas en este estudio fueron las siguientes: esturión de beluga (H. huso): edad de 18 a 2,1 meses, peso corporal a 2.700 x 300 g, y longitud del cuerpo a 55 x 5 cm; Esturión siberiano (A. baerii): edad a 9,6 a 2,4 meses, peso corporal a 1,750 a 250 g, y longitud de la carrocería a 45 x 5 cm; esturión sevruga (A. stellatus): edad de 14 x 1,3 meses, peso corporal a 1.000 a 100 g, y longitud del cuerpo a 65 x 5 cm.

2. Preparación de aletas para la extracción de cortisol

  1. Colocar las muestras de aleta (una muestra por tejido: 3 g) en papel de pesaje de laboratorio (107 mm x 210 mm) y secar a temperatura ambiente durante unos días hasta que se seque.
  2. Envuelva las muestras en láminas de papel de aluminio, colóquelas en bolsas de plástico etiquetadas y transfiera las muestras al laboratorio.
  3. Almacene las muestras en un refrigerador para su uso posterior, incluyendo lavado, extracción de cortisol, secado y análisis ELISA(Figura 2).

3. Análisis de cortisol de aleta

  1. Calibre la báscula analítica digital (precisión: 0.0001) y pese 300 muestras de 10 mg con papel de pesaje en la bandeja de la báscula.
  2. Lave las muestras.
    1. Transfiera cada muestra a un tubo de polipropileno cónico de 15 L. Añadir 3 ml de isopropanol a cada tubo utilizando una pipeta monocanal de 5.000 ml.
    2. Gire los tubos a 80 rpm durante 2,5 minutos para lavar el cortisol y eliminar cualquier posible contaminación externa. Repita este procedimiento dos veces.
    3. Seque al aire las muestras lavadas a temperatura ambiente (22-28 oC) durante 7 días.
    4. Repita el procedimiento de lavado con agua ultrapura como agente de lavado.
  3. Extraiga la mandíbula del tejido corporal utilizando fórceps de corte óseo. Aplique los pasos 1.5-3.2.4 a las muestras de la mandíbula.
  4. Pesar (75 x 5 mg) muestras de aleta seca o mandíbula y moler con un batidor de cuentas a 50 Hz durante 32 min.
    1. Entregar 1,5 ml de metanol en cada tubo que contenga aleta o mandíbula en polvo utilizando una pipeta de 1000 ml. Coloque las muestras en un rotador de tubo a rotación lenta (40 rpm) durante 18 horas a temperatura ambiente para extraer el cortisol con mezcla continua.
  5. Después de la extracción de cortisol, centrifugar las muestras a 9.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, recoja la capa orgánica superior que contiene cortisol (1 ml) de cada muestra y colóquela en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml.
    1. Secar las muestras por incubación a 38oC para evaporar el metanol. Conservar las muestras de cortisol extraídas bajo una campana de humo durante la noche para permitir que el metanol se disipe.
      NOTA: La capa que contiene cortisol suele ser de color amarillento.

4. Detección de cortisol de aleta

  1. Descongelar las muestras de aleta seca o mandíbula a temperatura ambiente durante 1,5 h antes de utilizar el kit ELISA.
  2. Añadir 400 l de tampón de fosfato, vórtice y centrífuga a 1.500 x g durante 15 min.
  3. Ejecute cada muestra (25 l) por duplicado para mejorar la precisión y fiabilidad del ensayo. Elimine los datos fuera de la curva estándar como valores atípicos.
  4. Establezca un lector de microplacas en 450 nm, luego ajuste a ág dL-1 y lea la densidad óptica de la placa.
    1. Utilice el software de microplaca con un ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros. Convierta los niveles de cortisol de las muestras obtenidas del software en pg mg-1 utilizando la siguiente ecuación:
      F a 10.000E (A/B) (C/D),
      donde F - el valor final del nivel de cortisol de la aleta en (pg mg-1), E - el volumen (ml) del tampón de ensayo utilizado para reconstituir el extracto seco, A - la concentración (g dL-1) proporcionada por la salida del ensayo, B - el peso (mg) de la aleta sometida a ction, C - el volumen (mL) de metanol añadido a la aleta en polvo, y D - el volumen (ml) de metanol recuperado del extracto y posteriormente secado hacia abajo3.

5.Análisis estadístico

  1. Divida cada muestra en dos submuestras antes del procedimiento de lavado y, a continuación, ejecute por duplicado durante el ensayo del kit ELISA (2 x 2 x 4 observaciones por muestra) para mejorar la potencia de la prueba y la fiabilidad de los resultados.
  2. Compare los efectos de los dos disolventes de lavado y sus interacciones aplicando el procedimiento de modelo lineal general (GLM) en el entorno de software SAS a los datos de medición18.
  3. Pruebe las diferencias entre los medios que utilizan la prueba de Tukey en un nivel de significancia de p < 0.05. Acepte 0.05 < p < 0.10 como evidencia de una tendencia en lugar de como una diferencia significativa.

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Representative Results

La técnica de extracción de cortisol de aleta presentada fue desarrollada y confirmada en este estudio utilizando tres especies de esturión. Se compararon los niveles de cortisol obtenidos con agua ultrapura e isopropanol como disolventes de lavado(Figura 2). Se examinó el cortisol de H. huso jawbones para determinar si los maxilares de esturión podrían utilizarse como una matriz alternativa a las aletas. Los efectos del disolvente de lavado, las especies de esturión y su interacción se muestran en la Tabla 1. Los niveles de cortisol tendieron a ser más altos en las muestras de aleta lavadas con isopropanol que en las que se lavaron con agua (p a 0,089). No hubo diferencias significativas en los niveles de cortisol de las aletas (p - 0,525) entre las especies de esturión. No hubo una interacción significativa entre los disolventes de lavado y las especies de esturión (p x 0,947). El disolvente de lavado no tuvo ningún efecto significativo sobre el nivel de cortisol en H. huso sturgeon (p - 0,45) (Tabla 2). Los coeficientes de variación entre ensayos e interensayos fueron de 14,15 y 7,70, respectivamente. Los datos mostraron una alta similitud entre las aletas de las tres especies de esturión(Tabla 1) y en H. huso jawbones (Tabla 2). No investigamos correlaciones entre los niveles de cortisol en los maxilares y los de las aletas de diferentes especies de esturión porque obtuvimos muestras de mandíbula sólo de H. huso. Estas relaciones deben ser exploradas en un estudio futuro.

Figure 1
Figura 1. (A) Fotografía de Huso huso sturgeon (10 años). (B) Características morfológicas del esturión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Infografía del análisis de cortisol de aleta5,6 realizado en el laboratorio. Todas las fotografías presentadas en el resumen infográfico fueron tomadas en el laboratorio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Especies de esturión (SS) Disolvente de lavado (WS) Valor P
Huso huso Acipenser baerii Acipenser stellatus Sem Agua Isopropanol Sem Ss Ws SS-WS
Cortisol (pg mg-1)
3.46 2.85 3.34 0.41 2.86 3.69 0.33 0.52 0.08 0.95

Tabla 1. Niveles de cortisol de aleta en tres especies de esturión obtenidos utilizando dos disolventes de lavado diferentes.

Disolvente de lavado (WS) Sem Valor P
Agua Isopropanol
Cortisol (pg mg-1) 1.11 1.43 0.31 0.45

Cuadro 2. Niveles de cortisol de mandíbula en esturión beluga (Huso huso) utilizando dos disolventes de lavado diferentes.

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Discussion

El esturión a veces se llama un "fósil viviente" porque ha exhibido pocas adaptaciones a lo largo de los últimos milenios. El género de esturiones Acipenser contiene 27 especies que producen caviar; sin embargo, tres especies (beluga, baerii y sevruga) producen la mayor parte del suministro mundial de caviar. El esturión es vulnerable a la sobrepesca y a la interferencia en su hábitat natural y, por lo tanto, está en peligro de extinción más crítico que cualquier otro grupo de especies. El esturión pertenece al grupo más antiguo de vertebrados vivos, que ha existido durante 150 millones de años. Las especies de Acipenser maduran y crecen lentamente; algunos (por ejemplo, H. huso) pueden vivir 100 años y superar los 2.000 kg de peso. Los esturiones son peces cartilaginosos sin escamas, y se caracterizan por cinco hileras de grandes placas óseas llamadas scutes y barbas táctiles situadas en la parte delantera de la boca(Figura 1). Las diferencias fisiológicas entre estas especies y otros peces incluyen disminución del plasma (corticosteroides) respuestas a los factores estresantes ambientales. Nuestras mediciones de cortisol de aleta proporcionan evidencia de que la mandíbula del esturión acumula cortisol en proporción a las concentraciones circulantes.

Los peces muestran numerosas respuestas a los factores de estrés físicos, químicos y percibidos. Estas reacciones son bien conocidas como mecanismos adaptativos que permiten a los peces hacer frente a las perturbaciones ambientales y mantener un estado homeostático. Si un estresante es lo suficientemente prolongado o grave que el pez es incapaz de recuperar la homeostasis utilizando sus respuestas naturales, entonces los peces pueden experimentar efectos adversos, poniendo en peligro su salud y/o vida general19. El sexo del esturión se puede determinar a partir de alrededor de 2 años de edad. Por lo tanto, para determinar si los niveles de cortisol y el sexo esturión están correlacionados, es necesario documentar la acumulación de cortisol a largo plazo en aletas y mandíbulas (como un nuevo enfoque y matriz alternativa) de esturión. Este estudio es el primero en reportar los niveles de cortisol de aleta y mandíbula en el esturión.

El papel de un disolvente de lavado de cortisol es eliminar las fuentes externas de cortisol de la mucosidad de la piel9. 14 utilizaron agua destilada para eliminar la contaminación externa del cortisol de la piel de los peces; en estudios anteriores2,5,12,17, comparamos los efectos del uso de isopropanol y agua como disolvente para examinar el contenido de cortisol capilar. Los efectos del disolvente de lavado pueden variar entre las muestras debido a las diferencias en las propiedades de los huevos de esturión13, piel15,aletas y mandíbulas. Brossa7 informó que el nivel de cortisol en escalas de peces dorados (Carassius auratus) se mantuvo constante cuando se utilizó isopropanol como disolvente independientemente del número de lavados, mientras que los niveles de cortisol variaron cuando se utilizó agua. Nuestros resultados mostraron que el disolvente de lavado no tuvo ningún efecto sobre los niveles de cortisol de la mandíbula. Las diferencias entre estos estudios incluyen el número de lavados, agitación frente a vórtice, pureza de isopropanol, y lo que es más importante, sensibilidad o resistencia de las escamas / piel a la penetración de líquido externo. 20 demostraron que la aplicación de diferentes ensayos como RIA y ELISA puede dar lugar a diferencias en la producción. Los esteroides son más solubles en alcoholes de masa molecular inferior (por ejemplo, metanol) que en alcoholes de mayor peso molecular como el isopropanol4. La extracción de metanol desnaturaliza la proteína rompiendo los enlaces no covalentes, permitiendo así la liberación de cortisol capilar. El metanol también modifica la estructura hormonal rompiendo enlaces no covalentes, lo que resulta en la liberación de cortisol de los tejidos. Para homogeneizar eficazmente las aletas de esturión y mandíbulas antes de la extracción de metanol, se puede utilizar un batidor de cuentas para descomponer eficientemente la estructura tisular. Este procedimiento requiere tiempo para moler completamente las muestras de aleta y mandíbula; por lo tanto, el proceso debe repetirse para garantizar la pulverización y homogeneización completas antes de la extracción de cortisol. La rotación lenta durante 18 h permite la eliminación gradual del cortisol por lavado.

Como se sugiere en estudios previos de pelo de mamífero4,5,6, fuentes externas o internas de contenido de cortisol en aletas y mandíbulas, excepto la sangre, no deben ser descuidadas. Aunque este estudio no fue diseñado específicamente para investigar cómo el cortisol se difunde de la sangre a las aletas o mandíbulas, pone de relieve la necesidad de ampliar nuestro conocimiento de este proceso para interpretar mejor las fluctuaciones del cortisol de estas matrices. Las propiedades de las aletas y mandíbulas difieren de las de las escamas y la piel. 17 niveles cuantificados de cortisol en el esturión del lago (A. fulvescens) huevos para investigar los efectos ambientales sobre la condición fisiológica materna y la calidad del huevo. Utilizaron metil tert-butylether (MTBE), acetato de etilo (AcOEt) MTBE y éter dietílico (Et2O) como disolventes de lavado y concluyeron que el acetato de etilo era el mejor disolvente de extracción en términos de recuperación y efecto matricial. En el presente estudio, el isopropanol eliminó mayores cantidades de cortisol externo de la mucosidad de la piel durante el lavado, lo que llevó a una ligera sobreestimación del cortisol de las aletas de esturión, que debe ser cuidadosamente considerado al interpretar los resultados de extracción. Es posible que el isopropanol fue capaz de lavar la piel de la aleta, como se ha informado en un estudio anterior7. El isopropanol es conocido por penetrar los folículos pilosos y las escamas de los peces4,7. Los resultados del presente estudio indican que la elección del disolvente no tuvo ningún efecto significativo en los niveles de cortisol, lo que sugiere que la extracción de cortisol puede ser más difícil en algunas partes de la aleta que en otras utilizando agua ultrapura; en tales casos, el isopropanol puede utilizarse como alternativa.

Este estudio demostró la aplicabilidad de la mandíbula como una matriz novedosa para la indicación fiable de estrés en el esturión. H. huso mandíbula cortisol valores fueron similares a los extraídos de aletas de la misma especie; estudios futuros deben confirmar este resultado entre diferentes especies, edades y sexos a través del análisis de correlación. Un número bajo de peces se utilizó en el estudio actual debido al alto costo del esturión; intentamos superar esta limitación probando cada muestra dos veces y también duplicando la extracción de metanol para el ELISA. El uso de la multiplicación cuádruple podría aumentar la potencia de la prueba para cubrir el bajo número de muestras.

Concluimos que el tipo de disolvente de lavado afectó moderadamente la extracción de cortisol de las aletas, pero no las mandíbulas, del esturión. Antes de generalizar la conclusión de este estudio y validar estos resultados, se deben realizar más investigaciones utilizando diferentes especies y disolventes. El presente trabajo proporciona evidencia de que la mandíbula del esturión se puede aplicar como una matriz alternativa en estudios futuros utilizando cortisol como índice de estrés en el esturión. La idoneidad de ELISA para la medición de cortisol de aleta y mandíbula también se demostró en el presente estudio. Las investigaciones futuras deben centrarse en dos aspectos: 1) determinar la correlación entre los niveles de cortisol en los maxilares y los de las aletas de esturión y 2) la recolección de muestras de matriz para la medición del cortisol a partir de peces más viejos y su caviar para determinar el estrés a largo plazo diferentes especies de esturión a lo largo de la vida útil.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo se llevó a cabo con el apoyo del Programa de Investigación Cooperativa para el Desarrollo de La Ciencia y Tecnología Agrícola (Título del Proyecto: Análisis del cambio de productividad ganadera con cambio climático, Proyecto No. PJ012771), Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Además, este estudio fue apoyado por una subvención (No. PJ01344604) del Equipo de Nutrición y Fisiología Animal, Instituto Nacional de Ciencias Animales, RDA, Seúl, República de Corea. Los autores reconocen con gratitud al CEO de Persian Gesture Mohammad Hassan Salmanzadeh y a su equipo, que proporcionó peces de las tres especies de esturión examinadas en este estudio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposal latex surgical gloves Ansell 63754090
Platform scale-electronic weighing 100kg Baskoolnikoo 101 EM
Serological pipette to deliver up to 24 mL Becton Dickinson Falcon 35-7550
Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters BioTek 8041000
Reagent reservoirs BrandTech 703459
Zipper storage plastic bag  Cleanwrap 30cm x100m
Isopropyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5035-4400
Methyl alcohol Daejung chemicals & Metals  5558-4100
Tube rotator- MX-RL-Pro DLAB Scientific  824-222217777
Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL Eppendorf Research Plus M21518D
  Precision pipette to deliver 15 and 25 μL Eppendorf Research Plus R25623C
Weighing paper (107 x 210 mm) Fisherbrand 09-898-12B
Bead beater, 50/60 Hz 2A GeneReach Biotechnology Corp tp0088
Plate rotator with orbit capable of 500 rpm Hangzhou Miu Instrument  MU-E30-1044
Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL Hyundai Micro  H20050
Fume hood Kwang Dong Industrial KD 901-22128175
Micro-centrifuge capable of 1500 x g Labo Gene  9.900.900.729
Mini vortex mixer LMS VTX-3000L 
Lotte aluminum foil roll  Lotte Aluminum B0722X5FK5
Digital scale Mettler Toledo   ME204
Ultrapure water MDM MDM-0110
Pipette tips Neptune Scientific REF 2100.N
Large fish net Pond H2O Hoz135 
Salivary cortisol kit Salimetrics 1-3002-4
Bone cutting forceps Sankyo 26-188A
Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL VITLAB 18A68756
Towel Yuhan Kimberly 1707921546
Tissue paper (107 × 210) Yuhan Kimberly 41117

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