Övervakning ExtracellulärpH i cross-kingdom biofilmer med confocal mikroskopi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokollet beskriver odling av cross-kingdom biofilmer som består av Candida albicans och Streptococcus mutans och presenterar en konfokal mikroskopi-baserad metod för övervakning av extracellulära pH inuti dessa biofilmer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cross-kingdom biofilmer som består av både svamp och bakterieceller är involverade i en mängd olika orala sjukdomar, såsom endodontiska infektioner, parodontit, slemhinnor infektioner och, framför allt, tidig barndom karies. Under alla dessa förhållanden påverkar pH i biofilmmatrisen mikrob-värdinteraktioner och därmed sjukdomsprogressionen. Det nuvarande protokollet beskriver en konfokal mikroskopibaserad metod för att övervaka pH-dynamikinuti cross-kingdom biofilmer bestående av Candida albicans och Streptococcus mutans. PH-beroende dual-emission spektrum och färgning egenskaper ratiometric sonden C-SNARF-4 utnyttjas för att bestämma droppar i pH i extracellulära områden av biofilmer. Användning av pH-ratiometri med sonden kräver ett minutiöst val av bildframställningsparametrar, en grundlig kalibrering av färgämnet och noggrann, tröskelbaserad efterbehandling av bilddata. När den används på rätt sätt möjliggör tekniken en snabb bedömning av extracellulärt pH i olika områden av en biofilm och därmed övervakning av både horisontella och vertikala pH-gradienter över tiden. Medan användningen av konfokal mikroskopi begränsar Z-profilering till tunna biofilmer på 75 μm eller mindre, är användningen av pH-ratiometri idealisk för den noninvasive studien av en viktig virulensfaktor i cross-kingdom biofilmer.

Introduction

Cross-kingdom biofilmer som omfattar både svamp och bakteriearter är involverade i flera patologiskt förhållanden i munhålan. Candida spp. har ofta isolerats från endodontiska infektioner1 och från parodontala lesioner2,3. Vid slemhinnor infektioner har streptokockarter från mitigruppen visat sig förbättra svampbiofilmbildning, vävnadsinvasion och spridning i både in vitro- och murinmodeller4,5,6,7. Mest intressant, oral transport av Candida spp. har visat sig vara förknippad med förekomsten av karies hos barn8. Som visas i gnagare modeller, en symbiotisk relation mellan Streptococcus mutans och Candidas albicans ökar produktionen av extracellulära polysackarider och leder till bildandet av tjockare och mer kardiogenbiofilmer9,10.

I alla ovan nämnda förhållanden, tidig barndom karies i synnerhet, biofilm pH är av betydelse för sjukdomsprogression, och den framstående roll biofilm matris för utveckling av suragenmikromiljöer11 kräver metoder som gör det möjligt att studera pH förändringar inuti cross-kingdom biofilmer. Enkla och korrekta konfokala mikroskopibaserade metoder för att övervaka pH inutibakteriella 12 och svamp13 biofilmer har utvecklats. Med det ratiometriska färgämnet C-SNARF-4 och tröskelbaserad bild efterbearbetning kan extracellulärpH bestämmas i realtid i alla tre dimensionerna av en biofilm14. Jämfört med andra publicerade tekniker för mikroskopibaserad pH-övervakning i biofilmer är pH-ratiometri med C-SNARF-4 enkel och billig, eftersom det inte kräver syntes av partiklar eller föreningar som innehåller ett referensfärgämne15 eller användning av tvåfotonexcitation16. Användningen av bara ett färgämne förhindrar problem med sondcompartmentalization, fluorescerande blödning och selektiv blekning16,17,18 samtidigt som det möjliggör en tillförlitlig differentiering mellan intra- och extracellulärpH. Slutligen utförs inkubation med färgämnet efter biofilmtillväxt, vilket gör det möjligt att studera både laboratorie- och insitu-odlade biofilmer.

Syftet med detta arbete är att utvidga användningen av pH ratiometri och ge en metod för att studera pH-förändringar i cross-kingdom biofilmer. Som konceptbevis används metoden för att övervaka pH i biofilmer med dubbla arter bestående av S. mutans och C. albicans som exponeras för glukos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet för salivsamlingen granskades och godkändes av Institutionen för Nya fri- och vattenlagen (M-20100032).

1. Odling av cross-kingdom Biofilms

  1. Väx S. mutans DSM 20523 och C. albicans NCPF 3179 på blodagarplattor vid 37 °C under aeroba förhållanden.
  2. Överför enstaka kolonier av varje organism till provrör fyllda med 5 ml hjärnhjärtainfusion (BHI). Väx i 18 timmar under aeroba förhållanden vid 37 °C.
  3. Centrifug över natten kulturer på 1.200 x g för 5 min. Kassera supernatant, omfördela cellerna i fysiologisk kokain och justera OD550 nm till 0,5 för C. albicans (~ 107 celler / mL) och S. mutans (~ 108 celler / mL). Späd S. mutans suspension 1:10 med steril fysiologisk koklina (~107 celler/ml).
  4. Pipett50 μL steril spottlösning, beredd enligt metoden för de Jong et al.19,i brunnarna på en optisk botten 96-brunnsplatta för mikroskopi. Inkubera i 30 min vid 37 °C. Tvätta brunnarna 3x med 100 μL steril fysiologisk kokvatten. Töm brunnarna.
  5. Tillsätt 100 μL C. albicans suspension till varje brunn. Inkubera vid 37 °C i 90 min. Tvätta 3x med steril fysiologisk kokvatten.
    Obs:Töm inte brunnarna helt under tvättningen. Lämna en behållare på 20 μL för att undvika överdrivna skjuvkrafter.
  6. Tillsätt 100 μL värmeinaktiverat fetalt bovint serum (inaktiverat vid 56 °C i 30 min) till varje brunn. Inkubera vid 37 °C i 2 h. Tvätta 3x med steril fysiologisk kokvatten. Töm brunnarna och lämna en reservoar på 20 μL.
  7. Tillsätt 100 μL S. mutans suspension (beredd i steg 1.3) till varje brunn. Tillsätt 150 μL BHI som innehåller 5% sackaros. Inkubera vid 37 °C i 24 timmar eller längre. När du odlar äldre biofilmer, ändra mediet dagligen till färsk BHI. I slutet av den cross-kingdom biofilm tillväxtfasen, tvätta 5x med steril fysiologisk kokato.

2. Ratiometric pH Imaging

Obs:Ratiometrisk pH-avbildning måste utföras omedelbart efter biofilmtillväxten är klar.

  1. För ratiometric pH imaging, använd en inverterad confocal laser scanning mikroskop med en 63x olja eller vatten nedsänkning lins, en 543 nm laserlinje, och en spektrala bildsystem (dvs META detektor) för att möjliggöra avbildning av överlappande lysrör signaler. Använd en inkubator för att värma mikroskopstadiet till 35 °C.
  2. Ställ in detektorn för att säkerställa detektering av grön fluorescens från 576−608 nm och samtidig detektion av röd fluorescens från 629−661 nm. Välj en lämplig laserkraft och få för att undvika över- och underexponering.
    OBS: Exponering av bilderna ses bäst i palett bilder med falsk färg.
  3. Ställ in hålstorleken på 1 Luftenhet eller en optisk skiva på ~0,8 μm. Ställ in bildstorleken på 512 x 512 pixlar och skanningshastigheten till 2. Välj ett radgenomsnitt på 2 med hjälp av medelvärdet.
    OBS:I början av en serie experiment, kontrollera att de valda mikroskopinställningarna ger en tydlig kontrast mellan bakterieceller, svampcellväggar, biofilmmatris och svampcytoplasma.
  4. Förbered 100 μL steril fysiologisk kokatosom innehållande 0,4 % (w/v) glukos, titrerad till pH 7. Förbered en stamlösning av C-SNARF-4 (1 mM i dimetylsulfoxid). Tillsätt färgämnet till en slutlig koncentration på 30 μM.
    VARNING: Använd nitrilhandskar vid hantering av det ratiometriska färgämnet.
  5. Töm en av brunnarna med en cross-kingdom biofilm, lämnar en reservoar på 20 μL. Tillsätt den sterila slipmedel som innehåller glukos och ratiometric färgämne. Placera 96-brunnsplattan på mikroskopstadiet och starta avbildningen av biofilmen.
  6. Hämta enstaka bilder eller Z-stackar på olika platser i biofilmen. Markera X-Y-positionen i mikroskopprogramvaran för att följa pH-ändringar inom vissa synfält över tiden. Med jämna mellanrum, ta bilder med lasern avstängd för att korrigera för detektoroffset.
  7. Upprepa steg 2.4–2.6 för analysen av varje biofilm som odlas i en annan brunn.

3. Kalibrering av det ratiometriska färgämnet

OBS: Kalibrering av färgämnet och montering av en kalibreringskurva kan utföras på en annan dag än ratiometrisk pH-avbildning.

  1. Förbered en serie av 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffert titrerad till pH 4.0−7.8 i steg om 0,2 pH-enheter vid 35 °C. Pipette 150 μL av varje buffertlösning i brunnarna på en optisk botten 96-brunnsplatta för mikroskopi.
  2. Tillsätt färgämnet till de buffertfyllda brunnarna på 96-brunnsplattan till en slutlig koncentration på 30 μM. Låt ekvilibrera i 5 min.
  3. Värm mikroskopstadiet till 35 °C. Välj samma mikroskopinställningar som för ratiometric pH-avbildning. Placera den 96-brunnsplattan på mikroskopstadiet. Fokusera på botten av brunnarna. Skaffa två bilder (grön och röd kanal) för alla buffertlösningar, 5 μm över brunnens botten. Med jämna mellanrum, ta bilder med lasern avstängd för att korrigera för detektoroffset.
  4. Utför kalibreringsexperimentet i treexemplar.
  5. Exportera alla bilder som TIF-filer. Importera dem till dedikerad bildanalys programvara (dvs. ImageJ20). Subtrahera bilderna som tagits med lasern avstängd från respektive bilder av buffertlösningargenom att klicka på Process | Bild Kalkylator | Subtrahera).
    Obs: Om det behövs beskär du bilderna för att eliminera artefakter vid bildkanterna genom att utföra rektangulärt val med hjälp av Bild | Beskär.
  6. Dela upp de gröna kanalbilderna genom de röda kanalbilderna och beräkna de genomsnittliga fluorescensintensiteterna i de resulterande bilderna genom att klicka på Analysera | Histogram.
  7. Från triplicate experiment, rita den genomsnittliga gröna / röda förhållanden mot pH. Använd dedikerad programvara för att passa en funktion till kalibreringsdata (d.v.s. MyCurveFit).

4. Digital bildanalys

OBS:Digital bildanalys kan utföras när som helst efter kalibrering av färgämnet och ratiometrisk pH-avbildning.

  1. Lagra de gröna och röda kanalbiofilmbilderna i separata mappar och byt namn på båda filerna med sekventiella tal (t.ex. GREEN_0001). Importera bilderna till dedikerad bildanalysprogramvara (dvs. ImageJ). Klicka på Analysera | Histogram för att bestämma den genomsnittliga fluorescensintensiteten i bilderna tagna med lasern av och subtrahera värdet från biofilmbilderna genom att klicka på Process | Matematik | Subtrahera.
  2. Importera 2-bildserien till dedikerad bildanalysprogramvara (dvs. daime21). Utför en tröskelbaserad segmentering av de röda kanalbilderna (Segment | Automatisk segmentering | Anpassat tröskelvärde). Ställ in den "låga" tröskeln över fluorescensintensiteten hos svampcytoplasman och den "höga" tröskeln under intensiteten i svampcellväggarna och bakterierna.
    Obs:När lämpliga tröskelvärden har valts identifieras endast extracellulära områden som objekt.
  3. Överför objektskiktet för den segmenterade bildserien till den gröna kanalbildserien. Det gör du genom att klicka på Segment | Överför objektskiktet.
    OBS: Om kontrasten mellan extracellulära områden och svampcytoplasma är för svag i de enskilda färgkanalerna lägger du till den gröna kanalbildserien till den röda kanalserien före segmenteringen genom att klicka på Redigera | Bildkalkylator | Tillägg. Utför segmenteringen enligt beskrivningen under 4.2 och överför objektskiktet i den segmenterade bildserien till både den gröna och röda kanalbildserien.
  4. Använd objektredigeraren för att ta bort pixlar som inte är objekt i den röda och gröna kanalbildsserien (Visualizer | Objektredigerare | I alla bilder | Ta bort pixlar som inte är objekt). Nu rensas biofilmbilderna från både bakterie- och svampceller. Exportera den bearbetade bildserien som TIF-filer.
  5. Importera båda bildserierna till ImageJ. ImageJ tilldelar en intensitet på 0 till alla pixlar som inte är objekt. Ta bort dessa pixlar genom att dividera den röda bildserien (R1) av sig själv (Process | Bildkalkylator | Bild 1: R1; Åtgärd: Dela; Bild 2: R1) och multiplicera den resulterande bildserien (R2) med den ursprungliga röda bildserien (Process | Bildkalkylator | Bild 1: R1; Åtgärd: Multiplicera; Bild 2: R2). En tredje bildserie (R3) skapas, identisk med R1, förutom det faktum att NaN tilldelas alla pixlar med en intensitet på 0 i R1. Fortsätt på samma sätt med den gröna bildserien.
  6. Använd filtret "Medelvärde" (Process | Filter | Medelvärde | Radie | 1 pixel) på den röda och gröna kanalbildsserien för att kompensera för detektorbrus. Dela upp den gröna kanalbildserien med den röda kanalbildserien (Process | Bildkalkylator | Bild 1: G3; Åtgärd: Dela; Bild 2: R3). Den resulterande bildserien (G3/R3) visar det gröna/röda förhållandet för alla objektpixlar.
  7. Beräkna medelförhållandet för varje bild (Analysera | Histogram). Applicera falsk färg för bättre visuell representation av nyckeltalen i bilderna (Bild | Uppslagstabeller). Konvertera de gröna/röda förhållandena till pH-värden med den funktion som monterats under 3,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter 24 h och 48 h, robusta cross-kingdom biofilmer utvecklas i brunnen plattor. C. albicans visade varierande grad av glödande tillväxt, och S. mutans bildade täta kluster på upp till 35 μm i höjd. Enstaka celler och kedjor av S. mutans grupperade kring svamphyphae, och stora intercellulära utrymmen indikerade förekomsten av en omfattande matris (figur S1).

Kalibrering av det ratiometriska färgämnet ger en asymmetrisk sigmoidalkurva13,14. Den extracellulära pH i biofilmer sjönk snabbt under de första 5 min efter exponering för glukos i olika takt inom olika mikroskopiska synfält. Därefter avtog försurningen och nådde normalt värden på 5,5–5,8 efter 15 min (figur 1). Replikera biofilmer visade ett liknande beteende, med endast små variationer i genomsnittligpH (figur S2).

Noggrannheten i pH-beräkningarna är starkt beroende av ett noggrant val av bildinställningar under förvärvet. För biofilmerna i fråga visade sig en optisk skiva på 0,8 μm vara idealisk för att uppnå bästa möjliga kontrast mellan extracellulära områden och svampcytoplasma(figur S3). Dessutom gav en pixelstorlek på 0,28 μm (figur S4), en pixeluppehålltid på 102,4 μs (figur S5) och ett linjegenomsnitt på 2 (figur S6) en bra kontrast tillsammans med en godtagbar bildförvärvstid på ~1 min. Under bild efter bearbetning, alla bakteriella och svampceller togs bort från bilderna, medan de flesta av de omgivande extracellulära områden ingick i den efterföljande pH-analys. Beroende på bildernas ljusstyrka måste olika övre och nedre tröskelvärden väljas (figur 2).

PH-data som visas i figur 1 och figur S2 registrerades 5 μm från gränssnittet för biofilmsubstratum. Med ökande avstånd från substratet, och beroende på celltätheten i biofilmerna, minskar fluorescensintensiteten, vilket resulterar i en lägre kontrast mellan celler och matris. I de tunna biofilmerna (~35 μm) som odlas i den aktuella studien tillät dock kontrast en övre del av biofilmen tillförlitlig bildanalys (figur S7A).

Figure 1
Figur 1: Användning av pH-kvotmetri i cross-kingdom biofilmer utsätts för glukos. (A)Ett synfält i en färgat biofilm avbildades med konfokal mikroskopi och det område som omfattas av bakterie- och svampceller togs bort före kvotanalys. (B) PH i extracellulärt utrymme beräknades och visualiserades med hjälp av en uppslagstabell (16 färger). Skala stänger = 20 μm. (C) PH i 24 h cross-kingdom biofilmer sjönk snabbt vid exponering för glukos i något olika grad inom olika synfält. Felstaplar = standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Tröskelbaserad bildsegmentering av färgade biofilmer. På grund av de lokala pH-ändringarna ändras fluorescensintensiteten i biofilmerna med tiden. (A) och (B) visar samma mikroskopiska synfält efter 1 min respektive 15 min exponering för glukos. Under bildsegmentering måste höga och låga trösklar väljas på lämpligt sätt för att eliminera alla områden som omfattas av bakterie- och svampceller. (C) Blå områden eliminerades genom den låga tröskeln (40), röda områden med den höga tröskeln (115). (D) Endast extracellulära områden erkändes som föremål (omgivna av orange linjer). (E)Efter eliminering av det område som omfattas av mikrobiella celler kan pH-beräkningen utföras i biofilmmatrisen. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 1
Figur S1: Typisk 24 h cross-kingdom biofilm färgas med ratiometric färgämne. Många C. albicans celler visas glödtråd tillväxt, medan S. mutans (gula) celler bildade täta kluster eller lokaliserade runt svamp hyphae som enstaka celler eller kedjor. Stora intercellulära utrymmen indikerade närvaron av en omfattande biofilmmatris. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 2
Figur S2: PH-utvecklingen i 24 h cross-kingdom biofilmer utsätts för glukos. (A), (B) och (C) PH fastställdes ratiometrically i tre replikat biofilmer i 15 min efter exponering för glukos. Efter en snabb pH-nedgång under de första 5 min avtog försurningen, och nivåerna på 5,5−5,8 uppnåddes efter 15 min. Något olika frekvenser observerades i olika mikroskopiska synfält (var och en representerad av en linje). Kalibrering av den ratiometriska sonden utfördes endast en gång. Felstaplar = SD. Klicka här för att visa en större version av den här siffran.

Supplemental Figure 3
Figur S3: Inverkan av optisk skivatjocklek på bildkontrast. Bilder av färgade biofilmer förvärvades med (A) en hålstorlek på 2 luftiga enheter och en optisk skivatjocklek på 1,6 μm och (B) 1 Luftig enhet och en optisk skiva på 0,8 μm. Vid 1 Airy Unit behövdes en högre lasereffekt/vinst för bildförvärv, men kontrasten mellan svampcytoplasma och extracellulära områden förbättrades. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 4
Figur S4: Upplösningens inverkan på bildkontrast. Bilder av färgade biofilmer förvärvades med pixelstorlekar på (A) 1,12 μm, (B) 0,56 μm, (C) 0,28 μm, (D) 0,14 μm och (E) 0,11 μm. Minskning av pixelstorleken under 0,28 μm förbättrade inte kontrasten mellan extracellulära områden och svampcytoplasma. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 5
Figur S5: Skanningshastighetens inverkan på bildkontrast. Bilder av färgade biofilmer förvärvades med pixelbortider på (A) 12,8 μs, (B) 25,6 μs, (C) 51,2 μs, (D) 102 μs och (E) 164 μs. Öka pixelns uppehållstid efter 102 μs förbättrade inte kontrasten mellan extracellulära och intracellulära områden. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 6
Figur S6: I genomsnittseffekt på bildkontrast. Bilder av färgade biofilmer förvärvades med linjemedelvärden (medelvärde) av (A) 1, (B) 2 och (C) 4. Ett linjegenomsnitt på 2 gav den bästa kompromissen mellan kontrast och förvärvstid. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplemental Figure 7
Figur S7: Bildkontrast i rent svampbiofilmer och cross-kingdom biofilms. (A) Toppen av en färgat cross-kingdom biofilm avbildades 30 μm från gränssnittet. Kontrasten mellan extracellulära och intracellulära områden var lägre än vid biofilmbasen men fortfarande tillräcklig för ratiometric pH-analys. (B) A C. albicans monospecies biofilm avbildades för pH ratiometri. Laserkraft/förstärkning kan ökas för att optimera kontrasten mellan svampcellsväggar och cytoplasma. (C) I cross-kingdom biofilmer, de ljust fluorescerande bakterier na förhindrade ytterligare förhöjning av laserdriver/vinst. Därför är kontrasten mellan svampcellväggar och cytoplasma mindre uttalad än i rent svampbiofilmer. Skalstänger = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Olika protokoll för odling av cross-kingdom biofilmer som involverar C. albicans och Streptococcus spp. har beskrivits tidigare9,22,23,24,25. Den nuvarande installationen fokuserar dock på enkla tillväxtförhållanden, en tidsplan som är kompatibel med vanliga arbetsdagar, en balanserad artsammansättning och utvecklingen av en omfattande biofilmmatris. Dessutom var 96-brunnsplattor belagda med salivary lösning för att efterlikna muntliga förhållanden vidhäftning i viss utsträckning.

Användningen av pH ratiometri med C-SNARF-4 är en billig metod för snabba mätningar av biofilm pH, vars fördelar och nackdelar har diskuterats i detalj på annat håll12,26. I korthet möjliggör tekniken bedömning av pH på olika platser inuti biofilmer och därmed övervakning av horisontella pH-gradienter och pH-utveckling över tiden27. Vertikala pH-profiler kan också registreras, men penetrationsdjupet begränsas av användning av konfokal mikroskopi. Därför representerar pH ratiometri en snabbare, mer mångsidig och mindre invasiva alternativ till pH mikroelektroder, som för närvarande är den metod som väljs för Z-profilering av tjocka biofilmer28. Jämfört med andra mikroskopibaserade metoder för pH-inspelningar i biofilmer har pH-ratiometri med C-SNARF-4 fördelen att endast använda en fläck. Därför kringgås flera problem som kan uppstå till följd av differentialfluorescerande beteende och samspelet mellan olika färgämnen26.

I cross-kingdom biofilmer, tröskel-baserad differentiering mellan mikrobiell biomassa och extracellulära områden innebär vissa problem jämfört med biofilmer som bara omfattar bakteriella eller svampceller. Bakterieceller internaliserar ratiometriska färgämne och visar en ljus fluorescerande signal jämfört med biofilm matrisen, men också jämfört med svamp cellväggar. Svampcellväggar verkar något ljusare än biofilmmatrisen, vilket i sin tur visar högre fluorescens än svampcytoplasman. I biofilmer som bara består av svampceller kan bilder förvärvas med hög lasereffekt/vinst, vilket resulterar i tillräcklig kontrast mellan biofilmmatrisen och svampcytoplasman (figur S7B). När bakterier finns måste lasereffekt/förstärkning minskas för att undvika överexponering av bakterieceller (figur S7C). Därför är kontrasten mellan svampcytoplasma och extracellulära områden inte lika uttalad, och bildinställningar som hålstorlek, pixelstorlek och pixel-uppehållstid måste väljas med stor omsorg om ratiometric analys.

När det gäller alla mikroskopi-baserade tekniker, bildkvalitet och förvärvstid är omvänt korrelerade. I den nuvarande cross-kingdom biofilmer, en bildbehandling tid ~ 30 s, helst 1 min, var nödvändigt att få en lämplig kvalitet för efterföljande pH-analys. I jämförelse kan biofilmer som endast hyser bakterier avvisas med tillräcklig kvalitet i 10 s eller mindre29. För mikroskopianalyser av biofilmtillväxt, struktur eller sammansättning utgör förvärvstiderna på 1 min inte ett problem, och i många fall kan detta också gälla för pH-inspelningar. Extrema pH-förändringar, såsom den snabba försurning som observerats omedelbart efter exponering för glukos (ΔpH > 1 enhet/min), är dock svåra att övervaka i cross-kingdom biofilmer.

Det nuvarande arbetet visar att ratiometric pH inspelningar med C-SNARF-4 är genomförbara i cross-kingdom biofilmer som består av S. mutans och C. albicans. Framtida studier kan använda metoden för att analysera pH-förändringar i cross-kingdom biofilmer med större art mångfald, särskilt i biofilmer odlas på plats (dvs. hos barn med förskolebarn)30. I denna studie övervakades pH i biofilmerna under statiska förhållanden och under en begränsad observationstid på 15 min, direkt efter en glukospuls. Ytterligare framsteg kan omfatta tillämpning av ett vätskeflöde för att efterlikna in situ-förhållanden närmare14,31,32. Dessutom kan pH ratiometri användas för att studera effekterna av olika näringsförhållanden på långsiktiga pH-förändringar i cross-kingdom biofilmer och bidra till att belysa effekten av biofilm pH på de underliggande värdvävnader. Återigen kan demineralisering av tandemalj i tidig barndom karies fungera som ett framträdande exempel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Anette Aakjær Thomsen och Javier E. Garcia är erkända för utmärkt teknisk support. Författarna tackar Rubens Spin-Neto för givande diskussioner om bildanalys.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97, (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14, (1), 0210527 (2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35, (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16, (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214, (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, (11), 7967 (2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80, (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52, (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82, (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13, (6), 1006407 (2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92, (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18, (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75, (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92, (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2, (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47, (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8, (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11, (3), 0150457 (2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51, (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9, (11), 1242 (2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81, (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76, (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6, (9), 25299 (2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28, (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics