Kalsiyum İyonofor Kullanarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eritotoz İndüksiyonu

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Eritrositlerde eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, kalsiyum iyonofor, iyonomisin kullanılarak programlanmış hücre ölümü için bir protokol sağlanır. Başarılı eritoz membran dış broşüründe lokalizasyon fosfatidilseriniz izleyerek değerlendirilir. Protokolün başarısını etkileyen faktörler incelenmiş ve en uygun koşullar sağlanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eritrosit programlı hücre ölümü olan eritoz, bir dizi hematolojik hastalıkta ve eritrositlerin yaralanması sırasında ortaya çıkar. Eritoretik hücrelerin ayırt edici özelliği hücre zarının bileşimsel asimetri kaybıdır, membran dış broşürfosfatidilserine translokasyon yol. Bu süreç Ca2 artanhücre içi konsantrasyonu tarafından tetiklenir + hangi scramblase aktive, membran broşürler arasında fosfolipidlerin çift yönlü hareketini kolaylaştıran bir enzim. Çeşitli hastalıklı koşullarda eritozun önemi göz önüne alındığında, in vitroeritoz unneden çalışmalar yapılmıştır. Bu tür çabalar genellikle kalsiyum iyonofor dayanıyordu, ionomisin, hücre içi Cageliştirmek için 2 + konsantrasyonu ve eritotsis indüklemek. Ancak literatürde iyonomisin kullanılarak eritotoz unneden işlem le ilgili birçok tutarsızlık bildirilmiştir. Burada, insan eritrositlerinde iyonomisin kaynaklı eritoz için adım adım protokol bildiriyoruz. İonofor konsantrasyonu, kuluçka süresi ve glikoz tükenmesi gibi prosedürdeki önemli adımlara odaklanır ve temsili sonuç sağlarız. Bu protokol laboratuvarda tekrartekrar eritotis indüklemek için kullanılabilir.

Introduction

Eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, eritoz olarak da bilinir, birçok klinik durum ve hematolojik bozukluklarda yaygındır. Eritoz hücre büzülmesi ve hücre plazma zarında fosfolipid asimetri kaybı ile ilişkilidir1,2. Asimetri kaybı fosfatidilserin translokasyonu sonuçları (PS), normalde iç broşür lokalize bir lipid3,4, hücre dış broşür, hangi fagositoz makrofajlar sinyalleri ve kusurlu eritrositkaldırmak5,6,7,8. Eritrositlerin normal ömrü sonunda eritofotik hücrelerin makrofajlar tarafından uzaklaştırılması dolaşımdaki eritrositlerin dengesini sağlar. Ancak, hastalıklı koşullarda, orak hücre hastalığı ve talasemi gibi9,10,11, gelişmiş eriptoz ciddi anemi neden olabilir2. Hematolojik hastalıklardaki önemi nden dolayı, eritpoza neden olan veya inhibe eden faktörlerin ve bu sürecin altında yatan moleküler mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilgi vardır.

Sağlıklı eritrositlerin plazma membranı asimetriktir ve dış ve iç broşürlerde farklı fosfolipidler lokalize dir. Membran asimetrisi öncelikle membran enzimlerinin etkisi ile düzenlenir. Aminofosfolipid translocase aminofosfolipidlerin taşınmasını kolaylaştırır, PS ve fosfatidylethanolamine (PE), hücre iç broşür bu lipidler yönlendirerek. Öte yandan, floppase fosfolipidler içeren kolin taşır, fosfatidilkolin (PC) ve sfingomyelin (SM), hücre zarının iç gelen12. Ancak, sağlıklı hücrelerin aksine, eritrositler membran karıştırılır. Bu aminofosfolipidlerin çift yönlü taşıma kolaylaştırarak fosfolipid asimetri sayarıya üçüncü bir enzim, scramblaz, eylem kaynaklanmaktadır13,14,15,16. Scramblase Ca2 +yüksek hücre içi seviyeleri ile aktive edilir. Bu nedenle, kalsiyum iyonoforlar, hangi hücre zarı arasında Ca2 + taşımakolaylaştırmak12,eritrosit etkili indükleyiciler vardır.

Bir kalsiyum ionofor, ionomisin, yaygın eritrositlerde eritrosit12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26eritrosoz neden olmak için kullanılmıştır . İonomisin bağlamak ve Ca2 + iyon yakalamak için gerekli olan hidrofilik ve hidrofobik gruplar vardır, ve sitosolik alana taşıma27,28,29. Bu, PS'nin dış broşüre bağlanması ve scramblazın aktivasyonuna yol açar, bu da PS12'yeyüksek bir yakınlığı olan hücresel protein olan annexin-V kullanılarak kolayca tespit edilebilir. İyomit ile eritotazın tetiklediği yaygın olarak rapor edilse de literatürde önemli yöntem tutarsızlığı bulunmaktadır(Tablo 1). Eritotsitlerin popülasyonu iyonofor konsantrasyonu, iyonofor ile tedavi süresi ve hücre dışı ortamın şeker içeriği (glikoz tükenmesi katyon kanallarını aktive eder ve Ca2+'nın sitosolik alana girişini kolaylaştırır)30,31gibi farklı faktörlere bağlıdır. Ancak literatürde bu faktörlerde çok az tutarlılık vardır, bu da eritotozun tekrartekrar in vitroolarak gerçekleştirilmesi zorhale getirmektedir.

Bu protokolde, insan eritrositlerinde eritoza neden olmak için adım adım bir prosedür sayılacağız. Glukoz tükenmiş tamponda Ca2+ konsantrasyonu, iyonofor konsantrasyonu, tedavi süresi ve pre-kuluçka gibi başarılı eritotzu etkileyen faktörler incelenir ve optimal değerler bildirilmiştir. Bu prosedür, glukoz içermeyen bir tamponda eritrositlerin pre-inkübasyon önemli ölçüde glukoz içeren tampon ile karşılaştırıldığında eritoz yüzdesini artırdığını göstermektedir. Bu protokol çeşitli uygulamalar için eritrosit eritrosit üretmek için laboratuvarda kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıda açıklanan protokolde kullanılan tüm insan kanı örnekleri tanımlanmamış numuneler olarak satın alınmıştır. Hiçbir insan denek doğrudan dahil edildi veya bu çalışma için işe. Helsinki Bildirgesi'nin yönergeleri, araştırma insan denekleri kapsadığında kullanılmalıdır.

1. Tam kandan eritrosit izolasyonu

  1. Bir mikrosantrifüj tüpüne asit sitrat dekstrozuna (ACD) (4 °C'de depolanır) 500 μL'lik tam kan ekleyin.
    NOT: Tam kan ACD olarak satın alındı. Şirkete göre 7 mL tam kana (8,5 mL toplam hacim) 1,5 mL ACD ilave edilmiştir.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika (RT) için 700 x g tüm kan santrifüj ve kırmızı eritrosit tabakası bırakmak için bir pipet kullanarak açık plazma ve ince buffy ceket çıkarın.
  3. 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM glukoz ve 1 mM CaCl2içeren 1 L Ringer çözeltisi hazırlayın. 1,0 M NaOH'a 2 μL damla ekleyerek pH'ı 7,4'e ayarlayın. Glikozsuz Ringer çözeltisi hazırlamak için aynı protokolü uygulayın, ancak çözeltiye glikoz eklemeyin.
  4. Eritrositleri Ringer çözeltisinde 2x yıkayın, hücre peletini 1,5 mL Ringer çözeltisinde askıya alarak, 700 x g'de RT'de 5 dk santrifüj ederek ve süpernatantı çıkararak.
  5. 10 mL'lik son hacme ulaşmak için 9.960 μL glukozsuz Ringer çözeltisinde 40 μL eritrosit peletini yeniden sulayarak %0.4 hematokrit yapın.
    NOT: Hematokrit süspansiyon eritrositlerin hacim fraksiyonu başvurmak için kullanılan bir terimdir. %0.4 hematokrit %0.4 eritrosit içeren bir süspansiyondur.
  6. Hücre süspansiyonuna 37 °C'de 7 gün kuluçkaya yatırın.

2. Iyonomisin ile eritrosittedavisi ve hemolizi ölçümü

  1. 2 mM'lik son konsantrasyona ulaşmak için 630 μL dimetil sülfoksitte (DMSO) 1 mg iyonomisin kalsiyum tuzu çözün. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
  2. Adım 1.5'ten %0.4 hematokritin 1 mL'sini alın ve 37 °C'de 2 saat incubate için 1 μM'lik son konsantrasyona ulaşmak için 2 mM iyonomisin0,5 μL ekleyin.
    1. İyonomisin tedavisi olmayan hematokritin 1 mL'sini negatif kontrol olarak kullanın.
  3. Iyonomisin ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen hematokritleri RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüj edin ve tüplerin altındaki hücre peletlerini bırakmak için süpernatasyonlarını çıkarın.
  4. Hücreleri 3x Ringer çözeltisi ile yıkayın hücre peletlerini 1,5 mL Ringer çözeltisinde askıya alarak, 700 x g'de 5 dakika boyunca RT'de santrifüj edin ve süpernatantları atın.
  5. Hemolizi ölçmek için, 1.5 adımdan mikrosentrifüj tüpüne kadar işlenmemiş %0.4 hematokritin 1 mL'sini ekleyin ve hemoliz için negatif kontrol olarak 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın (%0).
  6. 1 mL işlenmemiş% 0.4 hematokrit adım 1.5 bir mikrosantrifüj tüp ve santrifüj bir mikrosantrifüj tüp ve santrifüj de 700 x g 5 dakika rt. Süpernatant çıkarın ve hücre pelet ve kuluçka 1 mL ekleyin 1 mL distile su hücre pelet ve kuluçka 2 saat için 37 °C hemolyzis için pozitif kontrol olarak (%100).
  7. Bir mikrosantrifüj tüpü adım 2.2 iyonomisin tedavi% 0.4 hematokrit 1 mL ekleyin.
  8. Tedavi edilmeyen hücreleri, tedavi edilen hücreleri ve damıtılmış sudaki hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüj edin.
  9. 200 μL'lik süpernatantları alın ve 96 kuyuluk bir tabağa ekleyin.
  10. Mikroplaka okuyucu kullanarak emiciliği 541 nm'de ölçün.
  11. Denklem 132kullanarak hemolizi hesaplayın :

    %Hemolizi = (AT - A0)/(A100 - A0)*100

    A0 Ringer çözeltisi eritrositlerin absorbe olduğu yerde, A100 sudaki eritrositlerin absorbe olduğunu ve AT iyonomisin ile tedavi eritrositlerin absorbe olduğunu.

3. Ekin-V bağlayıcı teşp

  1. 1x bağlama tamponu elde etmek için fosfat tamponlu salinin (PBS) 8 mL'lik 5x ekinin V bağlama tamponunun 2 mL'sini seyreltin.
  2. 1 x bağlama tamponunun 1 mL'sinde adım 2.4'ten iyonomisin ile tedavi edilen ve işlenmemiş hücre peletlerini yeniden askıya alın.
  3. Bağlayıcı arabellekteki hücre süspansiyonlarının 235°L'sini alın ve 15 μL Annexin V-Alexa Un 488 eşleği ekleyin.
  4. Rt'deki hücreleri karanlık bir yerde 20 dakika kuluçkaya yatırın. RT 5 dakika için 700 x g centrifuge ve supernatant çıkarın.
  5. Hücreleri 2x 1x bağlama arabelleği ile yıkayın, bağlayıcı arabelleğin 1,5 mL'sinde hücre peletini askıya alarak, 700 x g'de RT'de 5 dakika santrifüj ederek ve süpernatantı çıkararak.
  6. Akış sitometri ölçümleri için hücre peletlerini 250 μL 1x bağlayıcı tampon halinde yeniden askıya alın.

4. Akış sitometrisi

  1. Ekin-V lekeli eritrositlerin 200 μL'sini akış sitometrisi ile uyumlu 1 mL yuvarlak alt polistiren tüplere aktarın.
  2. Akış sitometri yazılımına giriş yapın ve yeni deneme düğmesine tıklayın. Yeni tüp düğmesine tıklayın. Küresel sayfayı seçin ve floresan yoğunluğunu 488 nm uyarma dalga boyu ve 530 nm emisyon dalga boyu ile ölçmek için uygulama analizini seçin.
  3. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) analizi için toplanacak hücre sayısını 20.000 olarak ayarlayın.
  4. İstenilen tüpü seçin ve yük düğmesine tıklayın. İleri dağılım ve yan dağılım ölçümleri için kayıt düğmesine tıklayın. Tüm numuneler için tekrarlayın.
  5. Numune düğmesine sağ tıklayın ve sonuç dosyasını oluşturmak için toplu iş analizi uygula'ya tıklayın.
  6. Örnek düğmesine sağ tıklayın ve FSC dosyaları oluşturmaktıklayın.
  7. Akış sitometrisi yazılımının işyerine akış sitometri verilerini (FSC dosyaları) ekleyin.
  8. İlgi hücre popülasyonu seçerek ve eritptosis değeri için istatistikler ekleyerek kontrol verilerini analiz edin.
    1. Kontrol üzerine çift tıklayın ve floresan yoğunluğuna karşı histogram seçin.
    2. Histogramda eritptosis yüzdesini gösteren bir geçit çizmek için kapı düğmesine tıklayın.
  9. Eritpizin değerlerini elde etmek için diğer tüm deneysel tüpler için aynı istatistikleri uygulayın. Denetime sağ tıklayın ve gruplandırmak için kopya analizini seçin.
  10. Tüm örnekleri düzgün bir şekilde gating sonra, sürükleyerek ve düzen düzenleyiciiçine bırakarak analiz verileri aktarın.
    1. Çözümlenen verileri düzen düzenleyicisinde denetimle birlikte yeraltına aktarın.
    2. Bökmalı grafiklerin x ve y eksenini değiştirerek istenilen histogramları ve yoğunlukları ayarlayın.
    3. Dışa aktarma düğmesine tıklayarak resim dosyalarını dışa aktarın ve grafikleri istenilen konuma kaydedin.

5. Konfokal mikroskopi

  1. Bir mikroskop slayt üzerinde annexin-V-lekeli hücrelerin 5 μL aktarın ve bir kapak fişi ile kaplayın. Fotobeyaztlamaönlemek için karanlık bir yerde tutun.
  2. İstenilen büyütmelerle 488 nm'de heyecanlanan hücreleri gözlemlemek için konfokal floresan mikroskobunun Argon lazerini kullanın.
    NOT: Konfokal mikroskop mutlaka gerekli değildir ve floresan yeteneğine sahip herhangi bir mikroskop, annexin-V bağlanmasını gösteren floresan görüntüleri elde etmek için kullanılabilir.
  3. Kontrol (tedavi edilmeyen hücreler) ve tedavi edilen hücrelerin floresan görüntülerini elde edin.
    NOT: Tedavi edilmeyen hücrelerin çok zayıf floresan sinyalleri göstermesi beklenirken, tedavi edilen hücrelerin membranlarında parlak yeşil floresan göstermesi beklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İonomisin konsantrasyonunun optimizasyonu

İzomisin eritotaz neden olmak için gerekli iken, artan iyonomisin konsantrasyonları hemoliz yol açabilir (eritrositlerin lysis ve hemoglobin salınımı), kaçınılması gereken. 2 saat için Ringer çözeltisinde 1 μM iyonomisin ile eritrositlerin tedavisi, annexin-V Alexa Un 488 eşleç ve FACS analizi ile nicelleştirme ile başarılı etiketleme ile kanıtlandıkça, eritotsisi tetiklemek için yeterlidir (Şekil 1A). Daha yüksek iyonomisin konsantrasyonları (5 ve 10 μM) eritozda hafif bir artışa neden olur(Şekil 1A-D). Ancak, bu tür konsantrasyonlar da hemoliz geliştirmek (Şekil 1E), hangi istenmez. %5'in altında hemoliz için 1 μM iyonomisin kullanılmalıdır.

İonomisin ile tedavi süresi

Ringer çözeltisinde iyonomisin içeren eritrositlerin 30 dk kadar az bir süre kuluçkaya yatması eritotise neden olmak için yeterlidir (Şekil 2A). Artan kuluçka süresi, ekteki V-bağlayıcı tsömlemi ile ölçüldüğü üzere, 2 saate kadar(Şekil 2B,C)eritoz seviyesini artırır. Ancak, daha fazla kuluçka süresi eritrosit düzeyinde hafif bir azalmaya neden olur (Şekil 2D). Maksimum eritotoz 1 μM iyonomisin ile tedavinin 2 saat sonra elde edildi ve diğer tüm tedavi süreleri için daha düşük eritoz elde edildi(Şekil 2E). Temsili akış sitometri histogramları Şekil 2A-D'dever. Buna ek olarak, ortalama yüzde eritoz ve hemoli, çeşitli tedavi süreleri için 1 μM iyonomisin ile, Şekil 2E ve Şekil 2F,sırasıyla sunulmaktadır. 180 dk sonra hemoliz yüksek değeri inkübasyon aynı miktarda sonra eritoz azalma açıklar(Şekil 2E) daha az canlı hücreler iyonomisin ile tedavi 180 dakika üzerinde var olarak.

Ayrıca hücreler 0, 0,25, 0,5 ve 1 μM gibi düşük iyonomisin konsantrasyonları ile 6 ve 12 saat olmak üzere daha uzun tedavi süreleri için tedavi edildi ve eritotoz ölçüldü(Şekil 3). 6 ve 12 saat için 1 μM daha düşük iyonomisin konsantrasyonları ile tedavi edilen hücreler, 1 μM iyonomisin ile tedavi edilen hücrelere göre daha düşük eritotaz gösterir(Şekil 3). Konsantrasyonun azalması ve maruz kalma süresinin arttırılması eritmetozu arttırdığı için eritozu tetiklemek için 1 μM kullanıldı.

Eritrosit, kuluçka süresine ve ekstrasellüler glukoz konsantrasyonuna bağlıdır.

Ekstrasellüler glukoz konsantrasyonu sürecin sonucunu etkiler. Eritrositler glukoziçermeyen Ringer çözeltisinde, 1 μM ionomisin ile 2 saat kuluçkadan önce glikoz içeren Ringer çözeltisine göre önceden kuluçkaya yatırıldığında daha yüksek eritotoz değerleri gözlenir. Her iki çözeltide de 7 günlük pre-kuluçkadan sonra en yüksek eritrosit değerleri elde edilir. Ancak, 5 mM glikoz içeren normal Ringer çözeltisine göre glikozsuz Ringer çözeltisinde kuluçka öncesi kuluçkadan sonra eritotaz daha yüksektir (temsili parseller için Şekil 4A'ya ve küresel yöntemlerin karşılaştırılması için Şekil 4B'ye bakınız). Buna ek olarak, ileri dağılım histogramları glukoz tükenmesinin eritrosit büzülmesi üzerindeki etkisini gösterir (Şekil 5A-D). İleri dağılım, ışık kırılmasına dayalı hücre boyutu için bir ölçüdür ve dağınık ışık düzeyi33hücresinin boyutuyla doğru orantılıdır. Glikoziçermeyen Ringer çözeltisinde kuluçkaya yatan hücreler, glikoz içeren tamponda inkübe edilen hücrelere göre daha az ileri dağılım gösterirler(Şekil 5E),glikozsuz ortamda hücre küçülmesini gösterir.

Akış sitometri ölçümlerine ek olarak, hücreler eritpozisi doğrulamak için konfokal floresan mikroskobu altında gözlendi. Tedavisi olmayan eritrositler(Şekil 6A)ve iyonomisin tedavisi(Şekil 6B)annexin-V Alexa Un 488 konjuge ile etiketlendi ve mikroskop altında gözlendi. Tedavi edilen hücreler, dış broşürde ekin-V'nin PS'ye bağlanması nedeniyle parlak floresan sinyali(Şekil 6B)gösterdi. Buna karşılık, tedavisi olmayan hücreler çok zayıf floresan sinyali(Şekil 6A)çok düşük eritoroz gösterdi. Ekin-V ile yüksek floresan sinyali ile etiketlenmiş eritrositlerin diğer örnek görüntüleri Şekil 6C'degösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: Çeşitli iyonomisin konsantrasyonlarının eritoz ve hemoloz üzerindeki etkisinin temsili grafikleri. (A) 1 μM, (B) 5 μM ve (C) 10 μM iyomisin (gri) ile tedavi edilen eritrositlerin akış sitometri histogramları 37 °C'de %0,4 hematokrit ile Ringer çözeltisinde tedavi edilmeyen hücreleri gösterir. Eritrosit yüzdesi her şekilde belirtilir. Ekin-V bağlanması ile fosfatidilserin maruziyeti ölçüldü. (D) Aritmetik, 2 saat tedavi den sonra farklı iyonomisin konsantrasyonları ile tedavi edilen hücrelerin yüzde eritozunun ± SD (n = 3) anlamına gelir ve (E) aritmetik anlamına gelir ± SD (n = 3) aynı koşullar altında farklı iyonosit konsantrasyonları ile eritrositlerin hemolisi anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Çeşitli iyonomisin tedavi sürelerinin eritoz üzerindeki etkisi ne anlama gelen temsili rakamlar. 37 °C'de 1 μM ionomisin (gri) ile tedavi edilen eritrosit histogramlarının akış sitometri histogramları (A) 30 dk, (B) 60 dk, (C) 120 dk ve (D) 180 dk 0.4% hematokrit Ringer çözeltisinde. Siyah çizgi tedavi edilmeyen hücreleri gösterir. Eritrosit yüzdesi her şekilde belirtilir. Ekin-V bağlanması ile fosfatidilserin maruziyeti ölçüldü. (E) Aritmetik, farklı zamanlarda 1 μM iyonomisin ile tedavi edilen hücrelerin yüzde eritozunun ± SD (n = 3) anlamına gelir. En yüksek eritoz 120 dk tedaviden sonra elde edildi. (F) Aritmetik, farklı zamanlarda 1 μM iyonomisin ile tedavi edilen hücrelerin yüzde hemolisinin ± SD (n = 3) anlamına gelir. İstatistiksel analiz için Kruskal-Wallis testi ile tek yönlü parametrik olmayan ANOVA yapıldı ve 120 dk tedaviden sonra eritoz, E. * panelinde belirtildiği gibi kontrolden önemli ölçüde daha yüksekti p < 0.05 içindir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Çeşitli iyonomisin konsantrasyonlarının ve tedavi sürelerinin eritoz üzerine etkisi. Aritmetik, çeşitli tedavi sürelerinden sonra farklı iyonomisin konsantrasyonları ile tedavi edilen hücrelerin yüzde eritozunun ± SD (n = 3) anlamına gelir. Hücreler daha uzun pozlama için 0, 0,25, 0,5 ve 1 μM (6 saat ve 12 saat) dahil olmak üzere düşük iyonomisin konsantrasyonları ile tedavi edildi. Daha yüksek konsantrasyonlar ve daha uzun tedaviler daha yüksek eritoz değerleri ile sonuçlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Enerji tükenmesinin eritrosit üzerine etkisi. (A) 1 ila 7 gün arasında glukozsuz Ringer çözeltisi (üst rakamlar) ve Ringer çözeltisinde (alt rakamlar) ön kuluçkadan sonra, 37 °C'de 1 μM iyonomisin (gri) ile tedavi edilen eritrositler için akış sitometri histogramı, enerji tükenmesi eritptosisi kolaylaştırdığını ortaya koymaktadır. Siyah çizgi tedavi edilmeyen hücreleri gösterir. Her gün için grafiklerde eritrosit yüzdesi belirtilir. (B) Aritmetik, Ringer çözeltisinde (siyah çubuklar) ve glikozsuz Ringer çözeltisinde (beyaz çubuklar) 1 ila 7 gün arasında kuluçka öncesi inkübasyon sonrası 37 °C'de 1 μM iyonomisin ile tedavi edilen eritrositlerin yüzde eritomisinin ± SD (n = 3) anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Enerji tükenmesinin hücre büyüklüğü üzerindeki etkisi. Glikozsuz Ringer çözeltisinde (gri) ve Ringer çözeltisinde (siyah çizgi)(A) 1 gün, (B) 3 gün , (C) 5 gün ve (D) 7 gün için kuluçka öncesi kuluçkadan sonra, 37 °C'de 37 °C'de 1 μM iyonomisin ile tedavi edilen eritrositler için ileri dağılım histogramı. Zaman içinde ileri dağılım histogramı glikozsuz tamponda eritrosit büzülmesini gösterir. (E) Aritmetik , 1 ila 7 gün arasında Ringer çözeltisi (siyah çubuklar) ve glukozsuz Ringer çözeltisi (beyaz çubuklar) de pre-kuluçka sonrası, 37 °C'de 1 μM ionomisin ile tedavi edilen eritrositlerin ileri dağılım yoğunluklarının ± SD (n = 3) anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: (A) 0 μM, (B) ve (C) 1 μM iyonomisin ile tedavi edilen eritrositlerin konfokal floresan mikroskopi görüntüleri 37 °C'de 2 saat için %0,4 hematokrit. A ve B panellerinde görüntüler için 40x nesnel büyütme kullanıldı ve 100x nesnel büyütme sağlıklı eritrositlerde C. PS paneli için görüntü almak için kullanıldı hücre zarının iç broşüründe yer alır, bu nedenle A panelinde floresan sinyali yoktur. B ve C eritrositleri eritrosoz için indüklenmiştir ve hücre zarının dış broşürüne aktarılan annexin-V'den PS'ye bağlanmasından kaynaklanan parlak bir floresan sinyali vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre yoğunluğu /hematokrit İonomisin konsantrasyonu Arabellek Kuluçka öncesi İonomisin ile tedavi süresi Algılama yöntemi Başvuru
1.65 x 108 hücre/mL 0,3 mM Arabellek A* Arabellek A'da 36 saat 1 saat Ek V 12
0.40% 1 mM Zil çözeltisi Ringer'da 48 saat 1 saat Ek V 17
50% 10 mM Tampon B** - 3 saat Merocyanine 540 18
0.40% 1 mM Zil çözeltisi Ringer'da 48 saat 1 saat Ek V 19
0.40% 1 mM Zil çözeltisi Ringer'da 48 saat 1 saat Ek V 20
2% 1 mM Zil çözeltisi - 4 saat Ek V 21
0.40% 1 mM Zil çözeltisi - 0,5 saat Ek V 22
10% 1 mM Zil çözeltisi - 3 saat Ek V 23
0.40% 10 mM Zil çözeltisi - 0,5 saat Ek V 24
0.40% 1 mM Zil çözeltisi Ringer'da 48 saat 0,5 saat Ek V 25
2 x 106 hücre/mL 1 mM HEPES tamponlu tuzlu (HBS) - 0,5 saat Ek V 26
*Tampon A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2·6H2O, 10 mM glikoz ve 1,8 mM CaCl2·2O
**Tampon B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl ve 10 mM glikoz

Tablo 1: Literatürde iyonomisin kullanarak eritotisi tetiklemek için kullanılan çeşitli protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu işlemin amacı, iyonofor konsantrasyonu, tedavi süresi ve eripozun başarılı indüksiyonunu sağlamada önemli faktörler olan hücre dışı glukoz konsantrasyonu için en uygun değerleri sağlamaktır. Protokoldeki kritik bir adım, önemine rağmen literatürde yeterince vurgulanamayan hücre dışı glikozun tükenmesidir. Normal Ringer çözeltisindeki şeker içeriği (5 mM) eritmetoz üzerinde önleyici etkiye sahiptir. Hücre dışı ortamda glikoz tükenmesi hücresel strese neden olur ve protein kiziaz C aktive (PKC), kalsiyum ve potasyum kanallarının aktivasyonu ile sonuçlanan. Bu sitosolik alanda Ca2 + girişinde bir artış ile sonuçlanır30,31,34 ve sonuçta scramblase aktive16, hangi erittoz artırır. Potasyum kanalının aktivasyonu da potasyum klorür sızıntısı ile sonuçlanır hücre dışına, hangi eritrosit büzülme yol açar35.

Yukarıda özetlenen işlemin hemolise özel bir dikkat ile yapılması gerekmektedir. Bu optimize edilmiş bir iyonofor konsantrasyonu kullanmak önemlidir, hangi eritoz neden yeterince yüksek, ve hemolizi önlemek için yeterince düşük. Benzer şekilde, iyonomisin ile kısa bir süre için eritrositlerin kuluçkaya yatması düşük eritoza yol açarken, çok uzun kuluçka hücre zarında bozulma ve hemoliz olabilir. Ayrıca, aynı eritrosit numunesi üzerinde yapıldığında sunulan protokolün son derece güvenilir olduğu, farklı bireylerden hücrelerin iyonomisine farklı tepki verdiği ve farklı örnekler arasında özneler arası değişkenlik olabileceği de unutulmamalıdır.

Akış sitometrisinden veri analizine özellikle dikkat edilmelidir. Akış sitometresinden elde edilen eritrosit yüzdesi, dış broşürlerinde PS olan hücre popülasyonunun yüzdesini gösterir. Ancak, annexin-V bağlama farklı yoğunlukları olan hücreler bu sayıya göre ayırt edilemez. Ekin-V PS hücre yüzeyinde maruz, çok yüksek yakınlık ve PS36yüksek özgüllük ile bağlanır,37,38. Ancak bu raporda mikroskopi görüntülerinde gösterildiği gibi, farklı hücreler ekin-V bağlama yoğunluğunda farklılıklar göstermektedir. Membranlarında DÜŞÜK PS olan hücreler düşük floresan yoğunluklarına sahipken, hücre zarında daha yüksek PS doluluk yüksek floresan yoğunlukları ile sonuçlanır.

Bu yazıda sunulan protokol hücre dışı Ca2+ konsantrasyonu artırılarak değiştirilebilir. Bu protokolde, 1 mM CaCl2varlığında eritoza neden olmak için iyonomisin kullanılmıştır; yüksek Ca2+ konsantrasyonları gelişmiş hücre içi kalsiyum düzeylerine yol açabilir ve daha fazla eritptosi neden olabilir. Buna ek olarak, farklı kalsiyum ionofores, seçici ve kalsimisin gibi, Ca hücre içi konsantrasyonunu artırmak için farklı yeteneğine sahip olabilir2 +, iyonomisin ile karşılaştırıldığında, ve farklı eritotoz değerleri neden olabilir. Ancak, eritrositlerin tutarlı eritrositler özetlenen protokol ile iyonomisin kullanılarak elde edilebilir ve eritoz moleküler mekanizmaları incelemek için laboratuvarda kullanılabilir, hastalıklı koşulları taklit39,40in vitro, ve diğer uygulamalar arasında, eritotaz inhibe ekran potansiyel terapötik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibe R15ES030140 ve NSF hibe CBET1903568 tarafından desteklenmiştir. Russ Mühendislik ve Teknoloji Koleji ve Ohio Üniversitesi Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü'nden de finansal destek kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8, (12), 1143-1156 (2001).
  2. Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
  3. Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39, (8), 794-798 (1990).
  4. Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323, (2), 178-193 (1973).
  5. de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
  6. Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405, (6782), 85-90 (2000).
  7. Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, (8), 627-633 (2001).
  8. Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22, (10), 878-881 (2000).
  9. Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27, (9), 717-722 (2010).
  10. Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87, (3), 1179-1197 (1996).
  11. Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39, (5), 308-314 (2012).
  12. Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 - a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19, (2), 262-276 (2014).
  13. Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112, (10), 3939-3948 (2008).
  14. Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146, (4), 447-455 (2009).
  15. Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39, (5), 1977-2000 (2016).
  16. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468, (7325), 834-838 (2010).
  17. Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43, (4), 1472-1486 (2017).
  18. Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902, (2), 253-262 (1987).
  19. Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6, (12), 3596-3612 (2014).
  20. Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4, (33), 1516-1526 (2014).
  21. Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6, (10), e26575 (2011).
  22. Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302, (4), C644-C651 (2011).
  23. Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38, (10), 1649-1651 (2015).
  24. Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98, (1), 37-46 (2013).
  25. Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38, (6), 2300-2310 (2016).
  26. Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Biochemistry. 46, (8), 2233-2238 (2007).
  27. Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22, (6), 373-380 (2008).
  28. Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277, (30), 27217-27226 (2002).
  29. Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253, (17), 5892-5894 (1978).
  30. Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte "Programmed Cell Death" Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 290, (1), C244-C253 (2006).
  31. Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257, (2), 431-434 (1989).
  32. Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6, (4), 1219-1232 (2019).
  33. Jaroszeski, M. J., Heller, R. Flow Cytometry Protocols. Humana Press. Totowa, NJ. (2003).
  34. Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157, (5), 1365 (2012).
  35. Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018, (5), 9405617 (2018).
  36. Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264, (14), 7944-7949 (1989).
  37. Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265, (9), 4923-4928 (1990).
  38. Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329, (1), 112-119 (2004).
  39. Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40, (6), 1391-1400 (2016).
  40. Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics - Clinical Applications. 10, (4), 403-414 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics