Assay עבור הידבקות ואת הפלישה אגר ב cerevisiae ס

Published 11/08/2006
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

אנו מתארים assay איכותי עבור הידבקות שמרים הפלישה אגר כאמצעי בידול פולשני pseudohyphal. Assay זה פשוט יכול לשמש כדי להעריך את פנוטיפ פולשני של מוטנטים שונים, כמו גם את ההשפעות רמזים סביבתיים איתות המסלולים על בידול שמרים.

Cite this Article

Copy Citation

Guldal, C. G., Broach, J. Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (1), e64, doi:10.3791/64 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שמרים נמצאים biofilms טבעי, שבו מיקרואורגניזמים רבים ליישב משטחים. בסביבות מלאכותי, כגון משטחים של אובייקטים מעשה ידי אדם, biofilms יכול להפחית את התפוקה התעשייתית, להרוס את המבנים, ומאיימים על חיי אדם. 1-3 מצד שני, רתימת העוצמה של biofilms יכול לעזור לנקות את הסביבה וליצור אנרגיה בת קיימא. 4-8 היכולת של cerevisiae ס ליישב משטחים ולהשתתף biofilms מורכב בעיקר התעלמו עד הגילוי מחדש של תוכניות בידול מופעלות על ידי איתות המסלולים השונים רמזים סביבתיים אורגניזם הזה. 9, 10 ההתעניינות המתמשכת באמצעות cerevisiae ס כאורגניזם מודל כדי להבין את האינטראקציה ההתכנסות של מסלולי איתות, כגון ראס PKA, Kss1 MAPK, ו Hog1 מסלולים osmolarity, הניח במהירות cerevisiae ס בצומת של biofilm ביולוגיה התמרה מחקר האות. 11-20 לשם כך, התמיינות של תאים השמרים לתוך ארוך, חוטים דבק pseudohyphal הפך readout נוח להפעלה של מסלולים הולכת אותות על שינויים סביבתיים שונים. עם זאת, filamentation הוא אוסף מורכב של פנוטיפים, מה שהופך assaying על זה כאילו זה פנוטיפ פשוט מטעה. בעשור האחרון, מספר מבחני אומצו בהצלחה ממחקרים biofilm חיידקי מחקר שמרים, כגון היווצרות מבחני MAT למדוד להפיץ המושבה על אגר רך סגול מכתים קריסטל כמותית למדוד על פני קרום התא דבקות. 12, 21 עם זאת, יש כבר כמה בלבול מבחני איכותית שפותחה כדי להעריך את פנוטיפים דבק פולשני של השמרים אגר. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ואמינה להערכת איכות דבק פולשני של זני שמרים עם קל להבין את השלבים הבאים כדי לבודד את הערכה הידבקות מהערכה הפלישה. השיטה שלנו, אימצו ממחקרים קודמים, 10, 16 כולל התאים גדל התקשורת נוזלי ציפוי על תנאי מזין ההפרש לצמיחה של כתמים גדולים, אשר אנו מכן לשטוף עם מים כדי להעריך את הידבקות ולשפשף התאים לחלוטין מעל פני השטח אגר להעריך הפלישה אגר. אנו לבטל את הצורך נמרח על גבי תאים אגר, אשר משפיע על פלישה של תאים לתוך אגר. באופן כללי, אנו ציין כי זנים הפלואידים כי לפלוש אגר תמיד דבק, אך לא כל זני דבק יכול לפלוש בינוני אגר. הגישה שלנו יכולים לשמש בשילוב עם מבחני אחרים כדי לנתח בזהירות את הצעדים בידול והדרישות של התמרה שמרים האות, בידול, חישה קוורום, היווצרות biofilm.

Protocol

  1. שים 200ul של תרבויות הולכת וגדלה של הריבית על צלחות התקשורת סינתטי עם התנאים הנדרשים רעב (SC עם גלוקוז 2% לעומת SC עם 0.2% גלוקוז, למשל) אם את הצפיפות של תרבויות שונות מדי אחד מהשני, להתאים לספור תאים לכל תרבות 200ul כך לכל אחד יש ירידה בערך את אותה כמות של תאים.
  2. הקפד לשמור תיעוד של דבר ירידה על צלחות הוא אשר התרבות.
  3. שמור את המכסה פתוחה הצלחת להשאיר או בטמפרטורת החדר או 30 מעלות צלזיוס עד טיפות יבשות.
  4. צלחות חותם עם parafilm פלסטיק לעטוף (לא חובה) ולהשאיר ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים.
  5. המסמך את הצמיחה של תאים על צלחות (על ידי סריקה, צילום תמונה דיגיטלית וכו ')
  6. לשטוף את התאים על פני השטח אגר עם מים בלחץ גבוה (רצוי מים DI) כדקה מטפלת עבור אגר לא להרים ולשנות כיוון.
  7. היפטר המים העודפים על ידי הקשה על הצלחות על מגבות נייר להשאיר אותם פתוחים יבש.
  8. לאחר הצלחות הם הידבקות מסמך יבש על כל צלחת (באמצעות סריקה או צילום תמונות דיגיטלי)
  9. תאים באצבע עטויה כפפה, לשפשף בעדינות את פני השטח בצורה אגר מתחת למים זורמים כדקה.
  10. יבש את הצלחות כמו קודם.
  11. אם אתה משתמש היקף לנתח, להוציא את המחט לפני הצבת צלחות על גבי פלטפורמת מיקרוסקופ.
  12. מסמך הפלישה עם הגדלה 10x או 40X. ודא להתמקד בחלק האמצעי של כל מעגל, שכן את הקצוות יהיה צפוף מדי כדי לראות מורפולוגיות תאים בודדים. הקצוות יכולים לציין את רמת הצמיחה פילמנטיות והוא יכול להיות מתועד לשימוש עתידי. סריקה או צילום תמונה דיגיטלית של צלחת כולו יכול גם להיות מועיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בתאי שמרים להציג מצבי בידול שונים על פי זמינות חומרי מזון ותנאים סביבתיים, כולל יצירת הנבגים בתנאי רעב ומתח, filamentation תחת מדגיש תזונה שונים, הפתתה. שמרים שונים, כולל cerevisiae ס ו ג אלביקנס, ניתן למצוא גם ב biofilms שהוקמה על ידי קבוצה מגוונת של מיקרואורגניזמים. אמנם יש איזשהו יחס עם filamentation התנהגות פולשנית, לא ברור בדיוק איך filamentation עלול לגרום הפלישה קולוניזציה של משטחים ורקמות. שמרים בהחלט יכול למצוא שתי צורות וגטטיבי לבין פילמנטיות ב biofilms בטבע, כמו גם במקומות שבהם הם מאיימים על בריאות האדם, כגון צנתרים איברים אנושיים נגועים. 10-13 על מנת להבין את מסלולי איתות מנוצל על ידי שמרים להדביק בעלי חיים להשתתף biofilms מזיקים מועילה, עלינו לפתח מבחני נגיש ואמין. כאן פיתחנו assay, אימצה מן הידבקות כבר קיימים מבחני הפלישה זמין שמרים, אשר מאפשרים לנו לקבוע את פנוטיפים איכותית דבק פולשני של זני שמרים מוטנטים בתנאים שונים. Assay המוצגים כאן מבטלת את הדרישה פסים בתאי שמרים על גבי אגר, שם הפעולה בלבד נמרח על פני אגר משנה את האיכויות פולשני דבק של שמרים. הדמיה דיגיטלית של במיוחד את התאים הפולשים על ידי מיקרוסקופ מאפשר הערכה כמותית למחצה של מידת הפלישה הידבקות. גילוי כזה של תאים פולשני דבק מחמיא תא בודד אגר הפלישה assay שפותחה על ידי מעבדה ספראג 9 ניתן להתאים לעשות קורס ניסויים זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ליסה Schneper ואת קתרין Duevel עבור התובנות שלהם בפיתוח זה assay.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Moticam 350 Camera Motic discontinued (new model: Moticam 352) A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
  2. Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
  3. Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
  4. Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
  5. Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
  6. Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
  7. Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
  8. Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
  9. Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
  10. Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
  11. Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
  12. Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
  13. Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
  14. Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
  15. Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
  16. Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
  17. Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
  18. Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
  19. Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
  20. Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
  21. Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats