Test voor Adhesie en Agar invasie in S. cerevisiae

Published 11/08/2006
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Beschrijven we een kwalitatieve analyse voor gist hechting en agar invasie als een maat voor invasieve en pseudohyfale differentiatie. Deze eenvoudige test kan gebruikt worden om de invasieve fenotype van verschillende mutanten, alsmede de effecten omgevingsfactoren te beoordelen en signaalwegen op gist differentiatie.

Cite this Article

Copy Citation

Guldal, C. G., Broach, J. Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (1), e64, doi:10.3791/64 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Gisten zijn te vinden in natuurlijke biofilms, waar veel micro-organismen koloniseren oppervlakken. In een kunstmatige omgeving, zoals de oppervlakken van de mens gemaakte objecten, kunnen biofilms verminderen industriële productiviteit, vernietigen structuren en bedreigen het menselijk leven. 1-3 op de andere kant kan het benutten van de kracht van biofilms helpen bij het schoonmaken van het milieu en het genereren van duurzame energie. 4-8 Het vermogen van S. cerevisiae aan oppervlakken koloniseren en participeren in complexe biofilms was grotendeels genegeerd tot de herontdekking van de differentiatie programma's veroorzaakt door verschillende signaalwegen en omgevingsfactoren in dit organisme. 9, 10 De aanhoudende belangstelling voor het gebruik S. cerevisiae als modelorganisme om de interactie en de convergentie van signaalwegen, zoals de Ras-PKA, Kss1 MAPK, en Hog1 osmolariteit paden, snel geplaatst S. cerevisiae in de kruising van de biofilm te begrijpen biologie en signaaltransductie onderzoek. 11-20 Te dien einde, differentiatie van gistcellen in lange, lijm, pseudohyfale filamenten werd een gemakkelijke uitlezing voor de activering van signaaltransductieroutes op diverse veranderingen in het milieu. Echter, filamentatie is een complexe verzameling van fenotypes, waardoor het testen voor het alsof het een simpel fenotype misleidend. In de afgelopen tien jaar werden verschillende tests met succes overgenomen van bacteriële biofilm studies om gist onderzoek, zoals de vorming van MAT assays om kolonie verspreiden meten op zachte agar en kristalviolet kleuring om kwantitatief te meten celoppervlak therapietrouw. 12, 21 echter, is er sprake van enige verwarring in assays ontwikkeld om de kwalitatieve evaluatie van de lijm en invasieve fenotypen van gist in agar. Hier presenteren wij een eenvoudige en betrouwbare methode voor de beoordeling van de lijm en invasieve de kwaliteit van giststammen met eenvoudig te begrijpen stappen om de hechting beoordeling isoleren van de invasie beoordeling. Onze methode, overgenomen van eerdere studies, 10, 16 impliceert groeiende cellen in vloeibare media en plating op differentiële voedingsstof voorwaarden voor groei van grote vlekken, die we vervolgens wassen met water om de hechting te beoordelen en volledig wrijven cellen uit de agar oppervlak invasie te beoordelen in de agar. We elimineren de noodzaak voor strepen cellen op agar, die de invasie van cellen beïnvloedt in de agar. In het algemeen hebben we opgemerkt dat haploïde stammen die agar binnenvallen altijd lijm zijn, maar niet alle lijm-stammen kunnen agar medium binnen te vallen. Onze aanpak kan worden gebruikt in combinatie met andere testen zorgvuldig te ontleden de differentiatie stappen en eisen van de gist signaaltransductie, differentiatie, quorum sensing, en biofilmvorming.

Protocol

  1. Doe 200ul van groeiende culturen van de rente op synthetische media platen met de vereiste hongerdood voorwaarden (SC met 2% glucose versus SC met 0,2% glucose, bijvoorbeeld) Indien de dichtheid van culturen zijn te verschillend van elkaar, aan te passen celgetal per 200ul cultuur zodat elke druppel is ongeveer dezelfde hoeveelheid cellen.
  2. Zorg ervoor dat gegevens van die druppel op de platen is die cultuur te houden.
  3. Houd de plaat deksel op een kier en laat zowel bij kamertemperatuur of bij 30 ° C tot druppels droog.
  4. Seal-platen met parafilm en plastic wrap (optioneel) en laat in 30 ° C voor 3-7 dagen.
  5. Document van de groei van cellen op platen (door het scannen, het nemen van een digitale foto, etc)
  6. Was de cellen off van de agar oppervlak met water onder hoge druk (bij voorkeur DI water) gedurende ongeveer een minuut nemen de zorg voor de agar niet op te tillen en te veranderen oriëntatie.
  7. Zich te ontdoen van overtollig water door te tikken platen op keukenpapier en laat ze open om te drogen.
  8. Zodra de platen zijn droge document hechting op elke plaat (door het scannen of het nemen van digitale foto's)
  9. Met een gehandschoende vinger, zachtjes af te wrijven cellen vormen de agar oppervlak onder stromend water gedurende ongeveer een minuut.
  10. Droog de platen als voorheen.
  11. Bij gebruik van een ontleding scope, verwijder dan de naald voordat u platen op de microscoop platform.
  12. Document invasie met 10x of 40x vergroting. Zorg ervoor om zich te concentreren op het midden van elke cirkel, want de randen zullen ook druk aan de individuele cel morfologie te zien. De randen kunnen wijzen op het niveau van de filamenteuze groei en kan worden gedocumenteerd voor toekomstig gebruik. Scannen of het nemen van een digitale foto van de hele plaat kan ook nuttig zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gistcellen scherm verschillende modes differentiatie afhankelijk van de beschikbaarheid van voedingsstoffen en milieu-omstandigheden, met inbegrip spore vorming onder honger en stress omstandigheden, filamentatie onder verschillende voedingsstoffen spanningen, en flocculatie. Verschillende gisten, waaronder S. cerevisiae en C. albicans, kan ook worden gevonden in biofilms gevormd door een gevarieerde set van micro-organismen. Hoewel er enige correlatie met filamentatie en invasieve gedrag, is het niet duidelijk hoe filamentatie kan leiden tot invasie en kolonisatie van oppervlakken en weefsels. Gist kan zeker worden gevonden in zowel de vegetatieve en filamenteuze vormen in de biofilms in de natuur maar ook plaatsen waar ze bedreigen de menselijke gezondheid, zoals katheters en geïnfecteerde menselijke organen. 10-13 Om de signaalwegen gebruikt door gisten om dieren te infecteren en te participeren in schadelijke en gunstige biofilms te begrijpen, moeten we toegankelijk en betrouwbare testen. Hier hebben we een test, overgenomen van reeds bestaande adhesie en invasie assays beschikbaar zijn voor gist, die ons in staat om kwalitatief de lijm en invasieve fenotypen van giststammen en mutanten te bepalen in verschillende omstandigheden. De test hier gepresenteerde elimineert de behoefte aan strepen gistcellen op de agar, waar het enkele actie van de strepen agar oppervlak verandert de invasieve en kleefkracht van gist. Digital imaging van vooral de binnenvallende cellen door een microscoop maakt voor semi-kwantitatieve beoordeling van de mate van invasie en hechting. Dergelijke detectie van invasieve en lijm cellen is gratis de eencellige agar invasie test is ontwikkeld door het lab Sprague 9 en kan aangepast aan de tijd natuurlijk experimenten doen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

We willen graag Lisa Schneper en Katrin Duevel bedanken voor hun inzichten in de ontwikkeling van deze test.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Moticam 350 Camera Motic discontinued (new model: Moticam 352) A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
  2. Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
  3. Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
  4. Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
  5. Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
  6. Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
  7. Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
  8. Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
  9. Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
  10. Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
  11. Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
  12. Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
  13. Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
  14. Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
  15. Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
  16. Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
  17. Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
  18. Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
  19. Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
  20. Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
  21. Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats