Prospection de souches microbiennes pour le développement de bioremédiation et de probiotiques pour la recherche et la préservation des méta-organismes

Bioengineering
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Summary

La pollution affecte tous les biomes. Les milieux marins ont été particulièrement touchés, en particulier les récifs coralliens, l'un des écosystèmes les plus sensibles de la Planète. La bioremédiation est la capacité des organismes à dégrader les contaminants. Ici, nous décrivons des méthodologies pour isoler et tester des microbes présentant la capacité de bioremédiation et les caractéristiques probiotiques potentielles pour des coraux.

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Villela, H. D. M., Vilela, C. L. S., Assis, J. M., Varona, N., Burke, C., Coil, D. A., Eisen, J. A., Peixoto, R. S. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60238, doi:10.3791/60238 (2019).

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Abstract

La pollution affecte tous les biomes. Les milieux marins ont été particulièrement touchés, en particulier les récifs coralliens, l'un des écosystèmes les plus sensibles de la Planète. À l'échelle mondiale, 4,5 milliards de personnes dépendent économiquement de la mer, où la plupart de leurs moyens de subsistance sont fournis par les récifs coralliens. Les coraux sont d'une grande importance et donc leur extinction entraîne des conséquences catastrophiques. Il existe plusieurs solutions possibles pour assainir les polluants marins et la contamination locale, y compris la biorestauration. La bioremédiation est la capacité des organismes à dégrader les contaminants. L'approche présente plusieurs avantages, tels que la durabilité, coût relativement faible, et le fait qu'il peut être appliqué dans différents écosystèmes, causant des impacts minimes sur l'environnement. Comme avantage supplémentaire, la manipulation des microbiomes endogènes, y compris les micro-organismes bénéfiques putatifs pour les coraux (pBMC), peut avoir des effets probiotiques pour les animaux marins. Dans ce contexte, l'utilisation des deux approches, la bioremédiation et l'inoculation pBMC combinées, pourrait être prometteuse. Cette stratégie favoriserait la dégradation de polluants spécifiques qui peuvent être nocifs pour les coraux et d'autres méta-organismes tout en augmentant la résistance et la résilience des hôtes pour faire face à la pollution et à d'autres menaces. Cette méthode se concentre sur la sélection des pBCM pour dégrader deux contaminants : l'oestrogène synthétique 17a-ethinylestradiol (EE2) et le pétrole brut. Les deux ont été signalés à un impact négatif sur les animaux marins, y compris les coraux, et les humains. Le protocole décrit comment isoler et tester les bactéries capables de dégrader les contaminants spécifiques, suivie d'une description de la façon de détecter certaines caractéristiques bénéfiques putatives de ces microbes associés à leur hôte corallien. Les méthodologies décrites ici sont relativement bon marché, facile à exécuter, et très adaptable. Presque n'importe quel type de composé cible soluble peut être utilisé au lieu de EE2 et de l'huile.

Introduction

La pollution est un problème majeur qui affecte la santé humaine, animale et végétale dans le monde entier. Bien que la pollution puisse être naturelle, comme les cendres volcaniques1, les activités humaines sont la principale cause de la plupart des pollutions. Les activités anthropiques contaminent le sol, l'eau et l'air, ce qui entraîne directement ou indirectement près de 20 millions de décès prématurés humains2 et décime des milliards d'autres formes de vie chaque année. Les polluants sont présents même dans les régions les plus reculées de la planète. Par exemple, des métaux lourds et des composés organiques persistants ont été détectés chez les invertébrés de haute mer et les mammifères polaires, respectivement3,4.

Les milieux marins ont été particulièrement touchés par la pollution. Pendant longtemps, on a supposé que l'océan resterait intact et fournirait une source infinie de marchandises en raison de son volume massif d'eau5. Pour cette raison, tous les types d'industrie et d'institutions ont libéré librement les déchets dans les plans d'eau pendant des siècles6,7. Plusieurs contaminants de tous types, tels que le plastique8, hormones synthétiques9, pesticides10, huile11, nutriments12, métaux lourds3, et les déchets radioactifs13 ont été signalés comme impact écosystèmes océaniques. Dans ce contexte, les récifs coralliens sont parmi les écosystèmes les plus importants et sensibles dans les environnements marins14. Les récifs sont des protecteurs côtiers, essentiels au développement de milliers d'espèces marines en jouant un rôle essentiel dans le cycle des nutriments et la lutte contre le climat. Les récifs contribuent également à l'économie en fournissant du poisson, des biens et du tourisme, entre autres15. Par exemple, 4,5 milliards de personnes dépendent des poissons de l'océan comme principale source de nourriture16, qui sont grandement soutenus par les récifs coralliens.

Indépendamment de leur importance écologique, sociale et économique, les récifs coralliens sont décimés17,18. Les activités anthropiques sont principalement responsables de la contribution aux trois principales causes de la mort des coraux : le changement climatique, la surpêche et la pollution de l'eau19. Même s'il est important de travailler à l'atténuation du réchauffement climatique, il est également important de travailler à réduire au-dessus de la contamination locale, y compris la pollution de l'eau, qui peut contribuer de façon critique au déclin des coraux20. Il est donc urgent d'établir des stratégies pour augmenter la durée de vie des coraux, ce qui pourrait leur donner plus de temps pour s'adapter et survivre.

À cet égard, il est extrêmement important de trouver des solutions pour minimiser la contamination et d'élaborer des stratégies pour augmenter la condition physique des coraux. Les stratégies visant à remédier aux polluants marins sont très diverses et peuvent être regroupées en approches physiques, chimiques et biologiques. Les approches physiques sont utiles. Cependant, ils ne sont pas toujours efficaces. Par exemple, les déchets plastiques peuvent être réduits au minimum par l'enlèvement physique, tandis que les composés solubles dans l'eau ont besoin d'autres méthodologies pour être éliminées. Des exemples de ces composés sont le pétrole brut, libéré par les activités de l'industrie pétrolière et les déversements, ainsi que d'autres micropolluants, tels que les hormones synthétiques, normalement utilisés comme composant oestrogénique dans les contraceptifs oraux et présents dans les eaux usées21, 22. L'utilisation de substances chimiques pour réduire la contamination peut résoudre un problème spécifique, mais elle peut aussi représenter une source supplémentaire de pollution. C'est le cas des dispersants chimiques pour atténuer la contamination par le pétrole, qui ont été décrits comme encore plus toxiques pour les écosystèmes marins que la contamination par le pétrole elle-même23. Pour ces raisons, les approches biologiques présentent plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes. La bioremédiation est la capacité des organismes vivants, ou de leurs produits métaboliques, à transformer les contaminants en formes moins toxiques ou non toxiques24. Les principaux avantages de l'utilisation des méthodes biologiques sont la durabilité, le coût relativement faible, le fait qu'elles soient respectueuses de l'environnement, et qu'elles peuvent être appliquées dans différents écosystèmes, causant un minimum ou moins d'impacts sur l'environnement21, 25,26,27.

En outre, la manipulation de la communauté microbienne présente dans un environnement permet un avantage potentiel supplémentaire. Il y a des microbiomes qui sont associés aux hôtes et sont essentiels à leur santé. Il est bien connu que ces microbiomes symbiotiques associés sont nécessaires pour maintenir l'homéostasie hôte19. La manipulation de ces micro-organismes associés a été bien explorée pour les hôtes tels que les plantes et les mammifères28,29, mais l'utilisation de probiotiques coralliens est encore nouveau15. Les coraux hébergent également, interagissent avec, et dépendent de grandes populations spécifiques de micro-organismes pour survivre19. Le rôle de ces communautés microbiennes dans la santé et la dysbiose des coraux est à l'étude active, mais il est encore loin d'être pleinement compris30. L'une des hypothèses les plus populaires est appelée l'hypothèse probiotique du corail. Il suggère l'existence d'une relation dynamique entre les micro-organismes symbiotiques et les conditions environnementales qui entraîne la sélection des méta-organismes coralliens les plus avantageux31. Sur la base de ces informations, des mécanismes probiotiques potentiels clés, ainsi que des stratégies d'isolement, de manipulation et de livraison de micro-organismes bénéfiques pour les coraux (BMC) à plusieurs fins, ont été proposés32 ettestés 33. Ces caractéristiques bénéfiques potentielles comprennent la résistance à l'augmentation de la température, la protection contre les espèces réactives d'oxygène (ROS), la fixation de l'azote, la résistance aux contaminants et le contrôle biologique contre les agents pathogènes, entre autres32.

Cette étude se concentre sur la sélection de BMCs et de micro-organismes libres présentant la capacité de dégrader deux contaminants couramment trouvés dans les environnements marins : l'oestrogène synthétique 17a-ethinylestradiol (EE2) et le pétrole brut. Les polluants contenant des agents actifs hormonaux sont souvent présents dans les plans d'eau34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Parmi eux, les composés endocriniens-perturbateurs oestrogéniques synthétiques (EDC) imitent l'action des oestrogènes sur les cellules cibles, causant plusieurs impacts sur des animaux, y compris le cancer du sein, l'infertilité, et l'hermaphroditism9. EE2 est excrété par l'homme en raison de l'utilisation de contraceptifs oraux. Il n'est pas retiré des eaux usées par les usines traditionnelles de traitement des eaux usées et a des effets négatifs même à de très faibles concentrations (p. ex., ng/L ou g/L)43,44,45. On sait peu de choses sur les effets des oestrogènes sur la physiologie des coraux46,47. Cependant, sur d'autres invertébrés marins, tels que les éponges, les crustacés et les mollusques, les oestrogènes auraient causé plusieurs effets négatifs principalement liés à la reproduction, tels que le développement et/ou la stimulation des gamètes, l'altération des enzymatiques et actions protéiques, problèmes dans les processus embryonnaires, et d'autres48,49,50,51,52. Les conséquences négatives causées par la contamination eE2 soulignent la nécessité de développer des approches durables pour éliminer ce composé de l'environnement sans avoir d'impact sur la vie marine.

En parallèle, avec le pétrole qui représente actuellement près de 40% des sources d'énergie consommées dans le monde53, la contamination chronique et les déversements d'hydrocarbures se produisent souvent près des zones récifales11. La contamination par le pétrole a été signalée comme ayant des effets négatifs chez plusieurs espèces d'animaux marins, d'oiseaux, de plantes etd'humains 54,55,56,57. Sur les coraux, il provoque le blanchiment, réduit la résistance des larves au stress thermique58, perturbe les communautés microbiennes associées21, et provoque la nécrose tissulaire. En outre, les dispersants chimiques, une technique d'assainissement du pétrole couramment utilisée par les compagnies pétrolières pour remédier aux déversements, sont encore plus toxiques pour les coraux que l'huile elle-même23. Les micro-organismes bénéfiques isolés des coraux, en revanche, sont connus pour jouer un rôle crucial sur la santé de l'hôte. Cependant, la manipulation de ces probiotiques potentiels doit être mieux explorée afin d'étudier les effets secondaires négatifs possibles et les capacités métaboliques qui peuvent être examinées pour améliorer la condition physique du méta-organisme. Dans ce contexte, des caractéristiques telles que l'activité antimicrobienne contre les agents pathogènes coralliens, la production de catalase pour lutter contre le stress oxydatif, la capacité de dégrader l'urée (qui peut avoir un rôle important dans le processus de calcification), et la présence de gènes qui confèrent des caractéristiques bénéfiques potentielles, entre autres, doivent faire l'objet d'une enquête. Ici, nous montrons comment la bioremédiation et les probiotiques peuvent être utilisés pour atténuer simultanément les impacts de la pollution et améliorer la santé des coraux. Le développement d'approches novatrices qui peuvent être utilisées comme interventions pour accroître la persistance des espèces marines représente un pas vers une planète plus durable et plus saine.

Protocol

1. Collecte et stockage de l'eau et des coraux pour l'isolement microbien

REMARQUE : Il est essentiel de prendre les coordonnées et la température des sites d'échantillonnage. Si possible, des métadonnées telles que la salinité, le pH, la profondeur et l'intensité lumineuse peuvent également aider à trouver des approches de culture affinées et une interprétation future des données. Pour obtenir des résultats fiables, conservez les échantillons entreposés pendant la durée minimale possible. Les microbiomes eau/coraux peuvent changer considérablement si les échantillons ne sont pas conservés à la bonne température et/ou sont stockés pendant de longues périodes. Si l'étape d'isolement n'est pas effectuée instantanément après la collecte, il est crucial de maintenir les échantillons à 4 oC jusqu'au traitement. Plus les échantillons sont stockés longtemps, même à 4 oC, plus la communauté microbienne changera.

  1. Échantillonnez et entreposez l'eau de mer.
    1. Recueillir des échantillons d'eau de 500 ml dans au moins le triple ment de chaque site d'échantillonnage ciblé. Utilisez de préférence des bouteilles stériles avec des bouchons à vis.
    2. Si vous traitez l'eau instantanément après la collecte, gardez les bouteilles à RT pendant un court intervalle. Si le traitement de l'échantillon a lieu plus tard, gardez les bouteilles à 4 oC.
  2. Échantillonnez et entreposez le corail.
    1. Utilisez une paire stérile de pinces pour couper des fragments de corail du même site d'échantillonnage des échantillons d'eau. Pour éviter la contamination, ne touchez les coraux qu'avec des gants stériles.
    2. Rincer le fragment de corail échantillonné à l'aide d'une solution saline stérile de 20 ml (3 % de NaCl dans de l'eau distillée) ou de l'eau de mer artificielle pour se débarrasser des bactéries libres de l'eau de mer.
    3. À l'aide de forceps, placez chaque fragment de corail dans un contenant stérile de 250 à 500 ml avec un bouchon à vis contenant une solution saline stérile.
    4. En laboratoire, à l'aide de forceps et de pinces stériles, peser 5 g de fragments de corail à l'aide de plats stériles de 100 mm x 20 mm Petri sur une balance de pesage.
    5. Transférer les 5 g d'échantillon de corail dans un mortier stérile et le macérer à l'aide d'un pilon stérile.
    6. À l'aide d'une spatule stérile, transférer l'échantillon macéré dans un flacon de culture stérile contenant 45 ml de solution stérile NaCl de 3 % et 10 à 15 perles de verre de 5 mm. Utilisez une partie de la solution saline stérile de 45 ml pour laver le mortier et récupérer la quantité maximale de macérate.
    7. Maintenir les flacons sous une agitation constante (150 x g)pendant 16 h à la température de l'eau du site d'échantillonnage.
      REMARQUE : Pour les coraux d'eau peu profonde, la température optimale variera de 24 à 28 oC. Cette étape permettra de détacher les micro-organismes de différents compartiments coralliens, tels que ceux attachés aux cellules hôtes, ou ceux vivant à l'intérieur du tissu et du squelette. Après cette étape, les macérats coralliens ne doivent pas être stockés, et l'étape d'isolement doit être effectuée instantanément.

2. Isolement des bactéries dégradantes eE2 de l'eau de mer et/ou des coraux

  1. Sélectionnez les bactéries.
    REMARQUE : Après les étapes 1.1.2 et 1.2.7, la concentration de micro-organismes dans l'eau de mer qui se sont détachées des différents macérats coralliens sera inconnue et variable. Afin de garantir l'isolement des colonies microbiennes individuelles dans les plats Petri contenant des agar, des dilutions en série sont nécessaires.
    1. Effectuer des dilutions en série jusqu'à 10-9 dans une solution saline stérile pour les échantillons de corail et jusqu'à 10-6 pour les échantillons d'eau. Pipette dilades de haut en bas 5x avant de jeter la pointe. Échantillons de Vortex pour 5 s à chaque fois avant d'effectuer la prochaine dilution en série.
    2. Pipette 100 l de chaque dilution sur des plats Petri contenant 3% naCl lysogeny bouillon (LB) agar milieu, et les plaquer.
      REMARQUE : Utilisez l'agar marin (MA) comme support alternatif. Les tripliques de chaque dilution sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables.
    3. Incuber les plaques pendant un ou trois jours à la température cible (p. ex., 26 oC). Vérifiez les plaques une fois par jour.
    4. Sélectionnez et isolez les colonies présentant des morphologies de croissance distinctes sur de nouvelles plaques en utilisant la technique de la plaque de stries. Répétez cette étape autant de fois que nécessaire pour avoir des colonies pures de plus en plus sur les plaques.
    5. Si la procédure n'est pas immédiatement continuée à l'étape 2.3.1, entreposez les isolats à 4 oC ou en glycérol tel que décrit à la section 2.2.
  2. Préparer les stocks de glycérol.
    REMARQUE : Cette étape est facultative et peut être utilisée pour le stockage à long terme des stocks bactériens.
    1. Choisissez des colonies simples dans l'assiette fraîche ou dans les assiettes entreposées à 4 oC et inoculez-les indépendamment dans 2 ml de milieu lb stérile.
    2. Placer les tubes sous une agitation constante (150 x g) à 24 à 28 oC pendant la nuit (ON).
    3. Ajouter 1 ml des cultures bactériennes de l'étape 2.2.2 et le glycérol stérile à une concentration finale de 20% aux cryovials de 2 ml.
    4. Laisser les cryovials ON à 4 oC.
    5. Placer les stocks bactériens de glycérol à -80 oC jusqu'à ce que nécessaire.
  3. Effectuez le test de capacité eE2-dégradation.
    1. Activez les isolats dans le bouillon LB ou les supports alternatifs. Pour cela, choisissez une seule colonie dans les assiettes fraîches ou l'assiette stockée à 4 oC, et inoculez 2 ml de milieu lb stérile. Dans le cas où il s'agit d'un stock de glycérol, la première strie sur les plaques d'agar LB et incuber à 24-28 oC ON pour avoir des colonies simples de plus en plus. Placer le tube contenant le milieu LB incliné sous une agitation constante (150 x g) à 24-28 oC ON.
    2. Après la croissance bactérienne, granulez les cellules en les centrifugeant à 8 000 x g pendant 8 min à température ambiante (RT). Jeter le supernatant et, doucement pipetting de haut en bas, resuspendre les cellules dans un volume égal (2 ml) d'eau saline pour laver le bouillon LB restant.
    3. Répétez l'étape 2.3.2 deux fois pour garantir qu'il n'y a aucune trace de source de carbone, en rependant les cellules dans un volume égal de solution saline. Par exemple, si elle a été commencée avec une culture de 2 ml, resuspendre les cellules dans un volume final de 2 ml solution saline.
    4. Inoculer les cellules lavées et resuspendues dans le milieu minimum de culture Bushnell Haas (BH Broth) contenant EE2 comme seule source de carbone59.
      REMARQUE : L'EE2 est dissous dans l'éthanol à une concentration finale de 5 mg/L dans le milieu de culture. Faire des changements dans le type de polluant et/ou la concentration si nécessaire.
    5. Évaluer la croissance bactérienne par densité optique à 600 nm et/ou colonies formant des unités (CFU) sur lb-agar moyen33, pour 16 à 72 h d'incubation.
      REMARQUE : Alternativement, les micro-organismes peuvent être directement isolés sur des supports minimaux contenant EE2, ou d'autres composés, comme seule source de carbone. Cette étape dirigerait la sélection et éviterait une croissance indésirable.

3. Isolement des bactéries dégradantes par l'eau de mer et/ou les coraux

  1. Préparer un support minimum contenant une fraction soluble dans l'eau d'huile (OWSF) et une fraction insoluble dans l'eau d'huile (oWIF) comme seule source de carbone21.
    1. Ajouter 1/2% de pétrole brut à 500 ml d'eau distillée stérile. Utilisez un flacon de filtre ouvert sur le fond pour enlever la fraction soluble sans perturber la couche supérieure de la fraction insoluble.
    2. Maintenir le mélange sous une agitation constante à 24 à 28 oC à 150 x g pendant 48 h.
    3. Placez le flacon de filtre contenant les fractions de pétrole brut sur une surface stable et attendez 10 à 20 min pour permettre une séparation des fractions solubles et insolubles.
    4. Transférer l'oWSF dans un nouveau flacon stérile, en sauvant l'oWIF en ouvrant le flacon de filtre inférieur et en éliminant la fraction soluble.
    5. En utilisant tous les oWSF récupérés dans l'étape précédente (400 ml), préparer 1 L de BH agar minimum milieu contenant oWSF comme la seule source de carbone.
    6. En utilisant l'oWIF restant dans le flacon de l'étape 3.1.4, préparer 1 L de BH agar minimum moyen contenant oWIF comme seule source de carbone.
  2. Isoler les bactéries qui dégradent l'OWSF et l'OWIF.
    1. À l'aide de l'eau et du macérate de corail des étapes 1.1.2 et 1.2.7, respectivement, diluent les échantillons jusqu'à 10-6 dans la solution saline stérile comme décrit dans l'étape 2.1.1.
    2. Pipette 100 l de chaque dilution sur des plats Petri contenant des supports d'agar BH-oWSF et BH-oWIF et les plaquer.
    3. Répétez les procédures décrites de l'étape 2.1.3 à l'étape 2.1.5.

4. Sélection des membres du Consortium

  1. Extraire et séquencer l'ADN pour l'identification taxonomique.
    1. Activez les isolats stockés dans le glycérol tel que décrit à l'étape 2.3.1.
    2. Extraire l'ADN à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN (voir Tableau des matériaux).
    3. Utilisez les amorces 27f (5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3) et 1492r (5-GTT TAC CTT GTT ACT T-3) pour l'amplification du gène 16S rRNA.
    4. Effectuer 50 réactions PCR ll selon le protocole suivant : 5 l de 10x tampon de polymérase, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 5 mM de chaque amorce, 10 ng d'ADN génomique, et 2,5 U de polymérase d'ADN Taq. Ajouter des contrôles négatifs (c.-à-d. extractions d'ADN vierge et réactions PCR sans ADN modèle) pour s'assurer qu'il n'y a pas de contamination.
    5. Mettre en place les étapes de vélo thermique suivantes : un premier cycle de dénaturation à 94 oC pendant 4 min; 35 cycles à 94 oC pour 1 min, suivis de 50 oC pendant 1 min et de 72 oC pendant 2,5 min; un cycle d'extension final de 10 min à 72 oC.
    6. Vérifiez l'intégrité de l'amplicon dans un gel agarose de 1,2 % à l'aide de 80 V.
    7. Gel purifier les échantillons à l'aide d'un kit de purification de gel (voir Tableau des matériaux).
    8. Quantifier les produits PCR à l'aide d'un fluoromètre.
    9. Envoyer le produit pour le séquençage.
      REMARQUE: Pour de meilleures classifications taxonomiques, la méthode Sanger est recommandée60, car elle fournit de longues séquences. Les amorces universelles 27f et 1492r peuvent être utilisées pour amplifier presque toute la longueur du gène 16S rRNA61. Si les contigs ne peuvent pas être assemblés à l'aide d'une paire d'amorces, une paire supplémentaire au milieu de la séquence doit être considérée.
  2. Déterminer la courbe de croissance.
    1. Activer les isolats dans les stocks de glycérol à partir de l'étape 2.2.5 comme décrit à l'étape 2.3.1 mais en utilisant 5 ml au lieu de 2 ml.
    2. Ajoutez 1 % (v/v) de la culture cultivée de 5 ml de l'étape 4.2.1 dans les tripliques, à un flacon de 250 ml contenant 100 ml de 3% de support LB. Assurez-vous de préparer des triplicates d'un contrôle négatif (pas d'inoculum) ainsi.
    3. Placer les flacons dans un incubateur sous une agitation constante (150 x g)à 24 à 28 oC.
    4. Prendre 1 mL d'aliquots tous les 4 h pour 48 h. Si les souches présentent un taux de croissance élevé, diminuer l'intervalle de 4 h.
    5. Mesurer l'estimation de la densité optique (OD) à 600 nm de longueur d'onde et unités de formation de colonies (CFU) comptées à partir de dilutions sérielles plaquées sur des plaques de médias riches (100 L doivent être inoculées dans chaque plaque et normalisées au volume de 1 ml).
    6. Tracez les courbes OD et CFU et analysez la corrélation de l'OD/CFU de chaque souche individuelle. A partir de maintenant, calculez le nombre de cellules en fonction des valeurs OD.
  3. Effectuez un test d'antagonisme.
    1. Activez les isolats tels que décrits à l'étape 2.3.1.
    2. Inoculer une souche à la fois le long du milieu des plaques contenant des milieuis d'agar et les autres perpendiculaires à la souche centrale. Répétez l'opération jusqu'à ce que chaque souche microbienne sélectionnée soit testée contre toutes les autres.
    3. Incuber les plaques à 24 à 28 oC et les surveiller quotidiennement afin d'observer les halos potentiels indiquant une activité antagoniste. Si des halos sont observés indiquant une activité antagoniste entre deux souches, l'une d'elles devrait être exclue.
  4. Effectuer l'assemblage du consortium.
    1. Activez les isolats tels que décrits à l'étape 2.3.1.
    2. Pelleter les cellules à 3500 x g et les laver doucement 2x dans un volume égal de solution saline. Resuspendre les cellules dans un volume égal (c.-à-d., si le volume final était de 2 ml de cellules, lavez-les en utilisant 2 ml de solution saline et suspendez-les dans un volume final de 2 ml).
    3. Inoculer 1 mL de culture en 100 mL 3% NaCl LB moyen et incuber ON à 150 x g.
    4. Répétez l'étape 4.5.2, inoculer les 100 ml cultivés, lavés, et les cultures suspendues dans les cultures de 10 L. Incuber ON dans des bioréacteurs stériles de transport à l'air, recevant l'air filtré d'une pompe. Si plus de culture est nécessaire, toujours inoculer 1% de la culture cultivée dans les médias frais.
    5. Centrifugeuses cultures cultivées à 8 000 x g pendant 8 min à 4 oC. Jeter le supernatant après centrifugation.
    6. Laver la pastille, en rependant doucement les cellules dans 500 ml de solution saline stérile.
    7. Répétez les étapes 4.5.5 et 4.5.6.
    8. Resuspendre chaque culture individuelle dans 100 ml de solution saline et mesurer l'OD pour estimer le nombre de cellules.
    9. Calculer le volume de chaque culture nécessaire pour atteindre une concentration finale de 107 cellules mL-1.
    10. Effectuer CFU compte sur les médias riches pour une confirmation finale de la viabilité cellulaire et la concentration.
    11. Mélanger un volume égal de chaque culture individuelle dans des flacons stériles et aliquot le consortium dans 50 ml tubes stériles.
    12. Conserver à 4 oC jusqu'à l'inoculation.
      REMARQUE : Préparer l'assemblage du consortium aussi frais que possible pour garantir que les cellules seront toujours viables. Alternativement, les comptes de CFU peuvent être exécutés avant l'inoculation. Pour assembler un consortium idéal, il est nécessaire d'utiliser des isolats présentant des capacités métaboliques différentes et complémentaires. Habituellement, les isolats de 6 à 10 sont utilisés pour former des consortiums, mais ce nombre varie en fonction des caractéristiques et des buts des membres.

5. Détection des caractéristiques bénéfiques putatives pour les coraux

  1. Activez les isolats des stocks de glycérol en les stries sur des plaques d'agar LB et en les incuber à 24 à 28 oC EN c. pour que les colonies individuelles poussent. Choisissez une seule colonie dans les assiettes et inoculez-la dans 2 ml de milieu LB stérile. Placer le tube contenant le milieu LB incliné sous l'agitation constante (150 x g) à 24-28 oC ON.
  2. Effectuer l'extraction de l'ADN telle que décrite dans la section 4.1 pour la détection de gènes potentiellement bénéfiques par PCR.
    REMARQUE : Les conditions de réaction et les amorces de PCR dépendront du gène visé. Les méthodologies pour tester les caractéristiques BMC des souches individuelles et la détection de PCR pour les gènes potentiellement bénéfiques sont décrites dans le tableau 1.

Representative Results

Sur la base des méthodes décrites ici, il a été possible d'isoler les micro-organismes de différentes sources d'eau et nubbins coralliens présentant des caractéristiques présumées BMC et capables de dégrader différentes classes de contaminants (Figure 1). À l'aide d'échantillons d'eau prélevés dans une station d'épuration, obtenus auprès du CESA-UFRJ (Centre expérimental d'assainissement de l'environnement de l'Université fédérale de Rio de Janeiro), et sur la base de la procédure présentée ici, 33 souches bactériennes capables de dégrader EE2 à une concentration finale de 5 mg/L ont été isolées (figure 2A). De plus, en utilisant la technique de sélection des bactéries dégradantes pour l'huile, 20 souches capables de dégrader à la fois l'OWSF (figure 2B) et l'OWIF (figure 2C) ont été isolées.

Les caractéristiques présumées du BMC ont été examinées chez des microorganismes isolés de différentes espèces de coraux dans des conditions diverses. Parmi eux, une souche présentant une forte activité antagoniste contre l'agent pathogène corallien Vibrio coralliilyticus (Figure 3A), souches capables de dégrader l'urée ( Figure3B), un bon producteur de catalase ( Figure3 C), et des micro-organismes présentant des gènes potentiellement bénéfiques (figure 3D) ont été trouvés.

En utilisant les deux approches combinées (c.-à-d. bioremédiation et inoculation BMC), il a été possible de protéger les coraux contre les impacts de l'exposition au pétrole. Pour cela, un consortium de bioremédiateur du pétrole pBMC, isolé du corail Mussismilia harttii, a été inoculé sur des nubbins coralliens exposés à 1% d'huile dans les tripliciates21. Les traitements exposés au pétrole ont présenté une diminution progressive de Fv/Fm à partir du quatrième jour, atteignant des valeurs proches de zéro par le dixième jour. Fluorescence/fluorescence maximale variable (Fv/Fm) a fourni une mesure de l'efficacité photochimique maximale du photosystème II (PSII) des zooxanthelles, représentant une mesure indirecte de la santé des coraux. D'autre part, les nubbins coralliens présents dans les aquariums inoculés avec le consortium ont montré une capacité photochimique mieux préservée (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Sommaire des principales étapes d'une sélection et d'un assemblage de consortium bioremédiateur-pBMC. Schéma des étapes de sélection des micro-organismes dégradants (en gris) et des étapes finales utilisées pour la sélection microbienne du consortium (séquençage de l'ADN, courbe de croissance, test d'antagonisme et assemblage de consortium en rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Sélection de bactéries dégradantes pour les polluants. (A) Isolats bactériens poussant sur des plaques de support minimales contenant EE2 comme seule source de carbone. (B) Colonies de bactéries poussant sur des plaques de support minimales contenant oWSF comme seule source de carbone. (C) Colonies de bactéries poussant sur des plaques de support minimales contenant l'OWIF comme seule source de carbone. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Détection des caractéristiques du pBMC. (A) Taches dans les tripliciates de souche présentant une activité antagoniste contre l'agent pathogène corallien Vibrio coralliilyticus (en noir) et une souche témoin (en vert). (B) Les souches se développent sur les médias contenant de l'urée comme seule source de carbone. (C) Strain produisant de la catalase et une mauvaise souche de producteur de catalase (-). (D) Exemple de détection du gène nirK (échelle de voie 1 à 1 kb; voie 2 - contrôle négatif de l'extraction de l'ADN blanc; détection de la voie 3 à nirK; réaction de la voie 4 et PCR sans ADN modèle). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Mesures Fv/Fm des nubbins de M. harttii inadaptés à 17 h, à l'aide d'un fluoromètre de chlorophylle sous-marine.PAM. Les mesures Fv/Fm du consortium de contrôle des traitements, du pétrole et du pétrole avec le consortium ont été effectuées dans des tripliques tous les jours pendant 10 jours. L'écart standard est indiqué. Les caractéristiques du graphique ont été modifiées avec la permission des résultats précédents21, disponibles à https://www.nature.com/articles/srep18268 sous une attribution Creative Commons 4.0. Conditions complètes à http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Moa Micro-organisme Technique de détection Références
Réglementation climatique; cyclisme surfur; composés antimicrobiens; augmenter la protection antioxydante des cellules. Aspergillus sydowii PCR pour gène dddP 81
Pseudovibrio sp. P12 Support culturel avec DMSP 82
Pseudoalteromonas sp. PCR pour gène dmdA 33
Régulation biologique des agents pathogènes. Microbiome d'Acropora palmata mucus Zone claire d'inhibition 83
Extraits de coraux L'inhibition de la croissance est d'autres 84
Marinobacter sp. Essais d'essaimage 85
Pseudoalteromonas sp. Plaque d'agar cross-streaking 86
Pseudoalteromonas sp. Méthode de diffusion de l'agar 33
Avantage au processus de calcification; source d'azote pour les coraux scléactiniens. Symbiodinium spp. Méthode colorimétrique 87
Microbiome de Stylophora pistillata mucus ___ 88
Microbiome d'Acropora alciminata Méthode par Bolland et al.80 89
Cycle d'azote; augmenter la fixation de l'azote. Communauté microbienne qPCR (en anglais seulement) 90
Communauté microbienne Pcr 91
Communauté microbienne qPCR (en anglais seulement) 92
Communauté microbienne Technique de réduction de l'acétylène adapté (C2H2) 93
Pseudoalteromonas sp. et Halomonas taeanensis Pcr 33
Cycle d'azote; diminution de la concentration d'ammonium. Pseudoalteromonas sp. Pcr 33
Microbiome de Tubastraea coccinea Pcr 94
Microbiome de Xestospongia testudinaria Analyse prédictive du métagénome 95
Protection holobiont contre les espèces réactives d'oxygène (ROS). Pseudoalteromonas sp., marina de Cobetia et Halomonas taeanensis Test de catalase 33
Symbiodinium spp. Amplex rouge 96
Vibrio pelagius et Sync- chococcus sp. Méthode peroxidase-scopoletin de raifort 97
Vibrio fischeri Méthodes multiples 98

Tableau 1 : Détection des caractéristiques présumées du BMC, mécanisme d'action (MOA), microorganismes signalés présentant le potentiel et la technique utilisés pour détecter la caractéristique.

Discussion

Les approches de bioremédiation ont été explorées massivement au cours des 50 dernières années. Par exemple, plus de 200 microbes parmi les bactéries, les cyanobactéries, les microalgues et les champignons dans plusieurs habitats différents ont été désignés comme étant capables d'indiquer la présence et/ou de dégrader les hydrocarbures pétroliers62,63,64 . En outre, d'autres classes de composés qui causent des impacts sur l'environnement et les humains, tels que le plastique, le bisphénol A, les perturbateurs endocriniens et les métaux lourds, sont des cibles pour le développement de la technique de bioremédiation65,66, 67. D'autre part, le développement des probiotiques marins a été limité aux champs qui ont un impact évident sur l'économie, tels que les probiotiques de poissons dans l'aquaculture68,69. Cependant, l'isolement et la caractérisation des microorganismes bénéfiques pour protéger les récifs coralliens, les écosystèmes marins qui soutiennent la pêche, le tourisme et d'autres activités rentables commencent à être évalués15. Ici, un protocole bon marché, facile et accessible pour sélectionner les micro-organismes dégradants de polluants qui peuvent également présenter des caractéristiques potentiellement bénéfiques pour les écosystèmes marins locaux, en particulier les micro-organismes bénéfiques putatifs pour les coraux (pBMCs), est Décrit.

En outre, la méthode démontrée ici est très adaptable à plusieurs composés et divers types de sources microbiennes. Il est possible de cibler différents polluants en remplaçant la seule source de carbone ajoutée au minimum des médias. Pour cela, au lieu de l'huile ou EE2, d'autres composés doivent être ajoutés à la concentration désirée. Il s'agirait de la pression sélective pour isoler les dégradations des polluants ciblés. Par exemple, des micro-organismes capables de dégrader d'autres classes de perturbateurs endocriniens ont déjà été sélectionnés et testés en utilisant la même méthodologie70. En outre, d'autres organismes marins et terrestres, tels que les éponges et les plantes71,72, ainsi que des types distincts d'échantillons environnementaux, tels que le sol, le carburant et les roches peuvent être utilisés comme sources dégradantes-microbiennes25, 73,74. Par exemple, il a été possible de détecter et d'isoler les bactéries dégradantes des hydrocarbures de différents échantillons de sol et de sédiments25,54,63,64,75. Enfin, en effectuant de légères modifications dans les médias, les micro-organismes autres que les bactéries peuvent être facilement sélectionnés comme microbes dégradants. Par exemple, une souche de microalgues avec la capacité de dégrader efficacement les composés d'oestrogène a étérapportée 76.

Idéalement, les consortiums bioremédiation-probiotiques doivent être assemblés pour chaque composé ou zone spécifique. Les microbes qui poussent dans un environnement spécifique peuvent ne pas se développer aussi bien dans de nouveaux sites que dans leurs conditions indigènes. Étant donné que les chercheurs n'ont pas trouvé de produit qui peut être appliqué efficacement dans toutes les conditions environnementales différentes, de nouveaux ensembles de consortiums devraient être effectués pour chaque situation spécifique. Cela s'apparenterait à une médecine personnalisée pour un rétablissement adapté à l'environnement. Pour cette raison, la création d'une banque centrale de souches microbiennes avec des caractéristiques probiotiques potentielles et la capacité de dégradation est une étape cruciale pour le progrès de ce domaine. Cette initiative permettrait d'économiser du temps et du travail, contribuant à l'assemblage de nouveaux consortiums spécifiques dans le monde entier.

Les microorganismes associés aux coraux (c.-à-d. les microalgues, les bactéries, les archées, les champignons et les virus) ont un rôle complexe et complexe dans le maintien de l'homéostasie hôte19. Les facteurs de stress environnementaux, tels que la pollution, peuvent également déstabiliser le microbiome corallien, entraînant une dysbiose, qui peut causer des maladies et la mortalité30. Les mécanismes par lesquels le microbiome corallien peut soutenir la santé des coraux commencent à être révélés. Ces mécanismes sont la clé pour comprendre la résistance et la résilience des coraux aux facteurs de stress environnementaux et, par conséquent, pour promouvoir la persistance et la préservation des récifs. En outre, les résultats sur le terrain aideront à comprendre les interactions générales hôte-microbiome, ce qui peut contribuer à l'élaboration de meilleurs probiotiques et des stratégies de promotion de la santé dans d'autres domaines. Il est également important de mieux étudier comment ces vaccinations probiotiques peuvent interférer sur la santé du méta-organisme lors d'événements de stress. Par exemple, des travaux montrant que l'augmentation de la performance des coraux est due aux probiotiques et pas seulement au corail utilisant des bactéries comme source de nourriture sont encore nécessaires.

Parallèlement, le développement de nouvelles approches de prestation de consortiums et l'amélioration des approches existantes sont d'une grande importance. D'autres méthodes d'immobilisation des consortiums ainsi que des approches novatrices, telles que l'inoculation des aliments coralliens (c.-à-d. artémie selles et rotifères) et leur utilisation comme vecteurs, sont prometteuses. Ces systèmes de distribution peuvent également être modifiés pour cibler d'autres organismes marins et seront essentiels au succès du champ de probiotiques marins.

L'atténuation de la pollution et la persistance des récifs coralliens sont actuellement deux des principaux sujets mis en évidence régulièrement dans les conférences environnementales. L'Agenda 2030, un document publié par les Nations Unies qui décrit les objectifs mondiaux que la société devrait atteindre pour permettre un avenir durable, consacre des objectifs spécifiques à chaque question. Bien que l'Objectif 6 souligne l'importance de l'amélioration de la qualité de l'eau en réduisant la pollution, l'objectif 14 renforce la pertinence de la conservation et de l'utilisation durable des océans, des mers et des ressources marines77. Dans ce contexte, la conservation des récifs coralliens dépend des changements qui devraient être réalisés dans un proche avenir, y compris l'atténuation de la pollution. Ceci est d'une grande importance, parce que la plupart des pertes massives de corail se sont produites lorsque d'autres facteurs ont été ajoutés aux événements climatiques, tels que la destruction de l'habitat local et la contamination78,79. Cet article a démontré qu'il est possible de combiner la bioremédiation et l'inoculation pBMC pour dégrader des polluants spécifiques, alors qu'il peut augmenter la résistance et la résilience des coraux pour faire face aux polluants et à d'autres problèmes. L'optimisation de protocoles existants et/ou le développement de méthodes innovantes, combinées ou appliquées de manière indépendante, seront cruciales pour déterminer l'avenir des écosystèmes marins.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette recherche a été réalisée en association avec le projet de R-D en cours enregistré sous le nom de AnP 21005-4, "PROBIO-DEEP - Survey of potential impacts caused by oil and gas exploration on deep-sea marine holobionts and selection of potential bioindicators and processus de bioremédiation pour ces écosystèmes" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) - "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela exploraçào de 'leo e g's em holobiontes marinhos em mar profundo e seleçào de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas ", parrainé par Shell Brasil dans le cadre de la redevance R-D de l'ANP sous le titre "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Les auteurs remercient également Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient-fico e Tecnolàgico (CNPq) et Coordenaço de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pour son soutien financier, et à Camila Messias, Phillipe Rosado, et Henrique Fragoso dos Santos, pour les images fournies.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 mL PYREX Media Storage Bottle thomas scientific/Corning 1743E20/1395-500 Used to sample water.
500 mL Aspirator Bottles thomas scientific/Corning 1234B28/1220-2X Used to separate the oil fractions.
6-inch wire cutter plier thomas scientific/Restek 1173Y64/23033 Used to cut coral fragments.
17a-Ethinylestradiol LGC Standards DRE-C13245100 Used as the only carbon source to make the selective media.
Agar Himedia PCT0901-1KG Used to make solid media.
Bushnell Haas Broth Himedia M350-500G Used as minimum media to be supplemented with carbon sources.
Erlenmeyer Flask thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble) 4882H35/26500-125 Used to incubate coral macerate with glass beads.
GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit GE Healthcare 28903470 Used to purify PCR products before sending them for sequencing.
Glass Beads MP Biomedicals 1177Q81/07DP1070 Used to detach the microorganisms from coral structures.
Laminar Flow Hood Needed to work at sterile conditions.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth) Himedia M1245-1KG Used as rich media to grow bacteria.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar) Himedia M384-500G Used as rich media to grow bacteria.
Orbital-Shaker Incubator Used to incubate liquid media and oil.
Plates Incubator Used to incubate plates.
Porcelain Mortar and Pestle Thomas scientific/United Scientific Supplies 1201U69/JMD150 Used to macerate coral fragments.
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Used for nucleic acids quantification of DNA and PCR products.
Refrigerated Centrifuge Used to centrifuge bacterial cultures.
Spectrophotometer Used to measure optical density of bacterial cultures.
Wizard Genomic DNA Purification kit Promega A1120 Used for microbial strains DNA extraction.

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