دراسة الآثار السلوكية العصبية للملوثات البيئية على يرقات حمار وحشي

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يتم تقديم بروتوكول تجريبي مفصل في هذه الورقة لتقييم السمية السلوكية العصبية للملوثات البيئية باستخدام نموذج يرقات حمار وحشي ، بما في ذلك عملية التعرض واختبارات المؤشرات السلوكية العصبية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد ثبت في السنوات الأخيرة أن الملوثات البيئية أكثر فأكثر هي سامة للأعصاب، ولا سيما في المراحل المبكرة من تطور الكائنات الحية. يرقات حمار وحشي هي نموذج بارز للدراسة السلوكية العصبية للملوثات البيئية. هنا ، يتم توفير بروتوكول تجريبي مفصل لتقييم السمية العصبية للملوثات البيئية باستخدام يرقات حمار وحشي ، بما في ذلك جمع الأجنة ، وعملية التعرض ، والمؤشرات السلوكية العصبية ، وعملية الاختبار ، و تحليل البيانات. أيضا ، تتم مناقشة البيئة الثقافية ، وعملية التعرض ، والظروف التجريبية لضمان نجاح الاختبار. وقد استخدم البروتوكول في تطوير الأدوية النفسية، والبحوث على الملوثات السمية العصبية البيئية، ويمكن تحسينها لإجراء دراسات المقابلة أو أن تكون مفيدة للدراسات الميكانيكية. يوضح البروتوكول عملية عملية واضحة لدراسة الآثار السلوكية العصبية على يرقات سمك الحمار الوحشي ويمكن أن يكشف عن آثار مختلف المواد السامة للأعصاب أو الملوثات.

Introduction

في السنوات الأخيرة وقد ثبت المزيد والمزيد من الملوثات البيئية العصبية السامة1،2،3،4. ومع ذلك، فإن تقييم السمية العصبية في الجسم الحي بعد التعرض للملوثات البيئية ليس سهلاً مثل تقييم اضطراب الغدد الصماء أو السمية النمائية. بالإضافة إلى ذلك ، اجتذب التعرض المبكر للملوثات ، وخاصة في الجرعات ذات الصلة بالبيئة ، اهتمامًا متزايدًا في دراسات السمية5و6و7و8.

ويجري إنشاء سمك الحمار الوحشي كنموذج لالحيوان يصلح لدراسات السمية العصبية أثناء التطور المبكر بعد التعرض للملوثات البيئية. سمك الحمار الوحشي هي الفقاريات التي تتطور بشكل أسرع من الأنواع الأخرى بعد الإخصاب. لا تحتاج اليرقات إلى التغذية لأن العناصر الغذائية في chorion كافية للحفاظ عليها لمدة 7 أيام بعد الإخصاب (dpf)9. تخرج اليرقات من التشوين عند 2 دبف وتتطور سلوكيات مثل السباحة والدوران التي يمكن ملاحظتها وتتبعها وقياسها كمياً وتحليلها آلياً باستخدام أدوات السلوك10،11،12،13 بدءاً من 3-4 dpf14،15،16،17،18. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضًا تحقيق اختبارات الإنتاجية العالية بواسطة أدوات السلوك. وهكذا ، فإن يرقات حمار وحشي هي نموذج متميز للدراسة السلوكية العصبية للملوثات البيئية19. هنا ، يتم تقديم بروتوكول باستخدام المراقبة عالية الإنتاجية لدراسة السمية السلوكية العصبية للملوثات البيئية على يرقات سمك الحمار الوحشي تحت المحفزات الخفيفة.

وقد درس مختبرنا السمية السلوكية العصبية من 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl الأثير (BDE-47)20,21, 6'-هيدروكسي / ميثوكسي-2,2',4'4'4'-tetrabromodiphenyl الأثير (6-OH/MeO-BDE-47)22, عشاري-برومينتيد ثنائي الفينيل الأثير (BDE-209), الرصاص, والبارافينات المكلورة التجارية23 باستخدام البروتوكول المقدم. كما تستخدم العديد من المختبرات البروتوكول لدراسة الآثار السلوكية العصبية للملوثات الأخرى على اليرقات أو الأسماك البالغة24،25،26،27. وقد استخدم هذا البروتوكول العصبي السلوكي للمساعدة في توفير الدعم الآلي تبين أن التعرض لجرعة منخفضة من البيسفينول A واستبدال البيسفينول S الناجم عن تكوين الأعصاب تحت المهاد المبكر في حمار وحشي الجنينية27. وبالإضافة إلى ذلك، قام بعض الباحثين بتحسين البروتوكول لإجراء دراسات مناظرة. قضت دراسة حديثة على سمية بيتا الأميلويد (Aβ) في نموذج حمار وحشي سهل وعالي الإنتاجية باستخدام جسيمات نانوية ذهبية مغلفة بالكازين (αCas AuNPs). وأظهرت أن αCas AuNPs في الدورة الدموية النظامية انتقلت عبر حاجز الدم في الدماغ من يرقات حمار وحشي وعزل Aβ42 داخل المخ، مما أدى إلى سمية بطريقة غير محددة، مثل المرافق، والتي كانت مدعومة من الأمراض السلوكية28.

الحركة وزاوية المسار والنشاط الاجتماعي هي ثلاثة مؤشرات سلوكية عصبية تستخدم لدراسة آثار السمية العصبية ليرقات سمك الحمار الوحشي بعد التعرض للملوثات في البروتوكول المقدم. يتم قياس الحركة من خلال مسافة السباحة لليرقات ويمكن أن تتلف بعد التعرض للملوثات. ترتبط زاوية المسار والنشاط الاجتماعي بشكل وثيق مع وظيفة الدماغ والجهاز العصبي المركزي29. تشير زاوية المسار إلى زاوية مسار حركة الحيوان نسبة إلى اتجاه السباحة30. يتم تعيين ثماني فئات زاوية من ~ -180 درجة - ~ + 180 درجة في النظام. لتبسيط المقارنة، يتم تعريف ست فئات في النتيجة النهائية على أنها منعطفات روتينية (-10 درجة ~ 0 درجة، 0° ~ +10 درجة)، متوسط المنعطفات (-10° ~ -90 درجة، +10 درجة ~ +90 درجة)، ومنعطفات مستجيبة (-180 درجة ~ -90 درجة، +90 درجة ~ +180 درجة) وفقًا لدراساتنا السابقة21،22. النشاط الاجتماعي اثنين من الأسماك هو أساسي للسلوك الضحوة المجموعة; هنا يتم تعريف مسافة 0.5 سم بين يرقين صالحين على أنه اتصال اجتماعي.

يوضح البروتوكول المعروض هنا عملية واضحة لدراسة الآثار السلوكية العصبية على يرقات سمك الحمار الوحشي ويوفر طريقة للكشف عن آثار السمية العصبية لمختلف المواد أو الملوثات. وسيستفيد من البروتوكول الباحثون المهتمون بدراسة السمية العصبية للملوثات البيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويتوافق البروتوكول مع المبادئ التوجيهية التي أقرتها لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة تونغجي.

1. جمع أجنة حمار وحشي

  1. وضع اثنين من أزواج صحية الكبار Tubingen حمار وحشي في مربع التفريخ في الليلة السابقة للتعرض، والحفاظ على نسبة الجنس في 1:1.
  2. إزالة الأسماك الكبار مرة أخرى إلى النظام 30-60 دقيقة بعد ضوء النهار في صباح اليوم التالي.
  3. إزالة الأجنة من مربع التفريخ.
  4. شطف الأجنة مع مياه النظام.
  5. نقل الأجنة إلى طبق بيتري زجاجي (قطر9 سم) مع ما يكفي من مياه النظام.
  6. مراقبة الأجنة تحت المجهر واختيار الأجنة السليمة للتعرض في وقت لاحق.
    ملاحظة: عادة ما تكون الأجنة السليمة شفافة بلون ذهبي فاتح تحت المجهر. عادة ما تكون الأجنة غير الصحية شاحبة وتتجمع معًا كما لوحظ تحت المجهر.

2. التحضير قبل التعرض

  1. إعداد حل هانكس وفقا للمبادئ التوجيهية لكتاب حمار وحشي31.
    ملاحظة: يتضمن حل هانكس 0.137 M NaCl و 5.4 m M KCl و 0.25 mM Na2HPO4و 0.44 mM KH2PO4و 1.3 mM CaCl2و 1.0 mM MgSO4و 4.2 mM NaHCO3.
  2. تمييع محلول هانكس إلى محلول هانكس بنسبة 10٪ باستخدام الماء المعقم.
  3. أضف 1 مل من DMSO إلى 999 مل من حل هانكس بنسبة 10٪ لجعل حل التحكم في حل 10٪ هانكس بما في ذلك 0.1٪ DMSO.
    ملاحظة: تستخدم الخطوات التالية BDE-47 كمثال على حل التعرض.
  4. إذابة 5 ملغ من BDE-47 أنيق في 1 مل من 100٪ DMSO لجعل حل التعرض القياسية من 5 ملغ / مل.
  5. دوامة حل 5 ملغ / مل لمدة 1 دقيقة لإذابة تماما BDE-47 في DMSO.
  6. نقل 10 ميكرولتر من محلول 5 ملغ /مل إلى زجاجة بنية 12 مل.
  7. أضف الماء المعقم إلى حجم نهائي قدره 10 مل لجعل تركيز محلول التعرض BDE-47 5 ملغم/لتر ونسبة DMSO عند 0.1٪، ثم دوامة لمدة دقيقة واحدة.
  8. نقل 10 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من محلول 5 ملغم/لتر إلى قوارير حجمية تبلغ 100 مل على التوالي.
  9. أضف محلول هانكس 10% بما في ذلك 0.1% DMSO (تم إعداده في الخطوة 2.3) إلى 100 مل لجعل التركيزات النهائية لمحلول التعرض BDE-47 5 ميكروغرام/لتر و50 ميكروغرام/لتر، على التوالي.
  10. نقل الحلول إلى 100 مل زجاجات زجاجية بنية وتخزينها في 4 درجة مئوية.

3- تعرض الأجنة

  1. نقل ~ 50 الأجنة في كل من ثلاثة أطباق بيتري الزجاج (قطرها 6 سم) 3-5 ساعات بعد الإخصاب (hpf).
  2. استخدم طرف ماصة 1 مل للطخة مياه النظام حول الأجنة.
  3. استخدم ماصة لنقل جهاز التحكم وحلول التعرض للإيثر الثنائي الفينيل العشاري البروم-47 (التحكم، 5 ميكروغرام/لتر، 50 ميكروغرام/لتر) إلى أطباق بيتري الزجاجية الثلاثة، على التوالي.
  4. يهز الزجاج بيتري أطباق بلطف واحدا تلو الآخر لجعل الأجنة تفريق في الجزء السفلي من لوحة.
  5. وضع أطباق بيتري الزجاج في حاضنة ضوء تحت 28.5 درجة مئوية.
  6. تجديد نصف حلول التعرض كل 24 ساعة حتى 5 dpf.
  7. تحقق من الأجنة الميتة من كل مجموعة على 1 dpf و 2 dpf وحساب معدل الوفيات.
  8. تحقق من الأجنة المحتضنة من كل مجموعة على 2 dpf و 3 dpf وحساب الفقس.
  9. تحقق من تشوه اليرقات كل يوم بعد خروجها من chorion وحساب معدل التشوه لكل مجموعة.
    ملاحظة: مؤشرات التشوه تشمل الكيس ة التهياب، انحناء العمود الفقري، انحناء الذيل، من بين عوامل أخرى32.

4. التحضير لاختبار السلوك

  1. إعداد 48 لوحة بئر لاختبار زاوية الحركة والمسار وثلاثة 6 لوحات صغيرة جيدا لاختبار النشاط الاجتماعي في صباح يوم 5 dpf.
  2. نقل 800 ميكرولتر من محلول التعرض إلى كل بئر من 48 بئر ميكروبليت.
    ملاحظة: استخدم 16 بئراً لكل مجموعة (أي محلول التحكم، 5 ميكروغرام/لتر، ومجموعة 50 ميكروغرام/لتر).
  3. استخدام تلميح ماصة 1 مل لنقل 200 ميكرولتر من حل التعرض مع يرقة واحدة من طبق بيتري الزجاج في بئر واحد من 48 ميكروبلايت جيدا.
  4. نقل 4 مل من محلول التعرض في كل بئر من 6 ميكروبليت جيدا.
    ملاحظة: استخدام واحد 6 لوحة صغيرة بشكل جيد لكل مجموعة.
  5. استخدام تلميح ماصة 1 مل لنقل 200 ميكرولتر من محلول التعرض مع اثنين من اليرقات في كل بئر من 6 بئر ميكرولوحة.
    ملاحظة: تحتوي كل مجموعة على ست مجموعات مكررة.
  6. تأكد من أن درجة حرارة غرفة الاختبار هي 28 درجة مئوية 2 ساعة قبل الاختبار.
    ملاحظة: عادة ما يتم إجراء الاختبارات السلوكية في فترة ما بعد الظهر.

5. الاختبار السلوكي

  1. اختبار زاوية الحركة والمسار
    1. انقر فوق رمز قاذفة على مكتب الكمبيوتر لفتح البرنامج (انظر جدول المواد)التي تتحكم في الضميمة مراقبة عالية الإنتاجية لبدء البرنامج.
    2. اختر وحدة"التتبع والدوران وزوايا المسار"لإدخال واجهة التشغيل.
    3. نقل 48 لوحة جيدة أعدت في الخطوة 4.3 إلى منصة التسجيل وسحب الغطاء.
    4. انقر فوق"ملف""إنشاء بروتوكول"الزر بدوره في البرنامج لبدء إنشاء بروتوكول جديد.
    5. إدخال "48" في"عدد المواقع"موقف وانقر فوق"موافق"زر.
    6. انقر فوق"معلمات""معلمات البروتوكول""الوقت"الزر بدوره في البرنامج. تعيين مدة التجربة لمدة 1 ساعة و 10 دقيقة وتعيين فترة التكامل إلى 60 s33.
    7. رسم المناطق المكتشفة.
      1. حدد الشكل البيضاوي ورسم الدائرة الأولى حول أعلى اليسار الأول جيدا.
      2. حدد الدائرة، انقر فوق"نسخ" "أعلى العلامة اليمنى" "لصق""حدد"زر بدوره، واستخدام الماوس لسحب الدائرة المنسوخة إلى أعلى اليمين بشكل جيد.
      3. حدد الدائرة، انقر فوق"نسخ""أسفل علامة""لصق""حدد"زر بدوره، واستخدام الماوس لسحب الدائرة المنسوخة إلى أسفل اليمين بشكل جيد.
      4. انقر فوق"بناء""علامات واضحة"الزر بدوره.
        ملاحظة: سيقوم النظام تلقائيًا برسم كل بئر آخر من اللوحة. وينبغي أن المناطق التي تم إنشاؤها حديثا تناسب تماما كل بئر بين الأسماك الفعلية وانعكاسها على جانب البئر.
    8. انقر فوق"رسم مقياس"الزر، رسم خط معايرة على الشاشة (مسار قطري أو بالتوازي مع جانب لوحة صغيرة)، أدخل طوله وتعيين "وحدة". ثم انقر فوق الزر"تطبيق على مجموعة".
    9. تعيين لون الحيوان في"أسود"في البرنامج.
    10. تعيين عتبة الكشف في 16-18 للسماح بالكشف عن الحيوانات.
    11. المدخلات غير النشطة / الصغيرة والصغيرة / الكبيرة السرعة في 0.5 سم / سنة و 2.5 سم / سنة على التوالي.
    12. تعيين فئات زاوية المسار. إدخال "-90، -30، -10، 0، 10، 30، و 90" لجعل فئات زاوية المسار من -180 درجة -+180 درجة.
    13. ضبط ظروف الإضاءة
      1. انقر فوق"معلمات""القيادة الخفيفة""يستخدم واحدة من 3 طرق الزناد أدناه" " تعزيزالمحفزات" زر بدوره لتعيين ظروف الضوء.
      2. اختر زر"الحافة"،ثم قم بتعيين فترة مظلمة مدتها 10 دقيقة، تليها ثلاث دورات من فترات الضوء والظلام بالتناوب لمدة 10 دقيقة.
    14. حفظ البروتوكول وأسفل ضوء غرفة الاختبار.
    15. تأقلم اليرقات في النظام لمدة 10 دقيقة وانقر على"تجربة""تنفيذ"زر بدوره، ثم اختر المجلد حيث يتم حفظ ملفات التجربة وأدخل اسم النتيجة.
    16. انقر فوق"الخلفية""ابدأ"الزر بدوره لبدء الاختبار.
    17. انقر فوق"التجربة""إيقاف"الزر بدوره لإيقاف التجربة عند انتهاء الاختبار.
      ملاحظة: يعرض النظام البيانات التي تم اختبارها عند توقف النظام. وتشمل البيانات المسافة المتتبعة في ثلاث فئات سرعة وأرقام زاوية المسار في ثماني فئات زاوية من كل دقيقة. بالنسبة لاختبار الحركة في المثال المعروض ، يتم حساب المسافة الإجمالية في كل فترة ضوء (10 دقيقة) ومقارنة الفرق بين مجموعة التحكم ومجموعات العلاج.
    18. نقل 48 بئر ميكروبليت مرة أخرى إلى حاضنة الضوء لتجارب أخرى.
  2. اختبار النشاط الاجتماعي
    1. انقر على رمز قاذفة على مكتب الكمبيوتر لفتح البرنامج الذي يتحكم في الضميمة رصد عالية الإنتاجية لبدء البرنامج.
    2. اختر وحدة"التفاعلات الاجتماعية"لإدخال واجهة التشغيل.
    3. نقل إعداد 6 لوحة صغيرة جيدا (مجموعة التحكم) في الخطوة 4.4 إلى منصة التسجيل وسحب الغطاء.
    4. انقر فوق"ملف""إنشاء بروتوكول"الزر بدوره في البرنامج لبدء إنشاء بروتوكول جديد.
    5. إدخال "6" في"عدد المواقع"موقف وانقر فوق"موافق"زر.
    6. انقر فوق"معلمات""معلمات البروتوكول""الوقت"الزر بدوره في البرنامج. تعيين مدة التجربة ل1 ساعة و 10 دقيقة وتعيين فترة التكامل إلى 60 s.
    7. رسم المناطق المكتشفة.
      1. حدد الشكل البيضاوي ورسم الدائرة الأولى حول أعلى اليسار الأول جيدا.
      2. حدد الدائرة، انقر فوق"نسخ" "أعلى العلامة اليمنى" "لصق""حدد"زر بدوره، واستخدام الماوس لسحب الدائرة المنسوخة إلى أعلى اليمين بشكل جيد.
      3. حدد الدائرة، انقر فوق"نسخ""أسفل علامة""لصق""حدد"زر بدوره، واستخدام الماوس لسحب الدائرة المنسوخة إلى أسفل اليمين بشكل جيد.
      4. انقر فوق"بناء""علامات واضحة"الزر بدوره.
        ملاحظة: يجب أن تناسب المناطق التي تم إنشاؤها حديثًا كل منها بشكل مثالي وبين اليرقات الفعلية وانعكاسها على جانب البئر.
    8. انقر فوق"رسم مقياس"الزر، رسم خط معايرة في الشاشة (مسار قطري أو بالتوازي مع جانب لوحة صغيرة)، أدخل طوله وتعيين "وحدة". ثم انقر فوق الزر"تطبيق على مجموعة".
    9. تعيين عتبة الكشف في 16-18 للسماح بالكشف عن الحيوانات.
    10. انقر فوق الزر"الحيوان الأسود"في البرنامج.
    11. اختيار"عتبة المسافة"زر وإدخال "5" في البرنامج.
    12. ضبط ظروف الإضاءة.
      1. انقر فوق"معلمات""القيادة الخفيفة""يستخدم واحدة من 3 طرق الزناد أدناه" " تعزيزالمحفزات" زر بدوره لتعيين ظروف الضوء.
      2. اختر زر"الحافة"،ثم قم بتعيين فترة مظلمة مدتها 10 دقيقة، تليها ثلاث دورات من فترات الضوء والظلام بالتناوب لمدة 10 دقيقة.
    13. حفظ البروتوكول وبدوره ضوء الغرفة.
    14. تأقلم اليرقات في النظام لمدة 10 دقيقة وانقر على"تجربة""تنفيذ"زر بدوره، ثم اختر المجلد حيث يتم حفظ ملفات التجربة وأدخل اسم النتيجة.
    15. انقر فوق"الخلفية""ابدأ"الزر بدوره لبدء الاختبار.
    16. انقر فوق"التجربة""إيقاف"الزر بدوره لإيقاف التجربة في البرنامج عند انتهاء الاختبار.
      ملاحظة: يعرض النظام البيانات التي تم اختبارها عند توقف النظام.
    17. نقل 6 بئر ميكروبليت (مجموعة التحكم) مرة أخرى إلى حاضنة الضوء لتجارب أخرى.
    18. نقل 6 لوحات صغيرة جيدة (5 ميكروغرام / لتر و 50 ميكروغرام / لتر) بدوره إلى منصة التسجيل وتكرار الخطوات من 5.2.4 إلى 5.2.17 حسب النظام.

6 - تحليل البيانات

  1. افتح ملف جدول البيانات في نتائج زاوية الحركة والمسار.
  2. حدد أعمدة المسافة الثلاثة(inadist، smldist، lardist)وإضافتها.
    ملاحظة: بيانات inadist، smldist، واليرقات يعني مسافات مختلفة سجلتها النظام في فئات سرعة مختلفة (غير نشط / صغير / كبير)، على التوالي.
  3. لكل فترة ضوء 10 دقيقة تلخص مسافة كل بئر ، وحساب متوسط المسافة من 16 بئرا ، ومقارنة بيانات المجموعات الثلاث تحت المحفزات الخفيفة.
  4. لكل فترة ضوء 10 دقيقة تلخيص عدد زاوية كل بئر في كل مدة الضوء من cl01 إلى cl08 بدوره، ومقارنة البيانات من المجموعات الثلاث تحت المحفزات الخفيفة.
    ملاحظة: بيانات الأعمدة من cl01 إلى cl08 تعني أرقام زاوية مسار مختلفة يتم تسجيلها بواسطة النظام في زوايا مسار مختلفة، على التوالي.
  5. افتح ملف جدول البيانات في نتائج النشاط الاجتماعي.
  6. حدد أعمدة contct وcontdur ، ولكل فترة ضوء 10 دقيقة تلخص الأوقات الاجتماعية ومدتها لكل بئر.
  7. حساب متوسط الأوقات الاجتماعية ومدة مجموعة واحدة في كل مدة الضوء ومقارنة بيانات المجموعات الثلاث تحت المحفزات الخفيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، نصف بروتوكولًا لدراسة الآثار السلوكية العصبية للملوثات البيئية باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي تحت المحفزات الخفيفة. يتم تعريف الحركة وزاوية المسار واختبارات النشاط الاجتماعي في المقدمة. ويرد أدناه إعداد لوحات صغيرة في الاختبارات زاوية الحركة والمسار وصور البرنامج. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم نتائج أبحاثنا كأمثلة. وتقدم دراستان آثار زاوية الحركة والمسار بعد التعرض للإيثر الثنائي الفينيل العشاري البروم-47 و6-OH/MeO-BDE-47. وتعرض الدراسة الثالثة آثار أربعة بارافينات مكلورة تجارية على السلوك الاجتماعي.

إعداد 48 بئر ميكروبليت والحركة مكان من اليرقات في الحركة ومسار زاوية اختبار.
واستخدمت في البروتوكول ثلاث مجموعات، بما في ذلك مجموعة مراقبة ومجموعتان علاجيتان. لأن كل مجموعة يمكن أن يكون 16 الحيوانات، يمكن استخدام النظام لإجراء اختبارات عالية الإنتاجية من الحركة وزاوية المسار في لوحة صغيرة واحدة. ويبين الشكل 1 يرقة واحدة عولجت بمحلول التحكم، ومحلول 5 ميكروغرام/لتر، ومحلول 50 ميكروغرام/لتر في كل بئر من الصفين الأول والمتوسط والأخير، على التوالي.

ويبين الشكل 1 أيضا كل loci حركة اليرقات في الحركة واختبارات زاوية المسار. تتبع النظام حركة اليرقات وحساب مسافة السباحة في فئات سرعة مختلفة. قام النظام بحساب أرقام زاوية المسار لليرقات في فئات زاوية مسار مختلفة. يمكن للباحثين تحليل البيانات التي يسجلها النظام بطرقهم الخاصة.

Figure 1
الشكل 1: إعداد 48 بئر ميكروبليت وloci حركة اليرقات في الحركة واختبار زاوية المسار. A1-A8، B1-B8 = مجموعة التحكم؛ C1-C8، D1-D8 = مجموعة 5 ميكروغرام/لتر؛ E1-E8، F1-F8 = مجموعة 50 ميكروغرام/لتر. خط تتبع اللون الأسود يعني الخمول أو الحركات الصغيرة. خط تتبع اللون الأخضر يعني الحركات العادية؛ والخط الأحمر تتبع اللون يعني حركات كبيرة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

و6 بئر ميكروبليت في اختبار النشاط الاجتماعي.
ويبين الشكل 2 لوحة صغيرة من 6 آبار في عملية اختبار النشاط الاجتماعي. كان لكل بئر يرقان ، وسجل النظام المسافة بين اليرقات أثناء عملية الاختبار بأكملها. سجل النظام أرقام النشاط الاجتماعي والمدة في وقت الاختبار المحدد (دقيقة واحدة في هذا البروتوكول).

Figure 2
الشكل 2: لوحة بئر 6 في اختبار النشاط الاجتماعي. كل بئر كان به يرقتان الخط الأصفر يعني المسافة بين الحيوانين هو < 0.5 سم; الخط الأحمر يعني المسافة بين اثنين من الحيوانات هو أكثر من 0.5 سم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وأثر التعرض للإيثر الثنائي الفينيل العشاري البروم-47 على الحركة في يرقات سمك الحمار الوحشي عند 5 دبف.
وكما هو مبين في الشكل 3،أنتجت أعلى مجموعة تركيز من الإيثر الثنائي الفينيل العشاري البروم-47 نقص نشاط واضح خلال الفترة المظلمة. ومع ذلك، لم تكن هناك تغييرات ملحوظة بسبب التعرض للإيثر الثنائي الفينيل العشاري البروم-47 خلال فترات الضوء.

Figure 3
الشكل 3: آثار التعرض للإيثر الثنائي الفينيل العشاري البروم-47 على حركة سمك الحمار الوحشي اليرقاني عند 5 دبف. تم تسجيل الحركة (المسافة التي تم نقلها مقاسة بالسم) في فترات متناوبة من الظلام والضوء لمدة إجمالية قدرها 70 دقيقة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SEM (*p < 0.05 مقارنة مع مجموعة التحكم). وقد تم تعديل هذا الرقم من تشاو وآخرون17 بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6-OH/MeO-BDE-47 أثر التعرض على زوايا مسار يرقات سمك الحمار الوحشي عند 5 dpf.
كما هو مبين في الشكل 4، أدت مجموعة التركيز العالي من 6-OH-BDE-47 عددًا أقل من المنعطفات الروتينية ومتوسط المنعطفات عند 5 dpf. ومع ذلك، فإن المنعطفات الأكثر استجابة كانت ناجمة عن مجموعات التعرض 6-MeO-BDE-47.

Figure 4
الشكل 4: آثار 6-OH/MeO-BDE-47 على زاوية مسار سمك اليرقات الوحشي خلال الفترة المظلمة. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SEM (*p < 0.05 مقارنة بالتحكم). وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ وآخرون18 بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد أثر التعرض لـ CPs على النشاط الاجتماعي ليرقات سمك الحمار الوحشي عند 5 dpf.
كما هو موضح في الشكل 5، تأثرت السلوكيات الاجتماعية ليرقات سمك الحمار الوحشي بثلاثة منتجات CP. وحفز النشاط الاجتماعي CP-70 وسلسلة قصيرة CP-52b. تقصير سلسلة طويلة CP-52a مدة لكل اتصال من اليرقات.

Figure 5
الشكل 5: آثار الـ CPs على متوسط المدة الاجتماعية لكل اتصال في فترات الضوء/الظلام المختلفة. (A)CP-42،(B)CP-52a،(C)CP-52b،(D)CP-70. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ± SEM (*p < 0.05 مقارنة مع عنصر التحكم). وقد عُدل هذا الرقم من يانغ وآخرون19 بإذن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا العمل بروتوكولًا تجريبيًا مفصلًا لتقييم السمية العصبية للملوثات البيئية باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي. يمر سمك الحمار الوحشي بالعملية من الأجنة إلى اليرقات خلال فترة التعرض ، مما يعني أن الرعاية الجيدة للأجنة واليرقات أمر ضروري. أي شيء يؤثر على تطور الأجنة واليرقات يمكن أن يؤثر على النتيجة النهائية. هنا تتم مناقشة البيئة الثقافية ، وعملية التعرض ، والظروف التجريبية لضمان نجاح الاختبار كله.

بالنسبة لبيئة الاستزراع ، تعيش أجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي تحت درجة حرارة مستقرة تبلغ ~ 28 درجة مئوية. في هذا العمل ، يتم استخدام حاضنة الضوء التي يمكن أن تحدد ظروف الإضاءة تلقائيًا والحفاظ على درجة الحرارة مستقرة لإيواء الأجنة واليرقات. لا تخرج الأجنة من chorion عند 1 dpf و 2 dpf ، لذلك يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف الأجنة غير المفقسة عند تجديد محلول التعرض. أيضا ، يجب أن تكون نسبة DMSO في الحل أقل من 0.1 ٪34،35، ويجب أن يكون حل التعرض الجديد عند 28 درجة مئوية قبل استخدامه للتجديد.

عملية اختيار الأجنة قبل التعرض هو أيضا عامل رئيسي لنجاح التجربة. اختيار الأجنة السليمة النامية في وقت واحد لكل مجموعة يضمن دقة تقييم السمية. يمكن أن يعيش حمار وحشي بدون طعام خلال الأيام السبعة الأولى بعد الإخصاب ، لذلك من الأفضل عدم إطعام الأجنة أو اليرقات خلال فترة التعرض بأكملها لأن الطعام يمكن أن يؤثر على النتيجة النهائية. أيضا ، فمن الأفضل لإعداد حل التعرض الطازجة عند الحاجة.

خلال اختبار السلوك ، من الضروري أن توفر لليرقات ما يكفي من الوقت للتكيف مع بيئة حاوية المراقبة عالية الإنتاجية. قبل الاختبار ، يجب فحص كل خطوة من البروتوكول المختبر بعناية ، بما في ذلك حالة الضوء ، ووقت الاختبار ، وما إلى ذلك. يجب أن تبقى غرفة الاختبار هادئة ومظلمة تمامًا من أجل عدم إزعاج الحيوانات.

يوفر البروتوكول المعروض إطارًا أساسيًا لدراسة السمية السلوكية العصبية للملوثات البيئية. وهناك أيضا أنواع أخرى من السلوكيات المستخدمة عند دراسة الآثار العصبية السلوكية، مثل اختبارات تفضيل الألوان36،اختبارات المسكن السفلي37،اختبارات تفضيل الضوء / الظلام38،39،الخ. ومع ذلك ، فإن هذه الاختبارات تستخدم بشكل رئيسي سمك الحمار الوحشي البالغ ، والتي لا تصلح لاختبارات الإنتاجية العالية. وبالإضافة إلى ذلك، Weichert وآخرون على شريط فيديو إلى سلوك حركات الذيل التلقائي التي يمكن قياسها كميا فقط بعد التعرض 24 ح40. ويشمل تقييم السمية السلوكية العصبية أيضا دراسات آلية على وظيفة الدماغ والجهاز العصبي المركزي. يتم تقديم المؤشرات السلوكية العصبية الأساسية هنا ويمكن أن تشكل الأساس لمؤشرات أكثر تعقيدًا باستخدام أدوات سلوك ية أخرى. في نهاية المطاف ، يمكن استخدام تطوير مؤشرات سلوكية عصبية جديدة مصحوبة بآلية الدراسة هذه في الدراسات المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (21876135 و21876136)، وهو المشروع الوطني الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا في الصين (2017ZX07502003-03، 2018ZX07701001-22)، مؤسسة وزارة التعليم- شنغهاي المختبر الرئيسي للصحة البيئية للأطفال (CEH201807-5)، ومجلس البحوث السويدي (رقم 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35, (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57, (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24, (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90, (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113, (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3, (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234, (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4, (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55, (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31, (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10, (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53, (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10, (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210, (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207, (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36, (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30, (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13, (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11, (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104, (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7, (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics