Induktion af Eryptose i røde blodlegemer ved hjælp af en calcium Ionophore

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En protokol til induktion af eryptose, programmeret celledød i erythrocytter, ved hjælp af calcium ionophore, ionomycin, er tilvejebragt. Vellykket eryptose evalueres ved at monitorere lokaliseringen phosphatidylserin i membranen ydre folder. Faktorer, der påvirker protokollens succes, er blevet undersøgt, og de optimale betingelser er opfyldt.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eryptose, erythrocyt programmeret celledød, forekommer i en række hæmatologiske sygdomme og under skade på erythrocytter. Et kendetegn for eryptotiske celler er tabet af kompositoriske asymmetri af cellemembranen, hvilket fører til translokation af phosphatidylserin til membranens ydre folder. Denne proces udløses af øget intracellulær koncentration af ca2 +, som aktiverer scramblase, et enzym, der letter tovejs bevægelse af phospholipider mellem membran foldere. I betragtning af eryptose betydning i forskellige sygdomstilstande, har der været bestræbelser på at inducere eryptose in vitro. Sådanne bestræbelser har generelt påberåbt sig calcium ionophore, ionomycin, at øge intracellulær ca2 + koncentration og inducere eryptose. Men, mange uoverensstemmelser er blevet rapporteret i litteraturen om proceduren for inducerende eryptosis ved hjælp af ionomycin. Heri rapporterer vi en trin-for-trin-protokol for ionomycin-induceret eryptose i humane erythrocytter. Vi fokuserer på vigtige trin i proceduren, herunder ionophor koncentration, inkubationstid, og glukose udtømning, og give repræsentative resultat. Denne protokol kan anvendes til reproducerbart at inducere eryptose i laboratoriet.

Introduction

Programmeret celledød i erythrocytter, også kendt som eryptose, er almindeligt i mange kliniske tilstande og hæmatologiske lidelser. Eryptose er forbundet med celle svind og tabet af phospholipid asymmetri i cellen plasma membran1,2. Tab af asymmetri resulterer i translokation af Phosphatidylserin (PS), en lipid normalt lokaliseret i den indre folder3,4, til cellen ydre folder, som signalerer til makrofager til fagocytose og fjerne defekte erythrocytter5,6,7,8. Ved afslutningen af den normale levetid af erythrocytter, fjernelse af eryptotiske celler ved makrofager sikrer balancen i erytrocytter i omløb. Men, i syge sygdomme, såsom seglcellesygdom og thalassæmi9,10,11, øget eryptose kan resultere i svær anæmi2. På grund af sin betydning for hæmatologiske sygdomme, er der betydelig interesse i at undersøge de faktorer, inducerende eller hæmme eryptose og de molekylære mekanismer underliggende denne proces.

Plasma membranen af sunde erythrocytter er asymmetrisk, med forskellige fosfolipider lokaliserer på de ydre og indre foldere. Membran asymmetri er primært reguleret af virkningen af membran enzymer. Aminophospholipid translocase letter transport af aminophospholipids, PS og phosphatidylethanolamin (PE), ved at dirigere disse lipiderne til cellens indre folder. På den anden side, floppase transporterer cholin indeholdende fosfolipider, phosphatidylcholin (PC) og sphingomyelin (SM), fra den indre til den ydre folder af cellemembranen12. Men, i modsætning til raske celler, membranen af eryptotiske erythrocytter er forvrænget. Dette skyldes virkningen af et tredje enzym, scramblase, der forstyrrer fosfolipid asymmetri ved at lette tovejs transport af aminophospholipider13,14,15,16. Scramblase aktiveres ved forhøjede intracellulære niveauer på ca2 +. Derfor er calcium ionophorer, som letter transporten af ca2 + på tværs af cellemembranen12, effektive induktorer af eryptose.

Ionomycin, en calcium ionophore, har været almindeligt anvendt til at inducere eryptose i erytrocytter12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin har både hydrofile og hydrofobe grupper, som er nødvendige for at binde og fange ca2 + ion, og transportere det til cytosolisk rummet27,28,29. Dette fører til aktivering af scramblase og translokation af PS til den ydre folder, som let kan påvises ved hjælp af bilagin-V, et cellulært protein med en høj affinitet til PS12. Selv om det er almindeligt rapporteret, at ionomycin udløser eryptose, er der en betydelig metode uoverensstemmelse i litteraturen (tabel 1). Populationen af erythrocytter gennemgår eryptose afhænger af forskellige faktorer såsom ionophor koncentration, behandlingstid med ionophor, og sukkerindholdet i ekstracellulære miljø (glucosenedbrydning aktiverer kation kanaler og letter indtastning af ca2 + ind i cytosolisk rummet)30,31. Men, der er lidt konsistens i disse faktorer i litteraturen, gør det vanskeligt at udføre eryptosis reproducerbart in vitro.

I denne protokol præsenterer vi en trin-for-trin procedure for at inducere eryptose i humane erythrocytter. Faktorer, der påvirker vellykket eryptose, herunder ca2 + koncentration, ionophor koncentration, behandlingstid, og præ-inkubation i glukose-depleteret buffer er undersøgt og optimale værdier rapporteres. Denne procedure viser, at præ-inkubation af erytrocytter i en glucosefri buffer øger procentdelen af eryptose i forhold til glucoseholdige buffer. Denne protokol kan anvendes i laboratoriet til at producere eryptotiske erythrocytter til forskellige anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle humane blodprøver, der anvendes i den nedenfor beskrevne protokol, blev købt som de identificerede prøver. Ingen forsøgspersoner var direkte involveret eller rekrutteret til denne undersøgelse. Retningslinjerne i Helsingfors-erklæringen bør anvendes, når forskningen involverer mennesker.

1. erythrocyt isolation fra fuldblod

  1. Der tilsættes 500 μL fuldblod i syre citrat dextrose (ACD) (opbevares ved 4 °C) til et mikrocentrifuge glas.
    Bemærk: fuldblod blev købt i ACD. Ifølge virksomheden tilsættes 1,5 mL ACD til 7 mL fuldblod (8,5 mL total volumen).
  2. Hele blodet centrifugeres ved 700 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT), og den klare plasma og den tynde Buffy-frakke fjernes ved hjælp af en pipette for at forlade det røde erytrocyt-lag.
  3. Forbered 1 L af ringetone opløsning, der indeholder 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mm Hepes, 5 mm glucose og 1 mm CaCl2. PH-værdien justeres til 7,4 ved at tilsætte 2 μL dråber 1,0 M NaOH. For at tilberede glucosefri ringe opløsning skal du følge den samme protokol, men Medtag ikke glukose i opløsningen.
  4. Du vasker erythrocytter 2x i ringer opløsning ved at suspendere celle pellet i 1,5 mL ring opløsning, centrifuger ved 700 x g i 5 min ved rt, og fjerne supernatanten.
  5. Lav en 0,4% hæmatokrit ved at resuspendere 40 μL erythrocyt pellet i 9.960 μL glucosefri ringe opløsning for at nå et endeligt volumen på 10 mL.
    Bemærk: Hematocrit er et begreb, der anvendes til at henvise til volumenfraktion af erythrocytter i suspension. En 0,4% hæmatokrit er en suspension indeholdende 0,4% erythrocytter.
  6. Cellesuspensionen inkubates ved 37 °C i 7 dage.

2. behandling af erythrocytter med ionomycin og måling af hæmolyse

  1. 1 mg ionomycin-calciumsalt opløses i 630 μL dimethylsulfoxid (DMSO) for at nå en endelig koncentration på 2 mM. Opbevares ved-20 °C.
  2. Tag 1 mL af 0,4% hæmatokrit fra trin 1,5 og tilsæt 0,5 μL 2 mM ionomycin for at nå en endelig koncentration på 1 μM. Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
    1. Brug 1 mL hæmatokrit uden ionomycin-behandling som negativ kontrol.
  3. Centrifuger ionomycin-behandlede og ubehandlede hematocrits ved 700 x g i 5 minutter ved rt, og fjern deres supernatanter for at forlade celle pillerne i bunden af rørene.
  4. Vask cellerne 3x med ringe opløsning ved at suspendere celle pillerne i 1,5 mL ringetoploesning, centrifugering ved 700 x g i 5 min ved RT og kassere Supernatanterne.
  5. For at måle hæmolyse tilsættes 1 mL ubehandlet 0,4% hæmatokrit fra trin 1,5 til et mikrocentrifuge glas og Inkuber i 2 timer ved 37 °C som den negative kontrol for hæmolyse (0%).
  6. Der tilsættes 1 mL ubehandlet 0,4% hæmatokrit fra trin 1,5 til et mikrocentrifuge glas, og der centrifugeres ved 700 x g i 5 minutter ved rt. Fjern supernatanten, og tilsæt 1 ml destilleret vand til celle pellet og Inkuber i 2 timer ved 37 °c som den positive kontrol for hæmolyse (100%).
  7. Der tilsættes 1 mL ionomycin-behandlet 0,4% hæmatokrit fra trin 2,2 til et mikrocentrifuge glas.
  8. De ubehandlede celler, de behandlede celler og cellerne i destilleret vand centrifugeres ved 700 x g i 5 minutter ved rt.
  9. Tag 200 μL af Supernatanterne og tilsæt til en 96-brønd plade.
  10. Absorbansen måles ved 541 nm ved hjælp af en mikropladen læser.
  11. Beregn Hæmolysen ved hjælp af ligning 132:

    % Hæmolyse = (AT -a0)/(a100 -a0) * 100

    hvor en0 er absorbansen af erythrocytter i ringer opløsning, en100 er absorbans af erythrocytter i vand, og enT er absorbansen af behandlede erythrocytter af ionomycin.

3. bilagin-V bindende analyse

  1. 2 mL af 5x bilagin V-bindings buffer fortyndes i 8 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at opnå 1x bindings buffer.
  2. De ionomycin-behandlede og ubehandlede celle pellets opslæmmes fra trin 2,4 i 1 mL 1x bindings buffer.
  3. Tag 235 μL af celle suspensionerne i bindings bufferen, og tilsæt 15 μL bilagI V-Alexa-mel 488 konjugat.
  4. Inkuber cellerne ved RT i 20 minutter på et mørkt sted. Centrifugeres ved 700 x g i 5 minutter ved rt, og supernatanten fjernes.
  5. Vask cellerne 2x med 1x bindings buffer, ved at suspendere celle pellet i 1,5 mL af bindings bufferen, centrifuger ved 700 x g i 5 minutter ved RT og fjerner supernatanten.
  6. Resuspendér celle pellets i 250 μL 1x bindings buffer til målinger af strømnings cytometri.

4. strømnings cytometri

  1. Overfør 200 μL af annekset i V-farvede erythrocytter til 1 mL runde bund polystyren-rør, som er kompatible med flowcytometri.
  2. Log ind på flow flowcytometri-softwaren, og klik på knappen nyt eksperiment . Klik på den nye rørknap . Vælg det globale ark , og vælg Anvend analyse for at måle fluorescens intensiteten med en excitation bølgelængde på 488 nm og en emissions bølgelængde på 530 nm.
  3. Angiv antallet af celler til 20.000, der skal indsamles til analyse af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS).
  4. Vælg den ønskede tube og klik på Load -knappen. Klik på Optag knappen for Forward scatter og side scatter målinger. Gentag for alle prøver.
  5. Højreklik på objekt knappen og klik på Anvend batch analyse for at generere resultatfilen.
  6. Højreklik på objekt knappen og klik på Generer FSC-filer.
  7. Tilføj flowcytometry-data (FSC-filer) på arbejdspladsen for flow flowcytometri-softwaren.
  8. Analysér kontroldataene ved at vælge den cellepopulation, som interesserer sig, og tilføje statistik for eryptosis-værdien.
    1. Dobbeltklik på kontrol, og vælg histogram versus fluorescens intensitet.
    2. Klik på Gate-knappen for at tegne en port på histogrammet, som angiver procentdelen af eryptose.
  9. Anvend de samme statistikker for alle andre eksperimentelle rør for at opnå eryptosis-værdierne. Højreklik på kontrol , og vælg Kopiér analyse til gruppe.
  10. Efter korrekt gating alle prøver, overføre de analyserede data ved at trække og slippe dem i layout editor.
    1. Overlejre de analyserede data med kontrol i layout editor.
    2. Indstil de ønskede histogrammer og intensiteter ved at ændre x-og y-aksen for de overlagte grafer.
    3. Eksporter billedfiler ved at klikke på Eksporter knappen og gemme graferne i den ønskede placering.

5. Konfokal mikroskopi

  1. Overfør 5 μL bilagin-V-farvede celler på et mikroskopdias og dæk det med en følgeseddel. Hold på et mørkt sted for at forhindre foto blegning.
  2. Brug argon laser af confokale fluorescens mikroskop til at observere cellerne spændt på 488 nm med ønskede forstørrelser.
    Bemærk: et Konfokal mikroskop er ikke nødvendigvis nødvendigt, og ethvert mikroskop med fluorescens egenskaber kan bruges til at opnå fluorescensbilleder, der demonstrerer annekin-V-binding.
  3. Få fluorescensbilleder af kontrolelementet (ikke-behandlede celler) og de behandlede celler.
    Bemærk: ikke-behandlede celler forventes at vise meget svage fluorescens signaler, hvorimod de behandlede celler forventes at vise lysegrøn fluorescens på deres membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optimering af ionomycin-koncentrationen

Mens ionomycin er nødvendig for at inducere eryptose, kan forhøjede ionomycin koncentrationer føre til hæmolyse (dvs. lyse af erythrocytter og frigivelse af hæmoglobin), som skal undgås. Behandling af erytrocytter med 1 μM ionomycin i ringer løsning for 2 h er nok til at inducere eryptose, som det fremgår af vellykket mærkning med annexin-V Alexa mel 488 konjugat og kvantificering ved FACS analyse (figur 1A). Højere koncentrationer af ionomycin (5 og 10 μM) resulterer i en let øgning af eryptose (figur 1a-D). Men, sådanne koncentrationer også forbedre hæmolyse (figur 1E), som ikke ønskes. For at holde under 5% hæmolyse, 1 μM ionomycin bør anvendes.

Behandlingstiden med ionomycin

Inkubation af erytrocytter med ionomycin i ringe opløsning til så lidt som 30 min er nok til at inducere eryptose (figur 2A). Øget inkubationstid øger niveauet af eryptose, målt ved bilagI V-binding assay, for op til 2 h (figur 2B, C). Yderligere inkubationstid resulterer dog i et svagt fald i niveauet af eryptose (figur 2D). Den maksimale eryptose blev opnået efter 2 timer behandling med 1 μM ionomycin, og for alle andre behandlingstider blev lavere eryptose opnået (figur 2E). Repræsentative flow cytometri histogrammer er præsenteret i figur 2A-D. Desuden er den gennemsnitlige procentvise eryptose og hæmolyse, for forskellige behandlingstider med 1 μM ionomycin, præsenteret i henholdsvis figur 2E og figur 2F. Den højere værdi af hæmolyse efter 180 min forklarer reduktionen i eryptose efter den samme mængde inkubation (figur 2E) som mindre levedygtige celler findes på 180 min behandling med ionomycin.

Desuden blev cellerne behandlet med lave koncentrationer af ionomycin, herunder 0, 0,25, 0,5 og 1 μM i længere behandlingstider, herunder 6 og 12 timer, og eryptose blev målt (figur 3). Celler behandlet med ionomycin-koncentrationer på under 1 μM i 6 og 12 timer viser lavere eryptose sammenlignet med de celler, der blev behandlet med 1 μM ionomycin (figur 3). Da reduktion af koncentrationen og forøgelse af eksponeringstid ikke forbedrer eryptose, blev 1 μM anvendt til at udløse eryptose.

Eryptose er afhængig af inkubationstid og ekstracellulær glucosekoncentration

Ekstracellulær glucosekoncentration påvirker udfaldet af processen. Højere eryptose værdier observeres, når erytrocytter er præ-inkuberet i glucosefri ringer opløsning sammenlignet med glucoseholdige ringer opløsning før inkubation med 1 μM ionomycin for 2 h. De højeste eryptosis-værdier opnås efter 7 dages præ-inkubation i begge opløsninger. Eryptose er imidlertid højere efter præinkubation i glucosefri ringe opløsning sammenlignet med normal ringe opløsning, som indeholder 5 mM glucose (Se figur 4A for repræsentative observationsområder og figur 4B for sammenligning af globale midler). Desuden indikerer Forward scatter histogrammer virkningen af glucosedepletering på erythrocyt svind (figur 5A-D). Forward scatter er et mål for Cellestørrelse baseret på lysrefraktion, og niveauet af lys spredt er direkte proportional med størrelsen af cellerne33. Cellerne inkuberet i glucosefri ringe opløsning viser mindre fremadgående scatter sammenlignet med cellerne inkuberet i glucoseholdige buffer (figur 5E), hvilket indikerer celle svind i det glukose frie miljø.

Ud over målinger af strømnings cytometri blev der observeret celler under et Konfokal fluorescens mikroskop for at bekræfte eryptose. Erytrocytter uden behandling (figur 6A) og med ionomycin-behandling (figur 6B) blev mærket med bilagin-V Alexa-mel 488 konjugat og observeret under mikroskop. De behandlede celler viste et klart fluorescens signal (figur 6B) på grund af bindingen af bilagin-V til PS i den ydre indlægsseddel. I modsætning hertil viste celler uden behandling et meget svagt fluorescens signal (figur 6a), der indikerer meget lav eryptose. Yderligere eksempel billeder af eryptotiske erythrocytter mærket med bilagin-V med høj fluorescens signal er vist i figur 6C.

Figure 1
Figur 1: repræsentative grafer over virkningen af forskellige ionomycin-koncentrationer på eryptose og hæmolyse. Flow cytometri histogrammer af erytrocytter behandlet med (A) 1 μm, (B) 5 μm, og (C) 10 μM ionomycin (grå) ved 37 °c ved 0,4% hæmatokrit i ringer opløsning for 2 h. sort linje indikerer ikke-behandlede celler. Procentdel af eryptose er angivet i hver figur. Fosfatidylserin eksponering blev målt ved hjælp af bilagin-V binding. D) aritmetiske midler ± SD (n = 3) af procentdelen eryptose af celler behandlet med forskellige koncentrationer af ionomycin efter 2 h behandling, og (E) ARITMETISKE midler ± SD (n = 3) hæmolyse af erythrocytter af forskellige koncentrationer af ionomycin under samme betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative tal for virkningen af forskellige ionomycin-behandlingstider på eryptose. Flow cytometri histogrammer af erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin (grå) ved 37 °C for (A) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min, og (D) 180 min ved 0,4% hæmatokrit i ringer opløsning. Sort linje indikerer ikke-behandlede celler. Procentdel af eryptose er angivet i hver figur. Fosfatidylserin-eksponeringen blev målt gennem bilagin-V-binding. E) aritmetiske midler ± SD (n = 3) procentvise eryptose af celler behandlet med 1 μM ionomycin til forskellige tidspunkter. Den højeste eryptose blev opnået efter 120 minutters behandling. F) aritmetiske midler ± SD (n = 3) procent hæmolyse af celler behandlet med 1 μM ionomycin til forskellige tidspunkter. Til statistisk analyse blev der udført en-vejs ikke-parametrisk ANOVA med Kruved-Wallis-testen, og eryptose efter 120 min behandling var signifikant højere end kontrol som angivet i panel E. * er for p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: virkningen af forskellige ionomycin-koncentrationer og behandlingstider på eryptose. Aritmetiske midler ± SD (n = 3) af procentdelen eryptose af celler, der er behandlet med forskellige koncentrationer af ionomycin, vises efter forskellige behandlingstider. Cellerne blev behandlet med lave koncentrationer af ionomycin, herunder 0, 0,25, 0,5 og 1 μM for længere eksponering (6 timer og 12 timer). Højere koncentrationer og længere behandlinger resulterede i højere eryptosis-værdier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: effekt af energi udtømning på eryptose. (A) flow flowcytometri histogram for erythrocytter behandlet med 1 μM ionomycin (grå) ved 37 °c i 2 h ved 0,4% hæmatokrit, efter præ-inkubation i glucosefri ringer opløsning (top tal) og ringer løsning (nederste tal) fra 1 til 7 dage, afslører, at energi udtømning letter eryptosis. Sort linje indikerer ikke-behandlede celler. Procentdelen af eryptose er angivet i graferne for hver dag. B) aritmetisk betyder ± SD (n = 3) af procentdelen eryptose af erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin ved 37 °c i 2 timer ved 0,4% hæmatokrit, efter præ-inkubation i ringetone opløsning (sorte stænger) og Glucosefri ringe opløsning (hvide stænger) fra 1 til 7 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: effekt af energi udtømning på Cellestørrelse. Forward scatter histogram for erythrocytter behandlet med 1 μM ionomycin ved 37 °C for 2 h ved 0,4% hæmatokrit, efter præ-inkubation i glucosefri ringe opløsning (grå) og ringer opløsning (sort linje) for (A) 1 dag, (B) 3 dage, (C) 5 dage, og (D) 7 dage. Det fremad spredte histogram over tid indikerer erythrocyt svind i glucosefri buffer. E) aritmetiske midler ± SD (n = 3) af Forward scatter intensiteter af erytrocytter behandlet med 1 μM ionomycin ved 37 °c i 2 timer ved 0,4% hæmatokrit, efter præ-inkubation i ringer opløsning (sorte stænger) og Glucosefri ringer opløsning (hvide stænger) fra 1 til 7 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Konfokal Fluorescens mikroskopi billeder af erytrocytter behandlet med (A) 0 μM, (B) og (C) 1 μM ionomycin ved 37 °c i 2 timer ved 0,4% hæmatokrit. 40x objektivforstørrelse blev brugt til billeder i paneler A og B, og 100x objektivforstørrelse blev brugt til at tage billeder til panel C. PS i sunde erythrocytter er placeret på den indvendige folder af cellemembranen, derfor er der ingen fluorescens signal i panel A. I paneler B og C erythrocytter er blevet induceret for eryptosis og der er en lys fluorescens signal som følge af bindingen af bilagin-V til PS translokeres til den ydre folder af cellemembranen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Celletæthed/hematocrit Koncentrationen af ionomycin Buffer Præ-inkubation Behandlingstiden med ionomycin Detekterings metode Reference
1,65 x 108 celler/ml 0,3 mM Buffer A * 36 h i buffer A 1 h Bilagin V 12
0,40% 1 mM Ringe opløsning 48 h i ringetone 1 h Bilagin V 17
50% 10 mM Buffer B * * - 3 h Merocyanin 540 18
0,40% 1 mM Ringe opløsning 48 h i ringetone 1 h Bilagin V 19
0,40% 1 mM Ringe opløsning 48 h i ringetone 1 h Bilagin V 20
2 1 mM Ringe opløsning - 4 h Bilagin V 21
0,40% 1 mM Ringe opløsning - 0,5 h Bilagin V 22
10 1 mM Ringe opløsning - 3 h Bilagin V 23
0,40% 10 mM Ringe opløsning - 0,5 h Bilagin V 24
0,40% 1 mM Ringe opløsning 48 h i ringetone 0,5 h Bilagin V 25
2 x 106 celler/ml 1 mM HEPES-bufferet saltvand (HBS) - 0,5 h Bilagin V 26
* Buffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2· 6h2o, 10 mM glucose og 1,8 mm CaCl2· 2H2o
* * Buffer B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl og 10 mM glucose

Tabel 1: forskellige protokoller, der anvendes i litteraturen til at inducere eryptose ved hjælp af ionomycin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne procedure er at tilvejebringe optimale værdier for ionophor koncentration, behandlingstid og ekstracellulær glukose koncentration, som er vigtige faktorer for at sikre vellykket induktion af eryptose. Et kritisk skridt i protokollen er nedbrydningen af ekstracellulær glucose, som trods sin betydning ikke er blevet tilstrækkeligt understreget i litteraturen. Sukkerindholdet i normal ringe opløsning (5 mM) har en hæmmende virkning på eryptose. Glucosedepletering i det ekstracellulære miljø inducerer cellulær stress og aktiverer proteinkinase C (PKC), hvilket resulterer i aktivering af calcium-og kaliumkanaler. Dette resulterer i en stigning i indtastning af ca2 + i cytosolisk rummet30,31,34 og i sidste ende aktiverer scramblase16, hvilket øger eryptose. Aktivering af kalium kanal resulterer også i kaliumchlorid lækage ud af cellen, hvilket fører til erythrocyt krympning35.

Proceduren skitseret ovenfor skal udføres med særlig vægt på hæmolyse. Det er vigtigt at bruge en optimeret ionophor koncentration, som er høj nok til at inducere eryptose, og lav nok til at forhindre hæmolyse. På samme måde resulterer inkubation af erythrocytter med ionomycin i en kort periode i lav eryptose, mens meget lang inkube ring kan føre til celle membran forstyrrelse og hæmolyse. Det skal også bemærkes, at mens den præsenterede protokol er meget pålidelig, når de udføres på samme erythrocyt prøve, celler fra forskellige individer reagerer forskelligt på ionomycin og der kan være Inter-subject variabilitet mellem forskellige prøver.

Der bør lægges særlig vægt på dataanalyse fra strømnings cytometri. Den procentdel af eryptose, som opnås fra strømnings flowcytometer, angiver procentdelen af celle populationen med PS på den ydre indlægsseddel. Der kan dog ikke skelnes mellem celler med forskellige intensiteter af bilagin-V-binding på grundlag af dette tal. Annekin-V binder sig til PS eksponeret på cellens overflade, med en meget høj affinitet og høj specificitet til PS36,37,38. Men som vist i mikroskopi billeder i denne rapport, forskellige celler viser forskelle i bilagin-V bindende intensitet. Cellerne med lav PS på deres membraner har lave fluorescens intensiteter, hvorimod højere PS belægning på cellemembranen resulterer i højere fluorescens intensiteter.

Den protokol, der præsenteres i dette dokument, kan ændres ved at øge den ekstracellulære ca2 + koncentration. I denne protokol blev ionomycin anvendt til at inducere eryptose i nærværelse af 1 mM CaCl2; højere ca2 + koncentrationer kan føre til forbedrede intracellulære calcium niveauer og kan inducere mere eryptose. Desuden, forskellige calcium ionophorer, såsom selectophore og calcimycin, kan have forskellige evne til at forbedre den intracellulære koncentration af ca2 +, sammenlignet med ionomycin, og kan resultere i forskellige eryptosis værdier. Men, konsekvent eryptose af erythrocytter kan opnås ved hjælp af ionomycin med den skitserede protokol og kan anvendes i laboratoriet til at undersøge de molekylære mekanismer af eryptose, efterligne syge betingelser39,40in vitro, og skærm potentielle Therapeutics, der hæmmer eryptose, blandt andre applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant R15ES030140 og NSF Grant CBET1903568. Økonomisk støtte fra Russ College of Engineering and Technology og Department of Chemical og Biomolecular Engineering på Ohio University er også anerkendt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8, (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39, (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323, (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405, (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22, (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27, (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87, (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39, (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19, (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112, (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146, (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39, (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468, (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43, (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902, (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6, (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4, (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6, (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38, (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98, (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38, (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46, (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22, (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277, (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253, (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290, (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257, (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6, (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157, (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018, (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264, (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265, (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329, (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40, (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10, (4), 403-414 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics