Нейтрофилов Изоляция протокола

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Нейтрофилы являются одними из первых клеток, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа, а также их функции и механизмы хорошо изучены в лабораторных условиях. Мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных раздела сред.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Нейтрофилов полиморфноядерных гранулоцитов (PMN) являются наиболее распространенными лейкоцитов в организме человека и одним из первых клетках, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа. Из-за их ключевую роль в воспалении, нейтрофилов функции, такие как передвижение, продукции цитокинов, фагоцитоз, и опухоль боевой ячейки хорошо изучена. Чтобы охарактеризовать специфические функции нейтрофилов, чистый, быстрый и надежный метод, отделяющий их от других клеток крови желательно в лабораторных исследованиях, тем более, что нейтрофилы являются короткоживущими и должны быть использованы в течение 2-4 часов после сбора. Здесь мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных разделение средств массовой информации, что представляет собой смесь натрия и metrizoate Декстран 500. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали в буфере для желаемой концентрации. При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность.

Protocol

Нейтрофилов Изоляция протокола

  1. Довести все реагенты до комнатной температуры.
  2. Сбор 5,0 мл нейтрофилов изоляции СМИ в центрифуге трубки. Тщательно слой 5,0 мл крови за разделение средств массовой информации. Данный шаг следует выполнять медленно и осторожно, и с кончика пипетки близко к поверхности, средств массовой информации, чтобы избежать смешивания крови и средств массовой информации.
  3. Центрифуга при 500 RCF в течение 35 минут при температуре 20-25 ° C. Кровь должна выделить на 6 отдельных полос: плазма, моноцитов, изоляция СМИ, нейтрофилы, больше СМИ изоляции и красных клеток крови гранул (рис. 1). Если эти группы не ясны, процесс разделения не было чистым и необходимо будет повторить.
  4. Аккуратно снимите верхнюю три слоя (плазма, моноциты, и изоляции средств массовой информации) с помощью пипетки. Утилизация этих слоев.
  5. Тщательно пипеткой слой нейтрофилов и все средства массовой информации изоляции под нейтрофилов. Место раствор в чистую пробирку центрифуги.
  6. Развести нейтрофилов решение до 10 мл HBSS без Са 2 + / Mg 2 +. Обратить трубку несколько раз, чтобы приостановить клеток.
  7. Центрифуга нейтрофилов решение при 350 RCF течение 10 минут. Красный шарик должен присутствовать на дне пробирки, содержащие нейтрофилов и остаточной красных кровяных телец (эритроцитов). Удалить супернатант с пипеткой осторожно, чтобы шарик не нарушается.
  8. Для лизиса остаточных эритроцитов, добавляют 2 мл красного буфера лизиса клеток к трубе. Для ресуспендирования гранул, вихревые флаконе установка 3-4. Избегайте увеличения вихревой настройки выше 4, так как это может привести к активации нейтрофилов. Это может быть необходимо, чтобы вихрь в течение нескольких секунд, или "пульс" вихрь, чтобы растворить гранулы.
  9. Центрифуга трубке при 250 RCF в течение 5 мин. Удалить супернатант с пипеткой. Повторите лизировать процесс, если требуется.
  10. Добавить 500 мкл HBSS без Са 2 + / Mg 2 + в каждую пробирку. Опять же, вихрь для ресуспендирования гранул в установке 3-4. Развести в 10 мл HBSS без Са 2 + / Mg 2 +.
  11. Центрифуга труб при 250 RCF в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и выбросьте.
  12. Ресуспендируют осадок в 250 мкл HBSS / HSA Решение (2% HSA). Ячейки могут быть посчитаны и доводят до нужной концентрации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разделение градиента плотности метод используется для изоляции нейтрофилов человека из цельной крови с использованием смеси натрия metrizoate и Декстран 500. Этот метод основан на мононуклеарных лейкоцитов метод разделения Boyum (1968), который был модифицирован для нейтрофилов разделения Ферранте и стринги (1980).

После сбора от донора, кровь может быть антикоагулянтом ЭДТА, цитрат или гепарин. Так как они недолговечны, нейтрофилов следует использовать в течение 2-4 часов после сбора. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали к желаемой концентрации.

Если шесть полос не являются отдельными после первого шага центрифугирования, процесс разделения не была чистой и необходимо будет повторить. Для четкого разделения, убедитесь, что выделение средств массовой информации еще не истек, или загрязнены. Разделение может быть неудачным, если кровь донора потребляемого алкоголя или лекарств в 72 часов до забора крови.

Для предотвращения активации нейтрофилов во время процедуры разделения, то лучше использовать HBSS без Ca2 + / Mg2 +, так как ионы Было показано, что премьер клеток. Ресуспендирования гранул также должны быть выполнены медленно, и вихрь настройки должны храниться в низкой и средней дальности, так что клетки не активируются.

При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность. Чистота и жизнеспособность можно оценить с помощью маркировки клеток с нейтрофилами специфическим маркером CD66b и трипанового синего красителя исключения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Финансирование из NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics