免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

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Summary

抗体標識、光学クリアリング、および高度光顕微鏡検査の組み合わせにより、完全な構造または器官の3次元解析が可能になります。ここでは、厚い腎臓スライスの免疫標識、エチルシナメートによる光学クリアリング、および3次元腎臓構造の可視化と定量を可能にする共焦点イメージングを組み合わせる簡単な方法です。

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Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue. J. Vis. Exp. (149), e60002, doi:10.3791/60002 (2019).

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Abstract

光学クリアリング技術は、その後の3次元(3-D)イメージングのためにサンプル全体で屈折率を平衡化することにより、組織を透明にします。彼らは、顕微鏡的な距離にわたって広がる顕微鏡多細胞構造を分析する可能性について、すべての研究分野で大きな注目を集めています。腎臓の管、血管、神経、糸球体が多くの方向に広がっていることを考えると、これまで伝統的な2次元技術によって部分的にしか捕捉されていなかったため、組織のクリアリングは腎臓研究の多くの新しい領域を開きました。光学クリアリング方法のリストは急速に成長していますが、この分野の初心者が特定の研究問題に最適な方法を選択することは困難なままです。ここでは、厚いマウス腎臓スライスの抗体標識を組み合わせた簡単な方法です。安価で非毒性ですぐに使用でき、化学エチルシナメートを用いて光学クリアリング。と共焦点イメージング。このプロトコルは、腎臓を浸透させ、特殊な装置を必要とせずに抗体結合を増加させるために抗原検索ステップを使用する方法について説明します。その応用は、腎臓内の異なる多細胞構造をイメージングする際に提示され、組織への不十分な抗体の浸透をトラブルシューティングする方法に対処される。また、内因性蛍風素をイメージングし、非常に大きなサンプルを取得することの潜在的な困難と、それらを克服する方法についても議論する。この簡単な議定書は3次元のティッシュを研究するための容易なセットアップおよび包括的な用具を提供する。

Introduction

臓器全体や大きな多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明な組織を3次元でイメージングする光学クリアリング法の開発につながっています。最近まで、全体の構造の細胞数、長さ、または体積を推定する最良の方法は、2次元1の後続の分析のための組織の全身サンプリングに基づく立体または網羅的な連続断面であり、2,3.しかし、これらの方法は時間がかかり、高いレベルのトレーニングと専門知識を必要とします4.光学クリア法は、サンプル全体で屈折率を平衡化して、3-Dイメージング5、6、7の組織を半透明にすることによって、これらの問題を克服する。

いくつかの光学クリア法が開発されており、溶媒ベースと水性ベースの2つのカテゴリーに分類されます。水性ベースの方法は、さらに単純な浸漬8、9、高水和10、11、およびヒドロゲル埋め込み12、13に分けることができる。溶媒ベースの方法は、組織を脱水し、脂質を除去し、屈折率を約1.55の値に正規化する。ほとんどの溶媒ベースの方法の限界は、GFPなどの一般的に使用されるレポータータンパク質の内因性蛍光の消光、溶媒毒性、一部のイメージングチャンバーまたは対物レンズで使用される接着剤を溶解する能力、および組織の収縮脱水14,15,16,17,18,19,20,21.しかし、溶媒ベースの方法は、簡単で時間効率が良く、多くの異なる組織タイプで働くことができます。

水性ベースの方法は、1.38-1.528、11、12、22、23、24の範囲で屈折指数を有する水溶液中の組織の浸漬に依存する.これらの方法は、内因性蛍光レポータータンパク質の放出を維持し、脱水誘発収縮を防ぐために開発されたが、ほとんどの水性ベースのクリアリング方法の限界は、プロトコルのより長い持続時間、組織の拡張、およびタンパク質修飾(すなわち、ScaleA2のような過水化プロトコルにおける尿素によるタンパク質の部分変性)7、11、23、25。ScaleSは、尿素とソルビトールを組み合わせることにより組織膨張に対処し、尿素誘発組織膨張を脱水してバランスをとり、電子顕微鏡10で評価した組織超構造を保存した。組織の収縮または膨張は、構造の絶対サイズ、オブジェクト間の距離、または体積あたりの細胞密度に影響を与えます。したがって、組織の除去時のサイズ変化の測定は、得られた結果7、26を解釈するのに役立ち得る。

一般に、光学クリアリングのためのプロトコルは、前処理、透過性化、免疫標識(必要な場合)、屈折率照合、高度な光顕微鏡によるイメージング(例えば、2光子、共焦点、またはまたは)光シート蛍光顕微鏡)。クリアリングアプローチのほとんどは、神経組織を視覚化するために開発されており、新しい研究は、他の臓器5での応用を検証しています。この包括的なツールは、糸球体27、28、免疫浸潤28、血管系28、および管状セグメントを含む腎臓構造の信頼性と効率的な分析を可能にするために以前に実証されています29、および健康および疾患における糸球体機能および管状リモデリングの理解を深める理想的なアプローチである。

ここで要約すると、腎臓の管状の免疫染色を組み合わせた溶媒ベースの方法です。安価で非毒性で、すぐに使用する化学エチルシナメート(ECi)による光学クリアリング。完全な管の視覚化および定量を可能にする共焦点顕微鏡イメージ投射。この方法は簡単で、市販の抗体の染色と腎臓スライスの抗原検索を組み合わせ、特殊な装置を必要としないため、ほとんどのラボがアクセスできます。

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Protocol

注:ここに記載されているすべての実験手順は、オレゴン州立保健科学大学、ポートランド、オレゴン州、およびドイツのアヘンの関連地方自治体の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 逆行性腹部大動脈灌流とマウス腎臓の固定

  1. 同じ日または夕方にソリューションを準備し、一晩冷蔵庫に保管してください。使用前に室温(RT)に対する温かい溶液。
  2. 1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で3%パラホルムアルデヒド(PFA)の新鮮なバッチを作ります。マウス1匹につき約50~100mLのPFAが必要です。
    1. PFAの1Lを作るために:PFAの30グラムの重量を量り、ヒュームフードに蒸留水の800 mLを追加します。50-60 °Cに攪拌し、熱します。70°C以上の加熱を行わな。
      注意: PFA は有毒です。ヒュームフードにPFAを準備します。
    2. ゆっくりと2N NaOHの数滴を追加します。PFA がソリューションに入るか、さらに数滴を追加するまで、数分待ちます。一部の小さなチャンクは溶解しません。
    3. 溶液を熱から取り除きます。20x PBSの50 mLを追加します。RTに氷の上で冷やす。
    4. pHをHClで7.3-7.4に調整し、蒸留水を1Lに加えます。
    5. 0.22 μm フィルターで 1x PBS および 3% PFA を濾過して、未溶解粒子を除去します。
  3. 1x PBSの1Lにヘパリンの1,000単位を追加します。ヘパリンを含む1x PBSと3%のPFAを1x PBSで別々の50 mLプラスチックシリンジに移します。
    注:利用可能な場合は、80-100 mmHgまたは静水圧(ドリップ法、灌流溶液の高さ:動物の上160〜200センチメートル)に設定された圧力制御ポンプは、腎臓灌流に使用することができます。
  4. PBS、PFA、鈍い21Gバタフライ針を3ウェイストップコックに接続します。システム全体に気泡がないことを確認します。
  5. 15 mLの円錐形チューブにラベルを付け、それにPFAの10 mLを分配します。
  6. 120 mg/kg 体重ケタミンと 16 mg/kg 体重キシラジンを使用して年齢の男性または女性 C57BL/6 マウス 12-24 週を深く麻酔.動物は、手術に進む前に反射神経をつまむ(例えば、つま先のピンチ反射)応答性の完全な欠如をチェックする必要があります。
  7. 動物が麻酔の外科面に達したら、解剖顕微鏡の下で背中に置きます。手術はさみを使用して中線腹部切開で腹部を外科的に開き、腹部大動脈を露出させる。
  8. 腹部大動脈を直上に固定し、血栓を曲がった止血で結節する。その後、マイクロセレファインで腎動脈のすぐ下の腹部大動脈をクランプします。バンナスはさみで2つのクランプの間に腹部大動脈に小さな切開(1ミリメートル)を作ります。蝶の針をゆっくりと切開部に挿入し、腹部大動脈を開けないように注意してください。
  9. 5-0シルク縫合糸で右腎動脈をリゲートし、灌流と固定のために1つの腎臓だけが必要な場合は、他の分析のために右の腎臓を取り除きます。
  10. マイクロセレファインを取り外し、ヴァンナスはさみでポータル静脈をトランスエクトし、ヘパリンを含むPBSの50 mLを直ちに浸透させ、その後、3%PFAの50 mLで切り替え、浸透する。
    注:腹部大動脈を通る高い灌流圧は、組織を通じてより良い抗体拡散のために腎管を開くために必要とされる。心臓を通る灌流は腎管を開けないかもしれない。
  11. 注入された腎臓を慎重に収集し、組織を穿刺または圧迫を避ける。
  12. カプセルを取り出し、腎臓を厚さ1mmの冠状動脈スライスに切ります。スライスの厚さを標準化するには、スライサーマトリックス (材料の表)を使用します。
    注:または、ビブラートムの使用を検討してください。
  13. 腎臓のスライスを標識された15 mL円錐形チューブに準備されたPFAで浸します。
  14. PFAの10 mLを別の標識された15 mL円錐形チューブに分配します。次のマウスに移動する前に、PBSで3ウェイストップコックと蝶の針をフラッシュします。
  15. 光から保護されたRTで一晩ポスト固定を行います。

2. 組織調製と免疫染色

  1. 固定後、腎臓スライスをRTの水平ロッカーで1時間1x洗浄バッファー(材料の表)で2回洗います。
  2. 抗原検索を実行します。500mLビーカーで1x抗原アンマスキング溶液(材料のT可能)の300 mLを92-98°Cに加熱します。92-98 °Cで1時間撹拌しながら加熱されたバッファーに透過性のカセットを埋め込んでスライスを囲みます。ビーカーを熱から取り出し、RTに冷ましておきます。
    注:一部のベンダーは、免疫組織化学の適用のために抗体をテストし、データシートに推奨抗原検索方法を含めます。したがって、一部のエピトープは、より基本的なバッファ(例えば、pH9)を必要としてもよい。
  3. スライスを0.1%のトリトンX-100で1x洗浄バッファーの10 mLに移し、RTで一晩ロックします。
  4. 通常の抗体希釈剤の500μLで一次抗体を希釈する(材料の表)。濃度が 1:50-1:100 から始まります。希釈した一次抗体で腎臓スライスを37°Cで4dで静かに揺らします。
    注:各抗体は固有の特性を有するため、抗体のインキュベーションおよび希釈時の温度は、個々のプローブに最適化する必要があります。二次抗体のみのコントロールの場合、一次抗体なしで希釈剤で腎臓組織をインキュベートする。市販の抗体希釈剤の代わりに、0.1%トリトンX-100および0.01%のアジドナトリウムを用いた1x PBSを使用することができる。
  5. 腎臓スライスを10mLの1x洗浄バッファーで一晩RTで洗浄し、8時間後に洗浄バッファーを1回交換します。
  6. 正常抗体希釈剤の500 μLで二次抗体(例えば、Alexa Fluor結合二次抗体の場合は1:100)を希釈する。希釈二次抗体で腎臓スライスを37°Cで4日間インキュベートします。このステップ以降は、腎臓のスライスを光から保護します。
  7. 腎臓のスライスを10mLの1x洗浄バッファーで一晩RTで洗浄し、8時間後に洗浄バッファーを1回交換します。

3. 組織クリアリング

  1. 腎臓スライスを5mLの高品位100%エタノール(材料表)を穏やかな揺れ(1時間後に新鮮なエタノールに1回変更)でRTで2時間転送します。このステップは、組織脱水のためです。
    注:高品位のエタノールは、次のステップで高い組織半透明を達成するために必要とされる。メタノールまたはテトラヒドロフランは、高い線引電性を持つ代替脱水試薬である。
  2. 一晩RTで穏やかな揺れ(2時間後に新鮮なECiに1回の変更で)とECi(材料のテーブル)の2 mLに腎臓スライスを浸します。
    注:ECiの凍結/融点は6-8 °Cです。そのため、サンプルは冷蔵庫に保管しないでください。適切に換気されたヒュームフードに浸漬を行い、衣服や皮膚との直接接触を避けます(ECiは非毒性食品医薬品局承認化合物ですが、臭いが強い)。通常のエッペンドルフチューブまたはガラス容器(ポリスチレン容器なし)を使用してください。
  3. 組織の半透明度はECi浸漬後および腎臓のスライスがイメージ投射の準備ができているとき達成することができる。

4. 共焦点イメージングと画像解析

注:イメージングのために、屈折率一致溶液が対物レンズと互換性がある限り、他の顕微鏡検査技術を使用することができる。このプロトコルは、反転共焦点顕微鏡を使用します。

  1. ガラス底皿(材料の表)にECiの600-1,000 μL追加します。
    注:ECiはプラスチック製の皿を溶かす有機溶剤であるため、通常の細胞培養皿の使用は避けてください。同様に、ECi は対物レンズのプラスチック部品/絶縁リングを攻撃する可能性があります。互換性のあるイメージング皿30および自作の3Dプリントチャンバ28の概要については、適切なレポートを参照してください。
  2. 半透明の腎臓スライスを皿に移します。腎臓のスライスに丸いカバースリップを置き、ガラス底に光圧をかけます。ECiの漏れを避けるために、パラフィンフィルム(材料のテーブル)で皿を密封します。
    注:全体の器官または数ミリメートルの厚さの組織スライスは、サンプルのためのECiプールを作るために組織の周りの境界(歯科セメントまたはシリコーンエラストマー;材料の表を参照)を必要とするかもしれません。
  3. 皿を顕微鏡イメージングプラットフォームに置きます。
  4. いくつかのZスタックを取り、ステッチを実行します。5 μm の Z ステップ サイズから開始します。
    注:非常に厚いティッシュスライスまたは器官のイメージ投射のための長い作業距離(>5 mm)および高い数値絞り(>0.9)の目的を使用することを検討してください。イメージング後、組織をエタノールに戻し、0.02%のアジドナトリウムで洗浄バッファーまたはPBSに保存します。
  5. ソフトウェア (材料の表)を使用して 3-D レンダリングを使用してイメージを分析します。

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Representative Results

腎臓は、43種類の細胞型31からなる複雑な器官である。これらの細胞のほとんどは、糸球体や細管などの大きな多細胞構造を形成し、その機能は互いの相互作用に大きく依存しています。古典的な2-D組織学的手法は、部分的にこれらの大きな構造をキャプチャし、無傷の構造内の焦点変化を見逃す可能性があります 31.したがって、光学クリアリング技術を用いて3D解析を行い、それらが健康や疾患においてどのように機能するかを理解するのに役立ちます。

ほとんどの溶媒ベースの光学クリアリング技術は、少なくとも部分的に内因性蛍光レポータータンパク質信号を消光する。YFPタグ付きパルブアルブミンのクエンチンは、ECiを用いた脱水および光学クリアリング時に観察された(図1)。しかしながら、他の強い蛍光タンパク質はシグナルクエンチングに抵抗し、およびpHを基本レベル(pH8-11)に調整し、内因性蛍光タンパク質14、20、28、30を安定化してもよい。また、蛍光タンパク質放出保存が望まれる場合は、水性法を考慮する必要があります。この現在のレポートでは、この溶媒ベースのクリアリングプロトコルが抗体標識と互換性があることを実証されています。しかし、特に腎臓のような密な細胞が豊富な器官では、組織の深い免疫標識を達成することは困難なままです。

その後、腎臓の逆行腹部大動脈灌流を行い、血液細胞を除去し、管を開いた(図2A,B)。このアプローチは、自己蛍光を減少させ、抗体拡散を改善する。抗体濃度は、組織の大きさおよび抗原の豊富さによって異なる。したがって、表在性シグナルは、抗体の浸透が不十分であるか、または抗体の量が不十分であるかのいずれかに関連しうる(図3A,B、図1も参照)。大きなサンプルまたは非常に豊富なマーカーの場合、1〜2日後に抗体のより高い濃度の抗体および補充が必要な場合があります。目的の抗原が腎臓血管系で発現する場合、抗体の血管内送達を考慮すべきである(図3C)。しかし、管状上皮細胞の頂点膜中のタンパク質を標的とする抗体は、分子サイズによる糸球体濾過障壁を越えないため、血管や糸球体に非特異的シグナルを生じさせる(図3D)。

このプロトコルは、腎臓のスライスまたは腎臓全体に適用することができます (図 4A,B)。抗体特異性を試験するために、二次抗体に対してのみ対照を行った(図4C)。組織は、特定の細胞集団(例えば、増殖細胞、図4D)を検出したり、セグメント特異的抗体を用いてチューブセグメント全体を可視化するために抗体で標識することができる(図4E)。さらに、複数の抗体の組み合わせは、3-Dで異なるタンパク質をコローカライズする機会を提供します(例えば、異なる刺激時にチューブルリモデリングで発生するセグメント特異的な管過形成を検出する)(図4F,G;ムービー2」も参照してください。

Figure 1
図1:内因性蛍光レポータータンパク質シグナルの消光。(A) パルブアルブミンYFP+トランスジェニックマウスに由来する内因性蛍光レポータータンパク質は、5μm薄いPFA固定凍結腎切片で検出可能である。矢印は、遠位複雑な管の初期の部分に位置するいくつかの蛍光標識パルブアルブミン+細胞をマークします。(B)腎臓組織の光学的なクリアリング後に明らかな蛍光シグナルが認められない。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:腎臓灌流品質の評価(A) 周期酸シフ(PAS)染色されたパラフィン埋め込み組織(5 μm薄いセクション)は、わずかに開いた内膜を有する小管が少ない(通常、ブラシ境界を有する近位管、矢印を参照)。(B) 良好な腎臓灌流の後、すべての管が開かれる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 全マウント免疫標識のトラブルシューティング。(A,B)厚い腎臓スライスを塩化ナトリウム共輸送体-2(NKCC2)に対する抗体で染色し、ヘンレのループの厚い上昇四肢で発現した。信号は、組織の表面((B)の矢印)で検出可能です。しかし、抗体は組織に浸透しなかった[(B)の矢印を参照]。(C)血管に発現するタンパク質を標的とする血管内抗体注射(例えば、CD31)は、迅速かつ均質な血管染色を可能にする。強い信号を持つ円形構造は糸球体です。(D) しかし、管状上皮の頂点膜に発現するタンパク質を標的とする抗体(例えば、遠位畳管で発現されるリン酸化塩化ナトリウム-塩化ナトリウム共輸送器(ホスホ-NCC)は糸球体を横断しない濾過バリアは、従って血管系内の非特異的信号を引き起こす(アフェレント動脈および他の血管を指す矢印を参照)および糸球体(矢印を参照)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:光学的にクリアされた腎臓組織の免疫標識の代表的な結果。(A,B)このプロトコルは、腎臓全体の光学的なクリアを可能にする。(C)前インキュベーションを行わずに対照として二次抗体の非特異的結合の欠如を示す代表的なZスタック。(D)代表的なZスタックの3-D可視化は、腎臓髄質における増殖ブロモデオキシリジン(BrdU)+細胞を示す。(E)髄膜採取ダクトは、アクアポリン-2(AQP2)に対する抗体を用いて可視化される。(F,G)AQP2+髄質採取ダクト内のBrdU+細胞の分析と定量。(F,G)については、ムービー 2も参照してください。この図は、Saritas et al.29から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ムービー1(図3に関連):ヘンレのループのNKCC2+厚い上昇四肢の3D可視化。この映画は、光学的にクリアされた腎臓スライスにおける抗体の浸透が不十分である。ビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ムービー2(図4に関連):BrdU+細胞およびAQP2+髄質採取ダクトを光学的にクリアされた腎臓スライスで3D可視化する。BrdU+細胞(赤色)およびAQP2+髄質収集ダクト(緑色)が示されている。 イマリススポットおよび表面アルゴリズムは、BrdU+細胞の外側(ターコイズスポット)または内部(ピンクスポット)AQP2+管状(緑色の表面)を決定するために使用された。この映画はもともとサリタスらに登場しました.29.ここをクリックしてビデオをダウンロードしてください。

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Discussion

光学クリアリング技術は、様々な臓器における微小解剖学の3D可視化と定量化に広く注目されています。ここで、溶媒系クリアリング法(ECi)を、腎臓スライス中の管状全体の3Dイメージング用免疫標識と組み合わせた。この方法は、シンプルで安価で迅速です。しかし、他の研究の質問は、他のクリアリングプロトコル5で最もよく答えられるかもしれません.また、溶媒ベースの方法は、主に脱水ステップ14、18に起因して、可変度で組織収縮を引き起こすことに留意することが重要である。ほとんどの溶媒ベースの方法(例えば、ECi14)も、GFPやtdTomatoなどのレポーターの内因性蛍光を少なくとも部分的に消光する。したがって、FDISCO32、CLARITY12、またはCUBIC11は、代替プロトコルとして機能してもよい。しかし、ECiの消光効果は可変であり、各レポーターマウス28の個々の構成要素に依存する。加えて、1)GFPおよび他のレポーターに対する蛍光抗体または2)内因性蛍光シグナル30、32を保持する改変溶媒ベースプロトコルの使用も、この文脈における代替アプローチでありうる。いくつかのグループが水性ベースのプロトコル24、33、34の互換性をテストしてRNAを3-Dで可視化しているが、溶媒ベースのクリアリング方法はまだテストされていないことは言及する価値がある。したがって、RNA分析を考慮する際に、CLARITY33の改変バージョンなどの水性系クリアリング方法が好ましい。

目的とする細胞や遺伝子産物は、内因性蛍光タンパク質発現を有するトランスジェニックマウスを用いて可視化することができるが、遺伝子組み換えマウスラインの生成は時間と費用がかかる。したがって、抗体標識はより実用的であり、より柔軟性を提供するが、大きな組織の免疫標識は困難である。元のECiプロトコル14とは対照的に、我々のアプローチは、抗原検索ステップを使用する改変ECi光学クリア法と免疫標識を組み合わせたものです。熱誘発抗原検索はタンパク質を変性させるが、PFA固定35中に抗原性の損失を回復するのに役立ち、抗体結合を改善する。

このプロトコルにはいくつかの重要な手順があります。まず、腎臓の良好な灌流を行うことが重要である。赤血球を含むヘモグロビンは、画像深度7を制限し、開いた内尿を有する膨張した管状は抗体の浸透を増強する。管の開口部はまた、上皮頂点膜で発現されるタンパク質を、反対側の他のアピカルに発現したタンパク質とのより良い区別を可能にする。しかしながら、人工的に膨張した管状は、腎臓の管構造およびマスク特異的病態生理学的応答(例えば、損傷した近位管の拡張)に悪影響を及ぼす可能性があるが、健康な管状36の影響を及ぼさない。第二に、4°CまたはRTではなく37°Cでの抗体インキュベーションは、抗体の浸透改善する27.しかし、各抗体は固有の特性を有する。したがって、抗体インキュベーション中の温度は、個々のプローブに最適化する必要があります。第3に、Alexa Fluor-647(遠赤色スペクトル)二次抗体の使用は、特に腎臓が青緑色スペクトル37で大量の自己蛍光を放出するので、信号対雑音比を高めるのに役立つ。

血管で発現されるタンパク質に対する蛍動管結合抗体を有する腎臓38のレトロ軌道注射14または灌流は、腎臓血管系に標識するエレガントかつ迅速な方法である。しかし、抗体は60〜65 kDaの範囲でタンパク質の濾過のためのカットオフ分子量で糸球体濾過障壁を横断できないため、管管の頂点膜内のタンパク質は血管内注射によってアクセスできないままである。したがって、小型抗体断片およびFabフラグメント(〜55kDa)、ダイアボディ(〜50 kDa)、タンデムscFv(〜28 kDa)または核酸アプタマー(〜6-30 kDa)などの小さな抗体断片および設計された変異体を使用すると、抗体の保存分子認識特性を有し、管管38、39の頂点の膜にアクセスする機会。さらに、電界40または圧力13を持つ小さな抗体断片の組み合わせまたは脂質を除去するドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ベースのクリアリングプロトコルの使用24、41、42組織の迅速かつ効率的な抗体浸透を可能にする可能性があります。

いくつかのグループは、クリアリング試薬との灌流がプロトコル時間を短縮するだけでなく、組織の透明性を増加させることを実証しました 19,24,43,44.したがって、脱水および屈折率マッチング溶液を有する腎臓のその後の灌流を伴う腹部大動脈または腎動脈のカンヌレーションは、より良く、より速い組織クリアを達成するために考慮されるべきである。しかし、腎臓全体にクリアリング試薬を浸透させなかったし、いくつかの理由でスライスされた腎臓を使用した。まず、1つの腎臓からの複数の腎臓スライスの抗体標識によって異なる抗原を可視化することができる。第二に、腎臓全体と比較して腎臓スライスの免疫標識を行うために必要な時間と抗体が少ない。第3に、大きなサンプルの3Dイメージングは、最大数テラバイトのデータ・セットを生成します。したがって、組織スライスまたは大きなファイルのサブセットからのデータは、自動カウントや距離測定などの複雑な操作を実行する方が便利です。

このプロトコルでは、共焦点顕微鏡は、単一細胞分解能でイメージングを実行するために使用され、これはコローカリゼーション研究において特に関連する。しかし、共焦点イメージングは、そのイメージング速度がクリアされた組織の小片に対してのみ実用的であるため、レーザースキャンを必要とします。長い管状セグメントや臓器全体などの多細胞構造の3次元形態解析を行うには、光シート蛍光顕微鏡(LSFM)などのより高速な顕微鏡技術が必要です。LSFMは、最高の細胞分解能が不可欠でない場合に高速イメージングを可能にします。例えば、遠位複雑な管の長さは、最近、クラリティ12に基づく全マウント免疫標識、およびLSFM29に基づく光学クリアリングを組み合わせることによって評価された。残念ながら、商用LSFMは高価であり、常に溶媒ベースのクリアリングプロトコルと互換性があるわけではありません。実際、CLARITYのためにカスタマイズされた客観的なLSFMはECi29と互換性がなかったので、この研究のためにCLARITYが選ばれました。しかし、クリングバーグらは、ECiがLSFM14と原理的に互換性があることを実証した。

結論として、簡単なECiベースの光学クリアリング法が実証され、約100μmから数ミリメートルの厚さに及ぶ固定組織スライスを使用して、あらゆる研究プロジェクトに適用することができます。また、以前はほとんど徹底的な努力を必要としていた実現可能な分析を完了し、形態の2次元分析に関連する必要な仮定と推論を排除します。全マウント免疫標識、光学クリアリング、および高度な光顕微鏡検査の組み合わせは、健康と疾患における細胞機能の理解を促進するのに役立ちます。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

T.S.は、DFGドイツ研究財団(332853055)、エルス・クローナー・フレセニウス・スティフトゥン(2015_A197)、RWTHアーヘン(RWTHリターナープログラム)の医学部からの助成金によって支援されています。V.G.P.は、ドイツのゲッセルシャフトファーネフロロジー、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団、オーストラリア国立保健医療研究評議会の研究フェローシップによって支援されています。D. H. E はフォンダシオン・レダックによってサポートされています。R. K. は、DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1,SFB/TRR57,SFB/TRR219)、ノースラインウェストファミリア州(MIWF-NRW)、RWTHアーヘン大学臨床研究学際センター(O3-1)からの助成金によって支えられています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Fisher Scientific 09-761-112
15 mL conical tube Fisher Scientific 339650
21 G butterfly needle Braun Venofix
3-way stopcock Fisher Scientific K420163-4503
3D analyis software Bitplane AG IMARIS
3D analyis software Cellprofiler free open-source software
5-0 silk suture Fine Science Tools 18020-50
50 mL plastic syringes Fisher Scientific 14-817-57
Anti-BrdU monoclonal antibody Roche 11296736001
Antibody diluent Dako S0809
CD31-647 BioLegend 102516
Citrate-based antigen retrieval solution Vector Laboratories H-3300
Curved hemostat Fisher Scientific 13-812-14
Dako Wash Buffer Agilent S3006
Dissecting microscope Motic DSK-500
Embedding cassettes Carl Roth E478.1
Ethanol Merck 100983
Ethyl cinnamate Sigma-Aldrich 112372
Flexible film/Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Goat anti-AQP2 Santa Cruz Biotechnology sc-9882
Guinea pig anti-NKCC2 N/A N/A DOI: 10.1681/ASN.2012040404
HCl Carl Roth P074.1
Heparin Sagent Pharmaceuticals 401-02
Hemostat Agnthos 312-471-140
Horizontal rocker Labnet S2035-E
Imaging dish Ibidi 81218
Ketamine MWI Animal Health 501090
Micro serrefine Fine Science Tools 18052-03
NaOH Fisher Scientific S318-500
Operating scissors Merit 97-272
Paraformaldehyde Thermo Fischer Scientific O4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC PhosphoSolutions p1311-53
Silicone elastomer World Precision Instruments Kwik-Sil KWIK-SIL
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Tissue slicer Zivic Instruments HSRA001-1
Triton X-100 Acros Organics AC215682500
Vannas scissors Fine Science Tools 15000-00
Vibratome Lancer Series 1000
Xylazine MWI Animal Health AnaSed Inj SA (Xylazine)

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References

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508, (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17, (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10, (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369, (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26, (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16, (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18, (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28, (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7, (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7, (3), e33916 (2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10, (5), e0124650 (2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28, (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70, (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14, (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5, (3), 035007 (2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25, (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95, (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, (1), eaau8355 (2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143, (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8, (8), e72039 (2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9, (1), 4596 (2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23, (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4, (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43, (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7, (1), 9895 (2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11, (5), e201700248 (2018).

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