एक मैक्रोफेज रिपोर्टर सेल परख की जांच करने के लिए टोल की तरह रिसेप्टर-मध्यस्थ एनएफ-केबी/एपी-1 संकेत पॉलीमेरिक सतहों पर Adsorbed प्रोटीन परतों पर

Bioengineering

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Summary

यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रकार की पॉलीमेरिक सतहों और एसोर्बेड प्रोटीन परतों के जवाब में एक मूत्र मैक्रोफेज सेल लाइन में टीएलआर-निर्भर एनएफ-डॉक्ब/एपी-1 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर गतिविधि को मापने की एक त्वरित, अप्रत्यक्ष विधि प्रदान करता है जो जैव सामग्री प्रत्यारोपण माइक्रोएनवायरमेंट को मॉडल करते हैं ।

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McKiel, L. A., Woodhouse, K. A., Fitzpatrick, L. E. A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces. J. Vis. Exp. (155), e60317, doi:10.3791/60317 (2020).

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Abstract

एक प्रत्यारोपित जैव सामग्री के लिए लगातार भड़काऊ मेजबान प्रतिक्रिया, विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया के रूप में जाना जाता है, जैव चिकित्सा उपकरणों और ऊतक इंजीनियरिंग निर्माण के विकास और कार्यान्वयन में एक महत्वपूर्ण चुनौती है । मैक्रोफेज, एक सहज प्रतिरक्षा कोशिका, विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया में प्रमुख खिलाड़ी हैं क्योंकि वे डिवाइस के जीवनकाल के लिए प्रत्यारोपण स्थल पर रहते हैं, और आमतौर पर इस हानिकारक मेजबान प्रतिक्रिया की समझ हासिल करने के लिए अध्ययन किया जाता है। कई बायोमैटेरियल्स शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि प्रत्यारोपित सामग्री पर एडोरबेड प्रोटीन परतें मैक्रोफेज व्यवहार को प्रभावित करती हैं, और बाद में मेजबान प्रतिक्रिया को प्रभावित करती हैं। इस पेपर में विधियां मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए बहुलक जैव सामग्री सतहों पर सेलुलर क्षति अणुओं वाले सोखदार प्रोटीन परतों का उपयोग करके इन विट्रो मॉडल का वर्णन करती हैं। एक एनएफ-ओटीबी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज सेल लाइन और संबद्ध रंगीन क्षारीय फॉस्फेनेस परख का उपयोग एक त्वरित विधि के रूप में किया गया था ताकि रक्त प्रोटीन और क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न वाले जटिल एडीसोबेड प्रोटीन परतों के जवाब में एनएफ-ओटीबी/एपी-1 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर गतिविधि की जांच की जा सके।

Introduction

विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया (एफबीआर) एक पुरानी मेजबान प्रतिक्रिया है जो भड़काऊ मध्यस्थों की लगातार रिहाई के माध्यम से और प्रत्यारोपित सामग्री और आसपास के ऊतकों1के बीच एकीकरण में बाधा के माध्यम से प्रत्यारोपित सामग्री या डिवाइस (जैसे, दवा वितरण उपकरणों, बायोसेंसर) के प्रदर्शन को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। यह सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रत्यारोपण प्रक्रिया द्वारा शुरू की जाती है और प्रत्यारोपण1के आसपास जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं और रेशेदार कैप्सूल गठन की दीर्घकालिक उपस्थिति की विशेषता है। सामग्री मेजबान प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में, मैक्रोफेज-सामग्री बातचीत का मेजबान प्रतिक्रिया की प्रगति और एफबीआर1के विकास पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। मैक्रोफेज एक विविध जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका आबादी है, जो प्रत्यारोपण स्थल पर या तो ऊतक-निवासी मैक्रोफेज आबादी से या रक्त से मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के रूप में भर्ती की जाती है। वे प्रत्यारोपण के तुरंत बाद प्रत्यारोपण के बाद प्रत्यारोपण साइट पर जमा करने के लिए शुरू, और दिनों के भीतर प्रत्यारोपण माइक्रोएनवायरमेंटल में प्रमुख सेल आबादी बन जाते हैं । सामग्री-अनुयायी मैक्रोफेज, मैक्रोफेज फ्यूजन के माध्यम से गठित विदेशी शरीर की विशाल कोशिकाओं (एफबीजीसी) के साथ, प्रत्यारोपण2,3के जीवनकाल के लिए सामग्री की सतह पर बनी रह सकती है। नतीजतन, मैक्रोफेज को एफबीआर के विशिष्ट चरणों को आर्केस्ट्रा करने वाली उनकी भूमिकाओं के कारण विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया में प्रमुख खिलाड़ी माना जाता है: तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया, ऊतक रीमॉडलिंग, और फाइब्रोटिक ऊतक1का गठन।

टोल की तरह रिसेप्टर्स (टीएलआर) पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स का एक परिवार है जो मैक्रोफेज सहित कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है, और सूजन और घाव उपचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। रोगजनक-व्युत्पन्न लिगांड के अलावा, टीएलआर एंडोजेनस अणुओं को बांधने में सक्षम होते हैं, जिन्हें क्षति से जुड़े आणविक पैटर्न (डीएबीपीएस) के रूप में जाना जाता है, जिन्हें सेल परिगलन के दौरान जारी किया जाता है और भड़काऊ सिग्नलिंग रास्तों को सक्रिय किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप भड़काऊ साइटोकिन्स4का उत्पादन होता है। हमने और अन्य लोगों ने प्रस्ताव किया है कि नरम ऊतक बायोमटेरियल प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं के दौरान किए गए नुकसान ने डैम्प जारी किए, जो तब रक्त प्रोटीन के अलावा बायोमटेरियल सतहों के लिए एसोर्ब और बाद में सेल-सामग्री बातचीत5,6को मिलाना। जब मैक्रोफेज एक प्रत्यारोपण पर सोखप्रोटीन परत के साथ बातचीत करते हैं, तो उनकी सतह टीएलआर एडोरबेड डैम्प को पहचान सकती है और भड़काऊ सिग्नलिंग कैस्केड को सक्रिय कर सकती है, जिससे एनएफ-बी और एपी-1 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सक्रियण और भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन हो सकता है। हमने पहले दिखाया है कि murine मैक्रोफेज काफी एनएफ-1बी/एपी-1 गतिविधि और ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α, में वृद्धि हुई है, प्रोफ्लेमेटरी साइटोकिन) डीएमपी युक्त एडोरबेड प्रोटीन परतों के जवाब में स्राव केवल एसोरबेड सीरम या प्लाज्मा के साथ सतहों की तुलना में पॉलीमेरिक सतहों की एक किस्म पर (यानी, कोई DAMPs मौजूद है), और यह प्रतिक्रिया काफी हद तक TLR2 द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जबकि TLR4 एक कम भूमिका5निभाता है ।

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाली एनएफ-बी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज सेल लाइन(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)मैक्रोफेज5,7,8में सापेक्ष एनएफ-बी और एपी-1 गतिविधि को मापने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है । टीएलआर पाथवे अवरोधकों के संयोजन में, यह सेल लाइन टीएलआर सक्रियण की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण है और विभिन्न उत्तेजनाओं5,7,8के जवाब में सूजन में इसकी भूमिका है। रिपोर्टर कोशिकाएं एक संशोधित माउस मैक्रोफेज जैसी सेल लाइन हैं जो एनएफ-बी और एपी-1 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एक्टिवेशन9पर स्रावित भ्रूणीय क्षारीय फॉस्फेटेज (सीईपी) का उत्पादन कर सकती हैं। रंगेमीय एंजाइमीय क्षारीय फॉस्फेटेज़ परख(सामग्री की तालिका)का उपयोग एनएफ-बी/एपी-1 गतिविधि के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में सीईपी अभिव्यक्ति की सापेक्ष मात्रा को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। चूंकि एनएफ-बी बी और एपी-1 कई सेल सिग्नलिंग रास्तों के डाउनस्ट्रीम हैं, विशिष्ट टीएलआर (जैसे, टीएलआर 2) या टीएलआर एडाप्टर अणुओं (जैसे, MyD88) को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी और अवरोधकों को बेअसर कर ते हैं, एक विशिष्ट मार्ग की भूमिका को सत्यापित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस लेख में वर्णित पद्धति प्रत्यारोपित बायोमैटेरियल्स के इन विट्रो मॉडल के रूप में रक्त प्रोटीन और डैम्प दोनों युक्त एडीसोर्बेड प्रोटीन परतों के साथ विभिन्न पॉलीमेरिक सतहों के लिए मूत्र मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं में टीएलआर सिग्नलिंग के योगदान का आकलन करने के लिए एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण प्रदान करती है।

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Protocol

1. मीडिया और रिएजेंट तैयारी

  1. फाइब्रोब्लास्ट मीडिया तैयार करें। Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM), भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के ५० mL के ४५० mL, और पेनिसिलिन के 5 mL/ 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. रिपोर्टर मैक्रोफेज ग्रोथ मीडिया को 50 एमएल एलिकोट में तैयार करें। डीएमईएम के 45 किलोग्राम, एफबीएस के 5 एमएल, 5 μg/mL mycoplasma उन्मूलन अभिकर्मक(सामग्री की तालिका),और 200 μg/mL phleomycin D1(सामग्री की तालिका)मिलाएं। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. रिपोर्टर मैक्रोफेज परख मीडिया को 50 एमएल एलिकोट में तैयार करें। डीएमईएम के 45 मिलीग्राम, गर्मी निष्क्रिय एफबीएस (एचआई-एफबीएस), 5 μg/mL mycoplasma उन्मूलन अभिकर्ता, और 200 μg/mL phleomycin D1 के मिश्रण। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पॉली (मिथाइल मेथेक्रिलेट) के साथ कोटिंग सेल कल्चर सतहें

  1. 20 मिलीग्राम ग्लास प्रस्फुटन शीशी में 20 मिलीग्राम/mL (जैसे, क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीग्राम में 100 मिलीग्राम पीएमएमए) में पॉली (मिथाइल मेथेक्रिलेट) (पीएमएमए) को भंग करें। शीशी में एक चुंबकीय हलचल बार रखें और कम से कम 2 घंटे के लिए हलचल करने की अनुमति दें, जब तक कि सभी ठोस भंग न हो जाएं।
    सावधानी: यदि सांस ली जाए तो क्लोरोफॉर्म हानिकारक है। पीवीए दस्ताने पहने हुए एक धुएं हुड में सॉल्वेंट का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  2. एक स्पिन कोटर में बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड के केंद्र पर पीएमएमए समाधान का पिपेट 400 माइक्रोन, और 2 मिन के लिए 3000 आरपीएम पर स्पिन करें। परख के लिए आवश्यक स्लाइड की संख्या तैयार करें, साथ ही पानी संपर्क कोण मापन के लिए 3−5 अतिरिक्त। भविष्य के उपयोग के लिए एक साफ बॉक्स (70% इथेनॉल के साथ छिड़काव और मिटा दिया गया) में स्लाइड स्टोर करें।
    नोट: स्पिन कोटिंग का उपयोग अक्सर एक सपाट सतह पर एक पतली, समान कोटिंग जमा करने के लिए किया जाता है। एक स्पिन कोटर सतह पर कोटिंग समाधान फैलाने के लिए अपकेंद्रित्र बल का उपयोग करते हुए उच्च गति पर एक सब्सट्रेट घुमाता है।
    1. अतिरिक्त लेपित स्लाइड की सतह पर दो यादृच्छिक पदों पर पानी संपर्क कोण उपाय (यानी, नहीं स्लाइड सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है) एक गोनियोमीटर के साथ कांच की सतह सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से बहुलक के साथ लेपित किया गया था ।
      नोट: पानी संपर्क कोण मापन के लिए केवल उच्चतम शुद्धता (जैसे, ग्लास ट्रिपल आसुत) का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में पीएमएमए कोटेड-स्लाइड्स में 8-चैंबर चिपचिपा कुओं को बाँझ संदंश और असेप्टिक तकनीक का पालन करते हैं। चिपचिपा कुओं के शीर्ष पर मजबूती से प्रेस सुनिश्चित करें कि वे दृढ़ता से जुड़े हुए हैं । सील सुरक्षित करने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर संलग्न चिपचिपा कुओं के साथ स्लाइड्स इनक्यूबेट करें।
    1. प्रत्येक कुएं में सेल कल्चर ग्रेड (एंडोटॉक्सिन-मुक्त) पानी के 200 माइक्रोन जोड़कर चिपचिपा कुओं की सील का परीक्षण करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर ६० ०० ०० के लिए इनक्यूबेट और आगे बढ़ने से पहले कोई रिसाव सुनिश्चित करें । पानी को एस्पिरेट करें, सावधान रहें कि पीएमएमए कोटिंग को परेशान न करें।
  4. एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी धोता है प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी के 300 μL जोड़कर और 1 घंटे (तीन बार), 12 घंटे, और 24 घंटे के लिए किसी भी शेष विलायक को हटाने के लिए उपयोग करने से पहले इनक्यूबेटिंग।
  5. सेल कल्चर के लिए इस्तेमाल की जाने वाली स्लाइड्स की एंडोटॉक्सिन एकाग्रता का टेस्ट करें। 1 घंटे के लिए प्रत्येक स्लाइड के एक कुएं में एंडोटॉक्सिन-फ्री रिएजेंट वॉटर(टेबल ऑफ मैटेरियल)का इनक्यूबेट 200 माइक्रोन।
    नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध एंडोटॉक्सिन परख किट के लिए विशिष्ट है।
  6. इस काम के लिए केवल पानी और उपभोग्य सामग्री (यानी, पिपेट टिप्स, माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब और अच्छी तरह से प्लेट) का उपयोग करें जो प्रमाणित पायजेन-मुक्त (यानी एंडोटॉक्सिन-मुक्त) हैं। इसके अलावा, पॉलीमर-लेपित सतहों की तैयारी में उपयोग किए जाने वाले किसी भी ग्लासवेयर को10का उपयोग करने से पहले सूखी गर्मी नसबंदी (30 0 0 के लिए 250 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके डिपिजेनेनेट किया जाना चाहिए। निकालने के समाधान में एंडोटॉक्सिन को मापने, जैसा कि यहां वर्णित है, सामग्री की सतह11,12पर एंडोटॉक्सिन का कम अनुमान लगा सकता है। नतीजतन, यह सिफारिश की जाती है कि पॉलीमर कोटिंग प्रोटोकॉल विकसित करते समय, एंडोटॉक्सिन परख प्रतिक्रिया (यानी, परीक्षण नमूनों के लिए चरण 2.5.4−2.5.6 [अभिपरिवर्तित जल] या स्पाइक नियंत्रण) सीधे कोटेड नमूना युक्त कुओं के भीतर करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एंडोटॉक्सिन का कोई स्रोत अनजाने में कोटिंग प्रक्रिया के दौरान सिस्टम में पेश नहीं किया जाता है।
    1. सभी परीक्षण नमूने (यानी, अर्क) और एंडोटॉक्सिन परख अभिकर्मकों को आरटी में लाएं । परख बफर में गुणसूत्र अभिकर्ता का पुनर्गठन करें और अभिएजेंट पानी में एंडोटॉक्सिन मानक, 5 मिन के लिए भंग करने के लिए और धीरे से उपयोग करने से पहले भंवर की अनुमति दें । उपयोग में नहीं होने पर पैराफिन फिल्म के साथ सभी बोतलों को कवर करें।
    2. एंडोटॉक्सिन मानक के 5−8 बिंदु मानक कमजोर पड़ने की अवस्था बनाएं, जो पुनः एजेंट पानी में एंडोटॉक्सिन मानक के धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करके परख की निचली से ऊपरी सीमा तक है।
    3. परीक्षण नमूनों में एंडोटॉक्सिन परख को बढ़ाने या अवरोध के लिए नियंत्रित करने के लिए, अप्रयुक्त परीक्षण नमूना समाधान में एंडोटॉक्सिन की ज्ञात मात्रा को कमजोर करके एक सकारात्मक नियंत्रण (जिसे स्पाइक नियंत्रण या नुकीला नमूना भी कहा जाता है) तैयार करें।
      नोट: सकारात्मक नियंत्रण की एकाग्रता मानक वक्र के बीच में एक मानक के रूप में एक ही एकाग्रता होनी चाहिए। यदि एंडोटॉक्सिन स्पाइक की बरामद राशि (यानी, सकारात्मक नियंत्रण की एकाग्रता शून्य से अनस्पाइक परीक्षण नमूने की एकाग्रता) एंडोटॉक्सिन स्पाइक की नाममात्र एकाग्रता के 50−200% के भीतर है, तो निष्कर्षण समाधान को परख में काफी हस्तक्षेप नहीं करने पर विचार किया जा सकता है।
    4. डुप्लिकेट या ट्रिपलेट में 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में मानकों, नमूनों या स्पाइक नियंत्रणों में 50 माइक्रोन जोड़ें। रिएजेंट पानी को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग करें।
    5. हर कुएं में क्रोमोजेनिक रिएजेंट के 50 माइक्रोन जोड़ें। सभी कुओं में जल्दी से अभिकर्मक जोड़ें। सभी कुओं में अभिकर्ता जोड़ने में लगने वाले समय की मात्रा रिकॉर्ड करने के लिए टाइमर का उपयोग करें। प्लेट को चिपकने वाली सील के साथ कवर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (ऊष्मायन समय बहुत निर्भर है और क्रोमोजेनिक रिएजेंट किट में शामिल विश्लेषण प्रमाण पत्र पर कहा गया है)। वैकल्पिक रूप से, सभी मानक कुओं में रंग परिवर्तन देखे जाने तक ऊष्मायन के दौरान हर 15 मिन प्लेट की जांच करें।
    6. ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से (10% एसिटिक एसिड प्रति अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता) में 50% एसिटिक एसिड के 25 माइक्रोन जोड़ें। क्रोमोजेनिक रिएजेंट के रूप में एक ही क्रम में एसिटिक एसिड जोड़ें। 405 एनएम पर एक प्लेट रीडर का उपयोग कर प्लेट का अवशोषण पढ़ें। एस्पिरेट तरल और त्यागने की थाली।
      नोट: एसिटिक एसिड जोड़ प्रत्येक में जोड़ने के लिए समय की एक ही लंबाई लेनी चाहिए क्योंकि गुणसूत्र रिएजेंट लिया (± 30 एस)।
  7. पराबैंगनी (यूवी) सेल संस्कृति प्रयोगों से पहले 30 मिन के लिए स्लाइड बंध्याकरण ।

3. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सीन के साथ कोटिंग सेल कल्चर सतह

  1. 10:1 वजन अनुपात (आधार: इलाज एजेंट) में पॉलीडिमिथाइलसिलिक्सॉकने (पीडीएफ) इलास्टोमर मिलाएं। एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सीन बेस के लगभग 10 मीटर की एक बाँझ ट्यूब में पिपेट। ट्यूब का वजन करें और धीरे-धीरे इलाज एजेंट जोड़ें जब तक कि 10% जोड़ा नहीं गया है।
    सावधानी: एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में पीडीएफ अभिकर्मकों का उपयोग करें और सुरक्षा चश्मा पहनकर आंखों के संपर्क से बचें।
  2. एक बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट टिप के साथ सरगर्मी और ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा इलास्टोमर को अच्छी तरह से मिलाएं। 48-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं के समाधान के लगभग 200 माइक्रोन जोड़ें। elastomer समाधान के साथ कुओं की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए धीरे से अच्छी तरह से थाली झुकाव ।
  3. एक वैक्यूम ओवन 50 cmHg, 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट में elastomer के साथ अच्छी तरह से थाली रखें। अन्य मलबे को कुओं में गिरने से रोकने के लिए ढक्कन और कवर को सिंगल-प्लाई वाइप से निकालें। कम से कम 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    1. पुष्टि कुओं पूरी तरह से दृश्य निरीक्षण के माध्यम से लेपित कर रहे हैं । सुनिश्चित करें कि आसस्तोमर हटाने से पहले एक बाँझ पिपेट टिप के साथ धीरे-धीरे उकसाने से पूरी तरह ठीक हो जाए।
  4. 70% इथेनॉल के 300 माइक्रोन जोड़ें (पूर्ण इथेनॉल और एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी के साथ बनाया गया) और 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें और प्रत्येक कुएं में एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी के 30 μL जोड़कर एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी धोता है और 1 घंटे (तीन गुना), 12 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करके एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी धोता है , और 24 घंटे किसी भी शेष विलायक को हटाने के लिए उपयोग करने से पहले।
    1. 1 घंटे के लिए प्रत्येक प्लेट के तीन कुओं में एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी का इनक्यूबेट 200 माइक्रोन।

4. फ्लोरिनटेड पॉली (टेट्राफ्लोरोएथिलीन) के साथ कोटिंग सेल कल्चर सतहें

  1. 20 मिलीग्राम ग्लास प्रस्फुटन शीशी में फ्लोरिनटेड पॉली (टेट्राफ्लोरोएथिलीन) (एफपीटीएफई) (जैसे, फ्लोरिनटेड सॉल्वेंट[टेबल ऑफ मैटेरियल्स])में 10 मिलीग्राम एफपीटीएफई को 10 मिलीग्राम एफपीटीएफई जोड़ें। शीशी में एक चुंबकीय हलचल बार रखें और कम से कम 24 घंटे के लिए हलचल करने की अनुमति दें, जब तक कि सभी ठोस भंग न हो जाएं।
  2. पॉलीस्टीरिन 48-वेल प्लेट (यानी, ऊतक संस्कृति का इलाज नहीं) के प्रत्येक कुएं में बहुलक समाधान के लगभग 150 माइक्रोन जोड़ें। पॉलीमर समाधान के साथ सभी कुओं की पूरी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए अच्छी प्लेट को धीरे-धीरे झुकाएं। ढक्कन बदलें।
    1. कुओं के प्रभावी एफपीटीएफई-कोटिंग को सुनिश्चित करने के लिए, ग्लास कवरस्लिप को एफपीटीएफई में लेपित किया जाना चाहिए और पानी संपर्क कोण माप (चरण 4.3.1) के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। 24-कूकर प्लेट के कुओं के अंदर कवरस्लिप रखें। एक कवरस्लिप युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से बहुलक समाधान के लगभग 400 माइक्रोन जोड़ें। बाँझ संदंश का उपयोग करके कवरस्लिप को नीचे धकेलें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे पूरी तरह से बहुलक समाधान में शामिल हैं, और अच्छी प्लेट को ढक्कन से कवर करें।
  3. कूप के घोल के साथ अच्छी प्लेट रखें और/या कवरस्लिप को वैक्यूम ओवन में रखें जो 50 सेमीजी, 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट होता है। अन्य मलबे को कुओं में गिरने से रोकने के लिए ढक्कन और कवर को सिंगल-प्लाई वाइप से निकालें। कम से कम 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    1. प्रभावी कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए गोरियोमीटर के साथ एफपीटीएफई-कोटेड कवरस्लिप के पानी संपर्क कोण को मापें।
      नोट: पानी संपर्क कोण मापन के लिए केवल उच्चतम शुद्धता (जैसे, ग्लास ट्रिपल आसुत) का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. 70% इथेनॉल के 300 माइक्रोन जोड़ें (पूर्ण इथेनॉल और एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी के साथ बनाया गया) और 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें और प्रत्येक कुएं में एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी के 30 μL जोड़कर एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी धोता है और 1 घंटे (तीन गुना), 12 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करके एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी धोता है , और 24 घंटे किसी भी शेष विलायक को हटाने के लिए उपयोग करने से पहले।
    1. 1 घंटे के लिए प्रत्येक प्लेट के तीन कुओं में एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी का इनक्यूबेट 200 माइक्रोन। एंडोटॉक्सिन एकाग्रता को एंडपॉइंट क्रोमोजेनिक एंडोटॉक्सिन परख (चरण 2.5.1−2.5.6) का उपयोग करके पानी के अर्क की मात्रा को मापें।
  5. यूवी सेल संस्कृति प्रयोगों से पहले 30 मिन के लिए अच्छी तरह से प्लेटों बंध्याकरण ।

5. 3T3 कोशिकाओं से Lysate बनाना

  1. 70% संगम के लिए कई T150 फ्लास्क में 3T3 कोशिकाओं को उगाएं। कोशिकाओं, एस्पिरेट मीडिया को अलग करने के लिए, पीबीएस के 5 mL के साथ सतह धोएं, और एस्पिरेट पीबीएस। पशु मूल मुक्त, पुनः संयोजन सेल विच्छेदन एंजाइम(सामग्री की तालिका)के 5 mL जोड़ें और 3−5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. फ्लास्क को आगे-पीछे धीरे झुकाकर कोशिकाओं को अलग करें। सेल विसोशन के लिए उपयोग किए जाने वाले पुनः संयोजन एंजाइम को बेअसर करने के लिए पीबीएस के 5 mL जोड़ें। फ्लास्क से अलग कोशिकाओं को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और पाइपटिंग के माध्यम से मिलाएं। हीमोसाइटोमीटर और सेल व्यवहार्यता डाई का उपयोग करके लाइव सेल काउंट करें।
    नोट: एक सेल विसोशन एंजाइम जिसे पीबीएस में कमजोर पड़ने के माध्यम से निष्प्रभावी किया जा सकता है, को लाइसेट तैयारी में सीरम आधारित प्रोटीन की शुरुआत से बचने के लिए चुना गया था। यदि कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्राइप्सिन का उपयोग किया जाता है, तो इसे सीरम युक्त समाधान के साथ निष्प्रभावी किया जाना चाहिए, और लाइसेट तैयारी में किए गए सीरम प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए एक अतिरिक्त पीबीएस वॉश किया जाना चाहिए।
  3. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। किसी भी शेष मीडिया को धोने के लिए पीबीएस की मूल मात्रा (यानी, 10 एमएल एक्स नंबर फ्लास्क) में सुपरनटेंट और रिस्पेंट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। दोहराएँ.
  4. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें। 1 x 106 कोशिकाओं/mL की अंतिम सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक पीबीएस की मात्रा जोड़ें । सेल समाधान को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में तब तक रखें जब तक कि नमूना पूरी तरह से जमे हुए न हो (कम से कम 2 घंटे)।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गल सेल समाधान। एक बार पूरी तरह से गल जाने के बाद, समाधान को पूरी तरह से जमे हुए होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में वापस रखें। कुल 3 फ्रीज-गल चक्र के लिए दोहराएं।
  6. प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए विभिन्न प्रकार के कमजोर (जैसे, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) पर कोशिका पर माइक्रो बिकिनोनिनिक एसिड (बीसीए) परख करें। सेल को 468.75 माइक्रोजी/एमएल, अलीकोट की प्रोटीन एकाग्रता में पतला करें और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: 48-अच्छी प्लेट में अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 125 μg/सेमी2 है (एक अच्छी तरह से सतह क्षेत्र के आधार पर, 0.75 सेमी2)।
  7. लाइसेट में डैम्पकी की उपस्थिति का आकलन करने के लिए एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन करें (उदाहरण के लिए, हीट शॉक प्रोटीन 60 [HSP60], उच्च गतिशीलता समूह बॉक्स 1 [HMGB1]) लोड करके 40−60 लाइसेट प्रोटीन की एक 1.5 मिमी मोटी 10% पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर लोड हो रहा है और मानक पश्चिमी दाग का पालन करें प्रक्रियाओं.

6. मैक्रोफेज की एनएफ-बी एक्टिविटी पर एडोरबेड प्रोटीन लेयर और टोल जैसे रिसेप्टर्स के प्रभाव का आकलन करना

नोट: प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह और प्लेट लेआउट की योजनाबद्ध तरीके से, क्रमशः चित्रा 1 और पूरक चित्रा 1को देखें।

  1. 70% संगम के लिए उचित आकार के फ्लास्क में रिपोर्टर मैक्रोफेज बढ़ाएं। एस्पिरेट मीडिया, पीबीएस के साथ सतह धोएं, और एस्पिरेट पीबीएस। 8 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रिकॉम्बिनेंट सेल डिसोजन एंजाइम और इनक्यूबेट जोड़ें।
  2. फ्लास्क के किनारों को मजबूती से टैप करके कोशिकाओं को अलग करें। विकास मीडिया (10% एफबीएस युक्त) की समान मात्रा जोड़कर पुनः संयोजन कोशिका विसोशन एंजाइम को निष्क्रिय करें। हीमोसाइटोमीटर और सेल व्यवहार्यता डाई का उपयोग करके लाइव सेल काउंट करें।
    नोट: सेल विसोशन एंजाइम में 8 मिन ऊष्मायन के बाद रिपोर्टर मैक्रोफेज के लिए अपेक्षित व्यवहार्यता 90% है।
  3. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। एस्पिरेट सुपरनेटेंट और कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस की मूल मात्रा में फिर से निलंबित करें। सेंट्रलाइज फिर से और परख मीडिया में ७.३ x १० कोशिकाओं/mL पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित (गर्मी निष्क्रिय FBS युक्त) ।
  4. 3 अलग ट्यूबों में अलग सेल निलंबन: TLR4 अवरोधक, विरोधी TLR2, और अनुपचारित। आरटी में ६० मिन के लिए 1 μg/mL TLR4 अवरोधक के साथ या आरटी में 30 मिन के लिए ५० μg/mL एंटी TLR2 के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं ।
  5. लाइसेट के 200 माइक्रोन, 10% एफबीएस, 10% वाणिज्यिक माउस प्लाज्मा(सामग्री की तालिका),या 48-अच्छी प्लेट (या समकक्ष) में प्रोटीन समाधान का मिश्रण जोड़ें और वांछित समय (यानी, 30 जिन, 60 टिन, या 24 घंटे) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एसोर्ब को प्रोटीन की अनुमति दें। कुओं से एस्पिरेट प्रोटीन समाधान, प्रत्येक प्रोटीन समाधान के लिए एक ताजा पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, और 5 मिन के लिए पीबीएस के 250 माइक्रोन के साथ सतहों को धोएं। एस्पिरेट पीबीएस। कुल 3 वॉश के लिए दोहराएं।
    नोट: इस कदम को वांछित सोखना समय के आधार पर प्रोटोकॉल में पहले शुरू करने की आवश्यकता हो सकती है। तदनुसार प्रोटोकॉल समायोजित करें।
  6. TLR4 अवरोधक या विरोधी TLR2 के साथ ऊष्मायन अवधि के बाद, पिपेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए । प्रत्येक अच्छी तरह से सेल समाधान के 200 μL जोड़ें।
  7. TLR2 सकारात्मक नियंत्रण स्थिति के लिए, १५० एनजी/mL की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Pam3CSK4 जोड़ें । TLR4 सकारात्मक नियंत्रण स्थिति के लिए, १.५ μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए लिपोपोलिससैकराइड (एलपीएस) जोड़ें । 20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. प्रत्येक कुएं से सुपरनेटेंट का नमूना 20 μL और एक 96-अच्छी प्लेट में डुप्लिकेट में प्लेट। पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में 20 μL परख मीडिया के तीन कुओं को शामिल करें। सीईपी रिपोर्टर परख के 200 μL जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्मक. प्लेट को चिपकने वाली सील से ढककर 37 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऊष्मायन समय प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर भिन्न हो सकता है, और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं के बीच अवशोषण में मजबूत अंतर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    1. सुपरनेट ेंट के शेष को 1.5 एमएल ट्यूब (प्रति अच्छी तरह से) में स्थानांतरित करें। किसी भी मलबे को गोली मारने के लिए 10 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। एक नई 1.5 mL ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) के माध्यम से भड़काऊ साइटोकिन्स (जैसे, टीएनएफ-α, इंटरल्यूकिन 6) की उपस्थिति के लिए सुपरनेटेंट का विश्लेषण करें।
  9. चिपकने वाली प्लेट सील निकालें। 635 एनएम पर एक प्लेट रीडर का उपयोग कर प्लेट का अवशोषण पढ़ें। एस्पिरेट तरल और त्यागने की थाली।

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Representative Results

बहुलक-लेपित सतहों के लिए सफाई विधियों का परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि कोटिंग में कोई व्यवधान नहीं था, जिसे पानी के संपर्क कोण में एक अनकोटेड ग्लास कवरस्लिप(चित्रा 2)में परिवर्तन के रूप में देखा जाएगा। 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में पीएमएमए-कोटेड माइक्रोस्कोप स्लाइड भिगोने के लिए पीएमएमए कोटिंग(चित्रा 2,बाएं पैनल), 80 wt% इथेनॉल13में पीएमएमए की घुलनशीलता के कारण होने की संभावना को हटाने के लिए पाया गया था, इसलिए पीएमएमए-कोटेड सतहों को अकेले यूवी नसबंदी के 30 मिन का उपयोग करके साफ किया गया था। कोटिंग के लिए पीएमएमए की एकाग्रता पहले5अनुकूलित की गई थी । पीडीएम को साफ करने के लिए 1 घंटे 70% इथेनॉल सोख का उपयोग किया गया था, और यूवी नसबंदी को उपेक्षित किया गया था क्योंकि यूवी प्रकाश श्रृंखला कैंची पैदा कर सकता है और पीडीएम14की सतह गीला गुणों को प्रभावित कर सकता है। 70% इथेनॉल सोख और यूवी नसबंदी दोनों ने एफपीटीएफई-लेपित कवरस्लिप(चित्रा 2,दाएं पैनल) के पानी संपर्क कोण को प्रभावित नहीं किया, इसलिए उत्तराधिकार में दो तरीकों का उपयोग एफपीटीएफई कोटिंग्स को साफ करने के लिए किया गया था। एफपीटीएफई कोटिंग की विधि का वर्णन पहले ग्रेनेजर समूह15द्वारा किया गया था ।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि DAMP प्रजातियों जटिल आणविक मिश्रण में मौजूद थे 3T3 lysate पर एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन किया गया था । परिणामों से पता चला है कि एचएमजीबी 1 और एचएसपी60, दो अच्छी तरह से प्रलेखित डैम्प16,17,लिस्ट(चित्रा 1बी)में मौजूद थे। बहुलक सतहों पर lysate से टीएलआर ligands के सोखने की पुष्टि रिपोर्टर मैक्रोफेज (अनुपचारित, TLR2 बेअसर, या TLR4 हिचकते हैं) प्रोटीन-adsorbed बहुलक सतहों पर 20 घंटे के लिए (यानी, ऊतक संस्कृति का इलाज पॉलीस्टीरिन [TCPS], PMMA, PDMS, FPTFE), और फिर परोक्ष रूप से एक enmatic assay का उपयोग कर SEAP उत्पादन पर आधारित NF-и/AP-1 गतिविधि का आकलन(चित्रा 1सी और आंकड़ा 3)। इसके अलावा, रिपोर्टर मैक्रोफेज ने एसोर्बेड एफबीएस या प्लाज्मा की तुलना में एडोरबेड लाइसेट पर एनएफ-डॉ. बी/एपी-1 गतिविधि में काफी वृद्धि की थी और कोई प्री-एसोर्बेड प्रोटीन (मीडिया)(चित्रा 4)नहीं था । टीएलआर लिगांड्स सिंथेटिक ट्राइसाइटेटेड लिपोपप्टाइड (पाम3सीएसके4, टीएलआर2 लिगलैंड) और लिपोपोलिसाक्काइड (एलपीएस, टीएलआर4 लिगलैंड) को एंटीबॉडी या अवरोधक की पुष्टि करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था और परख ठीक से काम कर रहे थे। टीएलआर2 बेअसर होने से टीएलआर4 अवरोध की तुलना में रिपोर्टर मैक्रोफेज की एनएफ-एएचबी/एपी-1 प्रतिक्रिया में काफी मजबूत कमी आई । साथ ही, सीरम में पतला लाइसैट की छोटी मात्रा (कुल प्रोटीन के आधार पर) ने अकेले सीरम की तुलना में एनएफ-डॉबी/एपी-1 प्रतिक्रिया में काफी वृद्धि की, बहुलक सतह पर निर्भर सबसे कम प्रभावी कमजोर पड़ने के साथ प्रेरित किया(चित्रा 5)। ये परिणाम विभिन्न प्रकार की पॉलीमेरिक सतहों पर रिपोर्टर मैक्रोफेज में टीएलआर-निर्भर एनएफ-एनएफ-एएचबी/एपी-1 गतिविधि को प्रेरित करने पर एडोरबेड लाइसेट-व्युत्पन्न अणुओं की शक्ति को प्रदर्शित करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: टीपीएस, पीएमएमए, पीडीएमएस और एफपीटीएफई पर एनएफ-ए-बी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज के क्षारीय फॉस्फेटेस परख के लिए तरीके और परिणाम । (A)रिपोर्टर मैक्रोफेज क्षारीय फॉस्फेनेस परख के लिए कार्यप्रवाह का आरेख । (ख)लोडिंग नियंत्रण के रूप में डीएमपी प्रजातियों एचएमजीबी 1 और एचएसपी60 की उपस्थिति की पुष्टि करते हुए लाइसेट का पश्चिमी दाग। (C)एनएफ-डॉबी/एपी-1 गतिविधि (मीडिया (नकारात्मक नियंत्रण), 10% एफबीएस, lysate पर सुसंस्कृत के रिपोर्टर मैक्रोफेज के (अवशोषण द्वारा प्रतिनिधित्व), 10% FBS, lysate, और Pam3CSK4 (TLR2 ligand, सकारात्मक नियंत्रण) 20 घंटे के लिए डेटा एक प्रयोग के परिणामों से पता चलता है और कम से कम 2 अलग प्रयोगों से परिणाम का प्रतिनिधि है, मतलब मानक विचलन (एसडी) के रूप में दिखाया गया है । प्रत्येक प्रयोग प्रति शर्त एन = 3 अलग कुओं का इस्तेमाल किया, और प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइमैटिक परख के लिए डुप्लिकेट में चढ़ाया गया था । एक तरह से ANOVA और Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया । पी एंड एलटी; 0.001। इस आंकड़े को मैककील और फिजपैट्रिक5की अनुमति से अनुकूलित किया गया है । कॉपीराइट 2018 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीएमएमए के लिए सफाई विधियों का अनुकूलन- और एफपीटीएफई-लेपित सतहों, पानी संपर्क कोण (WCA) का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। कम से कम 3 कवरस्लिप के 2 अलग-अलग स्पॉट पर माप लिया गया। डेटा को मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया गया है। एक तरह से ANOVA और Tukey पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया । * पी एंड एलटी; 0.05। इस आंकड़े को मैककील और फिजपैट्रिक5की अनुमति से अनुकूलित किया गया है । कॉपीराइट 2018 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: टीएलआर-मध्यस्थता एनएफ-डॉ.बी/एपी-1 गतिविधि (अवशोषण द्वारा प्रतिनिधित्व) रिपोर्टर मैक्रोफेज के 10% एफबीएस (नियंत्रण), lysate, और 20 घंटे के लिए सकारात्मक नियंत्रण पर सुसंस्कृत । (क)रिपोर्टर मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं पर टीएलआर2 बेअसर होने का प्रभाव। सकारात्मक नियंत्रण पाम (पाम3CSK4, TLR2 लिगांड) है। (ख)एडसोर्बेड लाइसेट के लिए रिपोर्टर मैक्रोफेज प्रतिक्रिया पर TLR4 अवरोध का प्रभाव । पॉजिटिव कंट्रोल एलपीएस (टीएलआर4 लिगामेंट) है। डेटा एक प्रयोग के परिणामों को दिखाता है और कम से कम 2 अलग प्रयोगों के परिणामों का प्रतिनिधि है, जो मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक प्रयोग प्रति शर्त एन = 3 अलग कुओं का इस्तेमाल किया, और प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइमैटिक परख के लिए डुप्लिकेट में चढ़ाया गया था । एक तरह से ANOVA और Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया । ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001। इस आंकड़े को मैककील और फिजपैट्रिक5की अनुमति से अनुकूलित किया गया है । कॉपीराइट 2018 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: NF-иB/एपी-1 गतिविधि (अवशोषण द्वारा प्रतिनिधित्व) रिपोर्टर मैक्रोफेज मीडिया (नकारात्मक नियंत्रण), 30 मिन और 24 h adsorbed प्रोटीन परतों पर सुसंस्कृत, और 20 घंटे के लिए TCPS पर Pam3CSK4 (सकारात्मक नियंत्रण) । डेटा को 3 अलग-अलग प्रयोगों से जोड़ा जाता है और मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया जाता है। प्रत्येक प्रयोग प्रति शर्त n = 3 अलग कुओं का इस्तेमाल किया, और प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइमैटिक परख के लिए डुप्लिकेट में चढ़ाया गया था (यानी, एन = 9 गैर स्वतंत्र सेल संस्कृति कुओं और n = 18 गैर स्वतंत्र एंजाइमेटिक परख कुओं) । एक तरह से ANOVA और Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया । पी एंड एलटी; 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: रिपोर्टर मैक्रोफेज एनएफ-डॉ.ए.बी/एपी-1 गतिविधि (अवशोषण द्वारा प्रतिनिधित्व) 20 घंटे के बाद एफबीएस में लाइसेट के कमजोर होने के जवाब में (कुल प्रोटीन = 280 μg/well) 30 मिन के लिए बहुलक सतहों के लिए विज्ञापन। (A)टीसीपीएस। (ख)पीएमएमए। (ग)पीडीएम। (D)fPTFE। डेटा एक प्रयोग के परिणामों को दिखाता है और कम से कम 2 अलग प्रयोगों के परिणामों का प्रतिनिधि है, जो मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक प्रयोग प्रति शर्त एन = 3 अलग कुओं का इस्तेमाल किया, और प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइमैटिक परख के लिए डुप्लिकेट में चढ़ाया गया था । एक तरह से ANOVA और Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया । * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001। इस आंकड़े को मैककील और फिजपैट्रिक5की अनुमति से अनुकूलित किया गया है । कॉपीराइट 2018 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: उदाहरण लेआउट NF-के लिए इस्तेमाल किया-1B/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज सेल संस्कृति 8 चैंबर और ४८-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूपों में परख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हमारी प्रयोगशाला का प्राथमिक ध्यान ठोस जैव सामग्री नरम ऊतक प्रत्यारोपण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया है, और विशेष रूप से कैसे सेलुलर प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान किए गए नुकसान मेजबान प्रतिक्रिया प्रभावों । यहां प्रस्तुत काम एक रिपोर्टर मैक्रोफेज सेल लाइन और इन विट्रो जनित DAMP युक्त सेलुलर lysate का उपयोग कर प्रारंभिक प्रयोगों का वर्णन करता है, सेलुलर क्षति के दौरान जारी अणुओं के प्रभाव की जांच करने के लिए (यानी, प्रत्यारोपण सर्जरी से) बायोमैटेरियल्स के लिए मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं पर । बायोमटेरियल प्लेसमेंट के कारण सेलुलर क्षति और डीएबीपीएस की रिहाई को मॉडल करने के लिए फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइसेट का उपयोग किया गया था। नरम ऊतकों में फाइब्रोब्लास्ट की व्यापकता के कारण लाइसेट बनाने के लिए फाइब्रोब्लास्ट को चुना गया था, साथ ही फाइब्रोनेक्टिन18सहित विभिन्न प्रकार के एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन को स्रावित करने की उनकी क्षमता थी। फ्रीज-गल साइकिलिंग को इंट्रासेलर और ईसीएम-व्युत्पन्न दोनों डैमेज का उत्पादन करने के लिए lysis की विधि के रूप में चुना गया था, जो प्रत्यारोपण वातावरण में मौजूद होगा। इस लाइसेट बनाने के लिए प्रोटीज़ अवरोधकों का उपयोग नहीं किया गया था। जबकि फ्रीज-गल साइकिलिंग की तरह अनियंत्रित कोशिका lysis प्रोटीज़ की रिहाई में परिणाम कर सकते है कि DAMPs नीचा हो सकता है, इन एंजाइमों की संभावना भी जैव सामग्री प्रत्यारोपण वातावरण में मौजूद होगा जब कोशिकाओं प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं । लाइसेट के जटिल आणविक मिश्रण में डैम्प की उपस्थिति की पुष्टि पश्चिमी दाग(चित्रा 1बी)द्वारा की गई थी ; HMGB1 और HSP60) और SEAP रिपोर्टर परख(चित्रा 1सी; एनएफ-एआईबी/एपी-1 गतिविधि के जवाब में एडसोर्बेड lysate) । हमने परखों का प्रदर्शन भी किया है जहां कुल प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर एफबीएस में लाइसेट को पतला किया गया था और सेल कल्चर सतहों पर एडोरबेड किया गया था(चित्रा 5)प्रत्यारोपण पर्यावरण की जटिलता को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए, क्योंकि इसमें रक्त प्रोटीन के साथ-साथ डैम्प6की बहुतायत होगी। रिपोर्टर मैक्रोफेज एनएफ-डॉ.

इस कार्य के लिए पॉलिमर पीएमएमए, पीडीएम और पीटीएफई को चुना गया क्योंकि वे अडिग्रेडेबल हैं और जैव सामग्री19,20,21,22,23,24,25के लिए प्रोटीन अवशोषण और मैक्रोफेज प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए साहित्य में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। टीटीसीएस का उपयोग तुलना के लिए भी किया गया था क्योंकि यह इन विट्रो मैक्रोफेज और टीएलआर सिग्नलिंग कार्य21,26,27,28के लिए उपयोग किया जाने वाला एक आम सब्सट्रेट है । हमारे काम में उपयोग की जाने वाली सामग्रियां गैर-अपमानजनक, ठोस जैव सामग्री के प्रतिनिधि उदाहरण हैं। हालांकि, इस मॉडल के साथ कई अन्य सामग्रियों का उपयोग किया जा सकता है, बशर्ते सामग्री को सेल संस्कृति प्लेटों या माइक्रोस्कोप स्लाइड पर लेपित किया जा सके और ठीक से दूषित किया जा सके। एनएफ-बी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज सेल लाइन को इस इन विट्रो मॉडल के लिए चुना गया था क्योंकि यह सीएपी की एनएफ-बी/एपी-1 इंडिकेशन के जरिए एनएफ-बी/एपी-1 एक्टिविटी के रैपिड, अप्रत्यक्ष माप-अपकोल को सक्षम बनाता है । एनएफ-एबी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज को संस्कृति मीडिया में फिलियोमाइसिन D1 के इस्तेमाल को चुनिंदा एंटीबायोटिक के रूप में इस्तेमाल करने की जरूरत होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एनएफ-डॉबी/एपी-1 इंड्यूबल सीएपी जीन के साथ केवल कोशिकाएं ही मौजूदहैं । क्षारीय फॉस्फेटेज़ परख के लिए, सीरम में मौजूद क्षारीय फॉस्फेटेस द्वारा उत्पन्न संभावित झूठे सकारात्मक परिणामों से बचने के लिए सेल संस्कृति मीडिया में एचआई-एफबीएस का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। आज तक हमारे शोध से पता चलता है कि एफबीएस-एसोर्बेड सतहों से पता चलता है कि एक पता लगाने योग्य झूठी सकारात्मक परिणाम उत्पन्न नहीं होता है, संभावना है क्योंकि सीरम अणुओं को दृढ़ता से संस्कृति की सतह पर विभाजित किया जाता है और सुपरनेटेंट में जारी नहीं किया जाता है। रिपोर्टर मैक्रोफेज (20 एच), परख ऊष्मायन टाइमपॉइंट (2.5 एच), और क्षारीय फॉस्फेटेज़ परख के लिए अवशोषण रीडिंग वेवलेंथ (635 एनएम) के लिए संस्कृति समय बिंदु को सभी स्थितियों के लिए मजबूत और प्रजनन योग्य माप सुनिश्चित करने के लिए इस प्रणाली के साथ अनुकूलित किया गया था।

प्रोटीन सोखने वाले साहित्य में सामान्य उपयोग के कारण इस कार्य के लिए 30 मिन के आरंभिक प्रोटीन सोखने का समय बिंदु चुना गया था ,(चित्र 1सी)30,31,32,33,34. हालांकि, हमने अब एडोपशन टाइम्स (यानी, 60 मिन और 24 एच, फिगर 4)का भी पता लगाया है ताकि एडोबेड प्रोटीन परत का बेहतर प्रतिनिधित्व किया जा सके जो मैक्रोफेज वीवो में बातचीत करेंगे, जो प्रत्यारोपण के बाद 4−24 घंटे होने की संभावना है1। यह पोस्ट किया गया है कि अधिकांश प्रोटीन सोखने और विनिमय सतह26,35,36के संपर्क में आने के पहले 60 चरण में होता है, इसलिए 60 मिन सोखने का समय अधिक प्रासंगिक समय बिंदु हो सकता है। हम भी वाणिज्यिक माउस प्लाज्मा के लिए एडोरबेड प्रोटीन परत में DAMPs की उपस्थिति के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में FBS का उपयोग करने से स्थानांतरित कर दिया है । सीरम के बजाय प्लाज्मा का उपयोग करने का तर्क यह है कि प्लाज्मा प्रोटीन प्रोटीन सोखने और मैक्रोफेज प्रतिक्रिया1में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है, और यह प्लाज्मा घाव वातावरण में प्रोटीन का बेहतर प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। प्रोटीन सोखने के प्रयोगों में उपयोग किया जाने वाला प्लाज्मा आमतौर पर 1−10% कमजोर पड़ने26,36,37के रूप में तैयार किया जाता है, जिसने 10% प्लाज्मा के हमारे उपयोग को प्रेरित किया। मानव प्लाज्मा आमतौर पर26,36का उपयोग किया जाता है, क्योंकि माउस प्लाज्मा की तुलना में बड़ी मात्रा में और अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक प्राप्त करना आसान होता है। हालांकि, हमने रिपोर्टर कोशिकाओं के अनुरूप प्रोटीन समाधानों की प्रजातियों को रखने के लिए इस मॉडल में वाणिज्यिक माउस प्लाज्मा का उपयोग करने का फैसला किया।

रिपोर्टर मैक्रोफेज सेल लाइन के इस्तेमाल ने अध्ययन के भीतर कुछ सीमाएं शुरू कीं । सबसे पहले, एक मूत्र ल्यूकेमिक मैक्रोफेज सेल लाइन का उपयोग करने में अंतर्निहित सीमाएं हैं, क्योंकि फेनोटाइप और व्यवहार प्राथमिक मैक्रोफेज संस्कृतियों से भिन्न हो सकते हैं। हालांकि इस सीमा को प्राथमिक मैक्रोफेज का उपयोग करके भविष्य के काम में संबोधित किया जाएगा, माता-पिता मैक्रोफेज सेल लाइन को उनके सेल सतह रिसेप्टर्स और टीएलआरएस 2, 3 और 438के लिए माइक्रोबियल लिगांड के संदर्भ में माउस बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की बारीकी से नकल करने के लिए दिखाया गया था। इसके अलावा, एनएफ-बी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज ने पेरिटोनियल प्राइमरी मैरिन मैक्रोफेज३९की तुलना में एचएमजीबी1 और एलपीएस उत्तेजना के जवाब में इसी तरह के परिणाम दिए । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एनएफ-बी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज, और उनके माता-पिता के तनाव, TLR5४०व्यक्त नहीं करते । शोधकर्ताओं ने दिखा दिया है कि HMGB1 एचईसी-293 कोशिकाओं में TLR5 सिग्नलिंग रास्तों के माध्यम से एनएफ-बी ट्रांसक्रिप्शन कारकों को सक्रिय करने में सक्षम था जो मानव TLR541से छेड़छाड़ करते थे। इसलिए, इस मॉडल में lysate-लेपित सतहों पर समग्र एनएफ-बी गतिविधि में एचएमजीबी1-टीएलआर5 सिग्नलिंग के योगदान को नजरअंदाज किया गया था। इसके अतिरिक्त, रिपोर्टर मैक्रोफेज और उनके माता-पिता तनाव एएससी एडाप्टर प्रोटीन को व्यक्त नहीं करते हैं, और नतीजतन अधिकांश प्रकार के इंफ्लेममसोम नहीं बनाते हैं और निष्क्रिय आईएल-1ए या निष्क्रिय आईएल-18 को उनके परिपक्व रूपों42तक संसाधित नहीं कर सकते हैं। इसलिए, हमने जिस मॉडल का उपयोग किया है, वह एएससी-निर्भर अदम्य गतिविधि और बाद में निरंकुश आईएल-1ए और आईएल-18 के योगदान के लिए जिम्मेदार नहीं है जो लिसैट-एसोर्डेड सतहों के लिए मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं में संकेत देता है। नतीजतन, इस परख का उद्देश्य टीएलआर-निर्भर एनएफ-बी एक्टिवेशन की प्रारंभिक परीक्षा के रूप में है, और बाद में प्राथमिक मैक्रोफेज का उपयोग करके अनुसंधान को ब्याज की सामग्री सतहों पर मैक्रोफेज सक्रियण और फेनोटाइप की अधिक पूर्ण और प्रतिनिधि समझ प्रदान करने की सिफारिश की जाती है।

क्षारीय फॉस्फेट परख अप्रत्यक्ष रूप से रिपोर्टर मैक्रोफेज की एनएफ-ए-एपी/एपी-1 गतिविधि को मापता है । हालांकि, टीएलआर के अलावा कई सिग्नलिंग रास्ते हैं जिनमें एनएफ-डॉबी/एपी-1 (जैसे, इंटरल्यूकिन-1 रिसेप्टर [आईएल-1आर]43 और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर रिसेप्टर [टीएनएफआर]44)शामिल हैं। इसलिए, अवरोध परखों(चित्रा 3)का उपयोग करके लाइसे-एसोर्बेड सतहों के लिए बढ़ी हुई एनएफ-एसोर्बेड सतहों के लिए बढ़ी हुई एनएफ-एएसबी/एपी-1 प्रतिक्रिया में टीएलआर 2 और टीएलआर4 सिग्नलिंग के योगदान का आकलन करना आवश्यक था । इन दो सतह टीएलआर के चयन का तर्क यह था कि कम से कम 23 डैम्प जिन्हें टीएलआर 2 और टीएलआर445के माध्यम से संकेत करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें अच्छी तरह से विशेषता एचएमजीबी1 शामिल है, और दोनों रिसेप्टर्स सेल की सतह पर व्यक्त किए जाते हैं और बायोमटेरियल सतह6के साथ सीधे बातचीत कर सकते हैं। टीएलआर2 और टीएलआर4 अवरोध परखों ने दिखा दिया कि जब टीएलआर2 या टीएलआर4 सिग्नलिंग को अवरुद्ध कर दिया गया था, तो रिपोर्टर मैक्रोफेज की एनएफ-एटीबी/एपी-1 प्रतिक्रिया कम हो गई थी, जो यह दर्शाती है कि दोनों रास्ते शामिल हैं । हालांकि, जब TLR2 सिग्नलिंग को निष्प्रभावी कर दिया गया था, तो एनएफ-एएचबी/एपी-1 गतिविधि में काफी बड़ी कमी आई थी, जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि टीएलआर2 रिपोर्टर मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया में एक प्राथमिक भूमिका निभा सकता है । हम समझते हैं कि एंटीबॉडी और अवरोधकों को बेअसर करने वाले टीएलआर सिग्नलिंग पाथवे के साथ कुछ ऑफ-टारगेट अवरोध हो सकते हैं। टीएलआर2 मार्ग को बाधित करने के लिए एक बेअसर एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था क्योंकि इस काम के समय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TLR2 अवरोधक अणु नहीं थे।

यहां प्रस्तुत किए गए तरीकों में डैम्प के जटिल स्रोत के रूप में लाइसेट का उपयोग किया जाता है, और एनएफ-बी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेजको टिम्प्स और अन्य प्रोटीनों को पॉलीमेरिक बायोमैटेरियल्स(चित्रा 1)के लिए मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग करते हैं । हम आशा करते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग एनएफ-बी/एपी-1 प्रतिक्रियाओं का जल्दी से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है और रिपोर्टर मैक्रोफेज के अपस्ट्रीम टीएलआर सिग्नलिंग को विभिन्न प्रकार की सामग्रियों (अपमानजनक सामग्री, छिद्रपूर्ण मचान या हाइड्रोगेल सहित) और एडोरबेड प्रोटीन परतें(चित्रा 3)के लिए। हालांकि, असुरक्षित सामग्रियों और हाइड्रोगेल का उपयोग प्रणाली के भीतर जटिलता शुरू करेगा, क्योंकि एसोर्बेड अणुओं और अप्रशिक्षित अणुओं के बीच अंतर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। हम यह भी आशा करते हैं कि इस प्रोटोकॉल को उपयुक्त अवरोधकों के साथ एनएफ-डॉबी/एपी-1 (जैसे, सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर्स46 और न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ओलिगोमराइजेशन डोमेन (एनओडी) जैसे रिसेप्टर्स47)के अन्य सिग्नलिंग पाथवे अपस्ट्रीम के योगदान की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, रिपोर्टर मैक्रोफेज की एनएफ-बी/एपी-1 प्रतिक्रिया की तुलना विभिन्न सामग्रियों के बीच की जा सकती है, बशर्ते प्रतिक्रियाओं को बेसलाइन सेल गतिविधि (यानी, मीडिया में कोशिकाओं को बिना किसी पूर्व-एसोर्बेड प्रोटीन के साथ प्रत्येक सतह पर सामान्यीकृत किया जाए) और सभी सामग्रियों में अज्ञेय एंडोटॉक्सिन का स्तर होता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजना के कनाडा के संस्थानों (PTJ १६२२५१), रानी विश्वविद्यालय सीनेट सलाहकार अनुसंधान समिति और नवाचार जॉन इवान नेतृत्व कोष (परियोजना ३४१३७) और अनुसंधान और नवाचार ओंटारियो अनुसंधान कोष (परियोजना ३४१३७) के लिए कनाडा फाउंडेशन से बुनियादी सुविधाओं का समर्थन से परिचालन धन स्वीकार करते हैं । ला.ए.एम. को क्वीन यूनिवर्सिटी आर सैमुअल मैकलॉफलिन फेलोशिप, कनाडा कनाडा के ग्रेजुएट स्कॉलरशिप मास्टर अवार्ड और ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप की नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ने सपोर्ट किया था । लेखक एनएफ-ए-बी/एपी-1 रिपोर्टर मैक्रोफेज सेल लाइन और डीआरएस माइकल ब्लेनेर्हैसेट और सैंड्रा लूरेनसेन के उदार उपहार के लिए डॉ मायरॉन Szewczuk को उनके जेल इमेजिंग सिस्टम और प्लेट रीडर के इस्तेमाल के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2) Biolegend 121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor) Invivogen TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin InnovativeResearch IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma Aldrich D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Fisher Scientific 14190250 No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade Wisent 98150
LPS-EK Invivogen TLRL-EKLPS Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts ATCC CRL-1658
Pam3CSK4 Invivogen tlrl-pms Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P4333-100ML
Plasmocin Invivogen ANT-MPP Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells Invivogen raw-sp NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
TrypLE express enzyme (1X) Fisher Scientific 12604021 animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin Invivogen ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6 Biolegend B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α Biolegend B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE) Associates of Cape Cope Inc. E0005-5 Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL Associates of Cape Cope Inc. WP1001 Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay Fisher Scientific PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit Associates of Cape Cope Inc. C1500-5 Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium Invivogen rep-qb2 Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous Sigma Aldrich 288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous Commercial Alcohols P006EAAN Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps Fisher Scientific 16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent Sigma Aldrich F9755-100ML Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free) Fisher Scientific SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Sigma Aldrich 182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit Fisher Scientific 50822180
Teflon-AF (fPTFE) Sigma Aldrich 469610-1G Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals Fisher Scientific AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps Fisher Scientific 03-337-4
Clear PS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-52
Clear TCPS 96-well plate Fisher Scientific 08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate Fisher Scientific 08-772-1C
Cover glasses, circles Fisher Scientific 12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25 Fisher Scientific 10-126-10
sticky-Slide 8 Well Ibidi 80828
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150 Fisher Scientific 08-772-48

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